KR100667860B1

KR100667860B1 - 고순도 사람 혈액응고 제9인자의 정제 방법

Info

Publication number: KR100667860B1
Application number: KR1020050098235A
Authority: KR
Inventors: 강용; 최용운; 손기환; 이성래; 성학모; 허재욱
Original assignee: 주식회사 녹십자
Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2007-01-11
Also published as: CN101291951A; WO2007046631A1; CN101291951B

Abstract

본 발명은 인간혈장으로부터 고순도의 사람 혈액응고 제9인자를 정제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 고순도의 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법은 냉침전물(cryopaste)이 제거된 인간혈장을 출발물질로 하여 1차적으로 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하여 용출시킨 다음, S/D 처리(Solvent/Detergent treatment)하여 바이러스를 불활성화시킨 후, 2차적으로 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 다시 용출시킨 다음, 농축 및 여과시켜 사람 혈액응고 제9인자를 정제하는 방법에 있어서, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피로 정제되어 용출된 용액을 3차적으로 헤파린 친화 크로마토그래피(heparin affinity chromatography)를 이용하여 용출시켜 정제한 다음, 4차적으로 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)를 이용하여 비흡착액을 수집하는 방법으로 다시 정제한 후, 나노여과(nanofiltration)시켜 바이러스를 제거하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하여 제2인자, 제7인자, 제10인자 등의 불순 단백질이 거의 없이 비활성(specific acitivity)이 150 IU/mg 이상인 고순도의 혈액응고 제9인자 제제를 제공하는 효과가 있다.

혈액응고 제9인자, 이온 교환 크로마토그래피, 헤파린 친화 크로마토그래피

Description

고순도 사람 혈액응고 제9인자의 정제 방법{Method for manufacturing high purified factor IX product}

도 1은 내인성, 외인성 혈액 응고 기전을 나타낸 도이고,

도 2는 본 발명의 고순도 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법에 대한 공정도이고,

도 3은 본 발명에 의해 제조된 혈액응고 제9인자 제제와 시판되는 다른 제품의 순도를 확인하기 위한 SDS-PAGE 결과이고,

M : standard marker(myosin; 198, galactosidase; 115, BSA; 93, ovalbumin; 49.8, carbonic anhydrase; 35.8, soybean trypsin inhibitor; 29.2, lysozyme; 21.3, aprotinin; 6.4)

lane 1; 실험 1 , lane 2; 실험 2, lane 3; 실험 3, lane 4; 훽나인(621A1031), lane 5; Mononine(U22409A, exp.2001.8, Centeon 사), lane 6; Octanine(022009230, exp.2002.5, Octapharma 사), lane 7; Berinin HS 600(2326327C, exp.2003.4, Aventis 사), lane 8; Immunine STIM plus 600(05D1301H, exp.2003.7, Baxter 사)

도 4는 CM-세파로즈 FF 정제조건에 따른 pH 별 역가(activity) 안정성 결과이다.

본 발명은 인간혈장으로부터 고순도의 사람 혈액응고 제9인자를 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 혈액응고 제9인자 제제에 존재하는 제2인자, 제7인자, 제10인자 등의 불순 단백질이 거의 제거된 고순도 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법에 관한 것이다.

사람 혈액응고 제9인자는 혈액응고과정에 있어서 필수적인 당단백질로서, 유전적인 요인 또는 병리적 요인에 의하여 혈액 내에 제9인자가 존재하지 않거나 부족할 경우, 혈액에서의 혈액응고 과정이 제대로 일어나지 않아 B형 혈우병을 야기시키게 된다.

B형 혈우병은 주로 유전적으로 발생하며, 남아 신생아 30,000 ~ 50,000명 중 1명 꼴로 발병하여 희귀질환으로 분류된다. 이러한 B형 혈우병 환자의 치료를 위해 사람의 혈액으로부터 제9인자를 정제 농축하여 환자에게 투여하고 있다.

제9인자는 간에서 합성될 때 비타민 K를 필요로 하며, 다른 비타민 K-의존성 당단백질과 여러 가지 공통적 특징을 가지고 있다. 혈액응고 과정에 관여하는 비타민 K-의존성 당단백질에는 제2인자, 제7인자, 제10인자 등이 있다. 제9인자는 약 17.5% 정도의 당(4.7% 헥소즈, 6.8% N-아세틸헥사민, 6% 시알릭산)을 함유하는 단쇄구조(monomer)의 당단백질로, 세린 프로테아제(serine protease)의 일종이다. 분자량은 제9인자에 존재하는 탄수화물의 양에 따라 결정되며, 그 크기는 약 55,000 ~ 75,000 Da이다. 아미노산 서열에 근거하여 계산된 단백질만의 분자량은 약 47,054 Da이다. 분자구조내 N 말단 부근에 12개의 γ-카르복시글루탐산(carboxyglutamic acid)를 가지는 영역이 존재하며, 활성화시에는 포스포리피드(phospholipid)와 Ca2+ 를 필요로 한다. 제9인자 1분자당 산성 올리고당(acidic oligosaccharide)인 시알릭산(sialic acid)를 10분자 정도 함유하고 있어 매우 낮은 등전점(isoelectric point)을 가진다. 제9인자에 존재하는 탄수화물의 종류와 양에 따라 pI 4.0 ~ 4.6 정도의 다양성을 나타낸다.(Journal of chromatography A, 844, 1999, 119-128)

활성화 기전은 활성화된 제11인자(Factora ⅩⅠa)에 의하여 아미노산 Arg(145) ~ Ala(146) 사이와 Arg(180) ~ Val(181) 사이가 가수분해를 받아서 35개의 아미노산으로 이루어진 활성 펩티드(activation peptide)가 떨어져 나가면서 활성화된다. 또 활성화된 제7인자(Factora Ⅶa)와 조직인자(Factor Ⅲ)와 칼슘이온(Ca²⁺)을 포함하는 인지질의 복합물에 의해서도 활성화된다(도 1). 사람혈장 내에 존재하는 제9인자의 농도는 0.1μ㏖(5㎍/㎖)로 매우 낮다. 따라서 B형 혈우병 환자 치료를 위한 전혈 또는 혈장의 투여는 많은 양을 필요로 하여, 혈장내에 존재하는 피브리노겐(fibrinogen) 등과 같은 다른 단백질의 과량 투여를 동반하게 된다.

이러한 부작용을 줄이기 위해 1950년대 말에 처음으로 농축된 제9인자가 개발되었다. 그 방법은 혈장으로부터 제9인자를 바륨설페이트(barium sulfate)에 흡착시켜 침전시킨 후 세척 공정에 의해 다른 단백질들을 제거한 후 바륨설페이트에 흡착된 제9인자를 분리해 내는 것이었다. 나중에 바륨설페이트는 비독성 염인 트리칼슘포스페이트(tricalcium phosphate)로 대체되어 사용되었다. 이러한 흡착과 침전에 의한 제9인자의 농축 공정은 제9인자 뿐만 아니라 다른 비타민 K-의존성 당단백질인 제2인자, 제7인자, 제10인자도 함께 농축한다. 이러한 농축물을 프로트롬빈 복합체 농축물(Factor Ⅸ complex)라 부른다. 이러한 제9인자 복합체는 1960년대부터 B형 혈우병 치료제로 널리 사용되어 왔다.

혈장으로부터 알부민, 글로불린 등 혈액제제의 분리정제를 위해 사용되어 온 냉에탄올 분획공정으로 제9인자 복합체를 생산하기가 어려웠다. 이러한 결점을 해소하기 위해 음이온 교환수지를 이용한 컬럼 공정이 개발되었다. 즉 냉침전(Cryoprecipitation)을 통해 제8인자가 풍부하게 존재하는 냉침전물(cryoprecipitate, cryopaste)을 제거한 후 냉침전물(cryopaste)이 없는 혈장에 존재하는 제9인자를 음이온 교환수지에 흡착하여 정제 농축하는 방법이다. 이러한 공정에서도 제2인자, 제7인자, 제10인자도 함께 농축된다. 최근까지도 이러한 음이온 교환수지를 이용하여 생산된 제9인자 복합체가 B형 혈우병 환자의 치료를 위해 사용되고 있다.

그런데 제9인자 복합체의 투여 후에는 정맥 혈전증(venous thrombosis)와 파종성 혈관내응고병증(disseminated intravascular coagulation, DIC) 증상이 나타난 보고들이 있다.(Thrombosis & Haemostasis, vol 73, no.4, 584-591, vol 79, no.4, 778-783) 이런 부작용들은 제9인자와 함께 투여된 불필요한 응고 단백질의 많은 양 또는 농축물안의 불필요한 혈전형성 성분(thrombogenic components)에 의해 초래된 과응고 현상(hypercoagulable state) 때문으로 생각되어진다. 제9인자 복합체를 다량으로 오랜 기간 투여하면 정상적인 제2인자의 양이 증가하게 되며, 혈장에서 소멸되는 시간도 길어지게 된다.

제9인자 복합체의 부작용을 줄이기 위해 제2인자, 제7인자, 제10인자가 제거된 고순도 제9인자가 1990년부터 생산되기 시작하였다. 고순도 제9인자는 음이온 교환수지를 이용하여 농축된 제9인자 복합체를 헤파린 겔(Heparin gel) 또는 단일세포항체 겔 컬럼 크로마토그래피(monoclonal antibody gel column chromatography)를 이용하여 제2인자, 제7인자, 제10인자를 제거한 것으로 현재 제9인자 복합체를 대체하여 가고 있다. 또한 1997년에는 CHO 셀(cell)을 이용한 유전자 재조합 제9인자를 GI(Genetic Institute)에서 개발되어 베네픽스(Benefix)라는 상품명으로 시판되고 있다.

혈액유래 응고인자의 가장 큰 문제점은 혈액속에 오염되어 있을 수 있는 HIV, HBV, HCV 등과 같은 혈액 유래 바이러스 감염 위험이다. 따라서 혈액유래 응고인자의 바이러스 안정성을 위해 정제 농축 공정은 반드시 바이러스 제거공정을 포함하여야 한다. 일반적으로 S/D 처리로서 바이러스를 불활화시키며 효과적인 바이러스 제거 방법으로는 불활성화 및 친화성 크로마토그래피 공정을 사용하는 예가 있다. 게다가 보다 효과적인 제거방법으로 나노필터(20nm 수준)를 적용하기 위해서는 고순도 정제가 요구된다.

단일세포항체(monoclonal antibody)를 이용하면 제9인자를 선택적으로 분리하여 낼 수 있지만, 항체 생산을 위해서는 동물세포를 사용하여야 하기 때문에 동물세포 유래 바이러스에 의한 감염 위험을 배제할 수 없다. 또한 크로마토그래피 공정시 항체가 같이 용출될 수 있어 마우스 IgG에 의한 부작용을 배제할 수 없다. 따라서 바이러스 자체를 크기에 의해 완전히 분리할 수 있는 나노여과 공정이 가장 적절하다고 할 수 있다. 이에 따라 나노여과(nanofiltration)가 가능하고 다른 응고 인자가 1% 미만인 고순도 사람 혈액응고 제9인자 제조공정의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 제반 문제점을 해결하기 위하여 개발된 것으로, 본 발명은 혈우병 B 환자의 치료에 있어 제9인자 복합체에 함께 투여된 불필요한 응고 단백질이나 농축물 안의 불필요한 혈전형성 성분에 의해 초래된 과응고현상(hypercoagulable state)으로 인하여 정맥 혈전증(venous thrombosis)이나 파종성혈관내응고병증(disseminated intravascular coagulation, DIC) 등의 부작용을 없애기 위한 고순도 사람 혈액응고 제9인자를 제조하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명의 고순도의 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법을 상세히 설명한다.

도 2는 본 발명의 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법에 대한 공정도이다.

본 발명의 고순도 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법은 냉침전물(cryopaste)이 제거된 인간혈장을 출발물질로 하여 1차적으로 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하여 용출시킨 다음, S/D 처리(Solvent/Detergent treatment)하여 바이러스를 불활성화시킨 후, 2차적으로 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 다시 용출시킨 다음, 농축 및 여과시켜 사람 혈액응고 제9인자를 정제하는 종래 방법에 있어서,

상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피로 정제되어 용출된 용액을 3차적으로 헤파린 친화 크로마토그래피(heparin affinity chromatography)를 이용하여 용출시켜 정제한 다음, 4차적으로 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)를 이용하여 비흡착액을 수집하는 방법으로 다시 정제한 후, 나노여과(nanofiltration)시켜 바이러스를 제거하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 1.2차 정제 방법은 종래 사용되고 있는 방법이고, S/D 처리(Solvent/Detergent treatment)로 혈장에 존재할 수 있는 HIV, HBV, HCV 등과 같은 바이러스를 불활성화시키는 방법 또한 종래 잘 알려진 기술이다. 음이온 교환 수지는 -N⁺H₃, -N⁺R₃등의 양전하를 띠는 기능기를 가지고 있으며, 일반적으로 불용성 합성수지, 세파덱스, 토요펄, 아가로즈, 셀룰로즈, 덱스트란 등의 레진이 이용될 수 있다.

본 발명은 상기 음이온 교환 크로마토그래피로 정제된 혈장 단백질 용출액의 남아있는 기타 불순 단백질을 제거하기 위하여 혈액응고 인자에 친화성이 있는 헤파린(heparin)을 리간드(ligand)로 한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 3차 정제과정을 거치고, 상기 3차로 정제된 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하 여 양이온 교환 컬럼에 흡착되지 않고 빠져나오는 비흡착액을 수집하여 기타 잔여 불순물을 제거하는 데 그 특징이 있다.

상기 헤파린 친화 크로마토그래피는 리간드로 헤파린(heparin)을 사용하는 있는 만큼, 그 지지체(레진)로는 세파로즈, 아가로즈, 폴리아크릴아마이드 등 다양한 레진이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 범용적으로 이용되고 있는 헤파린 세파로즈 6FF 컬럼(heparin sepharose 6FF)을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 헤파린 친화 크로마토그래피 정제에 있어서, 평형 버퍼는 15 ~ 25 mM 구연산나트륨(sodium citrate), pH 6.0 ~ 8.0 에서 이루어지는 것이 바람직하고, 레진에 흡착된 단백질은 0.1 ~ 0.2 M NaCl 로 세척한 다음, 0.25 ~ 0.45 M NaCl 로 용출하여 정제하는 것이 바람직하다.

상기 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)의 컬럼 기능기(functional group)는 약양이온(weak cation)인 카복시메틸(Carboxymethyl-)(CM-), 카복시-(Carboxy-)(C-) 뿐 아니라, 강양이온(strong cation)인 설포-(Sulfo-)(S-), 설포메틸-(Sulfomethyl-)(SM-), 설포에틸-(Sulfoethyl-)(SE-), 설포프로필-(Sulfopropyl-)(SP-), 포스포-(Phospho-)(P-) 등이 다양하게 이용될 수 있으며, 컬럼 레진(resine)으로는 세파로즈(Sepharose), 세파덱스(Sephadex), 아가로즈(agarose), 세파셀(Sephacel), 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리아크릴레이트(Polyacrylate), 셀룰로즈(Cellulose), 토요펄(Toyoperl) 등이 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명에서 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 pH 4.0 ~ 5.0 에서 실시되는 것이 바람직하며, 컬럼에 흡착되지 않고 빠져나오는 비흡착액을 수집하는 것으로 정제된다. 평형 버퍼는 조건에 따라 다양하게 실시가능하나, 10 ~ 20 mM 구연산나트륨(sodium citrate), 0.25 ~ 0.35 M NaCl, 아르기닌(arginine) 0.5 ~ 1.5 g/l 에서 이루어지는 것이 바람직하다.

실시예 1 : 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 1.2차 정제

냉침전물(cryopaste)을 제거한 혈장을 출발 물질로 하여 DEAE-세파로즈 A-50 배치법(batch법)을 실시하여 단백질을 흡착시킨 다음, 염 농도를 증가시켜 레진에 흡착된 단백질을 용출하여 1차 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다.

상기 용출액의 pH 를 조정한 후 투석, 농축하여 -70 ℃에서 보관하며, 농축액을 따로 샘플링하여 관련 기준 및 시험방법에 따라 역가시험을 실시하였다.

동결된 1차 용출액을 융해한 후 청정 여과하여 수집한 후 단백질을 15mg/ml로 조정하고, 교반 완료 후 세균여과를 실시하여 S/D 처리로 바이러스 불활화 공정을 수행하였다.

불활화 공정 후액을 2차 정제 DEAE-토요펄 650M 컬럼에 흡착시킨 후 공정에 따라 용출액을 수집하여 역가시험을 실시하였다.

실시예 2: 헤파린 세파로즈 6FF 컬럼 크로마토그래피를 이용한 3차 정제

상기 실시예 1에서 정제 제조된 혈액응고 제9인자 복합체 용액 10ml을 구연산나트륨(sodium citrate) 10 mM, 글리신(glycine) 120 mM, NaCl 으로 조정하여 로딩 시료(loading sample)를 준비한 다음, 헤파린 세파로즈 6FF 컬럼(컬럼 조건 : 직경 1cm, 높이 18cm, 유속(flow rate) 1.0 ml/min, 실온)에 평형 버퍼(20 mM sodium citrate, pH 7.0)를 유입시켜 평형을 유지하는 한편, 로딩 시료(loading sample)를 흘려 흡착시키고, 평형 버퍼와 동일 용액으로 1차 세척하고, 0.1 M NaCl 로 2차 세척한 다음, 0.25 M NaCl 로 용출시켰다. 상기 용출액에 대하여 단백농도 측정 및 SDS-PAGE 를 실시하였다(BSA standard(2 mg/ml, PIERCE)). Amelung 사의 Coagulation timer KC10 을 이용하여 역가를 측정하였다.

하기 표 1은 실시예 1의 2차 정제된 용출액에 대한 실시예 2의 3차 헤파린 세파로즈 6FF 컬럼 크로마토그래피의 수율, 비활성 및 정제도에 대한 결과이다.

측정항목		실험 1	실험 2
수율(Yield)(%)		76.4	96.6
비활성(Specific Activity)(IU/mg)	로딩(load)	5.98	5.24
비활성(Specific Activity)(IU/mg)	용출	80.0	85.6
정제 배수(Purification fold)		13.4	16.3

상기 표 1에 보인는 바와 같이, 3차 헤파린 친화 크로마토그래피 정제 결과 비활성(Specific Activity)이 약 14 배 이상 증가하고, 정제도(Purification fold) 역시 약 15 배 이상 증가하는 것을 알 수 있다.

실시예 3 : 헤파린 세파로즈 6FF 컬럼 크로마토그래피의 세척 및 용출 조건조사

헤파린 세파로즈 6FF 컬럼의 세척 및 용출 조건을 확인하기 위하여 실시예 2와 동일한 방법으로 헤파린 친화 크로마토그래피를 실시하되, 세척농도 및 용출농도를 변화시키고, 아르기닌(Arginine)을 첨가하여 용출시키는 실험을 하였다.

실험구분	세척농도	용출농도	수율(%)	비활성	Purification fold	비고
실험 1,2	0.1M	0.25M	59%, 57%	88, 45	14, 7	0.1M 세척비교
실험 3,4	0.15M	0.3M	69%, 72%	67, 88	16, 16	0.3M 용출분석
실험 5,6	0.15M	0.3M	68%, 67%	71, 90	14, 17	아르기닌 첨가

상기 표 2에 보이는 바와 같이, 세척농도 0.1 및 0.15 M , 용출농도 0.25 및 0.3 M 에서 비활성 및 정제도가 양호함을 알 수 있다.

실시예 4 : 양이온 교환 크로마토그래피(CM-세파로즈 FF 컬럼)를 이용한 4차 정제

상기 실시예 2에서 3차 정제된 혈액응고 제9인자 복합체 용액 10ml을 구연산나트륨(sodium citrate) 10 mM, 글리신(glycine) 120 mM, NaCl 으로 조정하여 로딩 시료(loading sample)를 준비한 다음, CM-세파로즈 FF 컬럼(컬럼 조건 : 직경 1cm, 높이 5cm, 유속(flow rate) 1.0 ml/min)에 평형 버퍼(0.30 ~ 4.0 M NaCl, 아르기닌 1 g/l, pH 4.0 내에 20 mM 시트레이트)를 유입시켜 평형을 유지하는 한편, 로딩 시료(loading sample)를 컬럼에 흡착되지 않고 흘러 나오는 비흡착액을 수집하였다. 상기 비흡착액에 대하여 단백농도 측정 및 SDS-PAGE 를 실시하였다(BSA standard(2 mg/ml, PIERCE)). 아멜룽(Amelung) 사의 Coagulation timer KC10 을 이용하여 역가를 측정하였다.

하기 표 3은 실시예 2의 3차 정제된 용출액에 대한 실시예 4의 4차 CM-세파로즈 컬럼 크로마토그래피의 수율, 비활성 결과이다.

	버퍼 pH	염 농도	수율(%)	비활성(IU/mg)
실험 1	pH 4.0	0.30 M NaCl	74.9%	193
실험 2	pH 4.0	0.35 M NaCl	80.9%	205
실험 3	pH 4.0	0.40 M NaCl	51.0%	128

상기 표 3에 보이는 바와 같이, 버퍼 pH 4.0 및 염 농도 3.0 ~ 4.0 M 에서 비활성(specific acitivity)가 크게 증가함을 알 수 있다.

도 3은 본 발명에 의해 정제된 고순도 혈액응고 제9인자와 현재 시판되고 있는 제9인자 제제에 대한 SDS-PAGE 결과이다.

도 3에 보이는 바와 같이 본 발명에 의해 정제 제조된 혈액응고 제9인자 제제는 다른 제품에 비하여 타 불순 단백질이 거의 없어 그 순도에서 우수함을 알 수 있다.

실시예 5 : 양이온 교환 크로마토그래피(CM-세파로즈 FF 컬럼)에서 pH 의 흡착 조건 조사

양이온 교환 크로마토그래피(CM-세파로즈 FF 컬럼)에서 pH 변화에 따른 정제 조건을 조사하기 위하여 실시예 4와 동일한 방법으로 실시하되, pH 4.0, 4.1, 4.2, 4.5 로 변화시켜 실시하여 그 수율 및 비활성을 하기 표 4에 나타내었고, 4, 8, 12 시간에서 역가를 측정하여 역가 안정성을 도 4에 나타내었다.

	실험 1		실험 2
	비활성(IU/mg)	수율(%)	비활성(IU/mg)	수율(%)
pH 4.0	168	27	165	42
pH 4.1	170	58	177	80
pH 4.2	180	61	186	87
pH 4.5	172	68	167	88

상기 표 4에 보이는 바와 같이, pH 4.0 ~ 4.5 에서 비활성(specific activity)가 양호한 것을 알 수 있고, 도 4에 보이는 바와 같이, 역가 측정 8시간 까지는 양호한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6 : 대량 정제를 위한 스케일 업(Scale up)

본 발명의 고순도 혈액응고 제9인자 제제의 대량 생산을 확인하기 위해 여러번 스케일 업을 실시하였고, 각각의 단계에서의 비활성, 정제도, 수율 등을 하기 표 5 ~ 표 10에 나타내었다.

	부피 (ml)	활성 (IU/ml)	단백질 (mg/ml)	전체 활성 (IU)	전체 단백질 (mg)	비활성 (IU/mg)	정제 배수	수율 (%)
1차 정제액	9000	74.1	55.8	666900	502200	1.33	1	100
S/D 첨가전	32700	18.55	13.049	606585	426702	1.42
2차 정제 용출액	8400	32.45	5.653	272580	47485	5.74	4.3
3차 정제 용출액	24600	9.83	0.109	241818	2681	90.2	68
4차 정제 비흡착액 농축후액	1500	127.8	0.762	191700	1143	167.7	126
나노필터 후액	3000	64.4	0.388	193200	1164	166.0	125
투석 농축액(원액)	1500	126.6	0.669	189900	1004	189.2
최종원액	1500	117.3	0.613	175950	920	191.4	144	26.4

	부피 (ml)	활성 (IU/ml)	단백질 (mg/ml)	전체 활성 (IU)	전체 단 백질 (mg)	비활성 (IU/mg)	정제 배수	수율 (%)
1차 정제액	9000	68.3	44.6	614700	401400	1.53	1	100
S/D 첨가전	26100	15.2	16.0	396720	418461	0.95
2차 정제 용출액
3차 정제 용출액	37020	9.31	0.138	344656	5109	67.5	44
4차 정제 비흡착액 농축후액	2000	156.4	0.867	312700	1734	180.3	118
나노필터 후액	2500	117.2	0.651	293000	1628	180.0	118
투석 농축액(원액)	2500	117.2	0.651	293000	1628	180.0
최종원액	2800	97.4	0.555	272720	1554	175.5	115	44.4

	부피 (ml)	활성 (IU/ml)	단백질 (mg/ml)	전체 활성 (IU)	전체 단 백질 (mg)	비활성 (IU/mg)	정제 배수	수율 (%)
1차 정제액	9000	65.6	54	590400	486000	1.21	1	100
S/D 첨가전	31500	18.05	14.09	568575	443804	1.28
2차 정제 용출액	10050	4335	9.667	435668	97153	4.48	3.7	74
3차 정제 용출액	37000	10.61	0.143	392570	5291	74.2	61	66
4차 정제 비흡착액 농축후액	2500	112.75	0.593	281875	1483	190.1	157	48
나노필터 후액	5000	59.8	0.312	299000	1560	191.7	158
투석 농축액(원액)	2500	113.6	0.563	284000	1408	201.8
최종원액	2500	107.7	0.559	269250	1398	192.7	159	45.6

	부피 (ml)	활성 (IU/ml)	단백질 (mg/ml)	전체 활성 (IU)	전체 단 백질 (mg)	비활성 (IU/mg)	정제 배수	수율 (%)
1차 정제액	18000	69.4	58.7	1249200	1056600	1.182	1	100
S/D 첨가전	65400	9.11	13.354	595794	873352	0.682
2차 정제 용출액	16300	49.25	12.329	802775	200963	3.995	3.38	64
3차 정제 용출액	27500	24.63	0.277	677325	7618	88.917	75.2	54
4차 정제 비흡착액 농축후액	5000	133.7	0.738	668500	3690	181.2	153.3	54
나노필터 후액	5075	111.8	0.688	567385	3492	162.5	137.5	45
투석 농축액(원액)	3940	145	0.788	571300	3105	184	156
최종원액

	부피 (ml)	활성 (IU/ml)	단백질 (mg/ml)	전체 활성 (IU)	전체 단 백질 (mg)	비활성 (IU/mg)	정제 배수	수율 (%)
1차 정제액	17500	73.7	50.9	1289750	890750	1.449	1	100
S/D 첨가전	59300	12.51	15.1	741843	895430	0.831
2차 정제 용출액	17000	41.2	9.76	700400	165920	4.220	2.9	54
3차 정제 용출액	34000	16.5	0.25	561000	8500	66.80	46	43
4차 정제 비흡착액 농축후액	5000	59.8	0.44	299000	2200	135.3	93.4	23
나노필터 후액	5000	61.2	0.41	306000	2050	149.6	103.3	24
투석 농축액(원액)	3000	105.1	0.63	315300	1890	167.6	116
최종원액	3000	106.9	0.63	320700	1890	170.2	117.5	25

	부피 (ml)	활성 (IU/ml)	단백질 (mg/ml)	전체 활성 (IU)	전체 단 백질 (mg)	비활성 (IU/mg)	정제 배수	수율 (%)
1차 정제액	17200	71.9	53.3	1236680	916760	1.4	1	100
S/D 첨가전	60820	13.93	15	847223	912300	0.9
2차 정제 용출액	17000	49.25	11	837250	187000	4.5	3.2	68
3차 정제 용출액	30400	18.73	0.28	569392	8421	67.6	48.3	46
4차 정제 비흡착액 농축후액	4500	104.25	0.62	469125	2808	167.1	119.4	38
나노필터 후액	4300	100.3	0.6	431290	2559	168.6	120.4	35
투석 농축액(원액)	4000	106.5	0.6	426000	2416	176.3	126
최종원액	4000	97.4	0.6	389600	2404	162.1	116	32

상기 표 5 내지 표 10에 보이는 바와 같이, 여러 번 반복하여 본 발명을 실시한 결과, 최종원액에서의 비활성(specific activity)은 약 150(IU/mg) 이상의 고순도의 혈액응고 제9인자 제제가 제조되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의해 정제 제조되는 사람 혈액응고 제9인자 제제는 종래 기술과 달리 헤파린 친화 크로마토그래피에 의한 3차 정제, 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 4차 정제과정을 더 포함하여 정제함으로써, 종래에 제조 시판되고 있는 제2인자, 제7인자, 제10인자 등의 불순 단백질을 포함하는 제9인자 복합체와 달리 불순 단백질이 거의 없이 비활성(specific acitivity)가 150 IU/mg 이상인 고순도의 혈액응고 제9인자 제제를 제공하는 효과를 지닌다.

Claims

냉침전물(cryopaste)이 제거된 인간혈장을 출발물질로 하여 1차적으로 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하여 용출시킨 다음, S/D 처리(Solvent/Detergent treatment)하여 바이러스를 불활성화시킨 후, 2차적으로 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 다시 용출시킨 다음, 농축 및 여과시켜 사람 혈액응고 제9인자를 정제하는 방법에 있어서,

상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피로 정제되어 용출된 용액을 3차적으로 헤파린 친화 크로마토그래피(heparin affinity chromatography)를 이용하여 용출시켜 정제한 다음, 4차적으로 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)를 이용하여 비흡착액을 수집하는 방법으로 다시 정제한 후, 나노여과(nanofiltration)시켜 바이러스를 제거하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도의 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 헤파린 친화 크로마토그래피는 헤파린 세파로즈 6FF 컬럼 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법.
제2항에 있어서, 평형 버퍼는 15 ~ 25 mM 구연산나트륨(sodium citrate), pH 6.0 ~ 8.0 에서 이루어지고, 세척 용액의 농도는 0.1 ~ 0.2 M , 용출 용액의 농도는 0.25 ~ 0.45 M 에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)의 컬럼 기능기(functional group)는 카복시메틸-(Carboxymethyl-)(CM-), 카복시-(Carboxy-)(C-), 설포-(Sulfo-)(S-), 설포메틸-(Sulfomethyl-)(SM-), 설포에틸-(Sulfoethyl-)(SE-), 설포프로필-(Sulfopropyl-)(SP-), 포스포-(Phospho-)(P-) 에서 선택된 것이고, 컬럼 레진(resine)은 세파로즈(Sepharose), 세파덱스(Sephadex), 아가로즈(agarose), 세파셀(Sephacel), 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리아크릴레이트(Polyacrylate), 셀룰로즈(Cellulose), 토요펄(Toyoperl) 에서 선택된 것을 특징으로 하는 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법.
제4항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 pH 4.0 ~ 5.0 에서 비흡착액을 수집하는 것을 특징으로 하는 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법.
제5항에 있어서, 평형 버퍼는 10 ~ 20 mM 구연산나트륨(sodium citrate), 0.25 ~ 0.35 M NaCl, 아르기닌(arginine) 0.5 ~ 1.5 g/l 에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 사람 혈액응고 제9인자 정제 방법.