KR100729971B1 - 만능 줄기 세포에서 유래되는 간세포 계통 세포 - Google Patents

Abstract

만능 줄기 세포가 간세포 분화 제제의 존재 하에 배양되는 경우, 간 세포에 특징적인 표현형을 갖는 세포의 비율이 현저히 높은 세포군이 유도된다는 것이 발견되었다. 하나의 예에서, 인간 배아 줄기 세포는 배상체를 형성한 후, 임의로 성숙 인자가 보충된 분화 제제 n-부티레이트와 배합된다. 또다른 예에서, n-부티레이트는 영양 세포가 없는 배양물 중의 인간 배야 줄기 세포에 첨가된다. 어떤 방식으로든, 간세포에 특징적인 표면 마커를 발현하고, 간 기능에 중요한 효소 및 생합성 활성을 갖는 세포가 우세한 현저히 균일한 세포군이 수득된다. 줄기 세포는 배양물 중에서 쉽게 증식하므로, 상기 시스템은 다양한 응용, 예컨대 약물 스크리닝 및 임상 처치와 관련된 간 기능의 보충을 위한 간세포 계통 세포의 풍부한 공급원을 제공한다.

만능 줄기 세포, 간세포, n-부티레이트

Description

만능 줄기 세포에서 유래되는 간세포 계통 세포 {HEPATOCYTE LINEAGE CELLS DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS}

본 발명은 일반적으로 배아 세포 및 간 세포의 세포 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 배양 조건 하에서 인간 만능 줄기 (human pluripotent stem) 세포의 간세포 계통 세포로의 의도적 분화에 관한 것이다.

출원 관련 참고문헌

본 출원은 2000. 4. 27. 일자로 출원한 미국 가특허 출원 60/200,095; 및 2000. 11. 20. 일자로 출원한 미국 실용 출원 09/718,308 을 우선권으로 주장한다. 미국에서의 절차를 위해, 본원에 우선권 출원의 전문을 참고문헌으로 삽입한다.

세계적으로 수백만명의 사람들이 간 질환에 걸린다. 전격성 간부전은 보통 수시간 내에 죽음에 이르는 간 기능의 즉시적이고 파괴적인 중지에 대한 임상 용어이다. 기타 형태의 간 질환, 예컨대 만성 간염 및 경변에는 생리학적 안녕과 장기적 예후에 부정적 효과를 갖는 잠행성 및 진행성 간 기능 부전이 관여된다. 미국에서는, 매년 간 질환으로 300,000 명이 입원하고, 약 4,500 개의 제공자 간만이 이식용으로 사용가능하여 30,000 명이 사망하는 것으로 추산된다.

건강한 간은 현저한 자체 재생능을 갖는다 - 그러나 상기 능력이 손상되는 경우, 그 결과는 심각하다. 현대 의학에서의 중요한 도전은 병에 걸린 환자에서 자연적 재생 과정을 보충하여 간 기능을 복구시키는 방법을 찾는 것이다.

일부 초창기 연구는 작은 동물 모델에서 간의 전구 세포를 동정하기 위해 수행되었다. Agelli 등 (Histochem. J. 29:205, 1997), Brill 등 (Dig. Dis. Sci. 44:364, 1999) 및 Reid 등 (미국 특허 5,576,207) 은 배아 및 신생아 래트 간으로부터 초기 간 전구 세포가 증식하는 조건을 제시하였다. Michalopoulos 등 (Hepatology 29:90, 1999) 은 생물학적 매트릭스에서 래트 간세포 및 비유조직 (nonparenchymal) 세포를 배양하기 위한 시스템을 보고하고 있다. Block 등 (J. Cell Biol. 132:1133, 1996) 은 화학적으로 제한된 배지 중에서 성장 인자의 조합에 의해 유도되는 간세포의 일차 배양물의 증식, 클론성 성장 및 특정 분화를 위한 조건을 개발하였다. 이전에, 성숙한 래트 간 세포는 성숙한 간세포 또는 담즙 상피 세포로 분화할 능력을 갖는 전구세포 (때때로 "간모세포 (hepatoblast)" 또는 "타원 세포 (oval cell)" 로 불림) 로 부터 유래됨이 밝혀졌다 (L.E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro 등, Cancer Res. 58:514, 1998; Germain 등, Cancer Res. 48:4909, 1988).

불행히도, 재생 요법을 위한 인간 간세포의 용이한 출처는 동정되지 않고 있다. 유럽 특허 출원 EP 953 633 A1 에는 명백히 기증된 인간 간 조직으로부터, 증식 및 분화된 인간 간 세포를 생성하기 위한 세포 배양 방법 및 배지가 제안되어 있다. 대부분의 사람의 솜씨로는 배양물 중 인간 간세포의 복제능이 실망스러웠다. 구제책으로서, SV40 바이러스의 거대 T 항원으로 전달감염시켜 간세포를 무한 증식화시키는 (immortalized) 것이 제안되었다 (미국 특허 5,869,243).

최근 다수의 발명에서, 줄기 세포가 질병, 감염 과정에서 또는 선천적 기형으로 인해 손상받은 것들을 대체하기 위한 다양한 세포 유형 및 조직의 출처가 될 수 있다는 예측이 제시되었다. 다양한 유형의 추정 줄기 세포는 이들이 분열함에 따라 분화하여, 특정 조직, 예컨대 심장, 간 또는 뇌의 독특한 기능을 수행할 수 있는 세포로 성숙한다.

특히 중요한 개발은 배아 조직으로부터 2 가지 유형의 인간 만능 줄기 (hPS) 세포의 단리였다. 만능 세포는 체내에서 대부분의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 것으로 여겨진다 (R.A. Pedersen, Scientif. Am. 280(4):68, 1999). 배아 줄기 세포에 대한 초기 연구는 마우스에서 수행되었다 (Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997; 및 Pederson, Reprod. Fertil. Dev. 6:543, 1994 에서 리뷰됨). 그러나, 원숭이 및 인간 만능 세포는 훨씬 더 연약해서, 마우스 배아 세포와 동일한 배양 조건에 반응하지 않는 것으로 나타났다. 최근에서야 영장류 배아 세포가 체외에서 수득 및 배양될 수 있는 발견이 얻어졌다.

Thomson 등 (미국 특허 5,843,780; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995) 은 최초로 영장류로부터 배아 줄기 세포를 성공적으로 배양하였다. 이어서 이들은 인간 포배로부터 인간 배아 줄기 (hES) 세포주를 유도하였다 (Science 282:114, 1998). Gearhart 와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 생식 (hEG) 세포주를 유도하였다 (Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998 및 국제 특허 출원 WO98/43679). hES 및 hEG 세포는 둘 다 오랫동안 찾던 인 간 만능 줄기 (hPS) 세포의 특징을 갖는다: 이들은 분화하지 않고 시험관 내에서 증식을 지속할 수 있고, 정상 핵형을 보유하며, 모든 성인 세포 유형을 생성하도록 분화하는 능력을 보유한다.

배양물 또는 기형종 (teratomas) 중 만능 줄기 세포의 자발적 분화는 상이한 세포 계통의 스펙트럼을 나타내는, 표현형이 불균일하게 혼합된 세포군을 생성한다. 다수의 응용에서, 분화된 세포가 보다 균일한 성질 - 이들이 발현하는 표현형 및 이들이 생성할 수 있는 자손의 유형에 있어서 - 인 것이 바람직하다.

따라서, 영장류 기원의 만능 배아 세포로부터, 특히 인간의 것으로부터 보다 균일한 분화된 세포군을 생성하는 기술이 필요하다.

개요

본 발명은 만능 세포로부터 간세포 계통의 세포로 분화된 영장류 세포의 효율적 생성 시스템을 제공한다. 상기 세포의 배양으로, 미분화된 세포 및 다른 조직 유형으로 수임된 (committed) 세포와 비교하여 간 세포에 전형적인 특징이 비교적 증가된 세포가 수득된다.

본 발명의 한 구현예는 세포군 내 상당 비율의 세포가 간세포 계통 세포의 특징을 갖도록 하는 방식으로 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포를 분화시켜 수득되는 세포군이다. 바람직한 특징은 명세서에 후술된다. 세포는 하기 중 임의 또는 전부를 나타낼 수 있다: 항체로 검출가능한 α₁-안티트립신 또는 알부민 발현; 항체로 검출가능한 α-페토단백질 (fetoprotein) 발현의 부재; 역 PCR 증폭으로 검출가능한 수준의 아시알로당단백질 수용체의 발현; 글리코겐 저장의 증거; 시토크롬 p450 또는 글루코오스-6-포스파타아제 활성의 증거; 및 간세포의 형태학적 특색. 바람직한 세포군은 세포군 내의 더 많은 비율의 세포가 더 많은 상기 간세포의 특징을 갖는다. 세포가 분화 도중 및 후속 조작에서 자손을 형성하도록 증식할 수 있음은 물론이다. 상기 자손도 또한 뚜렷이 배제되지 않는 한, 모든 경우 본 발명의 범위 내에 속한다.

대표적인 세포는 인간 포배로부터 유래되는 배양물로부터 수득되는 배아 줄기 (hES) 세포를 분화시켜 수득된다. 분화된 세포는 간세포 분화 제제, 예컨대 n-부티르산 또는 명세서에 개략된 기타 분화 제제를 포함하는 성장 환경에서 pPS 세포를 배양하여 생성된다. 분화 제제는 영양 세포와 함께 또는 영양 세포 없이 배양되는 미분화된 pPS 세포에 직접 첨가될 수 있다. 이와는 달리, pPS 세포는 혼합 세포군으로 분화될 수 있고 (예컨대 배상체를 형성하거나 배양물을 과다배양하여), 분화 제제가 혼합군에 첨가된다. 상당한 비율의 세포가 목적하는 표현형을 갖는 덜 불균일한 세포군이 얻어진다. 일부 경우, 배양 방법에는 또한 간세포 성숙 인자, 예컨대 DMSO 와 같은 용매, FGF, EGF 및 간세포 성장 인자와 같은 성장 인자, 및 덱사메타존과 같은 글루코코르티코이드를 포함하는, 명세서에 예시되는 것들이 포함된다.

본 발명의 또다른 구현예는, 본 발명의 분화된 세포군으로부터 회수되거나, 상기 세포군으로부터 회수되는 세포의 자손인 간세포 계통 세포의 특징을 갖는 분화된 세포이다. 인간 만능 줄기 (hPS) 세포를 본질적으로 영양 세포가 없는 성장 환경 중에 제공하고; 간세포의 특징적 특색을 갖는 세포가 농축된 세포군을 생성하는 조건 하에서 간세포 분화 제제를 함유하는 배지 중에 hPS 세포를 배양하고; 이어서 농축된 세포군으로부터 분화된 세포를 회수하여 생성되는 분화된 세포가 대표적이다.

본 발명의 또다른 구현예는, hPS 세포의 배양물을 제공하고, 분화된 세포를 농축시키는 조건 하에서 간세포 분화 제제를 함유하는 배양 배지 중의 기질 상에서 세포를 배양함으로써, 시험관 내 배양물 중에 유지될 수 있는 분화된 세포를 수득하기 위한 인간 만능 줄기 (hPS) 세포의 처리 방법이다. 상기 방법과 관련하여 사용하기에 유익한 기법 및 시약은 명세서에 후술된다. 또한 본 발명에서는, 본 발명의 방법에 따라 생성되는 분화된 세포, 특히 간세포 계통 세포의 특징을 갖는 것들이 구현된다.

본 발명의 또다른 구현예는, 본 발명의 분화된 세포를 접촉시키고, 세포 내에서 일어나는 임의의 표현형 또는 대사적 변화를 측정하는 것을 포함하는, 간세포 독성 또는 조절에 대한 화합물의 스크리닝 방법이다. 본 발명의 또다른 구현예는, 세포가 플루이드 중의 독소를 제거하거나 변형시킬 수 있는 조건 하에서 플루이드와 본 발명의 분화된 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 플루이드, 예컨대 혈액의 해독 방법이다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 분화된 세포는 간 보조 장치의 일부로서, 또는 개인의 간세포 기능을 재생시키기 위한 치료적 투여용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 및 기타 구현예는 하기 설명에서 더욱 자명할 것이다.

도면

도 1 은 위상차 광현미경 사진의 중간톤 재생이다 (4 ×, 10 ×, 20 ×). 우측: 인간 만능 배아 줄기 (hES) 세포로부터 배상체 세포를 간세포 분화 제제 n-부티레이트 중에서 2 일 동안 배양하였다. 생성 세포는 균일한 형태를 나타낸다. 좌측: 혈청 (FBS) 함유 배지 중에서만 배양된 배상체 세포. 다수의 상이한 세포 유형 형태를 나타내는 불균일한 세포 반점이 있다.

도 2 는 위상차 광현미경 사진의 중간톤 재생이다 (상부 2 개 패널은 10 ×, 다른 패널은 20 ×). 이들은 n-부티레이트와 함께 6 일 동안 배양되어 분화된 세포이다. 세포는 성숙한 간세포의 특징을 우세하게 나타낸다. 이 시야의 세포는 2 핵이며 다각형 모양이고, 면역염색 또는 역 PCR 에 의해 검출가능한 성숙한 간세포의 마커를 발현한다.

도 3 은 동일 시야에서 세포 핵의 위치 (비스벤즈이미드 염색, 좌측) 와 대조되는, 특정 세포 특이적 마커의 면역조직화학적 염색 결과 (우측) 를 나타내는 중간톤 재생이다. 도 3A (40 ×) 는 성인 인간 간세포의 결과를 나타낸다; 도 3B (20 ×) 는 n-부티레이트와 6 일 동안 배양하여 분화된 hES 세포의 결과를 나타낸다. 두 배양물 모두 높은 비율의 알부민, α₁-안티트립신 및 CD18 (간세포 계통 세포에 특징적인 3 가지 마커) 에 대한 양성 염색 및 α-페토단백질 (덜 성숙한 세포의 마커) 에 대한 음성 염색을 나타내는 세포의 비율이 높다.

도 4 는 글리코겐의 존재 하에 과요오드산 시프 (Periodic Acid Schiff) 로 염색된 세포의 중간톤 재생이다 (10 ×및 40 ×). 태아 간세포 (중간층) 에서의 ~80% 및 섬유아세포 세포주 (하층) 에서의 0% 와 비교하여, 부티레이트 처리된 세포 (상층) 의 ~60% 가 글리코겐 저장의 증거를 나타낸다.

도 5 는 예시되는 분화 및 성숙 단계 도중의 다양한 시점에서의 세포를 나타내는, 위상차 광현미경 사진의 중간톤 재생이다 (10 ×, 40 ×). A 열은 5 mM 소듐 n-부티레이트를 함유하는 SR 배지 중에서 배양 4 일 후의 세포를 나타낸다. 배양물 중 세포의 80% 초과는 거대 핵 및 여포성 세포질을 포함하며, 직경이 크다. 5 일 후, 세포를 특정화된 간세포 배양 배지 (HCM) 로 전환시킨다. 열 B 및 C 는 HCM 중에서 2 또는 4 일 동안 배양 후의 외견을 나타낸다. 다핵 다각형 세포가 일반적이다. 상기 기준에 따르면, ES-유래 세포는 바로 단리된 인간 성인 간세포 (D 열) 및 태아 간세포 (E 열) 와 유사하다.

도 6 은 시토크롬 P-450 효소 1A1 및 1A2 (CYP1A1/2) 의 활성을 나타내는 막대 그래프이다. 효소는 5 μM 메틸클로란트렌 (MC) 과 배양한 후, 에톡시레소루핀을 사용하여 측정되었다. CYP1A1/2 활성은 ES 세포의 H1 주로부터 유래된 2 가지 간세포 계통주 및 H9 주로부터 유래된 것에서 검출되었다. 활성 수준은 바로 단리된 인간 성인 간세포 (HH) 의 2 가지 제조물에서 관찰된 수준을 초과하였다. 미분화된 H1 및 H9 세포 및 BJ 배아 섬유아세포에서의 활성은 무시할 정도였다.

상세한 설명

본 발명은 영장류 기원의 만능 줄기 세포로부터 간세포 계통의 분화된 세포 를 제조하기 위한 시스템을 제공한다.

만능 줄기 세포가 간세포 분화 제제의 존재 하에 배양되는 경우, 배양된 간 세포의 표현형 특징을 갖는 세포의 비율이 현저히 높은 세포군이 유도된다는 것이 발견되었다. 임의로, 또한 간세포 성숙 인자의 존재 하에 세포를 배양하여 효과가 증강될 수 있다. 만능 줄기 세포가 배양물 중에서 1 년 이상 증식할 수 있으므로 (300 회 이상 세포군 분열), 본 명세서에 기재된 발명은 다양한 개발학적 및 치료적 목적에 적합한 거의 무제한의 간세포 유사 세포의 공급을 제공한다.

도 2 는 원형 (prototype) 간세포 분화 제제인 n-부티레이트와 배양하여 분화된 세포의 위상차 광현미경 사진을 나타낸다. 세포는, 다각형 모양을 포함하는 간세포의 일관된 특색을 나타내며, α-페토단백질은 없으면서, 특징적인 표현형 마커, 예컨대 알부민, α₁-안티트립신 (AAT) 및 아시알로당단백질 수용체를 발현한다. 세포는 부티레이트 함유 배지 중에서 1 - 3 주 동안 유지되었다.

부티레이트 및 트리코스타틴 A 와 같은 히스톤 디아세틸라아제 억제제가 넓은 범위의 세포 유형의 분화에 관련되었다는 관점에서, 상기 발견은 놀라운 것이다. 연역적으로, 부티레이트는, 만능 줄기 세포군을 영양세포 없이 또는 레탄산의 존재 하에 배아 줄기 세포가 자라는 결과에서와 같이, 널리 불균일한 세포군으로 이끌 것이라고 예측하는 것이 논리적일 것이다. 상기 예측과는 대조적으로, 간세포 계통 세포의 현저히 균일한 세포군이 수득된다.

이것은 인간 만능 줄기 세포군의 분화에 있어서 중요하고 새로운 파라다임을 나타낸다. 우리의 지식으로는 어떤 유형의 배아 줄기 세포로부터도 상기의 균일한 간세포 계통 세포군이 수득되었다는 공개 보고가 없었다.

일차 간세포 배양에 있어서 DNA 합성 및 마커 발현에 대한 부티레이트의 효과는 Gladhaug 등 (Cancer Res. 48:6560, 1988), Engelmann 등 (In vitro Cell. Dev. Biol. 23:86, 1987), Staecker 등 (J. Physiol. 135:367, 1988; Arch. Biochem. Biophys. 261:291, 1988; 및 Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:78, 1987) 에 의해 연구되었다. 인간 간 세포주에 대한 부티레이트의 효과는 Saito 등 (Int. J. Cancer 48:291, 1991) 및 Yoon 등 (Int. J. Artif. Organs 22:769, 1999) 에 의해 연구되었다. 래트 타원 세포 (간세포 전구세포) 에 대한 부티레이트의 효과는 Pack 등 (Exp. Cell Res. 204:198, 1993) 및 Germain 등 (Cancer Res. 48:368, 1988) 에 의해 연구되었다. 일차 배양에서 래트 간 성상 (stellate) 세포에 대한 트리코스사틴 A 의 효과는 Niki 등 (Hepatology 29:858, 1999; 및 유럽 특허 출원 EP 9837742 A1) 에 의해 연구되었다. 간세포 및 담즙 상피 둘 다가 될 수 있는 배아 래트 간 상피 세포에 대한 부티레이트의 효과는 Blouin 등 (Exp. Cell Res. 21:22, 1995) 에 의해 연구되었다. 배양된 래트 간 상피 세포 전구세포에 대한 부티레이트의 효과는 Coleman 등 (J. Cell. Physiol. 161:463, 1994) 에 의해 연구되었다. L.E. Rogler (Am. J. Pathol. 150:591, 1997) 은 DMSO 또는 소듐 부티레이트로의 마우스 간모세포 세포주의 처리가 신속한 간세포 분화를 유도함을 보고하였다. Watkins 등 (J. Dairy Res. 66:559, 1999) 은 부티르산이 또한 인간 간 종양 세포에서 세포소멸 (apoptosis) 을 유도할 수 있음을 보고하고 있다. 모든 상기 연구들은 암화된 (transformed) 간 세포 또는 수임된 간세포 전구세포인 성숙한 간세포에 관한 것이다.

부티레이트는 배양물 중 및 생체 내 둘 다에서 다양한 다른 세포 유형에 대한 분화 및 조절 효과를 갖는 것으로 나타났다. Kosugi 등 (Leukemia 13:1316, 1999) 및 Tamagawa (Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:1483, 1998) 는 히스톤 디아세틸라아제 억제제가 급성 골수성 백혈병 세포에 있어서 강력한 분화 유도제임을 보고하고 있다. Davis 등 (Biochem J. 346 pt 2:455, 2000) 및 Rivero 등 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 248:664, 1998) 은 적혈구모세포 분화에 있어서 부티레이트의 효과를 논의하고 있다. Perrine 등 (Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 16:67, 1994) 및 Perrine 등 (N. Engl. J. Med. 328:81, 1993) 은 베타-글로빈 장애에서 태아 글로빈 생성의 촉진제로서 부티레이트 유도체를 제안하였다. Tai 등 (Hematol. Oncol. 14:181, 1996) 은 호산구성 여포 함유 세포의 분화에 대한 부티레이트의 효과를 분석하고 있다.

미국 특허 5,763,255 는, 5 mM 의 부티르산을 건조된 천연 섬유성 콜라겐 세포 배양 매트릭스 상의 미분화된 세포에 첨가하는, 상피 세포의 분화 유도 방법을 보고하고 있다. Yamada 등 (Biosci. Biotech. Biochem. 56:1261, 1992) 은 3 가지 섬유아세포 및 2 가지 상피 세포주에 대한 부티레이트의 효과를 연구하였다. Jeng 등 (J. Periodontal. 70:1435, 1999) 은 배양된 잇몸 섬유아세포에 대한 부티레이트 및 프로피오네이트의 효과를 연구하였다. Devereux 등 (Cancer Res. 59:6087, 1999) 은 인간 섬유아세포 세포주를 트리코스타틴 A 로 처리하면 텔로머라아제 역 전사효소를 발현하는 세포가 유도됨을 보고하였다. Yabushita 등 (Oncol. Res. 5:173, 1993) 은 난소 선암 세포에 대한 부티레이트, DMSO 및 디부티릴 cAMP 의 효과를 연구하였다. Graham 등 (J. Cellular Physiol. 136:63, 1988) 은 소듐 부티레이트가 유방암 세포주의 분화를 유도함을 보고하고 있다. Kamitani (Arch. Biochem. Biophys. 368:45, 1999), Siavoshian 등 (Gut 46:507, 2000) 및 Reynolds 등 (Cancer Lett. 11:53, 1998) 은 인간 장 상피 세포 및 결장 암 세포의 증식 및 분화에 대한 소듐 부티레이트 및 트리코스타틴 A 의 효과를 연구하였다. McBain 등 (Biochem. Pharmacol. 53:1357, 1997) 은 선암종 세포주의 세포소멸적 괴사가 부티레이트 및 기타 히스톤 디아세틸라아제 억제제에 의해 유도될 수 있음을 보고하고 있다.

Rocchi 등 (Anticancer Res. 18:1099, 1998) 및 Matsui 등 (Brain Res. 843:112, 1999) 은 신경아세포종 세포에서 증식, 분화 및 카테콜아민 합성의 유도에 대한 부티레이트 유사체의 효과를 보고하고 있다. Gillenwater 등 (Head Neck 2:247, 2000) 은 편평 암종 세포주에 대한 소듐 부티레이트의 효과를 연구하였다. Buommino 등 (J. Mol. Endocrinol.) 은 정낭 상피 세포의 세포 분화에 대한 부티레이트의 효과를 연구하였다. Sun 등 (Lipids 32:273, 1997) 은 신경교종 세포의 부티레이트-유도 분화를 연구하였다. Wang 등 (Exp. Cell. Res. 198:27, 1992) 은 정상 인간 각질세포의 분화에 있어서 n-부티레이트의 효과를 연구하였다. Perez 등 (J. Surg. Res. 78:1, 1998) 은 부티레이트가 쿠퍼 (Kupffer) 세포에 의한 PGE2 생성을 상향조절하고, 면역 기능을 조절함을 보고하고 있다. Schultz 등 (J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Evol.) 285:276, 1999) 은 히스톤 디아세틸라아제 억제제로의 2-세포배의 처리가 특정 유전자의 발현을 재프로그래밍한다는 것을 발견하였다. Chen 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5798, 1997 및 PCT 출원 WO 97/47307) 은 바이러스로 형질도입된 유전자의 재활성화를 위한 히스톤 디아세틸라아제 억제제의 용도를 보고하고 있다. Simon 등 (Regul. Pept. 70:143, 1997) 은 인슐린 생성의 증가를 일으키는 췌도 세포의 분화 유도에 대한 부티레이트의 효과를 연구하였다.

부티레이트 및 관련 화합물이 매우 다수의 상이한 세포 유형에서 분화를 촉진하므로, 연역적으로 만능 배아 세포로부터 유래된 혼합 세포군을 처리하면 세포군 내의 각 세포는 이미 수임된 주를 따라 더욱 분화될 것이라고 - 간단히 더욱 성숙한 혼합 세포군을 만들 것이라고 - 예상할 것이다. 부티레이트 처리가 균일한 세포군을 만들 것이라고 - 또는 상기 세포가 어떤 조직 유형이 될 것이라고 - 예측할 수 없었다.

본 발명은 배아 만능 세포와 부티레이트 (또는 하기 설명된 또다른 간세포 분화 인자) 를 배양하여, 간 세포의 표현형 특징을 갖는 세포의 비율이 현저히 높은 세포군이 생성된다는 놀라운 발견에 관한 것이다.

분화 인자와 만능 세포 배양의 빈번한 결과는 배양물 중 80% 초과의 세포가 최초 24 시간 내에 손실되는 것이다. 배양 수일 후에는 간세포 계통의 특징적 특색 - 예컨대 다각형 2 핵 표현형, α₁-안티트립신 및 알부민과 같은 마커, 및 대사적으로 중요한 효소, 예컨대 시토크롬 p450 효소 1A1 및 1A2 의 활성 발현 - 을 갖 는 세포가 우세한 세포군이 얻어진다. 본 발명의 실시에 어떤 제한을 가하지 않으면서, 부티레이트 및 기타 분화 인자는 세포가 간세포 계통으로 수임되도록 유도하거나, 간세포 계통의 세포의 생존을 우선적으로 촉진하는 것을 돕거나, 또는 상기 효과 둘 다의 조합을 갖는 것으로 가정된다.

후술되는 것은 본 배양 시스템이 어떻게 영장류 기원의 만능 배아 줄기 세포로부터 간세포 계통 세포를 생성하는데 사용될 수 있는가에 대한 상세한 설명이다. 간세포 분화 제제 (n-부티레이트로 예시되지만 이에 제한되지는 않음) 의 용도는, 배양물 중 간세포 계통 세포의 생성을 촉진하는 배양 시스템의 기타 특색과 함께 설명된다.

만능 배아 줄기 세포는 본질적으로 무한 성장할 수 있으므로, 상기 시스템은 연구, 약학 개발 및 간 질환의 치료적 관리에서의 사용을 위한 간세포 유사 세포의 무제한 공급을 제공한다.

정의

"간세포 계통" 세포, "간모세포체 (hepatoblastoid)" 세포 및 "간배아체 (hepatoembryoid)" 세포라는 용어는 기재되는 방식으로 만능 세포의 분화에 의해 수득되는, 본 발명의 분화된 세포와 관련되어 사용될 수 있다. 분화된 세포는 본 명세서에서 이후에 제공되는 바와 같이, 공지된 간세포 전구세포, 간모세포 및 간세포의 다양하고 구별되는 표현형 특징의 1 가지 이상을 갖는다. 상기 용어의 사용은, 명백히 요청되지 않는 한, 세포 표현형, 세포 마커, 세포 기능 또는 증식능에 대해 특별히 제한되지 않는다.

"간세포 전구세포" 또는 "간세포 줄기 세포" 는 적합한 환경 조건 하에서 간세포로 증식 및 더욱 분화될 수 있는 세포이다. 상기 세포는 때때로 타원 세포, 담관 상피 세포 또는 추가적 간세포 전구세포와 같은 기타 유형의 자손을 생성할 수 있는 능력을 가질 수 있다.

"간세포 분화 제제" 및 "간세포 성숙 인자" 는 본 발명의 분화된 세포를 제조 및 유지하는데 사용될 수 있는 화합물의 집합을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용되는 상이한 의미를 갖는 2 가지 용어이다. 상기 제제는 후술되는 부분에서 더욱 설명 및 예시된다. 용어들은 작용의 특정 방식 또는 시점을 의미하는 것이 아니며, 그러한 제한은 추측되어서도 안된다. "간세포 증식 인자" 는 간세포 및/또는 간세포 전구 세포의 증식을 촉진하는 생물학적 또는 합성 화합물 (펩티드, 올리고당 등) 이다.

원형 "영장류 만능 줄기 세포" (pPS 세포) 는 수정 후 임의 시점에서 전배아, 배아 또는 태아 조직으로부터 유래된 만능 세포이며, 적합한 조건 하에서 몇몇 상이한 세포 유형의 자손을 생성할 수 있는 특징을 갖는다. 본 명세서의 목적을 위해 정의된 바와 같이, pPS 세포는, 적합한 숙주 중에 기형종을 형성할 수 있는 능력 등의 표준 기술로 허용되는 시험에 따라, 3 가지 배엽: 내배엽, 중배엽 및 외배엽 모두의 유도체인 자손을 생성할 수 있다.

pPS 세포의 비제한적 예에는, [Thomson 등, Science 282:1145, 1998] 에 기재된 바와 같은 인간 배아 줄기 (hES) 세포; [Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995] 에 기재된 바와 같은 Rhesus 줄기 세포와 같은 다른 영장류로 부터의 배아 줄기 세포; 및 [Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998] 에 기재된 바와 같은 인간 배아 생식 (hEG) 세포가 있다. 기타 유형의 비악성 만능 세포도 또한 용어에 포함된다. 구체적으로, 이들이 배아 조직, 태아 조직 또는 기타 출처로부터 유래되었는지 여부와 무관하게, 완전히 만능인 (모든 3 가지 배엽의 유도체인 자손을 생성할 수 있는) 영장류 기원의 모든 세포가 포함된다.

pPS 세포 배양물은 이들이 배아 또는 성인 기원의 분화된 세포로부터 이들을 뚜렷이 구별짓는 형태를 나타내는 경우 "본질적으로 미분화된" 것으로 불린다. pPS 세포는 전형적으로 높은 핵/세포질 비, 뚜렷한 인 (nucleoli) 및 구분하기 어려운 세포 연접을 갖는 밀집 콜로니 형성을 나타내며, 당업자에게 용이하게 인식된다. 미분화된 세포의 콜로니는 분화된 주변 세포에 의해 둘러싸일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 적절한 조건 하에서 배양되는 경우 본질적으로 미분화된 콜로니가 유지되고, 미분화된 세포는 배양 세포의 계대시 증식하는 세포에서 현저한 비율을 차지한다. 상기 범주에 속하는 임의 비율의 미분화된 pPS 를 포함하는 세포군이 본 발명에서 사용될 수 있다. 본질적으로 미분화된 것으로 기재되는 세포 배양물은 전형적으로 약 20%, 40%, 60% 또는 80% 이상 (클수록 바람직함) 의 미분화된 pPS 를 포함할 것이다.

"영양 세포 (feeder cell 또는 feeder)" 란 제 2 형의 세포가 유지되고 어쩌면 증식할 수 있는 환경을 제공하기 위해, 제 2 형의 세포와 공동 배양되는 한 유형의 세포를 설명하는데 사용되는 용어이다. 영양 세포는 임의로 이들이 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 올 수 있다. 예를 들어, 특정 pPS 세포는 마우스 배아 섬유아세포 (일차 배양 또는 텔로머화주로부터) 또는 인간 섬유아세포 유사 또는 간엽 세포 (hES 세포로부터 분화 및 선택될 수 있는 것) 로 지지될 수 있다. 전형적으로 (반드시는 아님), 영양 세포는 이들이 지지하는 세포의 과다성장을 예방하기 위해 조사되거나 항분열제, 예컨대 미토마이신 C 로 처리되어 불활성화된다.

pPS 세포군은, 세포가 새로운 영양 세포를 첨가하지 않고 새로운 배양 환경으로 계대되었다면 영양 세포가 "본질적으로 없는" 것으로 불린다. 영양 세포를 포함하는 이전 배양물이 계대를 위한 pPS 원으로 사용된다면, 계대에 생존하는 일부 영양 세포가 있을 것이 인식된다. 예를 들어, hES 세포는 종종 거의 콘플루언트한 ~375,000 개의 일차 조사된 배아 섬유아세포 표면 상의 9.6 ㎠ 웰 중에서 배양된다. 다음 계대시, 아마 150,000 개의 영양 세포가 여전히 살아있고, ~1 내지 1.5 백만개의 수로 증식한 hES 와 함께 분할 계대될 것이다. 1:6 분할 후, hES 세포는 일반적으로 증식을 재개하지만, 섬유아세포는 성장하지 않고 오직 작은 비율만이 배양 ~6 일의 말기에 살아 있을 것이다. 상기 배양물은 약 5%, 1% 및 0.2% 미만 (적을수록 바람직함) 의 영양 세포를 포함하는 조성을 가지며, 영양 세포가 "본질적으로 없다".

"성장 환경" 이란 해당 세포가 시험관 내에서 증식할 환경이다. 환경의 특색에는 세포가 배양되는 배지, 온도, O₂ 및 CO₂ 의 분압, 및 존재한다면, 지지 구조 (예컨대 고체 표면 상의 기질) 가 포함된다.

"영양 배지" 는 증식을 촉진하는 영양분을 함유하는 세포 배양용 배지이다. 영양 배지에는 임의의 하기물이 적절한 조합으로 함유될 수 있다: 등장성 식염수, 완충액, 아미노산, 항생제, 혈청 또는 혈청 대체제 및 외인성 첨가 인자.

"조건 배지" 는 배지 중에서 제 1 세포군을 배양한 후 배지를 회수하여 제조된다. 이어서 조건 배지는 (세포에 의해 배지 중에 분비된 임의물을 가짐) 제 2 세포군의 성장을 지지하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "항체" 라는 용어는 다클론성 및 단클론성 항체를 둘 다 말한다. 용어의 범위에는 온전한 면역글로불린 분자 뿐만 아니라, 당분야에 공지된 기법으로 제조될 수 있고 목적하는 항체 결합 특이성을 보유하는 면역글로불린 분자의 단편 및 유도체 (예컨대 단일쇄 Fv 구조체, 디아바디 (diabody) 및 융합 구조체) 도 신중히 포함된다.

"제한된 개발 계통 세포" 는 전형적으로 pPS 세포의 분화에 의해 배아 조직에서 유래되는 세포이다. 상기 세포는 증식할 수 있고 몇몇 상이한 세포 유형으로 분화될 수 있지만, 이들 자손의 표현형 범위가 제한된다. 예에는 하기가 포함된다: 혈액 세포 유형에 만능인 조혈 세포; 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte) 로 진행되는 아교세포 (glial cell) 전구세포를 생성할 수 있는 신경 전구세포; 다양한 유형의 신경으로 진행되는 신경 제한 세포; 및 간세포와 때때로 다른 간 세포, 예컨대 담관 상피에 대해 만능인 간세포 전구세포.

일반 기법

본 발명의 실시예 유용한 일반 기법의 상술을 위해, 실시자는 세포 생물학, 조직 배양 및 발생학의 표준 교과서 및 개론을 참고할 수 있다. 하기가 포함된다: [Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E.J. Robertson 편저, IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P.M. Wasserman 등 편저, Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P.D. Rathjen 등, Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998)]. 간세포 계통의 세포에 관련된 일반 정보 및 방법론은 [Liver Stem Cells (S. Sell & Z. llic, R.G. Landes Co., 1997), Stem cell biology...(L.M. Reid, Curr. Opinion Cell Biol. 2:121, 1990) 및 Liver Stem Cells (J.W. Grisham, pp 232-282, Stem Cells, Academic Press, 1997)] 에서 찾을 수 있다. 약학 연구에서 간세포 유사 세포의 용도는 [In vitro Methods in Pharmaceutical Research (Academic Press, 1997)] 에 기재되어 있다.

분자 유전학 및 유전 공학의 방법은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Sambrook 등, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait 편저, 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney 편저, 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) 시리즈: Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos 편저, 1987); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (F.M. Ausubel 등 편저, 1987 & 1995); 및 Recombinant DNA Methodology II (R. Wu 편저, Academic Press 1995)] 에 기재되어 있다. 본 명세서에 언급되는 유전 조작을 위 한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech 및 Sigma Chemical Co. 와 같은 상업적 공급자에서 시판된다.

항체 생성, 정제 및 변형에 사용되는 일반 기법, 및 면역조직화학을 포함하는 면역분석법의 고안 및 수행은 [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. BlackWell 편저); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan 등 편저, 1991); 및 R. Masseyeff, W.H. Albert 및 N.A. Staines 편저, Methods of Immunological Analysis (Weinheim: VCH Verlags GmbH, 1993)] 를 참고한다.

배지 및 영양 세포

pPS 세포의 단리 및 증식용 배지는 수득되는 세포가 목적하는 특징을 갖고, 더 증식될 수 있는 한 임의의 여러 상이한 조성을 가질 수 있다. 적합한 출처는 하기와 같다: 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Gibco #11965-092; 녹아웃 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), Gibco #10829-018; 200mM L-글루타민, Gibco # 15039-027; 불필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; β-머캅토에탄올, Sigma #M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), Gibco #13256-029. 대표적 혈청 함유 ES 배지는 80% DMEM (전형적으로 KO DMEM), 열로 불활성화되지 않은 20% 의 규명된 (defined) 소 태아 혈청 (FBS), 1% 불필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캅토에탄올로 제조된다. 무혈청 ES 배지는 80% KO DMEM, 20% 혈청 대체제, 1% 불필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캅토에탄올로 제조된다. 모든 혈청 대체제가 작용하는 것은 아니고, 효과적인 혈청 대체제는 Gibco #10828-028 이다. 만능 줄기 세포의 증식에서 무혈청 배지에 대한 정보는 국제 특허 공보 WO 97/47734 (Pederson, U. California) 및 WO 98/30679 (Price 등, Life Technologies) 에 출판되어 있다. 배지는 여과하여 2 주 미만 동안 4℃ 에서 보관한다. 사용 직전에 인간 bFGF 를 4 ng/mL 의 최종 농도로 첨가한다 (Bodnar 등, Geron Corporation, 국제 특허 공보 WO 99/20741).

pPS 세포는 전형적으로, pPS 세포를 다양한 방식으로, 예컨대 pPS 세포 생존 또는 증식을 촉진하거나 분화를 억제하는 가용성 인자의 생성과 같은 방식으로 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 영양 세포는 전형적으로, 종종 배아 또는 태아 조직에서 유래되는 섬유아세포 유형의 세포이다. 자주 사용되는 영양세포 섬유아세포의 출처는 마우스 배아이다. 영양 세포는 거의 콘플루언트하게 플레이팅되고, 증식을 방지하게 위해 조사되며, pPS 세포 배양을 지지하기 위해 사용된다.

영양세포 상의 pPS 세포 배양의 예에서, 마우스 배아 섬유아세포 (mEF) 는 비근교계 CF1 마우스 (SASCO 에서 수득됨) 또는 기타 적합한 품종에서 수득된다. 임신 13 일째 마우스의 복부를 70% 에탄올로 문질러, 탈락막 (decidua) 을 인산염 완충 식염수 (PBS) 중에 제거한다. 배아를 얻어서; 태반, 막 및 연질 조직을 제거하고; 시체를 PBS 중에서 2 회 세척한다. 이어서, 이들을 2 mL 트립신/EDTA 를 포함하는 신선한 10 cm 배양 디쉬로 옮겨서 미세하게 절단한다. 37℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션 후, 10% 소 태아 혈청 (FBS) 을 함유하는 5 mL DMEM 으로 트립신을 불활성화시키고, 혼합물을 15 mL 코니칼 튜브로 옮겨 분리하였다. 파편을 2 분 동안 침전시키고, 상청액을 최종 부피 10 mL 로 만들어 10 cm 조직 배양 플레이트 또 는 T75 플라스크 상에 플레이팅한다. 플라스크를 24 시간 동안 교란없이 인큐베이션한 후, 배지를 교체한다. 플라스크가 콘플루언트해지면 (~ 1~2 일), 세포를 새로운 플라스크 내로 1:2 로 분할한다.

영양 세포는 90% DMEM (Gibco #11965-092), 10% FBS (Hyclone #30071-03) 및 2mM 글루타민을 함유하는 mEF 배지 중에서 증식된다. mEF 는 T150 플라스크 (Corning #430825) 중에서 증식되며, 매 2 일마다 트립신으로 세포를 1:2 로 분할하여 세포가 서브콘플루언트하게 유지하고, 필요하다면 임의로 냉동한다. 영양 세포층을 제조하기 위해, 증식을 억제하지만 hES 세포를 지지하기 위해 중요한 인자의 합성은 허용하는 선량 (~4000 라드 감마선 조사) 으로 세포를 조사한다. 6 웰 배양 프레이트 (예컨대 Falcon #304) 를 웰 당 0.5% 젤라틴 1 mL 으로 37℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 코팅하고, 웰 당 375,000 개의 조사된 mEF 를 플레이팅한다. 영양 세포층은 플레이팅 5 시간 내지 1 주일 후 사용한다. 배지는 pPS 세포를 접종하기 직전에 신선한 hES 배지로 교체한다.

영장류 만능 줄기 (pPS) 세포의 제조

배아 줄기 세포는 영장류 종 멤버의 포배로부터 단리될 수 있다 (Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아 줄기 (hES) 세포는 Thomson 등이 기재한 기법을 사용하여 인간 포배 세포로부터 제조될 수 있다 (미국 특허 5,843,780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998).

인간 포배를 수득하기 위해서는, 인간 생체 내의 착상 전 배아 또는 시험관 내 수정 (IVF) 배아를 사용하거나, 1 세포 인간 배아를 포배 단계로 증식시킬 수 있다 (Bongso 등, Hum Reprod 4:706, 1989). 간단하게, 인간 배아를 G1.2 및 G2.2 배지 중에서 포배기까지 배양한다 (Gardner 등, Fertil. Steril. 69:84, 1998). 발생한 포배를 ES 세포 단리를 위해 선택한다. 프로나아제 (Sigma) 에 짧게 노출시켜 포배로부터 투명층을 제거한다. 포배를 1:50 배 희석한 토끼 항-인간 비장 세포 항혈청 중에 30 분 동안 노출시킨 후, 5 분 동안 DMEM 중에서 3 회 세척하고, 1:5 배 희석한 기니아픽 보체 (Gibco) 에 3 분 동안 노출시켜, 내부 세포 덩어리를 면역수술로 단리한다 (Solter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975 를 참조). DMEM 중에서 2 회 더 세척한 후, 용해된 영양아층 (trophectoderm) 세포를 손상되지 않은 내부 세포 덩어리 (ICM) 로부터 부드러운 피펫팅으로 제거하여, mEF 상에 ICM 을 플레이팅한다.

9 내지 15 일 후, 내부 세포 덩어리에서 유래된 증식물을 1 mM EDTA 가 들어있고 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 (PBS) 에 노출시키거나, 디스파아제 또는 트립신에 노출시키거나 또는 마이크로피펫으로 기계적으로 분리시켜 응괴로 분리한 후, 신선한 배지 중에서 mEF 상에 재플레이팅한다. 분리된 세포를 신선한 ES 배지 중 배아 영양세포 상에 재플레이팅하고, 콜로니 형성에 대해 관찰한다. 미분화된 형태를 나타내는 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선택하여, 기계적으로 응괴로 분리하고 재플레이팅한다. ES 유사 형태는 높은 핵 대 세포질 비 및 뚜렷한 인을 갖는 밀집 콜로니를 특징으로 한다.

인간 배아 생식 (hEG) 세포는 최종 생리 기간의 약 8 - 11 주 후 채취한 인 간 태아 물질 중에 존재하는 원시 생식 세포로부터 제조될 수 있다. 적합한 제조 방법은 [Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998] 및 국제 특허 출원 WO 98/43679 에 기재되어 있다.

간단하게, 생식 융기를 등장성 완충액으로 헹군 후, 0.05% 트립신 - 0.53 mM 소듐 EDTA 용액 (BRL) 0.1 mL 중에 놓고 < 1㎣ 의 큰 덩어리로 절단한다. 이어서, 조직을 100 ㎕ 피펫 팁을 통해 피펫팅하여 세포를 더욱 분리시킨다. 37℃ 에서 대략 5 분 동안 인큐베이션 후, 대략 3.5 mL 의 EG 성장 배지를 첨가한다. EG 성장 배지는 DMEM, 4500 mg/L D-글루코오스, 2200 mg/L mM 중탄산나트륨; 15% ES 검정된 소 태아 혈청 (BRL); 2 mM 글루타민 (BRL); 1mM 소듐 피루베이트 (BRL); 1000 - 2000 U/mL 인간 재조합 백혈병 억제 인자 (LIF, Genzyme); 1-2 ng/ml 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, Genzyme); 및 10μM 포스콜린 (10% DMSO 중) 이다.

LIF, bFGF 또는 포스콜린이 없는 변형된 EG 성장 배지 중에서 3 일 동안 배양된 후 5000 라드 γ선-조사된 서브콘플루언트한 영양 세포층으로 미리 96 웰 조직 배양 플레이트를 제조한다. 적합한 영양세포는 STO 세포 (ATCC 접근 번호 CRL 1503) 이다. 일차 생식 세포 현탁액의 ~ 0.2 mL 을 각각의 제조된 웰에 첨가한다. 각 웰을 조사된 STO 마우스 섬유아세포로 미리 제조된 24-웰 배양 디쉬의 1 웰로 옮기는 제 1 계대를 EG 성장 배지 중에서 7 - 10 일 후에 수행한다.

미분화된 pPS 세포는 높은 핵/세포질 비, 뚜렷한 인 및 구분하기 어려운 세포 연접을 갖는 밀집 콜로니 형성을 나타내는 특징적 형태적 특색을 갖는다. 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변형되지 않은 "정상 핵형" 을 갖는 세포 (정배수체의 세포를 의미함) 를 수득하는 것이 바람직하다. 상기 특징은 후속으로 유도되고 증식되는 임의의 분화된 세포에서도 또한 바람직하다.

특징적인 배아 항원은 SSEA 1, SSEA-3 및 SSEA-4 (Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda MD) 및 TRA-1-60 및 TRA-1-81 (Andrews 등, Robertson E 편저. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, IRL Press, 207-246, 1987) 에 대한 항체를 사용하여, 면역조직화학 또는 유세포분석 (flow cytometry) 에 의해 동정될 수 있다. SSEA-1 마커는 전형적으로 hES 세포 상에 거의 없거나 없지만, hEG 세포 상에는 존재한다. 시험관 내 세포의 분화는 일반적으로 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81 의 소실을 일으키고, SSEA-1 의 발현은 증가된다. pPS 세포는 또한 기질로서 Vector Red (Vector Laboratories, Burlingame CA) 를 사용하여 고정된 세포를 발색시키고 로다민 필터 시스템을 이용하여 산물의 적색 형광도를 측정하여 검출될 수 있는 알칼린 포스파타아제 활성의 존재를 특징으로 한다.

배아 줄기 세포의 만능성은 대략 0.5-10 ×10⁶ 세포를 8-12 주령 웅성 SCID 마우스의 뒷다리 근육에 주사하여 동정될 수 있다. 발생 8-16 주에 생성 종양을 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고 파라핀에 함몰시킨 후 조직학적으로 검사할 수 있다. 연골, 민무늬근 및 가로무늬근 (중배엽); 모낭을 갖는 층상 편평 상피, 공동 (ventricular) 층, 중간층 및 외투 (mantle) 층을 갖는 신경관 (외배엽); 섬모성 원주형 상피 및 융모가 깔린 흡수성 장세포 및 점액 분비 배상 세포 (내배엽) 와 같은, 각각의 3 가지 배엽에서 1 가지 이상의 세포 유형을 나타내는 기형종이 발생한다.

pPS 세포의 증식

배아 줄기 세포는 영양 배지 중 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. ES 세포는 일상적으로 짧은 트립신 처리, 둘베코 PBS (칼슘 또는 마그네슘이 없고 2 mM EDTA 함유) 로의 노출, 디스파아제 또는 제 IV 형 콜라게나아제 (1 mg/ml; Gibco) 로의 노출 또는 마이크로피펫에 의한 개별 콜로니의 선택에 의해 매 1-2 주 마다 분할된다. 약 50 내지 100 개 세포의 응괴 크기가 최적이다. 이와는 달리, 프로테아제와 함께 인큐베이션 후 배양물을 긁어내어 작은 응괴로 분리하고, 1:3 내지 1:30 의 분할 비로 신선한 영양 세포 상에 재접종할 수 있다.

배아 생식 세포는 전형적으로 1 내지 4 회 계대로 7 - 30 일 동안, EG 세포와 일치하는 세포 형태가 관찰될 때까지, 매일 성장 배지를 교체하여 영양 세포 상에서 배양될 수 있다. 세포는 여러 달의 배양 동안 이들의 만능성을 유지한다.

국제 특허 출원 WO 99/20741 에는 영양 배지와 세포외 매트릭스 상에서, 영양 세포 없이 만능 줄기 세포를 성장시키는 방법 및 물질이 기재되어 있다. 용해된 섬유아세포로부터 제조된 섬유아세포 매트릭스 또는 다수의 출처로부터 단리된 매트릭스 성분이 적합하다. 영양 배지에는 소듐 피루베이트, 뉴클레오시드 및 1 가지 이상의 내인성 첨가 성장 인자, 예컨대 bFGF 가 함유될 수 있고, 섬유아세포와의 배양으로 조건화 (conditioned) 될 수 있다.

영양 세포의 부재 하에서, pPS 의 증식에 적합한 기질에는 세포외 매트릭스 성분, 예컨대 Matrigel

(Becton Dickenson) 또는 라미닌이 포함된다. Matrigel

은 실온에서 겔화되어 복원된 기저막을 형성하는, 엥겔브레스-홀름-스왐 (Engelbreth-Holm-Swarm) 종양 세포로부터의 세포외 매트릭스의 가용성 제조물이다. 막 중에 존재하는 성장 인자 (예컨대 IGF-1, TGF 및 PDGF) 의 효과를 배제하기 위해, 성장 인자 감소 Matrigel

을 사용할 수 있다. 매트릭스의 결정적인 성분은 모든 성분의 인공 혼합물을 제조하고, 순차적으로 성분들을 제거하여 효과를 측정함으로써 동정될 수 있다. 세포외 매트릭스의 기타 혼합물도 또한 적합할 수 있다. 예에는 다양한 조합의 콜라겐, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 술페이트 등이 포함된다.

이어서, 만능 세포를 세포 생존, 증식 및 목적 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 중에, 적합한 분포의 기질 상에 플레이팅한다. 모든 상기 특징은 접종 분포에 주의를 기울여 얻어진다. 분포의 한 가지 특색은 플레이팅 밀도이다. 약 15,500 세포/㎠ 이상의 플레이팅 밀도가 생존을 촉진하고 분화를 제한하는 것으로 나타났다. 전형적으로, 약 90,000/㎠ 및 약 170,000/㎠ 의 플레이팅 밀도가 사용된다.

또다른 중요한 특색은 세포의 분산이다. 마우스 줄기 세포의 증식에는 단일 세포 현탁액으로의 세포 분산이 관여한다 (Robinson, Meth. Mol. Biol. 75:173, 1997, page 177). 대조적으로, 영양세포 부재 하의 pPS 의 계대는 pPS 세포를 작 은 덩어리로 제조하여 얻어진다. 전형적으로, 세포가 완전히 분산되기 전에 효소 분해를 중단한다 (즉, 콜라게나아제 IV 로 ~5 분). 이어서 플레이트를 피펫으로 부드럽게 긁어내고, 세포가 약 10 - 2000 개 세포 크기의 인접 세포 응괴로 현탁될 때까지 피펫으로 분쇄한다. 이어서 응괴를 더 분리하지 않고 기질 상에 직접 플레이팅한다.

또한 신선한 영양 세포의 부재 하에 플레이팅된 pPS 세포는 영양 배지 중에 배양되어 얻어짐이 발견되었다. 배지는 일반적으로, 등장성 완충액, 필수 미네랄 및 혈청 또는 일종의 혈청 대체제를 포함하는, 세포 생존을 증강시키는 통상적 성분을 함유할 것이다. 또한, 영양 세포에 의해 제공되는 일부 요소를 공급하도록 조건화된 배지가 유용하다. 조건화 배지는 조사된 일차 마우스 배아 섬유아세포 (또는 또다른 적합한 세포 제조물) 를 혈청 대체 배지, 예컨대 4 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 를 함유하는 20% 혈청 대체제가 포함된 KO DMEM 중에서 9.6㎠ 웰 당 5 ×10⁵ 세포의 밀도로 배양하여 제조될 수 있다. 배양 상청액은 37℃ 에서 1 일 후 회수되어, 전형적으로 pPS 세포 배양을 돕는 추가적 성장 인자로 보충된다. hES 에 있어서, bFGF 와 같은 성장 인자가 종종 사용된다. hEG 에 있어서, 배양 배지는 bFGF 와 같은 성장 인자, gp130 유도제, 예컨대 LIF 또는 옹코스타틴 (Oncostatin)-M, 및 때때로 사이클릭 AMP 수준을 상승시키는 인자, 예컨대 포스콜린으로 보충될 수 있다. 다양한 유형의 pPS 세포는 배지 중 기타 인자로부터 얻어질 수 있다.

몇몇 상기 기법으로 증식되는 세포군은 종종 수 개월에 걸친 다회 계대를 통해 본질적으로 미분화되어 남아있다. 특정 계대 동안, 콜로니 주변의 일부 세포가 분화될 수 있음이 인지된다 (특히 단일 세포로 재플레이팅되거나 커다란 덩어리가 형성되는 경우). 그러나, 배양물은 전형적으로 배양 기간 동안 특징적인 형태를 갖는 더 많은 비율의 미분화된 세포를 재구성한다. 최적으로는, 증식 세포가 약 20 - 40 시간 이하의 배가 시간을 가질 것이다.

pPS 세포 분화용 물질 및 절차

본 발명의 분화된 세포는 간세포 분화 제제의 존재 하에 pPS 세포를 배양하여 제조될 수 있다. 임의로는, 세포는 또한 이들의 분화 제제와 배양될 때와 동시적으로 또는 순차적으로, 간세포 성숙 인자의 존재 하에 배양된다. 생성 세포는 후술되는 부분에서 설명되는 바와 같이, 간세포 계통의 표현형 특징을 갖는다.

본 발명의 특정 구현예에서, pPS 의 분화는 먼저 배상체의 형성으로 개시된다. 배상체 배양의 일반 원리는 [O'Shea, Anat. Rec. (New Anat.) 257:323, 1999] 에 보고되어 있다. pPS 세포는 응집물이 형성되는 방식으로 배양되며, 여러 선택이 가능하다: 예를 들어, 공여 pPS 세포 배양물의 과다 증식에 의해, 또는 저접착 특성을 갖는 기질, 예컨대 메틸 세룰로오스를 갖는 배양 용기 중 pPS 의 배양에 의해. 배상체는 당업자에게 용이하게 인지될 수 있고, 용이하게 회수 및 새로운 배양 환경으로 전달될 수 있다. 배상체는 전형적으로 내배엽 외부, 및 중배엽과 외배엽 내부를 가질 것이다.

하기 실시예 부분에서 예시되듯이, 배상체는 또한 현탁 배양 중에 제조될 수 있다. pPS 세포는 짧은 콜라게나아제 분해로 회수되어 덩어리로 분리되고, 비부착 세포 배양 플레이트에 플레이팅된다. 응집물은 수일 동안 배양된 후 적합한 기간, 전형적으로 4-8 일 후 회수된다. 이어서, 응집물을 간세포 계통 세포에 적합한 기질 상에 플레이팅한다. 이전에 보다 자세히 상술된 Matrigel

(Becton Dickenson), 라미닌, 다양한 유형의 콜라겐 및 젤라틴이 대표적이다. 기타 인공 매트릭스 성분 및 조합물이 사용될 수 있다. 매트릭스는 또한 먼저 매트릭스 생성 세포주 (예컨대 섬유아 세포, 상피 세포 또는 간엽 줄기 세포주) 를 배양한 후 용해시키고, 매트릭스가 용기 표면에 부착되어 남도록 하는 방식으로 세포 파편을 세척 제거하여 제조될 수 있다. 배상체로부터 세포의 분산은 통상 필요한 것은 아니다; 배상체를 직접 매트릭스 상에 플레이팅할 수 있다. 이어서 세포를 간세포 분화 제제가 함유된 배지 중에 배양한다.

본 발명의 다른 구현예에서, pPS 세포는 상당수의 배상체를 형성하지 않으면서 분화 제제와 조합된다 - 즉, 표준 pPS 세포 배양물이 콘플루언트에 도달할 때 또는 그 전에, 그러나 과다성장을 시작하기 전에 제제를 첨가한다. 이는 본 명세서에서 직접 분화 방법으로 불린다. 일반적으로, pPS 세포가 무영양세포 배양액 중에 있는 것이 바람직하다 (요구되는 것은 아님). pPS 세포는 회수되어 새로운 기질 상에 플레이팅될 수 있고, 분화 제제를 함유하는 배지를 첨가할 수 있다. 이와는 달리, pPS 세포가 이미 분화된 세포의 배양에 적합한 매트릭스 상에서 유지되는 경우, 재플레이팅하지 않고 분화 제제를 직접 pPS 배양물에 첨가할 수 있다. 배양물은 콘플루언스가 도달하는지 여부를 매일 검사한다. 간세포 계통 세포의 수율은, 세포가 콘플루언스에 도달할 때 분화 제제가 첨가되는 경우가 ~60-80% 콘플루언스에서와 비교하여 3 배 더 높을 수 있는 것으로 나타났다.

간세포 계통으로의 분화는 생체 내 간세포 환경에 전형적인 기질을 제공하여 더욱 촉진된다. 예를 들어, Matrigel

(Becton Dickenson), 라미닌 또는 용해 세포로부터 수득되는 매트릭스와 같은 특정 세포외 매트릭스 성분은 적합한 표면을 제공한다. 상기 세포의 분화에 적합한 또다른 기질은 젤라틴이다. 세포는 세포를 유지하기에 적절한 완충액, 이온 강도 및 영양분을 함유하는 영양 배지 중에서 배양된다 (일반적으로 WO 99/20741 참조). 특정 세포용 배지의 최적화는 숙련자의 범위 내에 있으며, 본 명세서의 다른 곳에서 예시된다.

세포는 경험적으로 결정될 수 있는 바와 같은 적합한 기질 및 간세포 분화 제제를 함유하는 환경 중에서, 다른 세포로부터 분화된 세포가 농축되기 충분한 시간 동안 유지된다. 예를 들어 분화 제제, 예컨대 n-부티레이트와의 배양 제 1 일에는 기질로부터 약 90% 의 배양 배상체 유도 세포가 배지 중에 방출된다. 이어서 상기 세포는 배지가 24 시간 후 교체될 때 제거되고, 생존 세포는 n-부티레이트를 함유하는 신선한 배지 중에 배양된다.

충분한 배양 시기 후, 잔여 세포는 간세포 및/또는 간세포 전구 세포의 특징을 갖는 것들로 상당히 농축된다. 간세포 분화 제제 n-부티레이트에 있어서, 배양 기간은 전형적으로 약 4-8 일, 종종 약 6 일이다. 본 발명의 일부 분화 제제의 존재 하에서의 연장된 배양은 간세포 계통 세포의 수율을 최적화하는데 최적이지 않을 수 있음을 독자는 주의해야 한다. 기타 분화 제제, 예컨대 n-부티레이트는 연 장 관점에서 관용된다. 상기 상황 하에서는, 분화된 세포의 전체 표현형을 유지하도록 배지 중에 제제를 유지하는 것이 유리할 수 있다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명의 가설은 간세포 분화 제제, 예컨대 n-부티레이트가 2 가지 효과를 가질 수 있다는 것이다: 첫째로, pPS 세포의 간세포 계통으로의 분화 촉진, 및 둘째로, 배양이 계속되는 동안 상기 계통의 세포를 생존에 대해 우선적으로 선택.

적합한 분화 제제

n-부티레이트는 후술되는 실시예에 예시되는 모델인 간세포 분화 제제이다. 당업자는 유사한 효과를 갖는 다수의 n-부티레이트 동족체를 쉽게 식별할 것이며, 본 발명의 실시에 대체제로서 사용할 수 있음이 쉽게 인지될 것이다.

동족체의 한 군은 n-부티레이트와 유사한 구조적 및 물리화학적 특성을 갖는 다른 탄화수소로 구성된다. 상기 동족체의 일부는 분지형, 선형 또는 고리형인 3-10 개 탄소수의 산성 탄화수소, 및 카르복실레이트, 술포네이트, 포스포네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 짝염기, 및 기타 양성자 공여체이다. 적합한 예에는 n-부티르산, 이소부티르산, 2-부텐산, 3-부텐산, 프로판산, 프로펜산, 펜탄산, 펜텐산, 포화 또는 불포화의 기타 단쇄 지방산, 아미노 부티르산, 페닐 부티르산, 페닐 프로판산, 페닐 아세트산, 페녹시아세트산, 신남산 및 디메틸부티레이트가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 화합물과 등전자성인 탄화수소 술포네이트 또는 포스포네이트, 특히 n-부티레이트와 등전자성인 프로판술폰산 및 프로판포스폰산이 해당된다.

상기 화합물의 명명에 있어서, 달리 명백히 언급되지 않는 한 모든 입체이성 질체가 포함되는 것으로 이해된다. 산성기를 갖는 화합물은 산성 형태, 또는 임의의 적합한 반대 짝이온과 함께 짝염기로서 제공될 수 있다. 소듐 n-부티레이트의 사용은 이것이 사용되는 환경의 이온 강도를 증가시키므로, 필요하다면 염을 첨가하여 이온 강도의 변화를 제공함으로써 다른 제제의 작용이 증가될 수 있다.

또다른 동족체군은 다른 분자, 예컨대 아미노산, 단당류와의 콘쥬게이트 및 기타 허용가능한 콘쥬게이트 쌍을 포함하는 부티레이트 및 부티레이트 동족체의 유도체이다. 다수의 상기 유도체들은 생체 내에서 또는 원위치에서, 적합한 전환 효소, 예를 들어 프로테아제 또는 글리코시다아제의 존재에 의해 활성형으로 전환되는 부티레이트 전구약물로서 개발되었다. 예로써, 상기 군의 멤버에는 아르기닌 부티레이트, 라이신 부티레이트, 기타 부티레이트 아미드, 글루코오스 펜타부티레이트, 트리부티린, 디아세톤 글루코오스 부티레이트, 기타 부티레이트 당류, 아미노부티르산, 이소부티르아미드, 피발로일옥시메틸 부티레이트, 1-(2-히드록시에틸)4-)1-옥소부틸)-피페라진 부티레이트, 부티레이트의 기타 피페라진 유도체 및 피라세탐 (2-옥소-1-피롤리딘 아세트아미드, Notropyl^TM, 감마 아미노 부티레이트의 고리형 유도체가 포함된다.

동족체의 다른 군은 히스톤 디아세틸라아제의 억제제이다. 비제한적 예에는 트리코스타틴 A, 5-아자시티딘, 트라폭신 A, 옥삼플라틴, FR901228, 시스플라틴 및 MS-27-275 가 포함된다. 독자는 또한 미국 특허 5,922,837 의 안티프로토소알 고리형 테트라펩티드; 미국 특허 5,925,659 의 항균제; WO 99/23885 의 보조억제물질 (corepressor) 억제제; 및 WO 99/11659 의 고리형 펩티드 유도체를 참고할 수 있다. 히스톤 디아세틸라아제 억제제로 화합물을 동정하는 방법은, 호르몬 수용체 화합물의 탈억제에 의해 동정될 수 있다 (WO 98/48825).

n-부티레이트의 간세포 분화 활성은 일부 이상이 히스톤 디아세틸라아제에 대한 억제능에 의존할 수 있다. 히스톤 디아세틸라아제 활성의 분석은 다른 분화 제제에 대한 후보물을 선택하기 위한 예비 스크린으로 사용될 수 있다. 다수의 상기 분석이 사용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 5,922,837 (col. 3 ff) 에는 3 중수소화 N-데스메톡시아피시딘 및 디아세틸라아제 활성원으로서 기생충 또는 닭의 간 S100 용액을 사용하는 분석이 기재되어 있다. 후보 화합물을 반응 혼합물에 첨가하고, 필터 방법을 이용하여 3 중수소 방출을 측정한다. Nare 등 (Anal. Biochem. 267:390, 1999) 은 3 중수소로 아세틸화되고 근접 3 중수소의 양에 비례하여 신틸레이션하는 SPA 비드에 결합된 라이신 ε-아미노기를 갖는 히스톤 H4 의 펩티드를 사용하는 신틸레이션 근접 분석을 개발하였다. 히스톤 디아세틸라아제 활성 (HeLa 세포 핵의 추출물로부터 수득됨) 은 표지된 아세틸기를 방출시켜 신틸레이션을 감소시키며, 디아세틸라아제 억제제의 존재는 신틸레이션을 유지시킨다. Hoffman 등 (Nucl. Acids Res. 27:2057, 1999) 은 히스톤 탈아세틸라아제 활성에 대해 동위원소를 사용하지 않는 분석을 기재하고 있다. Ω-아세틸화 라이신의 아미노쿠마린 유도체인 형광 기질이 개발되었다. 상기물은, 히스톤 디아세틸라아제 억제제의 고효율 스크리닝을 가능케하는 나노몰 농도 범위의 기질 정량을 허용한다.

적합한 분화 제제의 최종 시험은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 간세포 계 통 세포가 농축된 배양물로의 pPS 세포 배양물을 전환시킬 수 있는 능력이다. 상기 기재된 하나 이상의 범주에 따라 임의로 예비 스크리닝된 후보 화합물을, n-부티레이트에 효과적인 것으로 공지된 바와 유사한 방식으로 pPS 세포 또는 배상체의 배양물에 첨가한다. pPS 세포의 간세포 계통으로의 분화 촉진, 간모세포 유형 세포의 성장을 우선적으로 허용 또는 다른 계통의 세포를 우선적으로 제거하는 중 어느 하나 이상을 할 수 있는 임의 화합물이 본 발명에서 구현되는 특정한 분화된 세포군의 유도에 유용할 것이다.

상기 기준에 따라, 간세포 분화 제제로서 작용하는 특정 화합물 또는 화합물 조합의 능력에는, 화합물의 존재 하에 실질적으로 미분화된 pPS 세포군 또는 분화된 pPS 세포의 혼합 세포군 (예컨대, 배상체로부터 또는 pPS 배양물의 과다성장에 의해 수득되는 것들) 을 배양한 후 세포 형태, 마커 발현, 효소 활성, 증식능 또는 간세포 계통 세포에 관련된 기타 해당 특색에 대한 효과를 측정하는 것이 포함된다. 최적 결과를 위해, 여러 농도의 시험 화합물을 평가한다. 적합한 기준 농도는 효과적인 부티레이트 농도와 동일몰 또는 등장성일 수 있거나, 또다른 히스톤 디아세틸라아제와 동등한 억제능을 갖는다. 이어서 화합물을 기준 농도의 약 1/10 내지 10 배 범위에 걸쳐 시험하여, 목적하는 간세포 분화능을 갖는지 여부를 결정할 수 있다.

pPS 세포 또는 배상체 세포의 배양물로부터 40% 이상의 세포가 3 가지 이상의 간모세포 또는 간세포의 특징을 갖는 세포군을 생성할 수 있는 경우, 화합물은 분화 제제로서 효과적인 것으로 간주될 것이다. 일부 경우, 더 많은 수의 간세포 특징을 갖는 보다 균일한 세포군을 생성하는 제제가 유리하다. 덜 균일하거나 덜 성숙한 간세포군을 생성하는 제제도 또한 세포가 또다른 바람직한 특색 (예컨대, 조작에 대한 인내성 또는 증식능) 을 보유하는 경우 유리할 수 있음이 인지된다. 하기에 설명되는 바와 같이 상기 세포군은 분류 또는 흡착 기법에 의해 목적하는 세포 유형이 더 농축될 수 있다.

성숙 인자의 최적 사용

필요하다면, 간세포 성숙 인자로 작용하는 개별 화합물 또는 화합물의 혼합물을 사용하여, 간세포 분화 제제를 사용하는 분화된 세포의 농축을 보충할 수 있다. 상기 제제는 분화 제제에 의해 촉진되는 표현형 변화를 증강시키거나, 더욱 성숙한 세포로 분화 기전을 진전시키거나, 간세포 계통의 세포를 선택하는 것을 도울 수 있거나 (예를 들어 이들의 생존을 우선적으로 지지함으로써), 또는 목적하는 표현형을 갖는 세포의 보다 신속한 증식을 촉진시킬 수 있다.

간세포 성숙 인자의 한 군으로 간세포 계통 세포의 성장을 촉진시킬 수 있는 가용성 성장 인자 (펩티드 호르몬, 시토카인, 리간드-수용체 복합체 등) 가 있다. 상기 인자에는 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, TGF-α, TGF-β, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 헤파린, 간세포 성장 인자 (HGF), 덱사메타존 존재 하의 Oncostatin M, IL-1, IL-6, IGF-I, IGF-II, HBGF-1 및 글루카곤이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.

또다른 간세포 성숙 인자 군에는 코르티코스테로이드, 특히 글루코코르티코이드가 있다. 상기 화합물은 스테로이드 또는 스테로이드 모방체로, 중간 대사, 특히 간의 글리코겐 축적 촉진 및 염증 억제에 영향을 미친다. 코르티솔로 예시되는 천연 생성 호르몬 및 합성 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타존 (미국 특허 3,007,923) 및 그 유도체, 프레드니손, 메틸프레드니손, 히드로코르티손 및 트리암시놀론 (미국 특허 2,789,118) 및 그 유도체가 포함된다.

또다른 간세포 성숙 인자군은 DMSO 와 같은 유기 용매이다. 유사한 특성을 갖는 대안물에는 디메틸아세트아미드 (DMA), 헥사메틸렌 비스아세트아미드 및 기타 폴리메틸렌 비스아세트아미드가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 군의 용매는 부분적으로 세포의 막 투과성 증가 특성에 관련된다. 또한 니코틴아미드와 같은 용질이 해당된다. 본 발명의 목적을 위해, 후보 화합물이 간세포 성숙 인자로 작용하는지 여부에 대한 시험은 경험적으로 수행된다: pPS 배양물은 모델 간세포 분화 제제, 예컨대 성장 인자 또는 DMSO (양성 대조군) 와 조합되어, 상기 기재된 간세포 분화 제제를 사용하여 간세포 계통의 세포로 분화된다. 이와 나란히, pPS 를 동일한 분화 제제 및 후보 성숙 인자를 사용하여 유사한 프로토콜을 수행한다. 이어서 생성 세포의 표현형을 비교하여, 후보 제제가 양성 대조군에서와 유사한 효과를 갖는지 여부를 결정한다.

본 발명의 특정 구현예에서, 간세포 분화 제제 및 간세포 성숙 인자는 동시적으로 또는 순차적으로 사용된다. 하나의 예에서, 새로 플레이팅된 배상체 또는 영양세포가 없는 pPS 배양물을 n-부티레이트 및 DMSO 둘 다를 함유하는 배지 중에 놓고, n-부티레이트 및 DMSO 를 함유하는 신선한 배지로 주기적으로 (즉, 매 24 시 간 마다) 배지를 교체하면서 4, 6 또는 8 일 동안, 또는 특징적 특색이 나타날 때까지 배양한다. 또다른 예에서, EB 또는 pPS 배양물을 먼저 n-부티레이트 및 DMSO 와 4, 6 또는 8 일 동안 배양한 후, 배지를 성장 인자 칵테일을 함유하는 간세포에 익숙한 배지 (아마도 n-부티레이트와의 조합) 로 교환한 후 목적하는 만큼 길게 배양 또는 분석한다.

상기 기준에 따라, 간세포 성숙 인자로서 작용하는 특정 화합물 또는 화합물의 조합의 능력에는 화합물의 존재 하에 간세포 분화 제제로 미리 처리된 세포군을 배양하거나 간세포 분화 인자로 처리된 세포 배양물 중에 화합물을 포함시키는 것이 포함된다. 이어서, 세포 형태, 마커 발현, 효소 활성, 증식능 또는 기타 관심 특색에 대한 화합물의 효과를 후보 화합물을 포함하지 않는 대조 배양물과 비교하여 결정한다. 최적 결과를 위해, 여러 농도의 시험 화합물을 평가한다. 유기 용매에 대해 적합한 기준 농도는 효과적인 DMSO 농도와 동일몰 또는 등장성일 수 있다. 성장 인자, 시토카인 및 기타 호르몬에 대해 적합한 기준 농도는 다른 시스템에서 유사한 성장 유도 또는 호르몬 활성을 갖는 것으로 공지된 농도일 수 있다. 이어서, 시험 화합물을 기준 농도의 약 1/10 내지 10 배 범위에 걸쳐 시험하여 pPS 세포의 간세포화 성숙에 대한 목적 효과를 갖는지 여부를 결정할 수 있다.

일단 목적하는 표현형의 세포가 수득되면, 세포를 임의의 목적 용도를 위해 회수할 수 있다. 본 발명의 특정한 분화된 세포군에서, 세포는 이들을 기질로부터 방출시키고 (예컨대 콜라게나아제 또는 물리적 조작에 의해) 임의로 세포에서 파편 들을 세척제거하여 간단히 회수될 수 있을 정도로 표현형이 충분히 균일하다. 필요하다면, 회수된 세포를 목적 특색에 대한 양성 선택에 의해, 또는 목적하지 않는 특색에 대한 음성 선택에 의해 더욱 조작할 수 있다. 예를 들어, 세포군을 항체 또는 콘쥬게이트 리간드와 인큐베이션한 후, 결합 세포를 분리하여 (예를 들어, 표지 분류 기법 또는 고체 표면으로의 흡착에 의해), 표면 마커 또는 수용체를 발현하는 세포를 양성적으로 또는 음성적으로 선택할 수 있다. 음성 선택은 보체의 존재 하에, 목적하지 않는 마커에 특이적인 세포용해성 항체와 세포군을 인큐베이션하여 또한 수행될 수 있다.

필요하다면, 회수된 세포를 다른 유형의 간세포 제조물의 증식에 대해 기재된 바와 같은 다른 배양 환경으로 옮길 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,030,105 및 5,576,207; 유럽 특허 출원 EP 953,633; [Angelli 등, Histochem. J. 29:205, 1997; Gomez-Lechon 등, p. 130 ff., "In vivo Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997)] 을 참조.

분화된 세포의 특징

세포는 여러 표현형 범주에 따라 특징화될 수 있다. 범주에는 발현된 세포 마커 및 효소 활성의 검출 또는 정량, 및 형태적 특색 및 세포간 신호전달의 특징분석이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 구현된 특정한 분화된 pPS 세포는 간세포에 특징적인 형태적 특색을 갖는다. 특색들은 평가에 의해 당업자에게 용이하게 식별되며, 하기 중 임의 또는 모든 것이 포함된다: 다각형 세포 모양, 2 핵 표현형, 분비 단백질의 합성을 위한 조면 소포체의 존재, 세포내 단백질 분류를 위한 골지-소포체-리소좀 복합체의 존재, 페록시솜 및 글리코겐 여포의 존재, 비교적 풍부한 미토콘드리아 및 모세 담관 공간의 생성을 일으키는 단단한 세포간 연접 형성능. 단일 세포 중에 존재하는 다수의 상기 특색은 간세포 계통 멤버인 세포와 일치된다. 세포가 간세포에 특징적인 형태학적 특색을 갖는지 여부의 확실한 결정은 분화된 pPS 세포, 성인 또는 태아 간세포 및 하나 이상의 음성 대조군 세포, 예컨대 섬유아세포 또는 RPE (망막 색소 상피) 세포를 현미경 사진으로 코딩한 후, 맹검 방식으로 현미경 사진을 평가하고 코드를 풀어서, 분화된 pPS 세포가 정확히 확인되는지 여부를 결정하여 수행될 수 있다.

본 발명의 세포는 또한 이들이 간세포 계통 세포에 특징적인 표현형 마커를 발현하는지 여부에 따라 특징화될 수 있다. 간 전구세포, 간세포 및 담즙 상피의 구별에 유용한 세포 마커를 표 1 에 나타낸다 (Sell & Zoran, p35, "Liver Stem Cells", R.G. Landes Co., TX, 1997; 및 Grisham 등, p 242, "Stem Cells", Academic Press, 1997 에서 채택됨).

간세포 분화에는 전사 인자 HNF-4α가 필요함이 보고되었다 (Li 등, Genes Dev. 14:464, 2000). HNF-4α발현에 의존하지 않는 마커에는 α₁-안티트립신, α-페토단백질, apoE, 글루코키나아제, 인슐린 성장 인자 1 및 2, IGF-1 수용체, 인슐린 수용체 및 렙틴이 포함된다. HNF-4α발현에 의존하는 마커에는 알부민, apoAI, apoAII, apoB, apoCIII, apoCII, 알돌라아제 B, 페닐알라닌 히드록실라아제, L-형 지방산 결합 단백질, 트랜스페린, 레티놀 결합 단백질 및 에리트로포이에틴 (EPO) 이 포함된다. 기타 해당 마커에는 하기 실시예 1, 2 및 6 에 예시된 것들이 포함된다.

상기 마커의 발현 수준 평가는 다른 세포와 대조하여 측정될 수 있다. 성숙한 간세포 마커에 대한 양성 대조군에는 해당 종의 성인 간세포 및 확립 간세포 세포주, 예컨대 미국 특허 5,290,684 에 보고된 간모세포종에서 유래된 HepG2 주가 포함된다. 독자는 HepG2 와 같은 영구 세포주가 대사적으로 변형되어 시토크롬 p450 과 같은 일차 간세포의 특정한 특징을 발현하지 못할 수 있음을 주의해야 한다. 일차 간세포의 배양은 또한 연장된 배양 후 일부 마커의 발현 감소를 나타낼 수 있다. 음성 대조군에는 개별 계통의 세포, 예컨대 성인 섬유아세포주 또는 망막 색소 상피 (RPE) 세포가 포함된다. 미분화된 pPS 세포는 상기 기재된 일부 마커에 대해서는 양성이지만, 하기 실시예에 예시되는 바와 같은 성숙한 간세포의 마커에 대해서는 음성이다.

본 명세서에 기재된 조직 특이적 단백질 및 올리고당 결정기는 임의의 적합한 면역학적 기법, 예컨대 세포 표면 마커에 대한 유식 면역세포화학, 세포내 또는 세포 표면 마커에 대한 면역조직화학 (예를 들어, 고정된 세포 또는 조직 단편의), 세포 추출물의 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석, 및 세포 추출물 또는 배지 내로 분비된 산물에 대한 효소 연관 면역분석을 이용하여 검출될 수 있다. 표준 면역세포화학 또는 유세포 분석에서, 임의로 세포를 고정한 후 표지를 증폭시키기 위해 표지된 2 차 항체 또는 기타 콘쥬게이트 (예컨대 비오틴-아비딘 콘쥬게이트) 를 임의로 사용하여 현저히 검출가능한 양의 항체가 항원에 결합하는 경우, 세포에 의한 항원 발현은 "항체로 검출가능한" 것으로 불린다.

조직 특이적 마커의 발현은 또한 노던 블롯 (Northern blot) 분석, 닷 블롯 혼성화 (dot-blot hybridization) 분석, 또는 표준 증폭 방법으로 서열 특이적 프라이머를 사용하는 역전사효소 개시 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR) 에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수 있다. 상세한 설명은 미국 특허 5,843,780 를 참조한다. 본 명세서에 기재된 특정 마커의 서열 데이타는 공개 데이타베이스, 예컨대 GenBank (URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez) 에서 수득할 수 있다. 전형적으로 조절되는 실험에서 표준 절차에 따른 세포 표본의 분석 수행이 뚜렷이 구별되는 혼성화 또는 증폭 산물을 생성하는 경우, mRNA 수준의 발현은 본 명세서에 기재된 분석의 하나에 따라 "검출가능한" 것으로 불린다. 단백질 또는 mRNA 수준에서 측정되는 바와 같은 조직 특이적 마커의 발현은, 그 수준이 대조 세포, 예컨대 미분화된 pPS 세포, 섬유아세포 또는 기타 관련없는 세포 유형에서의 2 배 이상, 바람직하게는 10 또는 50 배 초과인 경우 양성으로 간주된다.

세포는 또한 간세포 계통 세포의 특징인 효소 활성을 나타내는지 여부에 따라 특징지워질 수 있다. 예를 들어, 글루코오스-6-포스파타아제 활성의 분석은 Bublitz (Mol Cell Biochem. 108:141, 1991); Yasmineh 등 (Clin. Biochem. 25:109, 1992); 및 Ockerman (Clin. Chim. Acta 17:201, 1968) 에 의해 기재되어 있다. 간 세포에서의 알칼린 포스파타아제 (ALP) 및 5-뉴클레오티다아제 (5'- Nase) 의 분석은 Shiojiri (J. Embryol. Exp. Morph. 62:139, 1981) 에 의해 기재되어 있다. 연구 및 건강 관리 분야에 종사하는 다수의 연구소에서 상업적 서비스로 간 효소에 대한 분석을 제공한다.

시토크롬 p450 은 모노옥시게나아제 시스템의 중요한 촉매 성분이다. 이는 생체이물 (xenobiotics, 투여된 약물) 및 다수의 내인성 화합물의 산화 대사에 관여하는 헴단백질 (hemeprotein) 군을 구성한다. 상이한 시토크롬은 특징적이고 부분적으로 중복되는 기질 특이성을 갖는다. 대부분의 생체전환 능력은 1A2, 2A6, 2B6, 3A4, 2C9-11, 2D6 및 2E1 로 명명된 시토크롬에 기인한다 (Gomes-Lechon 등, pp 129-153, "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997).

시토크롬 p450 효소 활성을 측정하기 위한 다수의 분석이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, p450 활성에 의해 형광 산물로 전환될 수 있는 비형광 기질과 세포를 접촉시킨 후, 형광도 활성화 세포 계수에 의해 분석할 수 있다 (미국 특허 5,869,243). 구체적으로, 세포를 세척한 후, 10μM/L 의 5,6-메톡시카르보닐플루오레신 (Molecular Probes, Eugene OR) 용액과 함께 어두운 곳에서 37℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 세포를 세척하고 배양 플레이트로부터 트립신 처리하여 ~520-560 nm 에서의 형광도 방출을 분석한다. 시험 세포에서의 활성 수준이 대조 세포, 예컨대 섬유아세포의 2 배 초과, 바람직하게는 10- 또는 100-배 초과인 경우, 세포가 분석된 효소 활성을 갖는다고 불린다.

시토크롬 p450 의 발현은 또한, 예를 들어 웨스턴 블롯에서 특정 항체를 이용하여 단백질 수준에서, 또는 노던 블롯 또는 RT-PCR 에서 특정 탐침 및 프라이머를 이용하여 mRNA 수준에서 측정될 수 있다. [Borlakoglu 등, Int. J. Biochem. 25:1659, 1993] 참조. p450 시스템의 특정 활성도 또한 측정될 수 있다: 7-에톡시쿠마린 O-데-에틸라아제 활성, 알록시레소루핀 O-데-알킬라아제 활성, 쿠마린 7-히드록실라아제 활성, p-니트로페놀 히드록실라아제 활성, 테스토스테론 히드록실화, UDP-글루쿠로닐트랜스퍼라아제 활성, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 활성 및 기타 (Gomes-Lechon 등, pp 411-431, "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997 에서 리뷰됨). 이어서, 표 2 에 나타낸 바와 같이, 활성 수준을 일차 간세포의 수준과 비교할 수 있다.

소분자 약물의 콘쥬게이션, 대사 또는 해독에 관련된 효소의 분석도 또한 사용가능한다. 예를 들어, 뇨관 또는 담관을 통한 배출을 위해, 빌리루빈, 담즙산 및 소분자 약물을 콘쥬게이션하는 능력에 따라 세포를 특징지울 수 있다. 세포를 적합한 기질과 접촉시켜 적합한 기간 동안 인큐베이션 후, 배지를 분석하여 (GCMS 또는 기타 적합한 기법에 의해), 콘쥬게이션 산물이 형성되었는지 여부를 측정한다. 약물 대사 효소 활성에는 탈에틸화, 탈알킬화, 히드록실화, 탈메틸화, 산화, 글루쿠로콘쥬게이션, 술포콘쥬게이션, 글루타티온 콘쥬게이션 및 N-아세틸 트랜스퍼라아제 활성이 포함된다 (A. Guillouzo, pp 411-431, "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997). 분석에는 핀아세틴 탈에틸화, 프로카인아미드 N-아세틸화, 파라세타몰 술포콘쥬게이션 및 파라세타몰 글루쿠로니드화가 포함된다 (Chesne 등, pp 343-350, "Liver Cells and Drugs", A. Guillouzo 편저, John Libbey Eurotext, London, 1988).

간세포 계통의 세포는 또한 글리코겐을 저장하는 이들의 능력으로 평가될 수 있다. 적합한 분석은 단당류 및 이당류와는 반응하지 않지만, 장쇄 중합체, 예컨대 글리코겐 및 덱스트란을 염색시키는 과요오드산 시프 (PAS) 염색을 이용한다. PAS 반응은 복합 탄화수소 뿐만 아니라 가용성 및 막결합 탄화수소 화합물의 정량적 추정을 제공한다. Kirkeby 등 (Biochem. Biophys. Meth. 24:225, 1992) 은 탄화수소 화합물 및 세제의 정량적 PAS 분석을 기재하고 있다. van der Laarse 등 (Biotech Histochem. 67:303, 1992) 은 PAS 반응을 이용한 글리코겐을 위한 미세밀도측정 조직화학적 분석을 기재하고 있다. 세포가 대조 세포, 예컨대 섬유아세포에서보다 2 배 이상, 바람직하게는 10 배 초과의 수준으로 PAS-양성인지로, 글리코겐 저장의 증거가 측정된다. 세포는 또한 표준 방법에 따라 핵형분석으로 특징지워질 수 있다.

본 발명에 따라 분화된 pPS 세포는 α₁-안티트립신 (AAT) 또는 알부민의 항체로 검출가능한 발현; α-페토단백질의 항체로 검출가능한 발현의 부재; 아시알로당단백질 수용체 (ASGR-1 또는 ASGR-2 의 동종형) 의 RT-PCR 로 검출가능한 발현; 글리코겐 저장의 증거; 시토크롬 p450 또는 글루코오스-6-포스파타아제 활성의 증 거; 및 간세포에 특징적인 형태학적 특색을 포함하는, 다수의 상기 언급된 특색을 가질 수 있다. 특정 세포 중에 존재하는 상기 특색이 많을수록, 간세포 계통 세포로서 더욱 특징지워질 수 있다. 상기 특색의 2, 3, 5, 7 또는 9 이상 (클수록 바람직함) 을 갖는 세포가 더욱 더 바람직하다. 배양 용기 또는 투여용 제제 중에 존재할 수 있는 특정 세포군에 관련하여, 상기 특색의 발현에 있어서 세포 간에 일관성이 있는 것이 종종 유리하다. 이러한 상황 하에서, 세포의 약 40%, 60%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상 (클수록 바람직함) 이 목적하는 특색을 갖는 세포군이 더욱 바람직하다.

본 발명의 분화된 세포의 기타 바람직한 특색은 약물 스크리닝 분석에서 표적 세포로서 작용할 수 있는 능력과, 생체 내 및 체외 장치의 일부 둘 다에서 간 기능을 재생시킬 수 있는 능력이다. 상기 특색을 후술되는 부분에서 더욱 설명한다.

분화된 세포의 텔로머화

간세포 계통의 세포가 특정 약물 스크리닝 및 치료적 응용에서도 복제하는 능력을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포는 이들이 제한된 개발 계통 세포 또는 말단 분화 세포로 진행되기 전 또는 후에, 이들의 복제능을 증가시키기 위해 임의로 텔로머화될 수 있다. 텔로머화된 pPS 세포를 상술한 분화 기전으로 진행시키거나; 분화된 세포를 직접 텔로머화시킬 수 있다.

텔로머화 이전 및 이후에, 텔로머라아제 활성 및 hTERT 유전자 산물의 발현은 당분야에 공지된 시약 및 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, pPS 세 포는 TRAP 활성 분석을 이용하여 텔로머라아제에 대해 평가된다 (Kim 등, Science 266:2011, 1997; Weinrich 등, Nature Genetics 17:498, 1997). mRNA 수준에서의 hTERT 의 발현은 RT-PCR 로 평가된다.

세포는 적합한 벡터, 상동 재조합 또는 기타 적절한 기법으로 전달감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction) 시켜서, 이들이 텔로머라아제 촉매 성분 (TERT) 을 발현하도록 유전적으로 변형시킴으로써 텔로머화된다. 국제 특허 출원 WO 98/14592 에 제시된 인간 텔로머라아제의 촉매 성분 (hTERT) 이 특히 적합하다. 특정 응용을 위해, 마우스 TERT (WO 99/27113) 와 같은 종 동족체도 사용할 수 있다. 인간 세포에서 텔로머라아제의 전달감염 및 발현은 [Bodnar 등, Science 279:349, 1998 및 Jiang 등, Nat. Genet. 21:111, 1999] 에 기재되어 있다. 또다른 예에서, hTERT 클론 (WO 98/14592) 을 hTERT 코딩 서열원으로 사용하여, MPSV 프로모터의 조절 하에 있는 PBBS212 벡터의 EcoRI 부위 내로 삽입하거나, LTR 프로모터의 조절 하에 있는 시판되는 pBABE 레트로바이러스 벡터의 EcoRI 부위 내로 삽입한다. 분화되거나 미분화된 pPS 세포는 8-16 시간 동안 벡터 함유 상청액을 이용하여 유전적으로 변형된 후, 1-2 일 동안 성장 배지로 교환된다. 유전적으로 변형된 세포는 0.5-2.5 ㎍/mL 의 푸로마이신을 사용하여 선택 및 재배양된다. 이어서, 이들을 RT-PCR, 텔로머라아제 활성 (TRAP 분석), hTERT 의 면역세포화학적 염색 또는 복제능에 의해, hTERT 발현에 대해 평가한다. 연속적으로 복제하는 콜로니는 증식을 지지하는 조건 하에서 더 배양하여 농축되며, 목적하는 표현형을 갖는 세포는 임의로 한계 희석에 의해 클로닝될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에서, pPS 세포는 간세포 계통의 특징을 소지한 세포로 분화된 후, 분화된 세포는 TERT 를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 본 발명의 다른 구현예에서, pPS 세포는 TERT 를 발현하도록 유전적으로 변형된 후, 간세포 계통의 특징을 소지한 세포로 분화된다. TERT 발현을 증가시키는 성공적인 변형은 TRAP 분석 또는 세포의 복제능 개선도 여부의 측정에 의해 결정될 수 있다.

기타 세포의 무한증식화 (immmortalizing) 방법에는, 예컨대 SV40 거대 T 항원을 코딩하는 DNA 로 세포를 형질전환시키는 것이 예시된다 (미국 특허 5,869,243, 국제 특허 출원 WO 97/32972). 종양유전자 또는 종양바이러스 산물로의 형질감염은, 치료 목적으로 세포를 사용하는 경우에는 부적합하다. 예를 들어, 간기능을 증강시키기 위해 개인에게 분화된 세포를 투여하는 치료 프로토콜 및 약학 스크리닝에서, 증식하고 이들의 핵형을 유지할 수 있는 세포가 유용한 본 발명에서는, 텔로머화된 세포가 특히 의미 있는 것이다.

분화된 세포의 용도

본 발명은, 간세포 계통 세포를 다수 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 세포군은 중요한 다수의 연구, 개발학적 및 상업적 목적에 사용될 수 있다.

발현 라이브러리 및 특이 항체의 제조

본 발명의 분화된 세포는 기타 계통의 세포에서 바람직하게 발현되는 cDNA 가 상대적으로 덜 오염된 cDNA 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 5 분 동안 1000 rpm 에서 원심분리로 세포를 수합한 후, 표준 기법 (상기의, Sambrook 등) 에 의해 펠릿으로부터 mRNA 를 제조한다. cDNA 로 역전사시킨 후, 미분화된 pPS, 배아 섬유아세포, 내장 내배엽, 비강 내피 세포, 담관 상피 및 목적하지 않는 특이성을 가지는 기타 세포유형의 일부 또는 전부로부터 cDNA 를 분리하여, 성숙한 간세포, 간세포 전구세포 또는 둘 다의 대표적 발현 패턴을 나타내는 선택된 cDNA 라이브러리를 제조할 수 있다.

본 발명의 분화된 세포는 또한 간세포 마커, 전구세포 마커, 간세포 전구세포에 특이적인 마커 및 세포에서 발현될 수 있는 기타 항원에 대해 특이적인 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 세포는 간 조직으로부터 제조된 간세포 배양물 및 pPS 세포 배양물에 비해, 특정 세포 유형이 상대적으로 농축되어 있으므로, 상기 항체를 제조함에 있어서 개선된 방법을 제공한다. 면역원 형태인 본 발명의 세포를 척추 동물에 주사함으로써 다클론성 항체를 제조할 수 있다. 단클론성 항체의 제조는 표준 참고문헌에 기재되어 있다 (Harrow & Lane (1988), 미국 특허 4,491,632, 4,472,500 및 4,444,887 호 및 Methods in Enzymology 73B:3 (1981)). 특이 항체 분자 (바람직하게는 단쇄 가변 영역의 형태인) 를 수득하는 기타 방법에는 면역적격 (immunocompetent) 세포 또는 바이러스 입자의 라이브러리를 표적 항원에 접촉시켜, 양성 선택된 클론을 배양하는 것이 관여된다 (Marks 등, New Eng. J. Med. 335:730, 1996, 국제 특허 출원 WO 94/13804, WO 92/01047, WO 90/O2809 및 McGuiness 등, Nature Biotechnol. 14:1449, 1996 참고). 본 발명의 pPS 를 이용하여 양성 선택을 실시하고, 보다 광범위하게 분포된 항원을 갖는 세포 (예컨대, 분화된 배아 세포 등) 또는 성인에서 유도된 줄기 세포를 이용하여 음성 선택을 실시함으로써, 목적하는 특이성을 수득할 수 있다. 이들 항체는 다시, 목적하는 표현형을 갖는 간세포 전구 세포를 혼합된 세포군으로부터 동정 또는 분리하거나, 조직 표본을 이용한 면역진단 도중 함께 염색하거나, 성숙한 간세포 또는 기타 계통의 세포로부터 상기 세포를 분리하는 목적에 사용될 수 있다.

유전체학 (Genomics)

분화된 pPS 세포는, 간세포 전구세포에 특징적인, 전사물 및 새로이 합성된 단백질의 발현 패턴 동정에 유용하며, 분화 경로를 지정하거나 세포간 상호작용을 촉진하는 것을 도울 수 있다. 분화된 세포의 발현 패턴을 수득하여, 대조 세포주, 예컨대 미분화된 pPS 세포, 기타 유형의 수임된 전구세포 (예컨대, 다른 계통으로 분화된 pPS 세포, 조혈 줄기 세포, 기타 중배엽 유도된 조직의 전구세포, 내피 또는 담관 상피의 전구세포, 성인 조직으로부터 수득된 간세포의 줄기 세포, 또는 다른 시약 또는 기술을 이용하여 간세포 계통으로 분화된 pPS 세포) 와 비교한다.

단백질 수준에서 발현을 비교하는 적합한 방법에는, 상술한 면역분석 또는 면역조직화학 기법이 포함된다. 전사 수준에서 발현을 비교하기에 적합한 방법에는, mRNA 의 시간차 전시법 (Liang, Peng 등, Cancer Res. 52:6966, 1992) 및 매트릭스 배열 발현 시스템 (Schena 등, Seience 270:467, 1995; Eisen 등, Methods Enzymol. 303:179, 1999; Brown 등, Nat. Genet. 21 Suppl 1:33, 1999) 이 포함된다.

유전자 발현을 분석하는데 있어서 마이크로배열의 사용은 다음에서 리뷰된 바 있다: Fritz 등, Science 288:316, 2000; "Microarray Biochip Technology", M. Schena 편저, Eaton Publishing Company; "Microarray analysis", Gwynne & Page, Science (Aug. 6, 1999 supplement); Pollack 등, Nat Genet 23:41, 1999; Gerhold 등, Trends Biochem. Sci. 24:168, 1999; "Gene Chips (DNA Microarrays)", L Shi, www.Gene-Chips.com. 마이크로배열 분석을 수행하기 위한 시스템 및 시약은, 하기의 회사로부터 시판되고 있다; Affymetrix, Inc., Santa Clara CA; Gene Logic Inc., Columbia MD; Hyseq Inc., Sunnyvale CA; Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale CA; Nanogen, San Diego CA; 및 Synteni lnc., Fremont CA (Incyte Genomics, Palo Alto CA 가 인수).

목적 부위에서 탐침을 합성하거나 탐침 단편을 예비 합성하여 고체 지지체에 부착시킴으로써, 특정 부위에 탐침을 부착시켜 고체 상 배열을 제조한다. 다양한 고체 지지체를 사용할 수 있으며, 유리, 플라스틱, 세라믹, 금속, 젤, 막, 종이 및 각종 조성의 비드가 포함된다. 미국 특허 5,445,934 에는, 유리 슬라이드를 광절단성의 보호기를 포함하는 화학종으로 유도체화한 칩상 (on-chip) 합성법이 개시되어 있다. 각 부위는 연속하여 마스크를 통한 조사에 의해 탈보호된 후, 광보호기를 갖는 DNA 단량체와 반응된다. 고체 지지체 상에 미리 합성된 탐침을 부착시키는 방법에는 흡착, 자외선 연결 및 공유 부착이 포함된다. 하나의 예에서, 고체 지지체는 활성기, 예컨대 히드록실, 카르복실, 아민, 알데히드, 히드라진, 에폭시드, 브로모아세틸, 말레이미드 또는 티올기를 갖도록 수반되어, 이를 통해 탐침이 부착된다 (미국 특허 5,474,895 및 5,514,785).

탐침 분석은 전형적으로, 혼성화에 적합한 조건 하에서 해당 뉴클레오티드 서열을 잠재적으로 함유하는 플루이드와 배열을 접촉시킨 후, 임의의 형성된 혼성물을 측정함으로써 수행된다. 예를 들어, 표본 내의 mRNA 또는 DNA 를, 형광표지 Cy3 또는 Cy5 와 같은 적합한 표지에 부착된 뉴클레오티드의 존재 하에서 증폭시킨다. 완벽히 상보적인 매치 또는 적절하면서 다양한 정도의 상동성을 갖는 혼성화가 일어나도록 조건을 조절한다. 이후 배열을 세척하고, 고체상에 부착된 표지의 양 또는 존재를 측정하여, 결합된 핵산을 측정한다. 대부분의 관심 세포 내에서 발현된 유전자, 예컨대 리보솜 또는 하우스 키핑 (house-keeping) 유전자를 이용하여, 또는 표본 내 전체 폴리뉴클레오티드의 비율로서 임의로 표준화된 배열간 발현의 상대적 수준을 측정하여, 상이한 표본을 비교할 수 있다. 이와는 달리, 상이한 표지를 갖는 각 기원으로부터 증폭된 폴리뉴클레오티드를 제조함으로써, 동일한 배열 상에서 두 개 이상의 상이한 기원을 갖는 표본을 시험할 수 있다.

Genteic Microsystems 배열 생성기 및 Axon GenePix™ Scanner 를 사용하여 대표적 방법이 수행된다. 분석될 마커 서열을 코딩하는 cDNA 단편을 먼저 96 또는 384 웰 포맷에서 증폭하여 마이크로배열을 제조한다. 슬라이드 당 >5,000 개까지의 밀도로 유리 슬라이드 상에 cDNA 를 직접 스팟팅한다. 관심상의 두 가지 세포로부터의 mRNA 를 비교하기 위해, 하나는 Cy3-표지된 cDNA 로 전환시키고, 다른 하나는 Cy5-표지된 cDNA 로 전환시킨다. 두개의 cDNA 제조물을 마이크로배열 슬라이드에 동시에 혼성화시킨 후 세척하여, 비특이적 결합을 제거한다. 배열 상의 임의의 스팟은, 두 개의 원래 mRNA 제조물 중 전사물의 풍부함에 비례하여 각각의 cDNA 산물에 결합할 것이다. 이어서, 슬라이드를 각 표지에 적절한 파장에서 스캐닝하 여, 수득된 형광도를 정량하고, 결과를 포맷팅하여 배열상의 각 마커에 대한 mRNA 의 상대적 풍부함의 지표로 삼는다.

본 발명에서의 분화된 세포의 특징분석 및 영향에 사용되는 발현 산물의 동정에는, 간세포 계통에 따라 분화된 pPS 세포와 같은 제 1 세포 유형 내에서의 RNA, 단백질, 또는 기타 유전자 산물을 발현도 분석, 대조 세포 유형 내에서의 동일 산물의 발현도 분석, 두 가지 세포 유형 간의 상대적 발현도 비교 (전형적으로 표본 내의 전체 단백질 또는 RNA 에 의해, 또는 하우스 키핑 유전자와 같이 두 세포 유형 모두에서 유사한 정도로 발현이 기대되는 다른 유전자 산물과의 비교에 의해 표준화됨), 및 비교 발현도에 기초한 해당 산물의 동정이 관여된다.

대조군과 비교하여, 본 발명의 분화된 pPS 세포에서는, 이들의 상대적 발현도가 적어도 약 2 배, 10 배, 또는 100 배 이상 상승된 (또는 억제된) 산물이 전형적으로 관심의 대상이 된다. 이러한 분석은 임의로는 컴퓨터에 의해, 독립축 상에 각 세포 유형의 발현도를 표시한 후 (여기에서, 각 축에 대한 마크의 상대적 위치는 각 세포 내의 발현도와 일치함), 마크의 위치에 따라 관심 산물을 선택할 수 있다. 이와는 달리, 제 1 세포 및 대조 세포 간의 발현 차이를 색상 스펙트럼으로 표시할 수 있다 (예를 들어, 노랑은 동일한 발현도를, 빨강은 증가된 발현도를, 파랑은 감소된 발현도를 나타냄). 관심상의 마커 발현을 나타내는 색상에 따라, 또는 다수의 마커를 나타내는 색상의 패턴에 따라 관심 산물을 선택할 수 있다.

약물 스크리닝을 위한 분화된 pPS 세포

본 발명의 분화된 pPS 세포는, 간세포 계통의 분화된 세포의 특징에 영향을 미치는 인자 (예컨대, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등) 또는 환경 조건 (예컨대, 배양 조건 또는 조작) 의 스크리닝에 사용될 수 있다.

일부 응용에서, pPS 세포는 (분화된 또는 미분화된) 간세포 계통과 함께 세포의 성숙을 촉진, 또는 장기간 배양에서 상기 세포의 증식 및 유지를 촉진하는 인자의 스크리닝에 사용된다. 예를 들어, 간세포 성장 인자 또는 성장 인자의 후보는, 이들을 상이한 웰 내의 pPS 세포에 첨가한 후, 세포의 후속 배양 및 용도에 대해 바람직한 범주에 따라, 나타내는 임의의 표현형 변화를 측정함으로써 시험된다.

본 발명의 특정 스크리닝 응용은, 약물 연구에서 약학 화합물의 시험에 관련된다. 독자는 일반적으로 하기를 표준 교과서로 참조한다; "In vitro Methods in Pharmaceutieal Research", Academic Press, 1997 및 미국 특허 5,030,015. 본 발명에서, 간세포 계통을 가지도록 분화된 pPS 세포는 간세포 세포주 또는 단기간 배양의 일차 간세포에서 이전에 수행된 바와 같이, 표준 약물 스크리닝 및 독성 분석을 위한 시험 세포로 작용한다. 후보 약학 화합물의 활성 평가에는 일반적으로, 본 발명의 분화된 세포를 후보 화합물과 배합하고, 화합물에 기인한 세포의 형태, 마커 표현형 또는 대사 활성의 임의 변화를 관찰한 후 (비처리 세포 또는 불활성 화합물 처리 세포와 비교하여), 관측된 변화와 화합물의 효과를 관련짓는 것이 관여된다. 화합물이 간 세포 상에서 약리 효과를 가지도록 고안되었거나, 다른 곳에 효과를 가지도록 고안된 화합물이 의도치 않는 간에 대한 부수 효과를 가지기 때문에 스크리닝을 수행할 수 있다. 가능한 약물-약물 간의 상호작용 효과를 검출하기 위해, 두 개 이상의 약물을 조합하여 (동시적으로 또는 연속적으로 세포를 조합하 여) 시험할 수 있다.

일부 응용에서는, 먼저 잠재적 간독성에 대해 화합물을 스크리닝한다 (Castell 등, pp 375-410, "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997). 세포 독성은 먼저, 세포 생활성, 생존, 형태 및 배양 배지로의 효소 누출에 대한 효과에 의해 측정될 수 있다. 화합물이 독성 없이 세포 기능 (예컨대 글루코스 형성, 효소 형성 및 혈장 단백질 합성) 에 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위해, 보다 상세한 분석이 수행된다. 배양 조건에서 간 동종효소 (제 V 형) 가 안정하여, 12 - 24 시간 인큐베이션 후에도 세포 상청액에서 재현가능한 측정이 가능하기 때문에, 락테이트 디히드로게나아제 (LDH) 가 좋은 마커이다. 미토콘드리아 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나제 및 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나제와 같은 효소의 누출 또한 사용될 수 있다. Gomez-Lechon 등 (Anal. Biochem. 236:296, 1996) 은, 간세포 글루코스 형성에 대한 약학 화합물의 효과 측정에 응용가능한 글리코겐을 측정하기 위한 마이크로배열을 기재하고 있다.

간독성 평가를 위한 기타 현재의 방법에는, 알부민, 콜레스테롤 및 지단백질의 합성과 분비; 컨쥬게이션된 담즙산 및 빌리루빈의 수송; 요소 형성; 시토크롬 p450 수준 및 활성; 글루타티온 수준; α-글루타티온-s-트랜스퍼라제의 방출; ATP, ADP 및 AMP 대사; 세포내 K⁺ 및 Ca²⁺ 농도; 핵 매트릭스 단백질 또는 올리고뉴클레오좀의 방출; 및 세포소멸의 유도 (세포의 둥글어짐, 염색사의 응축 및 핵 단편화에 의해 나타남) 의 측정이 포함된다. DNA 합성은 [³H]-티미딘 또는 BrdU 혼입에 의해 측정할 수 있다. DNA 합성 또는 구조에 대한 약물의 효과는, DNA 합성 또는 보수 측정에 의해 결정될 수 있다. [³H]-티미딘 또는 BrdU 혼입은, 특히 세포 주기의 지정되지 않은 시점에서 또는 세포 복제에 요구되는 수준 초과 시, 약물 효과와 일치한다. 원하지 않는 효과에는 또한, 중기 스프레딩에 의해 측정되는 딸 크로마티드의 교환의 비정상적 속도가 포함될 수 있다. 추가의 정보에 대해서, 독자는 하기를 참고한다: A. Vickers, pp 375-410, "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997.

간 기능의 복구

본 발명은 또한, 급성, 만성 또는 유전된 간 기능 손상에 의할 수 있는 치료가 필요한 대상체의 간 기능 수준을 복구하기 위한 분화된 pPS 세포의 용도를 제공한다.

치료적 응용에 대한 분화된 pPS 세포의 타당성 결정을 위해, 먼저 세포를 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 한 단계에 있어서는, 생체 내에서 세포가 생존하면서 그들의 표현형을 유지하는 능력을 평가한다. 분화된 pPS 세포를, 면역결핍 동물 (예컨대, SCID 마우스, 또는 화학적으로 또는 광조사에 의해 면역결핍화된 동물) 의 신장 캡슐 하부, 비장 내부 또는 간 소엽 내부와 같은 추가 관측이 가능한 부위에 투여한다. 수일 또는 수주 이상의 기간 후에 조직을 취하여, pPS 세포의 존재 여부를 평가한다. 이는, 검출 가능한 표지 (예컨대, 초록 형광 단백질 또 는 β-갈락토시다제) 를 갖는 세포를 투여하거나, 투여된 세포에 특이적인 항상성 마커를 측정하여 수행될 수 있다. 설치류 모델에서 분화된 pPS 세포가 측정되는 경우, 투여된 세포의 존재 및 표현형은, 인간-특이적 항체를 이용하는 조직화학 또는 ELISA, 또는 인간 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적인 증폭을 유도하는 프라이머 및 혼성화 조건을 이용하는 RT-PCR 분석에 의해서 평가될 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 측정하는데 적합한 마커를 표 3 에 제공한다. 간세포 유사 세포를 동물 모델에서 결정하는 일반적 내용은 하기 문헌에 제공된다; Grompe 등 (Sem. Liver Dis. 19:7, 1999); Peeters 등 (Hepatology 25:884, 1997) 및 Ohashi 등 (Nature Med. 6:327, 2000).

또다른 단계에서, 전체 간 기능을 상실한 동물에서 간 기능을 복구시키는 능력에 대해 분화된 pPS 세포가 측정된다. Braun 등 (Nature Med. 6:320, 2000) 은, HSV tk 유전자에 대해 트린스제닉한 마우스에 있어서 독소 유도된 간 질환에 관한 모델을 개시하고 있다. Rhim 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4942, 1995) 및 Lieber 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6210, 1995) 은, 유로키나제의 발현에 의한 간 질환의 모델을 개시한다. Mignon 등 (Nature Med. 4:1185, 1998) 은, 세포 표면 마커 Fas 에 대한 항체에 의하여 유도된 간 질환을 개시한다. Overturf 등 (Human Gene Ther. 9:295, 1998) 은, Fah 유전자의 표적화된 교란에 의한 마우스에서의 유전성 티로신혈증 제 I 형의 모델을 개발하였다. 동물들에게 2-(2-니트로-4-플루오로-메틸-벤조일)-1,3-시클로헥산디온 (NTBC) 을 공급함으로써 결핍이 극복되었으나, NTBC 를 제거하자 간 질환이 발생하였다. 90% 간절제술에 의해 급 성 간 질환을 모델링할 수 있다 (Kobayashi 등, Science 287:1258, 2000). 급성 간 질환은 또한, 갈락토사민, CCl₄ 또는 티오아세트아미드와 같은 간독소로 동물을 처리함으로써 모델링할 수 있다. 경변과 같은 만성 간 질환은, 섬유화를 유도하기에 충분한 기간 동안 치사량 미만의 간 독소로 동물을 처리함으로써 모델링할 수 있다 (Rudolph 등, Science 287:1253, 2000). 분화된 세포가 간 기능을 재생시키는 능력의 평가는, 상기 동물에게 세포를 투여한 후, 1 내지 8 주 이상의 기간에 걸쳐 생존을 측정하면서 동물 상태의 진행을 모니터링하는 것이 관여된다. 간 기능에 대한 효과는, 간 조직 내에서 발현되는 마커, 시토크롬 p450 활성, 혈액 지표, 예컨대 알칼린 포스파타제 활성, 빌리루빈 콘쥬게이션 및 프로트롬빈 시간, 및 호스트의 생존을 평가하여 측정될 수 있다. 생존, 질환 진행의 임의 개선, 또는 임의의 상기 범주에 따른 간 기능의 유지는, 치료의 유효성에 연관되며, 추가의 최적화를 일으킬 수 있다.

본 발명에는, 캡슐화되거나 인공생체 간 장치의 일부인 분화된 세포가 포함된다. 캡슐화의 다양한 형태는 하기에 기재되어 있다; "Cell Encapsulation Technology and Therapeutics", Kuhtreiber 등 편저, Birkhauser, Boston MA, 1999. 본 발명의 분화된 세포는 시험관 내 또는 생체 내 사용을 위한 방법에 따라 캡슐화될 수 있다.

임상용 인공생체 장기는 장기간 치료의 일부로서, 또는 전격성 간 부전 및 간 재생 또는 간 이식 간의 시간을 연결하기 위해, 손상된 간 기능을 갖는 개인을 보조하기 위해 고안된다. 인공생체 간 장치는 Macdonald 등에 의해 리뷰되며 ("Cell Encapsulation Technology and Therapeutics", pp. 252-286) 및 미국 특허 5,290,684, 5,624,840, 5,837,234, 5,853,717 및 5,935,849 에 예시된다. 현탁형의 인공생체 간에는, 플레이트 투석기 중에 현탁되거나 적절한 기질 중에 마이크로캡슐화된, 또는 세포외 매트릭스로 코팅된 마이크로캐리어 비드에 부착된 세포가 포함된다. 이와는 달리, 패킹층 중의 고체 지지체 상에, 다층평판 중에, 마이크로채널 스크린 상에, 또는 둘러싸인 중공 섬유 모세관에 간세포를 위치시킬 수 있다. 장치는 대상체의 혈액이 통과하는 입구 또는 출구를 가지며, 때때로 세포에 영양분을 공급하기 위한 별도의 포트 세트를 가진다.

상기 간 보조 장치에 대한 현재 제안에는, 가능한 일차 인간 간세포의 부족 때문에, 돼지 간세포의 현탁액과 같은 이종 출처의 간세포가 관여된다. 이종 조직원은, 면역원성 및 가능한 종간 바이러스 전파에 관련된 제어상의 문제를 야기한다.

본 발명은, 인간 세포의 제조적 배양을 위한 시스템을 제공한다. 분화된 만능 줄기 세포는 상술한 방법에 따라 제조된 후, Matrigel

또는 콜라겐 매트릭스와 같은 적합한 기질 상의 장치 중에 플레이팅된다. 장치의 효율성은, 구심성 흐름에서 제거되는 대사물 및 원심성 흐름에서 새로이 합성되는 단백질에 관해, 구심성 채널 및 원심성 채널의 혈액 조성을 비교함으로써 평가될 수 있다.

이러한 종류의 장치는 혈액과 같은 플루이드를 해독하는데 사용될 수 있으며, 세포가 플루이드 내의 독소를 제거하거나 변형시킬 수 있는 조건 하에서 본 발 명의 분화된 세포와 플루이드가 접촉된다. 해독에는, 간에 의해 통상 처리되는 하나 이상의 리간드, 대사물, 또는 기타 화합물 (천연 또는 합성) 을 제거하거나 변형시키는 것이 관여될 것이다. 이러한 화합물에는 빌리루빈, 담즙산, 요소, 헴, 지단백질, 탄수화물, 트랜스페린, 헤모펙신, 아시알로당단백질, 인슐린 및 글루카곤과 같은 호르몬, 및 다양한 소분자 약물이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 장치는, 또한 알부민, 급성 상 반응물 및 로딩되지 않은 캐리어 단백질과 같은 합성된 단백질로 원심성 액체를 농축시키는데 사용될 수 있다. 다양한 상기 기능이 수행되어 필요한만큼 많은 간 기능을 복구시키도록 장치를 최적화시킬 수 있다. 치료적 관리의 관점에서, 장치는 간세포 부전 환자의 혈액 흐름을 처리한 후, 혈액을 환자에게 되돌린다.

동물 모델 (상기한 바와 같은) 에서 바람직한 기능적 특징을 나타내는 본 발명의 분화된 pPS 세포는 또한, 간 기능이 손상된 인간 대상체에게 직접 투여하는데 적합하다. 항상성을 위해, 순환이 적절히 접근되는 임의의 위치에, 전형적으로 복강 내부에 세포를 투여할 수 있다. 일부 대사 및 해독 기능을 위해서는, 담관에 접근할 수 있는 세포가 유리하다. 따라서, 간 근처로 (예컨대, 만성 간 질환의 치료에 있어서) 또는 비장에 (예컨대, 전격성 간 부전의 치료에 있어서) 세포를 투여한다. 한 방법에서, 인-드웰링 카테터 (in-dwelling catheter) 를 통한 주입에 의해, 세포를 간 동맥 또는 문맥을 통해 간 순환 내로 세포를 투여한다. 문맥 내의 카테터는, 비장 또는 간 또는 이들 조합으로 세포 대부분이 흘러갈 수 있도록 조작될 수 있다. 또다른 방법에서, 전형적으로 볼루스를 제 위치에 유지시킬 부형제 또는 매트릭스 중에서, 표적 기관 근처의 강 내로 볼루스를 위치시켜 세포를 투여한다. 또다른 방법에서, 세포를 간 또는 비장 소엽에 직접 주사한다.

본 발명의 분화된 세포는, 간기능을 복구 또는 보충시킬 필요가 있는 임의 대상체의 치료에 사용될 수 있다. 그러한 치료가 적절할 수 있는 인간 조건에는, 임의의 원인에 의한 전격성 간 부전, 바이러스성 간염, 약물 유도된 간 손상, 경변, 유전성 간 부전 (예컨대, 윌슨 질환, 길버트 증후군 또는 α₁-안티트립신 결핍), 간담즙성 암종, 자가면역성 간 질환 (예컨대, 자가면역성 만성 간염 또는 일차 담경변) 및 손상된 간 기능을 유도하는 기타 조건이 포함된다. 인간 치료를 위해서, 투여량은 일반적으로 약 10⁹ 내지 10¹² 개의 세포이며, 전형적으로 약 5 ×10 ⁹ 내지 5 ×10¹⁰ 개의 세포로서, 대상체의 체중, 통증의 성질 및 경중, 및 투여된 세포의 복제능에 따라 조절된다. 치료 방식 및 적절한 투여량을 결정하는 종국적 책임은 담당 의사가 가진다.

하기의 실시예는 본 발명의 특정 구현예의 비제한적인 예를 제공한다.

실험 절차

본 부분은 하기의 실시예에서 사용되는 기법 및 시약의 일부를 상술한다.

인간 배아 줄기 세포의 유지:

hES 세포를 무혈청 배지 중 일차 마우스 배아 섬유아세포 상에서 유지하였 다. hES 세포를 약 40,000 세포/cm² 의 조사된 마우스 배아 섬유아세포 상에 작은 덩어리로 접종하였다. 상기 배양물을 1% 불필수 아미노산, 1 mM 글루타민, 0.1mM β-머캅토에탄올 및 4ng/mL 인간 bFGF (Gibco) 가 보충된, 80% KO DMEM (Gibco) 및 20% 혈청 대체제 (Gibco) 로 이루어진 배지에서 유지하였다. 세포를 ES 콜로니의 연속 계대로 증식시켰다. 이는 ES 콜로니의 단층 배양물을 1mg/mL 콜라게나아제로 37℃ 에서 5-20 분 동안 처리하여 달성하였다. 이어서 배양물을 부드럽게 긁어 세포를 제거하였다. 이 덩어리를 부드럽게 분리시켜, 새로운 영양 세포 상에 작은 덩어리로 재플레이팅하였다.

배상체 (EB) 의 제조:

영양 세포 상의 또는 세포에서 떨어진 hES 세포의 콘플루언트 단층 배양물을 콜라게나아제 중에서 15-20 분 동안 인큐베이션 후, 세포를 플레이트에서 긁어 내어 회수하였다. 이어서 상기 세포를 덩어리로 분리시켜, 비부착성 세포 배양 플레이트 (Costar) 중에 1% 불필수 아미노산, 1 mM 글루타민, 0.1mM β-머캅토에탄올로 보충된 80% KO DMEM (Gibco) 및 20% 비열불활성화 FBS (Hyclone) 로 이루어진 배지 중에 플레이팅하였다. 상기 세포를 웰 (6 웰 플레이트) 당 2mL 배지 중에 1:2 비로 접종하였다. 매 2 일 마다 EB 에 웰당 2mL 배지를 첨가하여 공급하였다. 배지의 체적이 4mL/웰을 초과하는 경우 EB 를 수합하여 새로운 배지 중에 재현탁하였다. 현탁 4-8 일 후, EB 를 기질 상에 플레이팅하여 추가로 분화시켰다.

Matrigel

코팅 배양 기질

제조자의 지시에 따라 웰을 Matrigel

로 코팅하였다. 간단하게, 표준 Matrigel

또는 성장 인자 감소 Matrigel

(Collaborative Biosciences) 를 4℃ 에서 3 시간 이상 해동시켰다. 이것을 hES 세포 배양물에 대해서는 냉 KO DMEM 에 1:10 또는 1:20, 또는 간세포 배양물에 대해서는 1:30 으로 희석하였다. 예비 냉각된 플레이트 및 피펫 팁을 이용하여, 0.75-1 mL 의 Matrigel

용액을 각각의 웰 (9.6cm²) 에 첨가하였다. 이 플레이트를 실온에서 1 시간 또는 4℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션 후, 세포를 첨가하기 전에 냉 KO DMEM 으로 1 회 세척하였다.

면역세포화학:

챔버 슬라이드 상에서 성장하는 세포를 실온에서 5 분 동안 3.5% 파라포름알데히드 중에서 고정시킨후, -20℃ 에서 메탄올 중에 20 분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS 로 2 회 헹구고, PBS 중의 10% 염소 혈청 중에 1 시간 동안 블록킹하였다. 이어서, 10% 염소 혈청 및 PBS 에 희석된 1 차 항체 중에 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 알부민, 알파 페토단백질 (AFP)(Sigma) 및 α₁-안티트립신 (OEB Biosciences Inc.) 에 대한 항체를 1:500 으로 희석하고, 시토케라틴, 8, 18 및 19, 데스민, (Neomarkers), 비멘틴 (Dako) 및 SMA (Sigma) 에 대한 항체를 1:200 으로 희석하였다. 이어서 세포를 PBS 로 3 회 세척하고, PBS 중 5% 염소 혈청에 1:1000 으로 희석된 Hoechst HH33258 (Sigma) 및 1:100 로 희석된 FITC-콘쥬게이션된 항-마우스 IgG 인 2 차 항체 중에 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 염색 된 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, Vectashield^TM(Vector Labs) 에 마운팅하였다. 에피플루오레센스 (epifluorescence) 및 스팟 CCD 카메라가 장착된 Nikon Labophot^TM 를 이용하여 10 ×및 40 ×로 영상을 찍었다.

글리코겐 염색:

과요오드산 시프 염료 (Periodic Acid Schiff's stain)(PAS) 를 American Master Tech Scientific Inc. 사로부터 구입하였다. 세포를 챔버 슬라이드 상에서 키우고, -20℃ 의 아세톤:메탄올 (1:1) 중에서 20 분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 수돗물로 헹군 후 증류수로 헹구었다. 이어서 실온에서 4 분 동안 세포를 0.5% 과요오드산 용액 중에서 인큐베이션 후, 증류수로 헹구었다. 이어서 시프 용액으로 실온에서 10 분 동안 인큐베이션 후, 수돗물로 수회 헹구었다. 이어서 세포를 Fast Green 염료 중에서 2 분 동안 인큐베이션하고, 100% 알콜로 2 회 헹구고, DPX 마운팅 배지에 마운팅하였다. 에피플루오레센스 및 스팟 CCD 카메라가 장착된 Nikon Labophot^TM 를 이용하여 10 ×및 40 ×로 영상을 찍었다.

BrdU 염색:

세포를 챔버 슬라이드 상에서 지시된 성장 배지 중에 키우고, 24 시간 동안 10μM BrdU 로 표지하였다. 이어서 세포를 메탄올:아세트산 (3:1) 으로 30 분 동안 고정시키고, 암실에서 하룻밤 동안 풍건시켰다. 고정된 세포를 PBS 로 1 회 헹구고, 0.07 N NaOH 에서 2 분 동안 변성시킨 후 pH8.5 및 pH 7.4 의 PBS 로 수회 신속하게 헹구었다. 이어서 1.5% 염소 혈청 (Vector Labs) 을 이용하여 15 분 동 안 블록킹시키고, 1.5% 염소 혈청 및 0.05% Tween^TM 20 중에 1:500 으로 희석된 항 BrdU 항체 (Sigma)와 함께 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 표본을 PBS 로 3 회 세척한 후, 1.5% 말 혈청에 10 ㎍/mL 로 희석된 바이오틴화 염소 항-마우스 면역글로불린 (Vector Labs) 인 2 차 항체와 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이 표본을 다시 PBS 로 3 회 세척한 후, 10mM HEPES 완충액 및 0.15M NaCl pH8.5 에 30 ㎍/mL 로 희석된 Texas Red 표지된 스트렙타비딘 (Vector Labs) 인 염색 컨쥬게이트와 함께 암실에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. Hoechst HO33258 염료 (비스벤즈이미드, Sigma Cat, No. B2883) 를 2.5 μM 의 최종농도로 스트렙타비딘 용액에 혼합시켜 모든 핵을 염색시켰다. 염색된 세포를 PBS 로 다시 3 회 헹군 후, Vectashield^TM (Vector Labs) 에 마운팅하였다. 에피플루오레센스 및 스팟 CCD 카메라가 장착된 Nikon Labophot^TM 를 이용하여 10 ×및 40 ×로 영상을 찍었다.

역전사효소 PCR 증폭:

전사 수준에서의 발현의 RT-PCR 분석을 다음과 같이 수행하였다: RNA 를 제조자의 지시에 따라 RNAeasy Kit^TM (Qiagen) 을 이용하여 세포로부터 추출하였다. 이어서 최종 산물을 DNase 로 분해시켜 오염성 게놈 DNA 를 제거하였다. 10mM Tris pH 7.5, 10mM MgCl₂ 및 5mM DDT 를 함유하는 완충액 중의 RNA 가드 (Pharmacia Upjohn) 및 DNAse I(Pharmacia Upjohn) 중에서, RNA 를 37℃, 30-45 분 동안 인큐베이션하였다. 표본으로부터 단백질을 제거하기 위하여, 페놀 클로로포름 추출을 수행하고, 3M 아세트산나트륨 및 100% 냉 에탄올로 RNA 를 침전시켰다. 이 RNA 를 70% 에탄올로 세척하고, 펠릿을 풍건 및 DEPC-처리수에 재현탁하였다. 역전사효소 (RT) 반응을 위해서, 500ng 의 전체 RNA 를 최종농도 1 ×First Strand Buffer (Gibco), 20mM DDT 및 25 ㎍/mL 랜덤 헥사머 (Pharmacia Upjohn) 와 배합하였다. 이 RNA 를 70℃ 에서 10 분 동안 변성시킨 후, 실온에서 10 분 동안 어닐링시켰다. dNTP 를 0.5 ㎕ 의 Superscript II RT (Gibco) 와 더불어 1 mM 의 최종 농도로 첨가하여, 42℃ 에서 50 분 동안 인큐베이션 후, 80℃ 에서 10 분 동안 열불활성화시켰다. 이어서 PCR 분석을 위해 처리하기 전까지 표본을 -20℃ 에 저장하였다. 표준 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 은 목적하는 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 하기의 반응 혼합물 중에서 수행하였다: cDNA 1.0㎕, 10 ×PCR 버퍼 (Gibco) 2.5㎕, 10 ×MgCl₂ 2.5㎕, 2.5 mM dNTP 3.0㎕, 5μM 3' 프라이머 1.0㎕, 5μM 5' 프라이머 1.0㎕, Taq 0.4㎕, DEPC-수 13.6㎕. 선택된 마커 및 반응 조건을 표 3 에 나타낸다.

실시예 1: n-부티레이트를 이용한 인간 배아 줄기 세포의 분화

배상체 (EB) 를 선행 부분에 기재된 바와 같이 제조하였다. 현탁 배양 5 일 후, 이것을 회수하여 성장 인자 감소 Matrigel

코팅 플레이트 상 및 챔버 슬라이드 (Nunc) 에 플레이팅하였다. 다음 3 가지 조건 중의 하나를 병행하여 사용하였다:

- 20% 소 태아 혈청 (FBS) 함유 배지;

- 20% FBS 및 5mM 소듐 부티레이트 (Sigma) 함유 배지 ;

- 20% FBS, 0.5% DMSO (ATCC), 4μM 덱사메타존 (Sigma), 150 ng/ml 인슐린, 10ng/ml EGF, 600nM 글루카곤 (Sigma) 함유 배지.

각각의 경우, 배지는 매일 교환하였고, 세포는 플레이팅 4 일째에 면역세포 화학을 위해 고정시켰다.

플레이팅 1 일 후, 20% FBS 단독 중에 플레이팅된 EB 는 건강하게 보였고, 이것의 거의 모두가 플레이트에 부착되어, 증식하고 있는 것으로 보였다. 수일 후, FBS 단독 중의 세포는 잘 생존하였고, 분화되어 매우 이질적인 세포군을 형성하였다. 대조적으로, 플레이팅 1 일 후 소듐 부티레이트를 함유하는 배양물에서는 많은 비율의 뚜렷이 죽은 세포가 발생하였고, 상당히 동질적인 세포군을 포함하는 일부의 반점만이 생존하였다. 상기 세포의 형태는, 세포가 크고 수일 후 다핵화된다는 점에서 일차 간세포의 형태와 유사하였다. 이러한 배양물은 일차 인간 간세포의 배양물 (Dr. Stephen Strom, University of Pittsburgh 에서 입수) 및 HepG2 세포 (미국 특허 5,290,684 에 보고된 것과 유사한, 간모세포종 유래의 영구 인간 간세포 세포주) 와 비교하였다. 0.5% DMSO 및 성장 인자 (no.3) 을 갖는 조건에서, 세포는 건강하게 보였으며, 배양물에는 세포의 현저히 이질적인 세포군이 포함되었다.

도 1 은 재플레이팅 및 추가로 2 일 동안 배양된 배상체 세포의 형태를 나타낸다 (4 ×, 10 ×, 20 ×). 우측은 간세포 분화 제제 n-부티레이트 중에서 2 일 동안 배양하여 분화된 세포를 나타낸다. 원형 콜로니는 배상체가 플레이팅된 부위에서 형성되며; 중간의 백색 반점은 죽은 세포의 작은 영역이다. 이 시야에서의 기타 세포는 현저히 동질적인 형태를 보인다. 좌측은 혈청 함유 배지만에서 배양된 세포를 나타낸다. 배상체는 광범위하게 분산되어, 많은 상이한 세포 유형의 형태를 보이는 세포의 이질적인 반점을 형성한다.

플레이팅 4 일 후, 챔버 슬라이드 상에서 성장하는 세포를 상이한 간 특이적 마커에 대한 항체를 이용하여 면역세포화학을 위하여 고정시켰다. 그 결과를 표 4 에 나타낸다. 소듐 부티레이트로 처리된 배양물은 AFP 를 발현하지 못했지만, 세포의 약 30% 는 알부민을 항체로 검출가능한 수준으로 발현하였다.

실시예 2: 분화된 세포에 의해 발현된 마커

hES 세포 유래의 배상체를 현탁 4 또는 5 일 후 회수하여, Matrigel

코팅 6-웰 플레이트 (RNA 추출용) 및 챔버 슬라이드 (면역세포화학용) 상에 20% FBS 및 5mM 소듐 n-부티레이트를 함유하는 배지 중에 플레이팅하였다. 배지는 매일 또는 매 2 일 마다 교환하였다. 1 일째에는 많은 세포가 죽었으나 이후에는 세포들이 덜 죽었다.

도 2 는 n-부티레이트와 배양 6 일 후의 분화된 세포의 형태를 보여준다. 6 개의 상이한 시야를 동일한 배양물에서 나타낸다 (상단열에서 10 ×, 기타열에서 20 ×). 이 세포는 상당히 균일하며, 성숙한 간세포의 특징인 거대한 다각형 표면 및 2 핵화 중심을 보인다.

분화 제제에 플레이팅 후 6 일째에, 앞서 개략한 절차에 따라 세포를 RT-PCR 및 면역세포화학으로 마커의 발현에 대해서 분석하였다. 상기 세포에서 글리코겐 함량을 과요오드산 시프 염료를 이용하여 측정하였다. 세포 주기의 S 상의 세포의 수는 플레이팅 5 일째 세포와 10 μM BrdU 를 인큐베이션 후, 24 시간 후 항-BrdU 항체로 염색하여 측정하였다.

도 3 은 특정 세포에 특이적인 마커에 대한 면역조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 도 3A (40 ×) 는 피츠버그대학에서 입수한 일차 성인 인간 간세포에 대한 결과를 보여준다 - 항체 염색 (우측), 세포 핵에 대한 동일 시야의 Hoechst HH33258 비스벤즈이미드 염색 (좌측). 도 3B (20 ×) 는 n-부티레이트와 함께 6 일 동안 배양한 hES 세포에 대한 결과를 보여준다. 양 세트의 세포는 간세포 계통의 세포에 특징적인 3 개의 마커, 알부민, α₁-안티트립신 및 CD18 에 대한 높은 비율의 세포 염색을 보이나, 초기 전구 세포의 마커인 α-페토단백질에 대해서는 음성을 보인다.

도 4 는 n-부티레이트에서 6 일 동안 배양한 세포의 글리코겐 염색 패턴을 보여준다 (10 ×및 40 ×). 상기 세포를 글리코겐용 과요오드산 시프 염료 (핑크, 어두운색) 및 세포 세포질에 윤곽을 부여하기 위한 Fast Green 염료 (백그라운드 녹색, 밝은색) 로 염색하였다. 부티레이트 처리 세포의 약 60% 는 태아 간세포에 서의 80% 와 비교하여 (중간열, 양성 대조군) 글리코겐 저장의 증거를 보이고 (상단열), BJ 섬유아세포로 명명된 인간 섬유아세포 세포주에서는 실제적으로 아무것도 보이지 않는다 (하단열, 음성 대조군).

표현형 분석의 요약을 표 5 에 나타낸다. 알부민 발현은 세포의 55% 에서 발견되었다. AFP 는 완전히 부재하였다. 글리코겐은 세포의 60% 이상에서 저장되고 있었다. 세포의 16% 가 BrdU 로 표지된 것은 세포의 상당 부분이 분석 시에 증식하고 있었음을 나타낸다.

RT-PCR 분석은 또한 n-부티레이트와 함께 배양한지 6 일 후에 수행하여 간세포에서 정상적으로 발현되는 다양한 유전자의 발현 패턴을 관찰하였다. 이러한 데이타를 성인 간세포, 태아 간세포, HepG2 세포 (간암종 세포주) 및 비 간세포 RPE (망막 색소 상피) 세포주에서의 동일한 유전자의 발현 패턴과 비교하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.

소듐 부티레이트의 효과를 유사한 프로토콜에서 다른 잠재적 간세포 분화 제제와 비교하였다. 배상체를 4 일 동안 현탁 배양시킨후, 콜라게나아제 I 로 코팅된 플레이트 상에 재플레이팅하였다. 이어서 세포를 각각의 화합물의 존재 하에 6 일 동안 배양하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.

5mM 의 농도에서, 염화나트륨은 효과가 없는 반면, 부티르산 및 소듐 부티레이트는 동일하게 효과적이었으며, 이는 분화가 단순히 이온 농도의 변화에 기인하지 않음을 나타낸다. 부티르산 및 [소듐]부티레이트는 배양 배지의 완충능 내인 동일한 물질의 콘쥬게이트 형태임을 독자가 이해할 것이다. 따라서, 이 용어는 명확히 할 필요가 없는 한 본 명세서에서 혼용될 수 있다.

비교의 목적으로, 부티레이트의 다양한 구조 유사체를 5mM 에서 시험하였다. 유사체인 프로피온산, 이소발레르산 및 이소부티르산은 간세포 분화를 유도하는데 효과적이었으나, 간세포 표현형을 갖는 세포 농축이 덜 강하기 때문에, 상기와 같은 조건 하에서는 덜 바람직한 것으로 여겨진다.

실시예 3: 간세포 성숙 인자에 의한 n-부티레이트의 분화 효과의 증가

다양한 가능한 간세포 성숙 인자의 효과를 n-부티레이트를 이용하여 분화된 세포에서 시험하였다. hES 를 5 mM 소듐 n-부티레이트에서 4 일 동안 배양한 후, 다른 배지로 옮겼다. 하기의 대안을 시험하였다:

1. "HCM" 배지 (Clonetics)

2. 인슐린, 표피 성장 인장 (EGF), 덱사메타존 및 글루카곤으로 보충된 10% 소태아 혈청 (FBS);

3. 인슐린, EGF, 덱사메타존 및 글루카곤으로 보충된 10% 송아지 혈청(CS);

4. 인슐린, EGF, 덱사메타존 및 글루카곤으로 보충된 20% FBS.

상기 세포를 상기 조건 하에서 4 일 동안 유지하였다. 세포는 모든 조건 하에서 생존하였으나, 성장 인자를 가진 10% FBS 에서 최상을 보였다 (2 군 및 4 군). 상기 세포를 트립신 처리하여 신선한 Matrigel

코팅 플레이트에 재플레이팅하였다. 기타 성장 인자를 유사한 프로토콜에서 시험하거나, 조합하여 간세포 성숙 및 세포 표현형에 대한 이들의 효과를 측정하였다.

실시예 4: hES-유래 간세포의 텔로머화

소듐 부티레이트로 hES 를 분화시킨 수 일 후, 세포를 텔로머라아제 역전사효소 (hTERT) 의 인간 상동체를 코딩하는 레트로바이러스로 형질도입시킨다. 이 벡터는 시판되는 pBABE 푸로마이신 구조체의 EcoR1 부위 내에 pGRN145 로 명명된 플라스미드 유래의 hTERT 코딩 서열을 포함한다. hTERT 코딩 서열은 레트로바이러스 LTR 프로모터의 제어하에 놓인다. 대조군 및 hTERT pBABE 레트로바이러스 상청액을 PA317 패키징 세포주를 이용하여 제조하여, 4㎍/mL 폴리브렌과 배합한다.

분화된 hES 세포의 배양물을 제조하고, 배지를 레트로바이러스 상청액을 함유하는 배지로 8-16 시간 동안 교환한다. 이 배지를 다시 정상 성장 배지로 교환하고, 세포를 1-2 일 동안 회수한다. 이어서 0.5-2.5㎍/mL 푸로마이신을 이용하여 세포를 선택한다. 세포는 면역세포화학 및 RT-PCR 를 이용하여 성장률 및 발현 패턴에 대하여 형태학적으로 평가된다. 텔로머라아제 활성은 TRAP 분석을 이용하여 평가된다.

실시예 5: 무영양세포 배양물 중 인간 배아 줄기 세포의 분화

미분화된 hES 콜로니를 다음과 같은 무영양세포 조건에서 연속적으로 계대하였다. 배양물을 1 mg/mL 콜라게나아제 중 37℃ 에서 약 5 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 이 세포의 표면을 긁어내어 작은 덩어리로 분리시켜 상기 세포를 회수하였다. 세포를 1:3 또는 1:6 의 비, ~55,000 세포/mL (17,000 세포/cm²) 로 분할 하였다. 재플레이팅 후, 미분화된 세포의 콜로니를 다시 확인할 수 있었다. 콜로니 사이에 있는 단일 세포들은 분화되었다. 몇일 후, 미분화된 세포는 증식하는 것으로 나타났고, 콜로니가 커지고 밀집되었다. 콜로니 사이의 분화된 세포 또한 좀더 밀집되었다. 세포는 조건 배지가 매일 공급된 4-7 일 후 콘플루언트해졌다. 세포가 콘플루언스에 도달되었을 때, 이들을 한번 더 분할하였다.

상기 예에서, H9 hES 세포 (p30+5) 를 분화 전 30 일 (5 계대) 동안 무영양세포 조건에서 유지하였다. 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있는 바와 같이, 미분화된 세포를 라미닌 상에서 유지하고, MEF-조건 배지를 공급하였다. 분화를 유도하기 위하여, 조건 배지를 5mM 소듐 부티레이트를 함유하는 SR 배지 (보충 bFGF 없음) 로 교환하였다.

이러한 조건에서 1 일 후, 간세포-유사 형태를 갖는 세포의 작은 반점을 볼 수 있었다. 또한 다수의 세포가 죽었으며 접시의 바닥에 부착되어 있는 것으로 나타났다. 부티레이트 없이 SR 배지가 포함된 대조군 배양물에서, 상당히 다양한 분화 (상이한 형태를 갖는 세포) 가 관찰되었다. 처리한지 약 6 일 후, 소듐 부티레이트가 포함된 배양물은 많은 간세포-유사 세포의 반점을 포함하지만, 기타 형태를 갖는 소수의 세포가 확인되었다. 많은 죽은 세포가 여전히 접시에 부착되어 있었다. 부티레이트가 포함되지 않은 배양물은 다양한 표현형과 더불어 매우 분화된 것으로 나타났다.

후속 실험에서, 무영양세포 조건에서 유지된 hES 세포를 계대시 소듐 부티레이트에 노출시켰다. H9 로 명명되고 Matrigel

에서 48 일 (8 계대) 유지된 hES 세포주를 콜라게나아제를 이용하여 콘플루언스에서 회수하고, Matrigel

상에 재플레이팅하였다. 이 세포를 5 mM 소듐 부티레이트를 함유하는 SR 배지로 계대하고, 부티레이트 없이 배양된 세포와 비교하여, 간세포-유사 형태 및 다양한 배양 시점에서의 유전자 발현에 대하여 평가하였다.

실시예 6: DMSO 와 배합된 부티레이트의 효과

본 실험에서, 간세포 분화 제제 부티레이트의 효과를 간세포 성숙 인자 DMSO 의 존재 하에서 측정하였다.

인간 ES 세포 유래 배상체를 현탁 4 일 후 회수하여 다음의 4 가지 조건 중에서 플레이팅하였다.

- 5 mM Na 부티레이트의 존재 하의 젤라틴 코팅 플레이트

- 5 mM Na 부티레이트 및 1% DMSO 의 존재 하의 젤라틴 코팅 플레이트

- 5 mM Na 부티레이트의 존재 하의 Matrigel

코팅 플레이트

- 5 mM Na 부티레이트 및 1% DMSO 의 존재하 Matrigel

코팅 플레이트

배지를 매 2 일 마다 교환하고, 세포를 7 일째에 면역세포화학 및 RT-PCR 로 분석하였다. 상기 모든 조건에서의 세포는 균일한 형태를 갖는 세포의 콜로니를 포함하며 형태학적으로 유사하게 보인다. 부티레이트만으로 배양된 세포와 비교하여, 부티레이트 및 DMSO 둘 다 존재하는 세트에서의 세포의 콜로니가 더 적었다. 젤라틴에 플레이팅된 2 개의 세트는 훨씬 적은 세포를 가졌다.

면역염색은 모든 조건에서 유사한 마커 표현형을 보였다. 시험된 마커의 각 각에 염색 대한 배양 세포의 백분율을 표 9 에 나타낸다.

실시예 7: 배상체의 형성없이 hES 의 간세포-유사 세포로의 직접적 분화

미분화된 hES 세포를 무영양세포 조건 (MEF-CM 중 Matrigel

상) 에서 유지하였다. 전략은 간세포 성숙인자 DMSO 또는 레탄산 (RA) 를 서브콘플루언트한 배양물에 첨가하여 전체적 분화 공정을 개시시키는 것이다. 이어서, Na-부티레이트를 첨가하여 세포가 간세포-유사 세포를 형성하도록 유도한다.

hES 세포를 분할 후 2-3 일동안 미분화된 배양 조건에서 유지하였다. 이 때, 세포는 50-60 % 콘플루언트한 상태였고, 배지는 1% DMSO 를 함유하는 비조건화 SR 배지로 교환되었다. 배양물에 SR 배지를 4 일 동안 매일 공급하고, 이어서 2.5% Na-부티레이트를 함유하는 비조건화 SR 배지로 교환하였다. 이 배양물에 상기 배지를 6 일 동안 매일 공급하였고; 이때 배양물의 1/2 을 면역세포화학으로 평가하였다. 배양물의 나머지 반은 트립신으로 회수하고 콜라겐상에 재플레이팅하여, 간세포 계통 세포에 대한 농축을 추가로 촉진시켰다. 이어서 면역세포화학을 다음날 수행하였다.

표 10 에 나타낸 바와 같이, 최종 재플레이팅된 세포는 재플레이팅되지 않은 세포보다 알부민 발현이 ~5 배 높고, α₁-안티트립신 발현은 유사하였으며, 시토케라틴 발현은 2 배 더 적었다. 세포에 대한 2 차 플레이팅은 간세포-유사 세포를 농축시키는 것으로 여겨진다.

실시예 8: hES 세포로부터 간세포 분화에 대한 상이한 매트릭스의 비교

EB 를 무영양세포 조건에서 hES 세포로부터 발생시켰다. 현탁 4 일 후, EB 를 5 mM Na-부티레이트 또는 5 mM Na-부티레이트 및 1% DMSO 로 보충된 20% FBS 배지에 플레이팅하였다. EB 를 하기 매트릭스 상에 플레이팅하였다:

1. 콜라겐 I (37℃ 에서 하룻밤 동안 0.03 mg/ml 로 코팅)

2. 성장 인자 감소 Matrigel

(실온에서 1 시간 동안 1:10 으로 코팅)

3. 젤라틴 (37℃ 에서 2 시간 동안 1 % 로 코팅)

Na-부티레이트에서 6 일 지난 후, 세포를 간세포 마커에 대한 면역세포화학 을 이용하여 형태학적으로 평가하였다. 모든 조건에서, 간세포-유사 세포의 동질한 반점이 관찰되었다. 그러나, 세포 덩어리의 수는 다른 조건과 비교하여 젤라틴으로 플레이팅된 배양물에서 현저히 감소되었다. 표 11 에 나타낸 바와 같이, 알부민, 시토케라틴 및 α₁-안티트립신의 면역반응성을 갖는 세포의 백분율은 모든 조건에서 유사하였다. 글리코겐 저장도 또한 모든 조건에서 유사하였다. 이러한 데이타는 시험된 모든 기질이 간세포 분화를 촉진하나, Matrigel

및 콜라겐 I 코팅이 젤라틴보다 더 생존을 지지함을 나타낸다.

실시예 9: 직접적 분화에 대한 조건의 추가의 최적화

hES 세포를 앞서 상술한 직접 분화 프로토콜에 따라 처리하고, 표 12 에 나타낸 배양 조건으로 조정하였다. 간세포 배양 배지는 Clonetics 로부터 구입하고; 스트롬 배지 (Strom's Medium) 를 [Runge 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 265:376, 1999] 에 기재된 바와 같이 제조한다. 수득한 세포군을 면역세포화학 및 효소 활성으로 평가한다.

후속 (4 일) 성숙 단계에서 시험된 기타 첨가제에는 덱사메타존의 존재 하의 옹코스타틴 M 및 FGF-4 와 같은 인자가 포함된다.

도 5 는 hES-유래 세포의 성숙에 대한 HCM 의 효과를 보여준다. 좌측 컬럼: 10 ×확대; 우측 컬럼: 40 ×확대. 부티레이트의 존재하에서 4 일째까지, 배양물 중의 80% 이상의 세포는 직경이 크고, 큰 핵 및 여포성 세포질을 포함한다 (A 열). SR 배지에서 5 일 후, 세포를 HCM 으로 옮겼다. 2 일 후, 많은 세포가 다핵화되고, 거대한 다각형 모양을 갖는다 (B 열). HCM 에서 4 일째까지, 다핵화된 다각형 세포가 일반적이고, 더 어두운 세포질을 가지며 (C 열), 이러한 범주로부터 이들은 새롭게 단리된 인간 성인 간세포 (D 열) 또는 태아 간세포 (E 열) 와 유사하다.

실시예 10: 대사 효소 활성

직접적 분화 프로토콜에 의해 생성된 hES-유래 간세포 계통 세포를 시토크롬 P450 활성에 대해 시험하였다.

분화 프로토콜의 종결 후, 세포를 시토크롬 P-450 효소 1A1 및 1A2 (CYP1A1/2) 에 대한 유도제인 5μM 메틸클로란트렌의 존재 또는 부재 하에 24-48 시간 동안 배양하였다. 효소 활성은 에톡시레소루핀 (EROD) 의 탈에틸화 속도로 측정하였다. 기질을 배지에 5μM 의 농도로 첨가하고, 배양 상청액의 형광도를 355 nm 여기 및 581 nm 방사에서 형광계측 마이크로플레이트 탐독기로 2 시간 후에 측정하였다. 형성된 레소루핀의 양을 정제된 레소루핀으로 측정된 표준 곡선을 이용하여 결정하고, 단백질 mg 당 분 당 레소루핀의 피코몰로 나타내었다.

도 6 은 결과를 나타낸다. CYP1A1/2 활성을 시험된 3 개의 간세포 계통 세포주에서 검출하였다; 2 개는 H1 ES 세포주로부터 유래되고, 하나는 H9 ES 세포주로부터 유래된다. 활성 수준은 메틸클로란트렌 (MC) 으로 유도가능하고, 새롭게 단리된 인간 성인 간세포 (HH) 의 2 개 제조물에서 관찰된 수준을 초과하였다. 미 분화된 H1 및 H9 세포에서의 (및 BJ 인간 배섬유아세포 세포주에서) 활성 수준은 무시할 수 있을 정도였다.

본 명세서에 기재된 조성물 및 절차는 후술되는 청구범위에 구현된 본 발명의 취지를 벗어남없이 당업자에 의해서 효과적으로 변형될 수 있음을 인지할 수 있을 것이다.

Claims (34)

1. 세포군 내의 60% 이상의 세포가 영장류 만능 줄기 (primate pluripotent stem, pPS) 세포주에서 분화된 것인 특징을 갖고 하기 목록으로부터 3 가지 이상의 추가적인 특징을 갖는, 시험관 내에서 배양될 수 있는 분화된 세포군:

   ㆍ항체로 검출가능한 α₁-안티트립신 (AAT) 의 발현;

   ㆍ항체로 검출가능한 알부민의 발현;

   ㆍ항체로 검출가능한 α-페토단백질 (fetoprotein) 발현의 부재;

   ㆍRT-PCR 로 검출가능한 아시알로당단백질 수용체 (ASGR) 의 발현;

   ㆍ글리코겐 저장의 증거;

   ㆍ시토크롬 p450 활성의 증거;

   ㆍ글루코오스-6-포스파타아제 활성의 증거; 및

   ㆍ간세포의 형태학적 특색.
2. 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포주; 및 상기와 동일한 pPS 세포주에서 분화된 것을 특징으로 하고 하기 목록으로부터 3 가지 이상의 추가적인 특징을 갖는 분화된 세포군으로 이루어진 2 가지 단리된 세포군 세트:

   ㆍ항체로 검출가능한 α₁-안티트립신 (AAT) 의 발현;

   ㆍ항체로 검출가능한 알부민의 발현;

   ㆍ항체로 검출가능한 α-페토단백질 (fetoprotein) 발현의 부재;

   ㆍRT-PCR 로 검출가능한 아시알로당단백질 수용체 (ASGR) 의 발현;

   ㆍ글리코겐 저장의 증거;

   ㆍ시토크롬 p450 활성의 증거;

   ㆍ글루코오스-6-포스파타아제 활성의 증거; 및

   ㆍ간세포의 형태학적 특색.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 pPS 세포가 인간 배아 줄기 (hES) 세포인 세포군(들).
4. 하기를 포함하는, 시험관 내에서 배양될 수 있는 분화된 세포를 수득하기 위한 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포의 처리 방법:

   a) 인간 만능 줄기 세포의 배양물을 제공;

   b) 분화된 세포를 농축시키는 조건 하에서 간세포 분화 제제를 함유하는 배양 배지 중의 기질 상에서 상기 세포를 배양.
5. 제 4 항에 있어서, 하기 특징 중 1 가지 이상을 가지는 방법:

   ㆍ세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계; 상기 배상체를 세포외 매트릭스 상에 플레이팅하는 단계; 간세포 분화 제제를 상기 배상체의 플레이팅과 동시에 또는 그 후에 상기 배지에 첨가하는 단계; 및 그 후 분화된 세포를 농축시키는 조건 하에서 상기 플레이팅된 세포를 간세포 분화 제제와 함께 배양하는 단계에 의하여 pPS 세포 배양물을 제조함;

   ㆍ상기 간세포 분화 제제를, 세포외 매트릭스는 함유하나 영양 세포는 본질적으로 없는 pPS 세포의 배양물에 첨가하고; 그 후 분화된 세포를 농축시키는 조건 하에서 상기 pPS 세포를 상기 간세포 분화 제제와 함께 배양함;

   ㆍ상기 간세포 분화 제제는 n-부티레이트와 같은 히스톤 디아세틸라아제 억제제임;

   ㆍ상기 세포를, 상기 간세포 분화 제제와의 배양과 동시적으로 또는 순차적으로 1 가지 이상의 간세포 성숙 인자와 함께 배양하는 것으로서, 이때 상기 간세포 성숙 인자 중 하나 이상이 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디메틸아세트아미드 (DMA); 헥사메틸렌 비스아세트아미드 또는 기타 폴리메틸렌 비스아세트아미드와 같은 유기 용매, 또는, 글루코코르티코이드, 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, TGF-α, TGF-β, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 헤파린, 간세포 성장 인자 (HGF), IL-1, IL-6, IGF-I, IGF-II 또는 HBGF-1 과 같은 시토카인 또는 호르몬 중 하나임.
6. 삭제
7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 pPS 세포가 인간 배아 줄기 (hES) 세포인 방법.
8. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른, 또는 제 4 항 또는 제 5 항의 방법에 따라 제조된 분화된 세포를 화합물과 배합하고 상기 화합물이 세포에 독성인지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 화합물의 간세포 독성 스크리닝 방법.
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른, 또는 제 4 항 또는 제 5 항의 방법에 따라 제조된 분화된 세포를 화합물과 배합하고, 상기 화합물과의 접촉에 따른 세포 내 임의의 표현형 또는 대사적 변화를 측정하여 상기 변화를 간세포 기능의 조절능과 연관시키는 것을 포함하는, 화합물의 간세포 독성 스크리닝 방법.
10. 세포가 플루이드 중의 독소를 제거하거나 변형시킬 수 있게 하는 조건 하에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른, 또는 제 4 항 또는 제 5 항의 방법에 따라 제조된 분화된 세포를 상기 플루이드와 접촉시키는 것을 포함하는, 생체 밖에서의 플루이드의 해독 방법.
11. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른, 또는 제 4 항 또는 제 5 항의 방법에 따라 제조된 분화된 세포를 포함하는, 개인에서의 간세포 기능의 복원 또는 보충용 약학 제제.
12. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른, 또는 제 4 항 또는 제 5 항의 방법에 따라 제조된 분화된 세포가, 환자로부터 유입되고 장치에 의해 해독된 후 상기 환자에게 복귀되는 혈액을 해독시키도록 위치되는 간 보조 장치.
13. 제 5 항에 있어서, 세포외 매트릭스가 라미닌, 콜라겐 또는 엥겔브레드-홀름-스왐 (Engelbreth-Holm-Swarm) 세포의 매트릭스인 방법.
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
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23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
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31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제

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