KR100533911B1 - 아민 산화효소의 활성을 갖는 혈관 점착 단백질-1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VAP-1에 관한 것으로서, VAP-1은 내피성 시알로글리코프로테인이며 이것의 세포표면 발현은 염증성 조건하에서 유도된다. 이것은 이미 L-셀렉틴 독립형태로 인간 말초 임파절 혈관 내피세포에 재순환 임파구의 결합을 매개하는 것으로 나타났다. VAP-1 cDNA는 정제되어 분자의 가장 N-말단 단부에 위치된 단일 트랜스멤브레인 영역을 갖는, 84.6KD의 타입Ⅱ 트랜스멤브레인 단백질을 엔코드하는 것으로 나타났다. VAP-1은 생체내에서 주로 170-180KD의 다이머 6개의 잠재적인 N-결합 글리코실화 부위는 세개의 추정 O-글리코실화 부위와 같이 세포의 영역에 위치된다. VAP-1는 현재 알려진 어떤 점착 분자와는 많은 유사성을 갖지 않지만 구리 함유 아민산화효소족과 매우 동일성을 갖는다. 효소평가에서는 VAP-1을 멤브레인 결합 아민 산화효소로서 정의한다. 따라서, VAP-1은 이중 기능을 갖는 새로운 형태의 점착분자이다. 적절한 글리코실화와 함께 정확한 염증 셋팅에서는 임파구 점착을 매개하는 위치에 있는 관장내피세포표면상의 VAP-1 발현이 임파구 복귀의 신규한 메카니즘에 포함된 점착수용체로서 작용하도록 한다. 다른 위치에서의 기본적인 기능은 그것의 고유한 아민 산화효소활성에 좌우된다.

Description

아민 산화효소의 활성을 갖는 혈관 점착 단백질-1{VASCULAR ADHESION PROTEIN-1 HAVING AMINE OXIDASE ACTIVITY}

본 발명은 점착기능과 아민산화효소 활성을 갖는, VAP-1으로 명명된 새로운 인간 내피 세포 점착 단백질을 엔코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 VAP-1 핵산과 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.

혈액과 조직사이의 림프구의 연속적인 재순환은 면역계의 기능에서 중요하다. 이 과정은 특이 미세환경 조직구획내의 항원 징후에 대한 반응을 전개 및 형성하는 동안에 항원연구에서 신체내의 모든 위치를 림프구가 조사하도록 한다. 그 후에 림프구는 항원을 인식하는 그 지점에 특이적으로 되돌아올 수 있으며 따라서 면역반응의 선택성을 증진시킨다. 순환 림프구상의 복합 수용체와 그들의 후모세관 세정맥내의 내피세포 표면에 발현된 그들의 리간드(ligand)사이의 점착 상호작용은 이동과정을 위한 수단과 이를 선택적으로 조절하는 방법을 모두 제공한다. 비록 최근에 자유 유동 혈액으로부터 조직내로 통과하기 위하여 순환하는 백혈구에 요구되는 연쇄물질들을 설명하는데 있어 상당한 진전이 있었지만 이 과정에서 발견되어야 할 것이 많이 남아있다. 특히, 최근에 알려진 점착분자들의 기능은 지금까지 정상적이고 염증을 일으키는 응고에서 정의되었던 모든 개개의 재순환 경로와 결합특이성을 정의하기엔 충분하지 않다.

최근 가설은 몇 가지 수용체-리간드 쌍 사이의 반복적 상호관계를 제외하고 순차적으로 연속반응에 의존하는 내피에 백혈구 점착의 다단계 모델을 제안하고 있다(Butcher, E.G.와 Picker, L.J., Science 272:60-66(1996) ; Springer, T.A. Cell 76:301-314(1994)). 혈액흐름내의 백혈구와 혈관벽사이의 초기의 일시적이며 억제하는(tethering) 상호작용은 셀렉틴(selectin)과 당단백질 리간드(glycoprotein ligand)에 의해 우선적으로 수행된다. 인테그린(Integrin)과 다른 분자들 또한 이 단계에서 역할을 할지도 모른다. 적절한 신호의 존재하에 롤링(rolling)과 샘플링단계는 그들의 Ig 상과(上科, superfamily) 리간드에 대한 활성화된 인테그린의 결합으로 조정된 단단한 점착으로 이어질 수 있다. 고정된 시토킨(cytokine)과 다른 화학적 유인제의 부분적으로 향상된 단계는 세포내의 적절한 수용체와 연속적인 형질도입의 신호에 의해서 조정된 국부적인 활성이 시작될 때 포함될 수 있다. 최종 단계는 설명하기엔 어려운 메카니즘에 의해 조직내로 내피 내층(endothelial lining)을 통해 결합된 세포간의 형질이동을 포함한다. 조직 특이 재순환 경로(Tissue specific recirculatory pathway)는 적절한 위치에서 특정 점착 분자 수용체-리간드 결합의 조절된 발현에 의해 좌우된다.

본 발명자들은 이전에 새로운 인간 내피 세포 점착 분자를 인식하고, 또한 냉동 분할 분석으로 편도선 고내피세정맥(tondillar high endotherial venule, HEV)에 결합한 림프구를 차단할 수 있는 모노클로날 항체(monoclonal antibody, MAb), 1B2에 대해 설명했었다(여기에 참고로 도입된 Salmi, M. 과 Jalkanen, S., Science 257:1407-1409(1992); 미국 특허 제 5,512,442호와 제 5,580,780호 및 미국출원 제 08/447,799호 참조). MAb 1B2는 혈관점착 단백질-1(VAP-1)에 특이적이며, 이것으로 정의 내린다. 염증 발생 상황에서 VAP-1의 표면 발현이 유도되고 그 분자는 혈관 내피세포의 관강표면에서 발견된다(Salmi, M. 등, J.Exp.Med. 178:2255-2260(1993)). 분자질량이 다른 두 종의 VAP-1는 편도선 조직의 MAb 1B2 면역침전에 의해 검출될 수 있는데, 하나는 90KD이고 다른 하나는 170-180KD이다. 그러나, 비환원(non-reducing) 상황하에서 면역검정(immunoblotting) 후엔 170-180KD종이 가장 우세하다(Salmi, M.과 Jalkanen, S.,J.EXP.Med. 183:569-579(1996)). 비록 이 세포에서 그러한 기능이 측정될 것이 남아 있다할지라도, 다소 다른 분자량을 갖는 면역반응성 VAP-1는 다른 위치, 특히 다른 평활근-함유 조직에서 뿐만 아니라 혈관계의 평활근 세포에서도 발견될 수 있다. McNab등은 VAP-1이 간장 정현 내피(hepatic sinusoidal endothelium)에서 발현되고 T림프구의 결합을 조절할 수 있는 것으로 보고했다(McNab, G. et al., Gastroenterlolgy 1110:522-528(1996)). 특이적인 글리코시다아제(glycosidase)로 소화하도록 하는 편도선 VAP-1의 연구에서 VAP-1이 α-2,3과 α-2,6 모두 결합된 형태의 풍부한 시알산 잔기물을 갖는 N-과 O-결합된 당을 모두 함유할 수 있는 시알로글리코프로테인(sialoglycoprotein)이라는 것을 보여준다. VAP-1은 전단(shear)의 조건하에서 임파조직과 시알산 의존 방법에서 탈시알화 분자(desialylated molecule)가 동결 분절 분석법에서 더 이상 림프구의 결합을 지지할 수 없을 때 HEV에 대한 림프구의 결합을 매개한다는 것을 보여준다(Salmi, M.과 Jalkanen, S. J.Exp.Med.183:569-579(1996)). 비록 이 현상을 야기시키는 매개체가 아직 입증되지 않았지만 VAP-1은 피부, 장, 편도선 및 활액에서 질병에 의해 발생된 특정 면역 조건하 상향조절(upregulate)된다(Arvilommi, A.-M등, Eur J.Immunol. 26:825-833(1996; Salmi, M.등, J.Exp,Ned. 178:2255-2260(1993)). VAP-1과 PDAd 모두 전단 조건(shear condition)하에서 PLN에 대한 림프구 결합을 매개할 수 있지만 VAP-1은 MAb MECA-79에 의해 정의된 PLN(말초 림프 결절)어드레신(addressin)(PNAd)과는 구별된다. 그러나, PNAd에 비해 VAP-1은 L-셀렉틴 독립방법(L-selectin independent manner)하에서 작동할 수 있고 L-셀렉틴 음성 림프구(L-selectin negative lymphocyte)의 결합을 지지할 수 있다(Salmi,M.과 Jalkanen, S., J. EXP. Med. 183:569-579(1996)). 따라서, VAP-1은 알려진 셀렉틴과 독립적으로 작용하는 새로운 경로에서 중요한 점착 기능을 갖는 분자이고 PLN형 HEV에 대한 림프구 결합에서 초기 상호작용을 조정하는 경향이 있다.

발명의 요약

본 발명은

(a) 도 1에 있는 아미노산 염기서열(SEQ ID NO:2)을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 핵산분자 ;

(b) 도 1에 있는 VAP-1 염기서열의 VAP-1코딩 서열(SEQ ID NO:1)을 포함하는 정제된 핵산 분자 ;

(c) 기탁 번호 DSM 11536에 함유된 VAP-1 cDNA 클론에 의해 엔코드된 아미노산 염기서열을 포함하는 VAP-1 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 핵산 분자;

(d) 기탁 번호 DSM 11536에 함유된 VAP-1 뉴클레오티드 서열의 코딩서열을 포함하는 정제된 핵산 분자;

(e) (a), (b), (c) 또는 (d)에 있는 VAP-1 뉴클레오티드 서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 정제된 핵산 분자;

(f) 유전자 코드의 변성으로 인한 (b) 또는 (d)의 핵산 분자의 코딩서열과 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 핵산 분자 ; 및

(g) (e)의 분자를 교잡(hybridize)하고 도 1에 있는 VAP-1 염기서열(SEQ ID NO:2)에 대해 최소한 80% 동일성을 나타내는 아미노산 염기서열을 갖는 VAP-1을 엔코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 혈관 점착 단백질-1(VAP-1)을 엔코딩하는 정제된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 벡터로서 작용할 수 있는 DNA 서열내로 VAP-1 핵산 분자의 염기서열로 구성된 분자가 삽입된 재조합 벡터를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이런한 VAP-1 DNA를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 VAP-1를 엔코딩하는 DNA를 도입시키는 것을 포함하는, 숙주 세포에 VAP-1을 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 도입 DNA(introduced DNA)를 함유하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명은 엔코드된 VAP-1 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건하에서 본 발명의 VAP-1 엔코딩 DNA를 함유하는 재조합 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 혈관 점착 단백질-1(VAP-1) 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 숙주세포내로 VAP-1을 엔코딩하는 핵산을 형질 전환시키므로서 숙주세포에 아민 산화효소 활성(amine oxidase activity)을 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 (a) (i)VAP-1 표적 서열(targeting sequence); 및 (ii) VAP-1 표적 서열에 결합된 조절 서열을 포함하는 DNA 구조물을 숙주세포내로 도입시키고 ; (b) DNA 구조물과 외인성(endogeneous) VAP-1 DNA 서열 사이의 동종 재조합(homogeneous recombination)에 적합한 조건하에서 숙주세포를 유지시키는 것을 포함하는, 혈관 점착 단백질-1(VAP-1)의 발현을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 VAP-1의 발현이 상기 방법에 의해 변경된 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 (a) VAP-1 표적서열 ; 및 (b) VAP-1 표적서열에 결합된 조절 서열을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 VAP-1 폴리펩티드와 아민을 반응시키는 것을 포함하는, 아민을 산화시키는 방법에 관한 것이다. 예를들면 아민은 벤질아민 또는 메틸아민 일 수 있다. VAP-1 폴리펩티드는

(a') 도 1에 있는 VAP-1 아미노산 염기서열(SEQ ID NO:2)을 포함하는 정제된 폴리펩티드 ;

(b') 도 1에 있는 VAP-1 서열에 의해 엔코드된 VAP-1 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 포함하는 정제된 폴리펩티드 ;

(c') 기탁번호 DSM 11536에 포함된 VAP-1 cDNA 클론에 의해 엔코드된 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드 ;

(d') (a')-(c')중 어느 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 상보적인 것에 교잡하고 VAP-1을 엔코드하며 도 1에 있는 염기서열(SEQ ID NO:2)과 최소한 80% 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코드된 VAP-1 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드 ; 및

(e') (a') 또는 (b')의 폴리펩티드의 에피토프 운반 부분(epitope-bearing portion)의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 포함하는 그룹으로부터 선택된 서열과 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 상기 아민 산화효소 활성을 갖는 샘플에 효과적인 양의 억제제(inhibitor)를 제공하는 것을 포함하는, 아민 산화효소 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 예를들면, 억제제는 세미카바지드(semicarbazide), 하이드록실아민(hydroxylamine), 프로파르길아민(propargylamine), 이소니아지드 (isonizid), 니알아미드(nialamide),하이드랄라진(hydrallazine), 프로카르바진(procarbazine), 모노메틸하이드라진(monomethylhydrazine), 3,5-에톡시-4-아미노메틸피리딘 및 MDL72145((E)-2(3,4-디메톡시페닐)-3-플루오로알릴아민) 일 수 있다.

본 발명은 억제(inhibition) 또는 강화(potentiation)에 의해 내피세포에 아민 산화효소의 효소 활성을 변경시키는 것을 포함하는, 림프구에 내피세포의 혈관 점착 단백질-1(VAP-1)-조정된 결합을 조절하는 방법에 관한 것이다.

도 1. 인간 폐 cDNA 라이브러리로부터 분리된 VAP-1 cDNA의 서열 및 VAP-1 단백질의 예상되는 서열. N-말단, 트립신 및 면역 정제된 VAP-1 단백질로부터 정제되고 서열화된 V8 펩티드가 박스화되어 있다. 박스 범위내에 있는 이탤릭체 아미노산 잔기는 어떤 아미노산도 펩티드 염기서열에서 순환에 해당될 수 없다고 나타낸다. 잠재적인 N-글리코실화 부위는 화살표와 원으로 표시된 아스파라긴에 의해, 그리고 예상되는 O-글리코실화 부위는 화살표된 네모에 의해 표시된다. 잔기 5와 27사이의 막투과(transmembrane) 영역은 음영에 의해 표시된다. 도면 하단의 다이아그램은 막투과 영역의 위치(채워진 TMD 부위로 도시됨)를 나타내고 분자의 세포부위에서 예상되는 글리코실화 부위의 상대적인 위치는 각각 N- 과 O-결합된 당을 표시하기 위해 N 및 O로 표시된다. 표시 막대는 50개의 아미노산을 나타낸다.

도 2. VAP-1의 막 방향과 세포위치를 확인하기 위해 COS-7 세포를 감염시킨 VAP-1의 FACS 분석. COS-7세포를 감염시키기 위해 사용된 2개의 VAP-1 발현 플라스미드의 구조를 나타내는 다이그램이 도면의 상부에 도시되었다. VAP-1은 천연 VAP-1 발현구조물(native VAP-1 expression construct)이다. VAP-1 FLAG는 VAP-1으로 표식된 FLAG 에피토프(epitope)이다. 모의 세포 감염을 위한 음성 대조군(negative control)은 VAP-1가 발현 벡터에서 역 방향으로 있는 구조물로 제공되었다. 칼럼 1 : 세포 감염에 사용된 발현구조물. 칼럼 2 : 세포감염된 세포의 불투과성(-)과 투과성(+). 칼럼 3 : 음성 대조군 MAb 염색법. 칼럼 4 : 안티-VAP-1 MAb 1B2 염색법. 칼럼 5 : 안티-FLAG MAb M2 염색법. A-F열은 세포감염에 사용된 발현 구조 또는 모의 대조군 및 세포감염된 세포의 결과로 생긴 염색 형태를 나타낸다. 화살표는 양성적으로 염색 세포군을 나타낸다. 불투과된 세포에서 염색법은 안티-VAP-1 MAb 1B2를 갖는 것으로 보여진다(FACS 판넬 B와 C열, 칼럼 4). 세포를 감염시킨 모의 대조군은 음성적이다(FACS 판넬 A열, 칼럼 4). 어떤 염색법도 VAP-1 FLAG 세포 감염된 세포에서 안티-FLAG MAb를 갖는 것으로 나타나지 않는다(C열, 칼럼 5). 그러나, 침투된 세포에서 세포를 감염시킨 VAP-1은 여전히 양성적이지만(E열, 칼럼 4) 이번에 세포를 감염시킨 VAP-1 FLAG는 안티-FLAG MAb에 대해 양성적으로 염색되어(F열, 칼럼 5) 안티-FLAG MAb에 대한 세포의 침투성은 FLAG 에피토프에 대한 접근을 가능하게 하고 따라서 이 에피토프(epitope)는 세포내에 놓여진다는 것을 나타낸다.

도 3은 VAP-1을 포함하는, 서열 데이터를 이용할 수 있는 구리 아민 산화 효소 종류(copper amine oxidase family)의 포유류 구성원의 복합 배열. 왼쪽의 라벨은 각각의 열에 배열된 특정 단백질을 나타낸다. : BSAO, 소 혈청 아민 산화효소(bovine serum amine oxidase) ; VAP-1, 인간 혈관 점착 단백질-1(human vascular adhesion protein-1) ; PDAO1, 인간 태반 디아민 산화효소 1(human placental diamine oxidase 1) ; PDAO2, 인간 태반 디아민 산화효소 2(human placental diamine oxidase 2); 쥐 DAO, 쥐 디아민 산화효소(rat diamine oxidase). 숫자는 배열된 단백질이 각각의 열에서 제1아미노산에 해당한다. 염기서열은 최신 입수가능한 데이타 베이스로부터 얻었고 GCG Pileup를 사용하여 배열되었다. VAP-1와 동일성을 갖는 잔기는 GCG 암상자를 사용하여 강조되었다.

도 4는 COS-7 세포에서 발현된 VAP-1의 시알리다제(sialidase) 처리. 감염된 VAP-1과 모의 감염된 COS-7 세포로부터 세포 용출액(lysate)은 VAP-1 MAb 1B2(레인 1-4) 또는 음성대조물 MAb 3G6(레인 5-8)을 갖고 SDS-PAGE, 면역블롯팅(immunoblottiong)과 프로빙(probing)전에 시알리다제(sialidase) (+) 또는 (-)로 처리된다.

도 5는 A. 림프구가 세척과 압착에 의해 부분적으로 제거되었던 인간 장 평활근(human gut smooth muscle)과 편도선 기질(stroma)로부터 추출된 폴리 A⁺RNA에서 VAP-1 mRNA의 노던 블롯 분석법. mRNA를 교잡하는 4.2kb가 두 트랙 모두에서 나타나고 있다. B. 다른 인간 조직에서 VAP-1 mRNA의 노던 블롯 분석법. 노던 블롯은 클론테크(Clontech) 실험실로부터 입수되었고 동일한 양의 mRNA가 각각의 레인에 로딩(load)되었다. 모든 필터를 전체 코딩서열을 함유하는 ³²P-라벨 처리된 VAP-1 cDNA 프로브로 탐침되고 고온에서 세척되었다(후-교잡 세척 조건은 65℃에서 2×45분 동안 0.1×SSC, 0.1% SPS 이었다).

도 6은 VAP-1 cDNA 조절 림프구 점착으로 세포감염된 Ax세포. A. VAP-1 cDNA 또는 모의 대조군로 안정하게 세포감염된 Ax 세포의 세포표면에서 VAP-1의 발현. 막대 그래프에서 로그 스케일(log scale)로 염색의 강도는 x축에 도시됐으며 상대적인 세포수는 y축에 도시되었다. B. VAP-1 세포 감염체에 대한 림프구의 비독립적인 결합으로 증가된 VAP-1. 상당량의 PBL(단일층의 꼭대기에 작은 둥근 구형, 예를들면 화살표로 표시된 것)은 모의 세포 감염체(오른쪽)에서 보다 VAP-1 세포감염체(왼쪽)에 더 많이 결합된다. 상-대조 현미경 사진(phase-contrast micrographs), 확대×100. C. 결합 양. 5개 독립적인 실험결과는 평균±SEM으로 표시된다.

혈관 내피 세포에서 백혈구 표면 수용체와 그들의 리간드 사이의 상호작용은 염증 부위내로 백혈구의 넘쳐 흐름 뿐만아니라 혈액과 다양한 임파 기관 사이의 림프구 이동을 정밀하게(critically) 조절한다. 백혈구-내피 세포 점착 반응을 조절하는 혈관 점착 단백질-1(VAP-1)을 엔코딩하는 cDNA 클론이 기술된다. 엔코드된 VAP-1은 놀랍게도 아민 산화효소 활성도 갖는다. 보다 고등 유기체에서 아민 산화효소는 생물기원 아민의 신진대사에 포함되는 것으로 여겨진다(McIntire, W. 와 C. Hartmann, Principles and Applications of Quinoproteins, V.L. Davisson, ed., Marcel Dekker, Inc. N.Y., Chap 6(1992)).

VAP-1 cDNA 볼트

본 발명은 도 1에 도시된 아미노산 염기서열(SEQ ID NO:2)을 갖는 혈관 점착 단백질-1(VAP-1) 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정제된 핵산 분자를 제공하는데 이는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 염기서열(SEQ ID NO:1)을 제공하는 cDNA 클론을 서열화(sequencing)하므로써 측정되었다. 뉴클레오티드 서열을 함유하는 클론은 1997년 5월 7일에 D-38124 Braunschweig, Mascheroder Weglb에 소재하는 International Depository Authority of DSMA-Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zwllkulturen GmvHdp 부다페스트 조약하에서 기탁되어 기탁번호 DSM 11536가 부여되었다. 기탁된 클론은 pUC19 플라스미드에 함유된다.

모노클로날 항체(MAb) 면역 친화성 칼럼을 사용하여 VAP-1의 90 및 170-180KD, 1분자체(monomeric)와 2분자체(dimeric) 형태는 각각 트립신과 V8 프로테아제로 소화 후 내부 펩티드 서열을 얻기 위해 충분한 양으로 평활근의 세정 용출액(detergent lysates of smooth muscle)으로부터 정제되었다. 90KD VAP-1 부분은 N-말단 서열화(sequencing)되고 인간 장 평활근으로부터 준비된 mRNA에서 RT-PCR 실험을 위해 부분적으로 변질된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하기 위해 사용되었다.

대략 700bp의 단일 cDNA 입자는 이들 프라이머를 사용하여 증폭되었고 이것의 염기서열을 확인하기 위해 pUC18내로 클론되었다. 보다 긴 cDNA 클론을 발견하기 위해 10명의 인간 cDNA 라이브러리의 판넬은 VAP-1 cDNAs를 함유하는 것들을 확인하기 위해 PCR에 의해 분석되고 강한 신호를 제공하는 라이브러리는 PCR-생성된 VAP-1 cDNA 단편으로 스크린되었다. 이 방법에서 많은 중복 cDNA 클론은 인간 폐와 심장 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. ATG 메티오닌 코돈에서 시작되는 2292bp의 연속적인 개방 판독 프레임(open reading frame)을 포함하는 도 1(SEQ ID No:1)에 기술된 바와 같이 2501bp의 단일 cDNA는 이들 클론으로부터 유도되고 pUC19로 재클론화(subcloning)된다. 도 1에 있는 이 클론에 삽입된 VAP-1 cDNA의 측정된 염기서열(SEQ ID No:1)은 도 1에 있는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID No:2)의 80-82 위치에서 개시코돈과 약 84.6KD의 분자량으로 도 1(SEQ ID NO:1)의 763개의 아미노산 잔기의 단백질을 엔코딩하는 개방 판독 프레임(open reading frame)을 포함한다.

본 발명의 VAP-1은 구리 함유 아민 산화효소(EC1.4.3.6)로 불리는 효소 종류와 동일성을 갖는다. 도 1(SEQ ID NO:2)에 도시된 VAP-1 단백질은 약 24%가 Escherichia Coli Cu-모노아민 산화효소와 동일하고 약 41-81%가 이 종류의 포유동물 구성원과 비슷하다. 발견된 가장 높은 동일성은 소 혈청 아민 산화효소에서 확인된다(81%).

다르게 표시되지 않는다면 여기에 제시된 각각의 "염기서열"은 데옥시리보뉴클레오티드의 서열로서 표시된다(약어로 A,G,C 및 T). 그러나, 디옥시리보뉴클레오티드의 염기서열은 ,DNA 분자나 폴리뉴클레오티드의 경우, 핵산 분자나 폴리뉴클레오티드의 염기서열에 의해 나열된다. RNA 분자나 폴리뉴클레오티드의 경우, 해당 염기서열은 리보뉴클레오티드의 염기서열이고(A,G,C 및 U), 여기에서 특정화된 데옥시리보뉴클레오티드 서열에서 각각의 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드(T)은 리보뉴클레오티드 유리딘(U)으로 대체된다.

본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA 형태 또는 cDNA와 클론화(cloning)에서 얻어지거나 합성으로 만들어진 게놈성(genomic) DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 이중가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA 또는 RNA는 인식 가닥(sense strand)으로 알려진 코딩 가닥일 수 있거나 반-인식 가닥(anti-sense strand) 또는 보충물(complement)로서도 언급되는 비-코딩 가닥일 수 있다.

"정제된" 핵산 분자에 의해 핵산 분자, DNA 또는 RNA가 표시되는데 이는 자연적 환경으로부터 가져오가나 합성하여 생성된다. 정제된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 시험관내에서(in vitro) RNA 전사를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 1997년 5월 7일에 기탁번호 DSM 11536으로 지정된 플라스미드에 포함된 cDNA 클론에 의해 엔코드된 아미노산 염기서열을 갖는 VAP-1 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 더 나아가 도 1에 있는 도시된 염기서열(SEQ ID NO:1)을 갖는 정제된 핵산분자 또는 상기 기술된 지정된 클론에 포함된 VAP-1 cDNA의 염기서열 또는 상기 서열 중 하나에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 분리된 분자 특히 DNA 분자는 염색체와의 실험상 교잡(in situ hybridization)에 의한 유전자 지도화 및 예를들면 노던 블롯 분석에 의해 인간 조직에 VAP-1 유전자의 발현을 검출하기 위한 프로브로써 유용하다.

본 발명은 여기에서 기술된 정제된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 기탁된 cDNA의 VAP-1 염기서열 또는 도 1에 도시된 VAP-1 염기서열(SEQ ID NO:1)을 갖는 정제된 핵산분자의 단편은 여기에 기술된 진단용 프로브와 프라이머로서 유용한 길이인 최소한 약 15nt, 보다 바람직하게는 최소한 약 20nt, 보다 더 바람직하게는 최소한 30nt, 보다 더 바람직하게는 최소한 40nt의 단편이다. 물론 50-1500nt의 보다 긴 단편도 전부는 아니지만 대부분의 기탁된 cDNA의 염기서열 중 또는 도 1에 도시된 서열(SEQ ID NO:1)에 상응하는 단편과 같이 본 발명에 따라 유용하다. VAP-1 유전자가 기탁되고 도 1에 도시된 염기서열(SEQ ID NO:1)이 제공된 이래로 이러한 DNA 입자를 생성하는 것은 본 기술분야의 기술자에게 일반적인 것일 것이다. 예를들면, 제한 핵산분해효소의 분할, 초음파분해에 의한 전단 또는 올리고 뉴클레오티드 합성은 다양한 크기의 입자를 생성하기 위해 쉽게 이용될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 강한 접종(stringent hybridization)조건 하에서 상기에 기술된 본 발명의 핵산 분자에서 폴리 뉴클레오티드의 일부, 예를들면, 기탁번호 DSM 11536에 함유된 VAP-1 cDNA 클론으로 교잡시키는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정제된 핵산 분자를 제공한다. "강한 교잡 조건(stringent hybridizaion conditions"에 의해 50% 포름아미드, 5x SSC(150mM NaCl, 15mM 트리소듐 시트레이트), 10% 덱스트란 셀페이트 및 50mM 소듐 포스페이트(pH7.6), 5x 덴할트용액 및 20 g/ml 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액에 42℃에서 일야배양(overnight incubation)되고 65℃에서 0.1×SSC에서 필터로 세척된다.

폴리뉴클레오티드의 "일부"에 교잡하는 폴리뉴클레오티드에 의해 최소한 약 15뉴클레오티드(nt), 보다 바람직하게는 약 30-70nt의 인용 폴리뉴클레오티드(reference polynucleotide)로 교잡시키는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)가 나타난다. 이것들은 진단용 탐침과 프라미머로 유용하게 사용된다. 물론, 인용 폴리뉴클레오티드의 보다 긴 부분(예를 들면 지정된 cDNA 클론), 예를 들면 50-750nt 길이부분 또는 인용 폴리뉴클레오티드의 전체길이,에 교잡하는 폴리뉴클레오티드도 전체가 아닌 기탁된 cDNA의 VAP-1 염기서열 또는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1) 중 대부분에 해당하는 폴리뉴클레오티드이기 때문에 본 발명에 따르면 탐침으로서 또한 유용하다. 이러한 일부는 보편적인 DNA 교잡기술에 따라 프로브로써 또는 예를들면 여기에 참고로 도입된 Molecular Cloning, A Laboratory Marual, 2판, Sambrook, J., Fritsch, E.F. 와 Maniatis, T.,eds., Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)에 기술된 바와같이 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 표적서열의 증폭용 프라이머로서 진단학으로 유용하다.

본 발명의 정제된 핵산 분자는 도 1에 도시된 VAP-1 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)의 80-82위치에서 개시 코돈을 갖는 개방 판독 프레임(ORF)을 구성하는 DNA 분자와 먼저 기술된 것과 사실상 다른 서열을 포함하지만 유전자 코드의 저하 때문에 VAP-1 단백질을 엔코드하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전자 코드는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 퇴화 변종을 생성하는 것은 당업계의 기술자에게 일반적인 것이다.

본 발명은 단백질, 동족체 또는 VAP-1 단백질의 유도체를 엔코드하는 본 발명의 핵산 분자의 변종에 관한 것이다. 변종은 천연 대립 유전자 또는 접합 변종과 같이 자연적으로 발생할 수 있다. "대립 유전자 변종(allelic variant)"에 의해 유기체의 염색체에 주어진 자리를 차지하는 유전자의 몇가지 선택적인 형태 중 하나로 나타난다. Gene II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, 뉴욕(1985). 비-천연적으로 발생하는 변종은 선행기술 돌연변이 유발요인 기술을 사용하여 생성될 수 있다.

이러한 변종은 뉴클레오티드 치환(substitution), 제거(deletion) 또는 첨가(addition)에 의해 생성되는 것을 포함한다. 치환, 삭제 또는 첨가는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변종은 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 모두에서 변형될 수 있다. 코딩 영역에서 변형은 전통적 또는 비-전통적 아미노산 치환, 제거 또는 첨가를 생성하기도 한다. 특히 이들 중 바람직한 것은 VAP-1 단백질 또는 이들 중 일부의 성질과 활성을 변경시키지 않는 잠재(silent) 치환, 첨가 및 제거이다. 여기에서 특히 주목하는 것은 전통적인 치환(conservative substitution)이다.

본 발명에 대해 조금 더 구체화 것은 (a) 도 1에 있는 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자; (b) 도 1에 있는 VAP-1 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)의 VAP-1 코팅서열을 포함하는 핵산 분자; (c) 기탁 번호 DSM11536에 함유된 VAP-1 cDNA 클론에 의해 엔코드된 아미노산 서열을 포함하는 VAP-1 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자; (d) 기탁 번호 DSM11536에 함유된 VAP-1 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; (e) (a), (b), (c) 또는 (d)에서 VAP-1 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; (f) 유전자 코드의 저하로 인한 (b) 또는 (d)이 핵산 분자의 코딩 서열과 다른 염기서열을 포함하는 핵산 분자; 및 (g) (e)의 분자에 교잡하고 도 1에 있는 VAP-1 서열(SEQ ID NO:2)과 최소한 90% 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 VAP-1을 엔코드하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자 등은 최소한 90% 동일하고 보다 바람직하게는 최소한 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정제된 핵산 분자를 포함한다. 이것은 그것들이 VAP-1 활성을 가지는 폴리펩티드를 엔코드하는지는 무시한다. 이것은 특정 핵산 분자가 VAP-1 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코드하지 않는 위치에서 조차도 본 기술분야에 통상의 지식을 가진 자는 핵산 분자를 어떻게 ,예를들면 교잡 프로브 또는 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로서, 사용하는지 알고 있기 때문이다. 그러나, 더 좋은 것은 도 1(SEQ ID NO:1)에 도시된 VAP-1 핵산 서열 또는 사실상 VAP-1 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코드하는 지정된 cDNA의 VAP-1 핵산 염기서열에 대해 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는 핵산 분자인 것이다.

VAP-1 폴리펩티드를 엔코딩하는 인용 염기서열(reference nucleotide sequence)에 예로 최소한 90% "동일한" 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이 VAP-1 폴리펩티드를 엔코딩하는 인용 염기서열 각각의 100nt당 10개 포인트 돌연변이(point mutation) 이상을 포함할 수 있는 것을 제외하고는 인용 서열과 동일하다고 나타난다. 어떤 특별한 핵산 분자가 예를들면 도 1(SEQ ID NO:1)에 도시된 VAP-1 뉴클레오티드 서열 또는 지정된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열에 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지는 통상적으로 Bestfit 프로그램과 같은 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다(Sisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Geneties Computer Group, University Research Park 575 Science Drive, Madison, WI 53711).

벡터와 숙주세포

본 발명은 본 발명의 정제된 DNA 분자를 포함하는 벡터, VAP-1을 엔코딩하는 DNA로 유전적으로 제작된 숙주세포 및 재조합 기술에 의해 VAP-1폴리펩티드 또는 이들의 입자의 생성에 관한 것이다.

폴리뉴클레오티드는 숙주에서 증식을 위해 선택할 수 있는 마커(marker)를 함유하는 벡터에 결합될 수 있다. 일반적으로 플라스미드 벡터는 칼슘 포스페이트 침전물과 같은 침전물 또는 충전된 지질을 갖는 복합체에 도입된다. 만약 벡터가 바이러스라면 적당한 포장 세포주(packaging cell line)를 사용하여 시험관에서(in vitro) 포장된 후 숙주세포로 형질도입될 수 있다. 선택할 수 있는 마커(marker)는 진핵세포 배양균에 대한 디하이드로포레이트 환원효소(dihydrofolate reductase) 또는 네오마이신 저항 유전자 그리고 E. coli 와 다른 박테리아를 배양하기 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 저항 유전자를 포함한다.

더 나은 것은 관심있는 폴리 뉴클레오티드에 대해 시스-활성 조절 영역(cis-acting control region)을 포함하는 벡터이다. 적당한 트랜스-활성요소(trans-acting factor)는 숙주에 의해 공급되거나 상보 벡터에 의해 공급되거나 숙주내로 도입시 벡터 자체에 의해 공급될 수 있다. 이에 관한 관점에서 더 나은 구체적인 예는 벡터는 특이적 발현하는데 이는 유도적으로 세포의 형태-특이적일 수 있을 지도 모른다. 이러한 벡터 가운데 특히 바람직한 것은 온도와 영양 첨가제와 같은 처리하기 쉬운 환경요인에 의해 유도될 수 있는 것들이다.

본 발명에 유용한 발현 벡터는 염색체 에피솜-및 바이러스-유도된 벡터, 예를들면 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 이스트 에피솜, 이스트 염색체 성분, 바쿠로바이러스., 우두 바이러스, 아데노 바이러스, 계두 바이러스, 위광견병 바이러스 및 RNA 종양 바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 벡터 및 코스미드와 파지미드와 같은 이들의 조합으로부터 유도된 벡터를 포함한다.

DNA 삽입은 몇가지 이름으로 파지 람다 PL 프로모터, E.coli lac, trp tac 프로모터, SV40초기와 후기 프로모터 및 RNA 종양 바이러스성 LTR_S의 프로터와 같은 적당한 프로모터에 효과적으로 결합되어야 한다. 다른 적당한 프로모터는 능숙한 기술자에게 잘 알려져 있을 것이다. 발현 구조(expression construct)는 전사 개시, 종료 그리고 ,전사된 영역에서, 전이를 위한 리보좀 결합 부위에서 부위를 더 함유할 것이다. 구조에 의해 발현된 성숙한 전사의 코딩 부분은 바람직하게 코딩 서열의 초기에 개시하는 전이와 코딩 서열의 말단에 적당하게 위치한 종료코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함한다.

이러한 재조합 DNA 기술은 모두 여기에 참고로 도입된 Treco 등, WO94/12560과 Treco등. Wo95/31560에 기술된 재조합 방법도 포함하고 이는 세포에서 VAP-1 발현과 아민 산화효소 활성을 변형하기 위해 적용될 수 있다. 특히, 조절영역(예를 들면, 프로모터)은 내생적인(endogenous) VAP-1의 발현을 변경시키기 위해 숙주 게놈(host genome)에 도입될 수가 있다.

따라서, 본 발명은 혈관 점착 단백질-(VAP-1)의 발현이 변경되고 (ⅰ) VAP-1 표적 염기서열; (ⅱ) VAP-1 표적 염기서열에 결합된 조절서열을 포함하는 숙주세포, DNA 구조내로 도입시키고; (b) 유사한 재조합에 적당한 조건하에서 DNA 구조와 내생적인 VAP-1 염기서열 사이에 숙주세포를 유지시키는 것을 포함하는 재조합 숙주세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 VAP-1의 발현이 상기 발명에 의해 바뀌어 왔던 점에서 재조합 숙주 세포에 관계있다. VAP-1의 발현을 변경시키는 것은 천연 유전자의 발현을 불활성화시키기 위해 본 발명의 서열을 사용하는 것도 포함한다. 유사한 재조합 또는 표적은 내생적인 VAP-1과 정상적으로 관련된 조절 영역을 대체하거나 무력하게 하기 위해 사용되고 조절 서열은 유전자가 해당하는 세포로 감염되지 않은 세포에서 증거보다 높은 수준에서 발현되도록 하거나 해당하는 세포로 감염되지 않은 세포에서 증거와 다른 조절 또는 유도패턴을 제시하도록한다. 따라서 본 발명은 세포에서 소정의 생성물을 엔코드하는 내생적인 유전자를 활성화시키므로서 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

만약 DNA 구조물이 표적으로 된다면 이것은 최소한 표적서열과 바람직하게는 조절 서열을 포함해야 한다... Treco등 WO94/12650과 Treco등 WO/31560dp 기술된 것과 같이 선택 가능한 마커, 확대가능한 마커 또는 엑손 그리고 비접합 도너 부위와 같은 추가적인 구조들이 종종 있다. 이러한 구조에서 DNA는 외인성 DNA로써 언급될 수 있고 이는 본 발명의 방법에 의해 숙주세포 내로 도입된다. 외인성 DNA는 세포감염 전의 세포에 존재하는 외인성 DNA와 동일하거나 다른 서열을 처리(process)할 수 있다.

DNA 구조의 표적 염기서열은 VAP-1 자리에서 VAP-1 gene을 포함하는 선택된 세포의 게놈내로 적당한 유사한 재조합을 가능하게 하는 DNA 서열이다. 표적서열은 한 예로 일반적으로 조절서열의 양쪽 말단에서 얻어지고 위치되는 세포의 게놈내에 정상적으로 존재하는 VAP-1 DNA서열과 유사한 DNA서열이다. 사용된 표적 서열은 DNA구조가 삽입되어지는 VAP-1부위에 대해 선택된다.

DNA구조의 조절서열은 하나 이상의 프로모터, 강화제, 골격-부착 영역 또는 세포간질 부착부위, 음성조절성분, 전사 용소결합부위 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.

DNA 서열의 도입 부위는 일반적으로 내생적인 VAP-1 유전자 내 또는 상부 또는 VAP-1 유전자 기능에 영향을 미치는 부위 일 것이다. 내생적인 VAP-1 유전자의 발현을 변경하는 DNA서열은 단일 DNA구조 또는 세포감염된 세포의 게놈에서 물리적으로 결합되는 분리된 DNA 서열로서 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 더욱이, DNA는 한쪽 또는 양쪽 말단에서 단일 가닥 영역을 갖거나 갖지 않고 선형, 이중가닥 DNA로서 도입될수 있거나 DNA는 원형 DNA로서 도입될수 있다. 조절 DNA가 숙주 세포내로 도입된 후 세포는 게놈성 DNA와 도입된 DNA의 일부 사이에 발생하는 유사한 재조합에 적당한 조건하에서 유지된다. 게놈성 DNA와 도입된 DNA 사이의 유사한 재조합은 내생적인 VAP-1유전자의 발현을 변경시키는 서열이 VAP-1 유전자에 효과적으로 결합되는 유사한 재조합 숙주세포를 가져온다. 본 방법에 의해 생성된 결과로 생긴 유사한 재조합 숙주세포는 시험관내에서(in vitro) VAP-1 단백질을 생성하므로서 VAP-1단백질의 발현에 적당한 조건하에서 배양될 수 있거나 세포는 VAP-1 단백질의 생체내(in vivo) 운반(즉, 유전자 치료)에 사용될 수 있다.

표적 결과는 새로운 조절서열(예를들면, 프로모터 또는 강화제 또는 두가지 모두에, 내생적인 유전자의 조작에 의해)의 조절하에서 내생적인 VAP-1유전자를 위치시키는, 조절서열의 간단한 삽입일 수 있다. 표적 결과는 조직-특이적 음성조절 성분의 제거와 같은 조절 성분의 간단한 제거일 수 있다. 표적 결과는 존재하는 성분을 대체할 수 있다; 예를들면, 조질-특이적 강화제는 자연적으로 발생하는 성분보다 넓거나 다른 세포-형태 특이성을 갖고 해당하는 세포감염되지 않은 세포와 다른 조절 또는 유도패턴을 나타내는 강화제에 의해 대체될 수 있다.

유전자 표적은 다른 유전자로부터 분리된 조절서열 또는 유전학적인 처리 방법에 의해 합성된 새로운 조절서열을 갖는 VAP-1의 존재하는 조절 영역에 대체하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 외인성 DNA의 도입은 내생적인(게놈성)서열의 모두 또는 일부를 대체하거나 그렇지 않으면 내생적인 서열의 기능을 파괴하므로서 내생적인 VAP-1 유전자의 발현을 조절하는 내생적인 서열의 손상을 가져온다.

받아들이는 숙주세포에서 외인성 DNA의 발현을 위해 필요한 추가적인 서열과 함께 외인성 DNA, 임의적으로 선택할 수 있는 마커를 코딩하는 DNA를 포함하는 DNA구조가 VAP-1생성이 변경되는 세포를 세포감염시키기 위해 사용된다. 더욱이 내생적인 유전자 발현을 변경시키기 위한 유사한 재조합 방법의 상세한 설명은 모두 여기에 참고로 도입된 Treco등 WO94/12650과 Tresco등, WO95/31560에 제공된다.

DNA 또는 재조합 구조들은 형질전환, 세포감염, 일렉트로포레이션, 현미주사, 형질도입, 칼슘포스페이트 침전 및 리포좀-, 폴리브렌- 또는 DEAE 덱스트란- 매개된 세포감염을 포함하는 다양한 방법에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 이러한 방법은 Davis 등, Basic Method In Molecular Biology(1986)에서와 같이 많은 표준 실험 안내서에 기술된다. 대안으로, RNA 종양 바이러스, 포진, 아데노 바이러스, 아데노바이러스계, 유행성 이하선염 및 폴리오 바이러스 벡터와 같은 감염성 벡터가 DNA 구조를 도입하기 위해 사용될 수 있다.

적당한 숙주의 대표적인 예는 제한되는 것은 아니지만 E. Coli, Streptomyces와 Salmonella typhimurium세포와 같은 박테리아 세포, 이스트 세포와 같은 균성 세포, Drosophila S2와 Spodoptera sf9세포와 같은 곤충세포, Ax와 CRL 1998 세포(모두 내복조직 세포)와 같은 동물세포, CHO, COS와 Bowes 흑색종 세포 및 식물세포를 포함한다. 상기 기술된 숙주세포를 위한 적당한 배양균 배지와 조건은 본 기술분야에 알려져 있다.

적합한 원핵세포와 진핵세포 벡터는 능숙한 기술자라면 쉽게 알수있을 것이다.

본 발명에서 사용하기 위해 적당한 알려진 박테리아 프로모터 가운데는 E. coli lac I와 lac Z 프로모터, T3와 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 P_R과 P_L프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적당한 진핵세포 프로모터는 CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, Rous 육종 바이러스(RSV)의 프로모터와 같은 RNA 종양 바이러스 LTRs의 프로모터 및 쥐 메탈로티오네인-I 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다.

보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 VAP-1 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 전사는 벡터내에 강화제 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 강화제는 주어진 숙주세포 형태에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키기 위해 작용하는 보통 약 10-300bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 강화제의 예는 bp100-270에서 복제 기관의 뒤쪽에 위치되는 SV40 강화제, 세포확대 바이러스 초기 프로모터 강화제, 복제기관의 뒤쪽에 있는 폴리오마 강화제 및 아데노 바이러스 강화제를 포함한다.

VAP-1 폴리펩티드는 용해단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고 분비신호뿐만 아니라 추가적인 이종 기능영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가적인 아미노산 영역, 특히 전하를 띤 아미노산은 정제 또는 연속적인 작업 및 저장동안 숙주 세포에서 안정성과 지속성을 개선시키기 위해 VAP-1 폴리펩티드의 N-말단에 첨가될 수 있다. 또한, 펩티드 분자(moiety)는 정제를 촉진시키기위해 VAP-1폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조에 앞서 제거될 수 있다. 다른 것들 가운데 분비 또는 배설을 생기게 하고 안정성을 개성시키고 정제를 촉진시키기 위한 폴리펩티드 분자의 첨가는 본 기술분야에서 익숙하고 일반적인 기술이다.

VAP-1 단백질은 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 잘 알려진 방법에 의한 재조합 세포배양균으로부터 회수되고 정제될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 과정의 생성물 및 예를 들면 박테리아, 이스트, 고등식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포 숙주로부터 재조합 기술에 의한 생성된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 과정에 사용된 숙주에 따라 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다.

VAP-1 폴리펩티드 및 단편

도 1(SEQ ID NO:1)의 VAP-1 cDNA의 미리 결정된 뉴클레오티드 서열은 도 1(SEQ ID NO:1)에서 뉴클레오티드 서열의 80-82 위치에서 개시코돈과 84.6KD의 분자량을 갖는 도1(SEQ ID NO:2)의 763 아미노산 잔기의 단백질을 엔코딩하는 개방판독 프레임(open reading frame)을 포함한다.

단백질은 모노머당 6개의 잠재적인 N-글리코실화 부위와 3개의 추정되는 0-글리코실화 부위 (0-글리코실화 부위 예견 Email 서버, NetOoglyc@cbs.dtu.dk를 사용하여 결정(Hansen 등, Biochem, J. 308:801-813(1995))를 갖는다(도1).

따라서, 본 발명은 지정된 cDNA에 의해 엔코드되는 아미노산 서열을 갖는 정제된 VAP-1 폴리펩티드, 1(SEQ ID NO:2)에서 아미노산서열 또는 상기 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제동한다. 용어 "펩티드"와 "올리고펩티드"는 동의어(일반적으로 인정되는 바와같이)로서 간주되고 각각의 용어는 문장이 펩티드 결합에 의해 결합된 최소한 2개의 아미노산 사슬을 나타내기 위해 필요할 때 바꿔가며 사용될 수 있다.

VAP-1 폴리펩티드의 약간의 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 중요한 영향없이 다양해질 수 있는 것으로 본 기술분야에서 인정될 것이다. 따라서, 본 발명은 본질적인 VAP-1폴리펩티드의 활성을 보이는 VAP-1 폴리펩티드의 변종을 포함한다. 이러한 돌연변이는 유사한 잔기의 제거 삽입, 전환, 반복 및 치환을 포함한다. 작은 변화 또는 이러한 "중성"아미노산 치환은 일반적으로 활성에 거의 영향을 미치지 않는다. 표현형질적으로 무증후성(silent)인 것 같은 (즉, 기능에 심각한 해로운 영향을 미칠 것 같지 않은) 아미노산 변화에 관한 안내는 Bowie, J. U.등, Science 247 ; 1306-1310(1990)에서 찾을 수 있을 것이다. 변화는 VAP-1 단백질의 접힘(folding) 또는 활성에 심각한 영향을 미치지 않는 일반적인 아미노산 치환과 같은 최소의 성질이다.

기능에 기본적인 본 발명의 VAP-1 단백질에서 아미노산은 부위 지향성 돌연변이 유발요인(sited-directed mutagenesis)과 제거 분석(deletion analysis)과 같은 본 기술분야에 알려진 방법에 의해 입증될 수 있다. 결과로 생긴 돌연변이 분자는 아민 산화효소 활성 또는 점착기능과 같은 생물학적 활성이 시험된다.

본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게 사실상 정제된 형태로 제공된다. VAP-1폴리펩티드의 재조합적으로 생성된 이형(version)은 사실상 예를 들면 스미스와 존슨, Gene 67 : 31-40(1998)에 기술된 1단계 방법에 의해 정제될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 상기 기술된 것에 대해 최소한 90%의 유사성, 보다 바람직하게는 최소한 95% 유사성 및 더욱 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 지정된 cDNA에 의해 엔코드된 VAP-1폴리펩티드 또는 도 1(SEQ ID NO:2)의 VAP-1 폴리펩티드와 최소한 90% 또는 95%, 보다 더 바람직하게 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하고 최소한 30 아미노산과 보다 바람직하게는 최소한 50 아미노산을 갖는 이러한 폴리펩티드의 일부도 포함한다.

예를 들면 VAP-1 폴리펩티드의 참고 아미노산 서열과 최소한 90%동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 의해 폴리펩티드 서열이 VAP-1 폴리펩티드의 참고 아미노산의 각각의 100 아미노산 당 10개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 것을 제외하고는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 참고서열과 동일하다.

본 발명의 폴리펩티드는 폴리클로날과 모노클로날 항체를 발생시키기 위해 사용될 수 있고 이는 VAP-1 단백질 발현을 검출하기 위한 평가 또는 VAP-1 단백질 기능을 강화하거나 억제시킬 수 있는 작용물질과 길항물질로서 유용하다. VAP-1에 대해 발생된 모노클로날 항체의 상세한 것은 모두 여기에 참고로 도입된 Salmi,M.과 Jalkanen, S., Science 257 : 1407-1409 (1992), 미국 특허 제 5512442와 5580780호 및 미국출원 제 08/44799호에 기술된다. 더욱이, 이러한 폴리펩티드는 본 발명에 따라 후보 작용물질과 길항물질인 단백질을 결합하는 VAP-1단백질을 "포획(capture)"하기 위한 이스트(yeast) 2개 교잡 시스템이 사용될 수 있다(Fields와 Song, Nature 340:245-246(1989)).

여기에 사용된 바와같이, 용어 "항체(Ab) 또는 "모노크로날 항체"(MAb)는 VAP-1단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 입자(예를 들면 Fab와 F(ab)2 입자와 같은) 뿐만 아니라 완전한 분자라는 것을 의미된다. Fab와 F(ab`)2입자는 완전한 항체의 Fc입자가 부족하고 순환으로부터 쉽게 제거되며 완전한 항체 보다 덜 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다(WahI등, J, Nucl.Med : 316-325(1983)). 따라서, 이들 입자가 바람직하다.

본 발명의 항체는 다양한 방법 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, VAP-1 단백질을 발현하는 세포 또는 이들의 항원입자는 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생성을 야기하기 위해 동물에 투여될 수 있다. 보다 나은 방법으로, VAP-1 단백질의 제조는 사실상 천연 오염물질이 없게 하기 위하여 제조되고 정제된다. 이러한 제조는 보다 큰 특이적 활성의 모노클로날 항혈청을 생성하기 위해 동물내로 도입된다.

가장 바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체(또는 이들의 입자를 결합하는 VAP-1 단백질)이다. 이러한 모노클노날 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. (kohler 등 nature 256 : 495(1975) : kohler 등, Eur. J. Immunol. 6 : 511(1976) ; Kohler 등, Eur. J. Immunol. 6 : 292(1976) : Hammerling 등. In : Monoclonal Antibodies ard T-cell Hybridomas. Elesvier N.Y. (1981) pp. 563-681

Fed. F(ab')2와 본 발명의 항체의 다른 입자는 여기에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있다고 여겨진다. 이러한 입자는 전형적으로 파파인(Fab 입자를 생성하기 위해)또는 펩신(F(ab')2 입자를 생성하기 위해)과 같은 효소를 사용하여 단백질 가수분해 분열에 의해 생성된다. 대안으로, VAP-1 단백질 결합 입자는 재조합 DNA기술의 적용 또는 합성화학을 통해 생성될 수 있다.

" 인간화 된" 공상의(chimeric) 모노클로날 항체는 상기에 기술된 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 유도된 유전적인 구조물을 사용하여 생성될 수 있다. 공상적인 항체를 생성하기 위한 방법은 선행기술에 알려져 있다. 검토를 위해 Morrison, Science 229 : 1202(1985) : 등, Biotechniques 4:214(1986) : Cabilly 등 미국특허 제 4,816,567호 : Tonguchi등, 유럽특허 제 171,496호를 참조하라.

VAP-1 용도

본 발명의 VAP-1는 구리함유 아민 산화효소(효소 주문 분류, EC 1.4.3.6)로 언급된 효소 종류와 상당한 동일성을 갖는다. 도 1(SEQ ID NO:2)에 도시된 VAP-1 단백질은 Escherichia coli Cu-모노아민 산화효소와 약 24% 동일하고 이 종류의 포유동물 구성원과 약 41-81% 유사하다. 발견된 가장 높은 동일성은 소 혈청 아민 산화효소(81%)에서 갖는다. 벤질아민, 모노벤질아민 산화효소(MAO) 기질을 사용하는 중요한 아민 산화효소 효소 활성은 CHO 세포를 발현하는 VAP-1에서 검출되지만 모의 세포 감염된 세포에서는 검출되지 않는다. 구리 함유 모노아민 산화효소, 세미카바지드 및 하이드록실 아민의 억제제 존재하에서 VAP-1은 벤질아민에 대해 어떤 활성도 갖지 않는다.

따라서, 본 발명의 DNA에 의해 엔코드된 펩티드는 아민 산화효소 활성을 갖는 VAP-1 폴리펩티드와 아민을 반응시키므로서 아민을 효소적으로 산화시키기 위해 사용될 수도 있다. 아민은 예를 들면 특정 내생적(endogenous)이고 생체이물(xenobiotic)인 방향족 아민 일 수 있다. 아민은 벤질 아민이 가장 좋다.

아민 산화효소 기질로서 벤질아민의 아민 산화효소 분석 조건은 Material and Method section, infra에 상세히 기술되어 있다. 0.2-5 ml, 바람직하게는 0.5 ml의 최종부피에서 소듐 포스페이트 완충액이 0.05-0.2 mM, 바람직하게는 0.1 mM의 최종 조건을 위해 첨가 된다. 라벨처리되지 않는 벤질아민은 1-100 nmol 바람직하게는 80 nmol의 농도로 첨가되고 ¹⁴C-벤질아민은 활성이 0.1-1.0 μCi, 바람직하게는 0.4 μCi가 되도록 첨가된다. 0.05-0.5 ml, 바람직하게는 0.1 ml의 세포용해질 샘플이 평가를 위해 첨가될 수 있다. 37℃에서 1시간 동안 배양후, 아민 산화 효소 반응의 알데히드 생성물은 0.1-0.5 g/l, 바람직하게는 0.35 g/l의 디페닐 옥사졸을 함유하는 톨루엔으로 추출된다. 추가적인 추출은 톨루엔/디페닐 옥사졸 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다. 첫 번째 추출( 및 두 번째 추출)은 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)에서 ¹⁴C로 계산된다.

본 발명은 효과적인 양의 아민 산화효소 억제제를 제공하므로서 VAP-1 아민 산화효소 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 억제제는 예를 들면 세미카바자이드, 하이드록실아민, 프로파르길아민, 이소니아지드, 니알아미드, 하이드랄라진, 프로카바진, 모노메틸하이드라진, 3,5-에톡시-4-아미노메틸피리딘 또는 MDL 72146((E)-2-(3,4-디메톡시페닐)-3-플루오로아릴아민), 바람직하게는, 세미카바지드 또는 하이드록실 아민일 수 있다. 세미카바지드는 10-1000 μM의 농도로 제공될 수 있다. 하이드록실아민은 0.1-100 μM의 농도 또는 여기에서 1-10 또는 2-8μM과 같은 범위, 바람직하게는 5 μM의 농도로 제공될 수 있다.

본 발명에 따라 림프구에 대한 내피의 혈관 점착 단백질-1(VAP-1)-매개된 결합은 숙주에 대해 아민 산화효소의 억제제 또는 증가제를 제공하므로서 매개될 수 있다. 숙주는 포유동물 세포주, 동물 또는 인간일 수 있다. 본 발명은 처리를 위해 시험관내(in vitro) 또는 생체내에서(in vivo) 사용될 수 있다.

본 발명이 일반적으로 기술될지라도 동일한 것은 설명에 의해 제공되고 제한되지 않는 실시예를 통해 보다 쉽게 이해될 것이다.

실시예 1

VAP-1 cDNA의 분리

VAP-1이 강하게 발현되는 인간 장기 평활근을 수술과정에서 제거된 물질로부터 얻어진 VAP-1 단백질의 정제원으로 사용했다. Mab면역친화성 컬럼을 사용하여 90 및 170-180KD 형태의 VAP-1을 트립신 및 V8 프로테아제로 소화 후 내부 펩타이드 서열을 얻기에 충분한 양으로 평활근의 세정 용출액으로부터 정제했다. 또한, 일부의 90KD VAP-1을 직접적으로 N-말단 서열화 했다. 두 형태의 VAP-1로부터 펩타이드를 정제하기 위해 사용된 HPLC컬럼으로부터의 펩타이드 용리도(elution profile)는 상응하는 피크의 펩타이드 서열에서와 같이 동일했는데 이는 단백질이 두 90KD 서브유니트(subunit)로 이루어진 다이머(dimer)인 것을 나타낸다.

일부의 VAP-1 펩타이드 서열들을 인간장기 평활근으로부터 제조된 RNA상에 RT-PCR 실험을 위한, 부분적으로 변성된 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 설계하는데 사용했다. 약 700 bp의 단일 cDNA 단편을 이 프라이머들을 사용하여 증폭하고 rm 서열을 확인하기 위해 pUC18로 클론했다. 이 cDNA 서열은 면역정제된 VAP-1 물질의 트립신성 및 V8 펩타이드의 서열 일부를 함유하는 단백질을 엔코드한 연속적인 오픈 판독 프레임을 함유했으며 이에 의해 정확한 cDNA 단편이 증폭되었음을 확인했다. 보다 긴 cDNA 클론을 분리하기 위해 PCR로 10개 인간 cDNA 라이브러리의 패널을 분석하여 VAP-1 cDNA's를 함유하는 것들을 확인하고 가장 강한 신호를 나타내는 라이브러리를 PCR-생성 VAP-1 cDNA 단편으로 스크린했다.

이 방법으로, 인간의 폐와 심장 cDNA 라이브러리로부터 다수의 중복 cDNA클론을 분리했다. ATG 메티오닌 코돈에서 시작하는 2292bp의 연속적인 개방 판독 프레임을 함유한 2501bp의 cDNA를 이들 클론으로부터 유도하여 pUC19로 서브클론했다. 개시 코돈에 이어 정제된 90KD VAP-1 단백질의 N-말단에서 발견된 펩타이드 서열이 후속하며 부근의 개방판독 프레임은 단백질 서열화(도 1)에 의해 확인된 VAP-1 트립신성 및 V8 펩타이드 모두를 엔코드했다. TAG 정지 코돈에 이은 80 bp의 5`미번역 영역 및 120 bp의 3`미번역영역이 클론에 존재한다. 폴리아데닐화 신호 뿐만 아니라 폴리 A 서열도 cDNA의 3`말단부에서 발견되지 않았는데 이는 천연 VAP-1 mRNA가 여기에서 분리된 cDNA 의해 나타난 것보다 더 길다는 것을 암시한다.

cDNA를 함유하는 발현 벡터로의 형질감염에 의한 COS-7세포에서의 VAP-1의 일시적인 발현은 VAP-1 MAb, 1B2를 갖는 세포 개체군의 강한 표면 염색을 나탸냈다(도 2, FACS 패널 B 열, 컬럼4). 감염된 세포 대조군은 음성이었다(도 2, FACS 패널 B 열duf, 컬럼 4). 따라서 cDNA가 분리되어 VAP-1 cDNA 형질감염세포의 표면상에 발현된 면역반응의 VAT-1을 엔코팅하는 것으로 결론지어 진다.

VAP-1 단백질

개방 판독 프레임은 84.6KD의 763개의 아미노산 단백질을 엔코드한 VAP-1 cDNA에 함유되었다. 입수가능한 단백질 서열 데이터 베이스의 조사에서는 VAP-1가 구리함유 아민 옥시다제의 효소족과 매우 동일성을 갖는 것으로 나타났다(Enzyme Commission Classification, EC1.4.3.6). 이러한 동일성은 E.coli Cu-모노아민 옥시다제에 대해서 24%에서 이 족의 포유동물구성원에 대해서 41-81%까지 다양하다. 발견된 가장 높은 동일성은 분자의 N-말단에서의 짧은 영역을 제외하고 단백질 전체 길이에 걸쳐 유의한 보존을 나타낸 소 혈청 아민 옥시다제(81%)에서 였다. 서열 데이터가 이용가능한 구리 함유 아민 옥시다제족으로 이루어진 네 개의 다른 포유동물 구성원에서의 VAP-1 다양한 계열은 도 3에서 보여진다.

VAP-1은 현재 알려진 어떤 점착 분자와도 유의한 동일성이 없으며 잔기 726-728사이에서의 RGD 모티브(motif) 발생을 알고 있음에도 불구하고 그러한 단백질내에서 종종 발견되는 단백질 도메인을 전혀 함유하고 있지 않다. 이러한 일반적으로 발생하는 모티프의 인테그린 결합과 관련한 기능적 중요성은 어쨌든 아직알려지지 않았다. 단백질은 모노머당 6 잠재적 N-글리코실화 부위 및 3 추정되는 0-글리코실화 부위(0-글리코실화 부위 예측을 사용하여 측정하였을 때, Email server, NeOglyc@ cbs. dtu, dk 한센(hansen) 등, Biochem. J. 308 : 801-813(1995)를 갖는다(도 1).

단백질 서열의 실험에서는 도 1에 도시된 분자의 가장 N-말단 (잔기 5-27)에서 ,우세적으로 소수성인, 23 아미노산의 위치를 제외하고 막 스패닝(spanning)도메인 특성을 갖는 뚜렷한 지역이 나타나지 않았다. 이 지역은 본 헤인(von Heijne)의 G., Nucl. Acids Res. 14:4683-4690(1986)의 방법으로 측정했을때 위치 19에서 잠재적 분할 부위를 포함했기 때문에 분할가능한 증거로서 또는 투과막 도메인으로서 해석될 수 있다. 90KD VAP-1 단백질의 N-말단 단백질 서열은 이러한 소수성 영역이 우리가 정제한 물질에서 분할되지 않았으며 분비를 위한 정상적인 분할 신호서열로서 작용할 수 없었다는 것을 나타냈다. 또한, 소수성 영역측면에 갖는 전하를 띤 성질은 세로질의 N-말단과 C-말단을 갖는 타입 II 막단백질(하트만, 이(Hartman, E) 등, Proc. Natil Acad. Dci. USA 86:5786-5790(1986))의 막 스패닝 도메인 일 수 있다는 것을 나타냈다.

Transmembrane domain처럼 소수성 지역의 같은 기능을 갖고 있는지 그리고 막에서 VAP-1의 방향을 확실히 하는지를 증명하기 위해서 우리는 상업적으로 이용할 수 있고 MAb M2에 의해서 인식되어진 FLAG 에피토프가 추정적인 Transmembrane domain의 예견되는 cytoplasmic 부분에 초기 methionine 코돈이 시작한 후에 틀안으로 옮겨지는 곳에 VAP-1 cDNA 발현 물질들을 말들었다. 이 제작물과 운반체 안에서 역 방향으로 옮겨진 VAP-1 cDNA 대조군 제작물들은 COS-7세포들로 옮겨졌고, M2와 1B2 각각에 의해서 인식되어진 FLAG와 VAP-1 에피토프들의 일시적 발현은 투과된 것과 그렇지 않은 세포들의 FACS 분석 의해서 분석되어졌다(도.2). FLAG의 염색은 오직 투과가 된 세포에서만 나타났고, 반면에 VAP-1 염색은 투과된 것과 투과 되지 않은 것 모두에서 나타났다(도.2. F줄, 컬럼5). 세포 감염된 대조군은 FLAG와 VAP-1 MAbs모두 나타나지 않았다(도.2, A와D 줄, 컬럼 4.5). 이러한 것은 N-말단의 FLAG 에피토프가 세포막의 세포질쪽에 위치하고, 소수성 부분이 이중지질층에 걸쳐있고, 점착을 방해하는 MAb 1B2에 의해 인식되는 거대한 C-말단 세포외 부분이 있다. 모든 잠재적인 글리코실화 위치는 그 분자의 세포바깥부분에 위치한다.

COS-7 세포들에서 일시적으로 발현되는 재조합 VAP-1의 크기와 glycosylation 상태를 확인하기 위해서 우리는 분리한 VAP-1의 세포 추출물과 MAb1B2를 이용한 sialidase로 전처리 한것과 그렇지않은 것의 형질전환된 세포들과 면역블럿(immunoblotting)을 하였다. Sialoglycoprotein은 Sialidase 처리에서 원래의 VAP-1과 같이 170-180kD부터 약 180-190kD으로 VAP-1의 분자량이 증가하고 음극성을 갖는 sialic acids가 제거되어 SDS-PAGE에서 VAP-1의 유동성에서 감소원인이 되기 때문에 전체 음극에서는 감소한다. Sialidase 처리에 유사한 결과는 편도선 VAP-1에서도 밝혀져왔다. (Salmi, M., and Jalkanen, S., J. Exp.Med. 183:569-579 (1996)).

VAP-1 발현

인간의 장평활근과 백혈구가 고갈된 Tonsil stroma에서 분리한 mRNA의 Northern Blot 분석은 복제된 VAP-1 cDNA는 양쪽 조직들에 있는 4.2kb mRNA에 혼성화되어지는 것을 보여줬다(도 5A). Northern blot 분석은 4.2kb VAP-1 mRNA는 인간의 조직들에서 폭넓게 발현되어지는 보다 나은 결과를 보여주었다. 이러한 메시지는 다른 혈액 백혈구에서는 검출할 수 없으나 다른 조직들과 비교할 때 폐, 장, 맹장에서 강렬하게 발현되어졌다. VAP-1 mRNA의 적은 량들은 비장, 흉선, 고환, 간, 췌장, 골수, 태아 간에서 검출되었다. 발현의 중간단계는 전립선, 난소, 대장의 융털돌기, 심장, 태반, 골격근육, 림프구에서 보여주었다(도 5B). 다른 mRNA 종류는 연장된 autoradiography한 후에도 검출되지 않았다.

재료 및 방법

Ab들 및 시약들 VAP-1에 대항하는 쥐의 MAbs 1B2, 닭의 T세포에 대항하는 3G6는 Salmi, M., and Jalkanen, S., Science 257:1407-9 (1992))에서 설명되어지고 있다. FLAG 펩타이드 (DYKDDDDK)를 인식하는 MAb M2는 KEBO 실험실, Espoo, 핀란드에서 얻었다.

VAP-1 정제 및 서열화 복부 외과 수술로부터 얻어진 일반 창자시료들은 lamina propria로부터 해부 되어 졌다. 평활근 세포벽은 밤새도록 lysis buffer(150mNaCl, 100mM Tris-base, pH 7.2, 1.5mM MgCl2. 1% NP-40, Aprotinin and 1mM PM5F)에서 작은 조각으로 잘리어지고 분해되어 졌다. 정화(clarification)후에 분해된 상등액은 정상 쥐 혈청, 결합하지 않은 MABs와 항 VAP-1 MAb(3mg/ml heads)과 함께 준비된 CnBr activated Sepharose bead들을 포함한 5 ml를 면역 친화력 칼럼(immunoaffinity column)에 넣었다.

이 특이적인 칼럼은 lysis buffer로 씻어 냈고, VAP-1 항원들은 50mM 트리틸 아민으로 분리(elute)되었다. 이 용출체(elutate)는 즉시 냉동되어졌고 곧바로 냉동 건조되었다. 시료는 비환원 Laemmlis sample buffer에 용해되어졌고, 5-12.5% SDS-PAGE gel로 분리되었다. 전기적 블로팅(electroblotting)에 의해서 polyvinylidine ditluride 막으로 옮긴후, 그 막은 coomassie bule로 염색되어 졌고, 90, 170-180 kD 밴드들은 절제(excise)하였다. 170-180kD 전체와 90kD의 부분은 트립신으로 처리되어졌다(Sequencing grade, Boehringer Mannheim, GmbH, Mannheim, Germany). 마치 Fernandez et. al.에 의한 설명처럼 (Fernandez, J., et. al.) Anal. Biochem. 201:251-262(1992). Elute된 펩타이드들은 Vydac C18 column(2.1 X 150mm)의 HPLC(150 A; Applied Biosystems)에 의해서 분리되어졌고, N-말단 서열분석은 on-line phenylthiohydantoin 아미노산 분석기(120A; Applied Biosystems)를 갖춘 단백질 분석기(477A; Applied Biosystems)로 수행되어졌다.

90 KD의 잔여 부분은 전 처리(prior digestion)없이 N-말단 서열분석에 넣었고 트립신으로 처리한 다음, 막들은 V8 protease(Sequencing grade, Boehringer Mannheim)으로 재처리되어졌고, 분리된 펩타이드들은 정제 서열화 되어졌다. 몇가지 펩타이드들의 서열들은 그들의 예상된 질량(Lasermat, Finnigan)를 확인하기 위해서 모체 방출 질량 스펙트럼(matrix desorption mass spectrometry)으로 갖추어진 레이저를 이용하여 확인하였다.

분자 생물학적 기술들. 대장균으로부터의 작고 큰 규모의 Plasmid를 분리, 제한효소 절단, Plaque 혼성화, λ파지의 정제와 파지DNA의 추출, 대장균의 형질전환, cDNA 합성과 plasmid의 구성은 표준 기술들에 의한 수행된다(Sambrook,J., et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y (1989)). 아가로스 젤들로부터 분리한 DNA 조각들은 QIAEX 키트를 이용하여 수행하였다. (QIAEGEN, Hilden, Germany). DNA 탐침들은 Amersham Multiprime DNA labeling 키트와 3000 Ci/mMol이하의 [α-³²P]dCTP (Amersham,Bucks,UK)를 이용하여 수행되어졌다. 자동 방사선 그래픽은 필요하다면 Amersham Hyperfilm MP에서 강렬한 스크린들을 이용하여 수행되어졌다. PCR 단편들은 Sureclone kit를 이용하여 pUC18에 clone된 blunt 말단이다(Pharmacia, Uppsala, Sweden). Plasmid DNA는 제작자들의 지식과 Turkueogkr의 의학유전학과의 DNA sequencing facility에서 버전 2.0kit를 이용하여 서열화시켰다.(United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH, USA). 서열 집합과 분석은 Genetic Computer Group에서의 버전 8.1-UNIX Wiscosin Package를 이용하여 수행되어졌다. 데이터들의 비교분석은 BLAST 전자우편 또는 NCBI의 WWW서버를 이용하여 만들어졌다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sequencing과 PCR에 사용되는 Oligonucleotide primer들은 kebo lab에서 구입했다(Espoo, Filand). PCR은 PCR 프라이머들의 특성에 맞추어서 제안되어져 선택된 다양한 증폭 상수들과 제조자가 제안한 조건하에 Dynazyme polymerase를 이용하여 수행되어졌다. RT-PCR에 의해 평활근 mRNA로부터 VAP-1의 cDNA 조각들을 증폭하기 위한 프라이머들은 VAP-1 n-말단 단백질 서열 AVITIFA (SEQ I1) NO:4) 로 제작된 (완전한 단백질의 염기서열 13-19) N2; gctgtgatcacmatyttygc이다 (SEQ II). 그리고 T4 Tryptic peptide 서열 VFYQGR (SEQ ;ID NO:6) (염기서열 264에서 269)로부터 제작된 ccggccctgrtagaasac이다. 이 프라이머들의 증폭조건들은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃ 2분을 30번정도 돌렸다. 총(Total) RNA는 제작자의 지식에 의해서 Ultraspec (Biotecx, 휴스톤, TX, USA)를 이용하여 세포주와 조직에서 수거 하였다. 인간의 다단계 조직 Northern blot들은 Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA)로부터 얻었다. 제작회사에 의해 제안 되어진 것처럼 ³²P로 label된 탐침들과 혼성화 되어졌다. 인간의 cDNA 집합체와 폐 (카탈로그 No. HL 3004a), 심장 (카달로그 No. HL 3026a) cDNA 집합체들은 Clontech Laboratories로부터 얻었다.

포유동물 세포에서 세포배양과 VAP-1 cDNA들의 발현. ATCC (Rockville, MD)으로부터 얻은 COS-7 (원숭이 fibroblasts), CHO (중국산 햄스터 난소 세포들), 그리고 CRL1998 (인간 immortalized umbilical vein endothelial cells)들은 형질전환과 VAP-1 발현을 위해 숙주로서 이용되어졌다. COS-7, CRL 1998 세포들은 10% 태아 송아지 혈장 (PAA-Linz, Austria), 2 mM 글루타민 (Biological Industries, Israel), 그리고 128 U/㎖ 페니실린과 128 ㎍/㎖ 스트렙토 마이신이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco BRL)에서 키워졌다. CHO 세포들은 위와 같은 첨가들과 함께 CHO 뉴클레오티드가 첨가된 α-MEM 에서 키워졌다. 발현 벡터 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA)에 subclone된 VAP-1 cDNA들로 구성된 발현 plasmid들은 일시적인 COS-7 세포 형질전환과 안정하게 형질전환된 CHO 세포 line들의 생산을 위해 이용되어졌다. 발현 plasmid(20㎍)은 Bio-Rad Gene Pulser 기기 (1 mM Na-pyruvate, 2 mM L-glutamaine 그리고 혈장없는 RPMI에서 0.3kv, 960㎌, 0.4㎝ Cuvette)로 Electrophoration에 의해 형질전환 되어졌다. 일시적으로 형질전환된 세포들은 그후 3일 동안 분석되어졌다. 안정적으로 형질전환된 세포들은 0.5 ㎎/㎖ Geneticin(Gibco BRL)이 존재하에 4주 동안 배양에 의해 선택되어졌다.

실시예 2

VAP-1 효소적 활성

VAP-1는 구리를 포함한 아민 산화제 집합체에 중요하게도 동일하게 갖고, 분비된 Bovine Serum Amine Oxidase (BSAO)에 VAP-1이 amine oxidase 활성을 갖고있다는 사실을 위해 이용되어졌다. 구리를 포함한 아민 산화제는 독특한 퀴논 보조효소의 존재, 구리에 결합된 효소, 그리고 기본의 단량체 아민들 또는 다량체 아민들에 대응하는 활성에 의해서 구별되어졌다. 그래서 그들은 FAD를 포함하고 있는 세포내(미토콘드리아) 단량체아민 산화효소들로부터 구별되어지고 있다. (McIntire, W.S., and Hartmann, C., in Principles and Applications of Quinoproteins, P.97 (V.L. Davidson, ed., Deckker, New York (1993)).

VAP-1에 의해서 어떠한 활성을 가지고 있는지 확인하기 위해서 우리는 VAP-1 단백질을 발현하는 안정한 CHO세포 형질전환체를 생산하였다. 이 세포들의Sonicate된 용출액은 기질로 putrescine을 이용한 단량체 아민 산화제 (DAO) 활성 또는 벤질아민을 이용한 단량체아민 산화제 (MAO) 활성을 위해 분석되어졌다. Positive 대조군처럼, 상업적으로 이용할수 있는 DAO, MAO는 분석되어졌고, negative 대조군들은 형질전환된 CHO세포의 mock plasmid에 의해서 제공되어졌다. 이러한 결과들은 VAP-1를 발현하는 세포들은 putrescine에 대해서 약한 활성을 가졌지만, 이러한 중요한 활성은 MAO의 기질 벤질아민 (표 1)를 이용하여 검출되어 졌음을 보여주었다. 그러나, 단량체 아민 산화제(MAO)의 기질인 벤질아민을 이용한 중요한 활성은 VAP-1을 발현하는 CHO세포들과 상업적으로 이용되는 Bovine plasma MAO (표1)의 양성 대조군에서 측정되어졌다. Mock CHO세포 용출액들은 그리 중요하지 않은 효소 활성을 보여주었다. 100 μM semicarbazide와 10 μM hydroxylamine의 존재하에서 구리를 포함한 단량체아민 산화제의 특이적인 억제제인 (Lyles, Intl.J. Biochem, Cell Biol.28: 254-274 (1996)) VAP-1는 벤질아민 (표1)에 대해서 활성을 갖지 못했다.

게다가 우리는 Ax 세포에서 발현된 점착-경쟁(adhesion-competent) VAP-1는 semicarbazide와 hydroxylamine (표1)에 의해 저해할 수는 벤질아민에 대한 MAO활성을 소유하는 것을 증명하였다. Ax 세포들은 낮은 수준은 mock 대조군 세포들에서 (표1) 검출되어졌을 때 semecarbazide 또는 hydroxylamine에 의해서 저해되지 않는 벤질아민에 대해 대응하는 자연적 MAO 활성을 소유하는 것을 보여준다. 실험실적으로, VAP-1에서 MAO 활성을 소요하기 위해 그들 스스로 나타난다.

실험실적으로(in vivo), VAP-1에서 MAO활성이 발견되기를 확인하기 위해서 우리는 면역친화적으로 Tonsil로 로부터 VAP-1를 정제하였고, 세 번에 한번씩 재료를 분석하였다. 형질전환된 CHO세포들의 VAP-1와 같은, Tonsillar VAP-1는 분석 조건 아래에서 벤질아민에 대한 활성이 37℃에서 시간당 0.09의 증가를 흡광도 490nm에서 증명하였는데, 이는 끓인 샘플보다 4.5배 더 큰 흡광도를 갖는 것이다. 얻어진 tonsillar VAP-1단백질은 매우 낮은 효율 때문에 특별한 활성을 측정하는 것이 불가능하였다.

아민 산화제 활성을 측정하기 위한 기질처럼 일반적으로 이용했을 때, 벤질 아민은 실험실적으로 발견되지 않았다. 그래서, 생물학적으로 endogenous 아민들을 일으키는 다수는 VAP-1(표-2)에 의해서 그것들이 이용되어질 수 있는지를 보기 위해서 검사되어졌다. 1 mM에서 메틸아민은 VAP-1에 의해서 쉽게 이용되어지는데 테스트한 다른 아민들은 반응을 보이지 않았다. 표1에서 분석한 용균액들과 비교한 이 세포의 용균액 중에서 벤질아민으로 관찰된 낮은 특이 활성은 세포의 다른 배양조에서 발견된 VAP-1 발현에서 변화하는 것을 보여주고 있다.

VAP-1에서 퀴논 조요소의 존재는 조건을 줄이고 재료들을 니트로셀룰로즈로 전이하여 SDS-PAGE로 면역순화된 편도선의 VAP-1 재료의 일부분을 분리함으로써 확인했다. 이 때 니트로셀룰로즈 필터는 단백질에서 퀴논 일부분을 특이하게 염색하기 위한 순환 산화환원 조건에서 니트로블루 테트라졸리움/Na 글리신으로 염색했다(Paz, M.A., et al., J. Biol. Chem. 266:689-92(1991)). 그 염색은 단량체 90KD과 이량체 180KD VAP-1, 편도선의 VAP-1은 각각 서브유니트에서 퀴논 조요소를 갖는 것으로 보여진다.

재료 및 방법

아민 산화효소 분석법. VAP-1 cDNA 발현 플라스미드를 가지고 안정하게 감염된 다량의 CHO또는 Ax 세포(플라스크 당 10-15 ×10⁶)들은 플라스크로부터 100 mM 인산화 완충액, pH 7.2의 10 ㎖에 긁어 넣었고 원심분리한 후 세포 침전물은 완충액 10 ㎖을 첨가하여 세척했다. 세포 침전물은 최종적으로 인산화 완충액 1.5 ㎖에 다시 섞은후 세포들은 얼음에서 중간 전력으로 2 ×10 초의 초음파 분해기(Braun sonicator)로 분해되었다. 초음파 분해된 용균액은 효소 분석법(분석법 당 50-100㎕)에 곧바로 사용하거나 -20℃에 저장했다.

전체 단백질 농도는 다음 기질들을 사용하여 전에 설명된 테크닉으로 측정했는데, 기질은 D`Agostino, L et al ., Biochem. Pharmacol. 38:47-49 (1989)의 방법에 의한 ¹⁴C로 표지된 putrescine(Amersham)(참조문헌에 기재됨), Baylin, S. B., and Margolis, S., Biochem. Biophys. Acta 397:294-306(1975)의 방법에 의한 ³H histamine(참고문헌에 기재됨), 표지된 0.4Ci가, 표지되지 않은 benylamine 기질을 함유하는 각 반응마다 쓰여지는 것을 제외하고는, putrescine에 대하여 유사한 방법으로 분석된 ¹⁴C bezylalamine(Amersham) 등이다.

반응액 0.5 ml은 100mM의 sodium phosphate buffer, pH7.2, 0.4Ci ¹⁴Cbenzylamine(Amersham), 80 nmol의 표지되지 않은 benzylamine을 함유한다. 그리고 각 반응당 용균세포 추출액의 100 ㎕을 최대로 sampling한다.

37℃에서 한 시간 동안 배양후에 0.35 g/l의 diphenyloxazole이 든 900 ㎕의 톨루앤을 첨가하고 강하게 흔든 뒤에 반응의 aldehyde 생산물을 추출해 낸다. 그 상(phase)을 분리한 후 700 ㎕의 톨루엔 층을 제거하고 toluene/diphenyl oxazole의 700 ㎕로 추가 추출을 다시 수행하고 이 톨루엔/디페닐 옥사졸 층의 500 ㎕를 제거하고 처음의 추출액과 이것을 모아서 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)로 ¹⁴C를 측정한다. 모든 효소 분석은 100℃에서 10분 동안 끓인 시료액을 포함하는 blanks나, 2벌이나 3벌의 같은 실험물에서 표현되지 않는 sample의 존재 하에서 수행되고 결과는 pmol substrate / (min · mg-protein) 의 형태로 표현된다. 정제하지 않은 돼지의 신장 DAO와 소의 혈장 MAO의 대조군는(controls) Sigma Chemical Company(St.Louis, MO, USA)에서 얻을 수 있었다.

평가

VAP-1을 인지하는 MAb 1B2를 갖는 우세한 염색을 여러 군데에서 혈관의 내피조직, 특히 PLN type의 임파구에서 얻을 수 있었다. 그러나 이런 조직에서 탐지되는 VAP-1의 전체수준이 비교적 높지 않기 때문에 단백질 서열 정보를 얻기 위한 충분한 양을 동정하고 정제하는 것은 어렵다는 것을 입증했다. VAP-1가 발견된 또 다른 조직 중에서 맥관조직(vasculature)의 연근육(smooth muscle)과 장 관련 연근육에서 가장 풍부했다(Salmi, M.,et al., J. Exp. Med. 178:2255-2260(1993)). 다른 물질에서 얻은 VAP-1은 약간 다른 분자량을 보이는데 이것은 당분해과정의 차이에 기인한 것이다. 그러나 편도선과 PLN type의 조직에서 분석된 형태와 유사하다.

장 연근육에서 정제한 VAP-1으로부터 얻어진 단백질 서열 정보를 사용했을 때 이 점착 분자를 엔코딩하는 cDNA를 분리하였다. 이런 결론은 다음의 몇 가지 사실에 기초한다. 첫째, 면역학적으로 정제된 VAP-1로부터 얻은 단백질 서열은 연속적으로 분리된 VAP-1 cDNA clone의 예상되는 단백질 서열에서 발견되었다. 둘째, VAP-1 cDNA를 발현하는 형질전환된 세포들은 VAP-1 (Salmi, M., and Talkanen, S., Science 257: 1407-1409(1992))를 밝히기 위해서 원래 사용된 MAb 1B2로 그들의 표면에서 염색되어질수 있었고, 그들의 세포들로부터 면역적으로 침전된 VAP-1는 실험실적으로 170-180KD의 유사한 분자량을 가졌다.

VAP-1은 크고, dimeric, 분자의 N-말단 끝부분에 위치한 막에 위치한 도메인을 가지는 Type II 막 단백질이다. 세포내 도메인은 독특하게 작고, 길이에서 오직 4 아미노산들을 갖고, dimer당 163 KD의 거대하고 glycosylation된 extracellular 도메인을 남겨둔다. Dimer당 12 N-연결된 것과 6 잠재적인 O-연결된 부위 갖는 모든 잠재적 glycosylation 부위들은 extracellular domain에 위치한다. 비록 이러한 모든 것들이 이용되어지는 것이 현재에 알려지지 않았지만 예전 데이터는 VAP-1이 N-와 O- 연결된 당들과 N부분에 연결된 탄수화물의 말단 잔기 또는 O-연결된 당의 일부분으로서 나타나는 상당수의 sialic산이 포함된다는 것을 나타내고 있다. 특히 탄수화물과 sialic산이 VAP-1 단백질의 점착기능에 중요한 부분으로 작용되어 진다고 생각될 때(Salmi, M., and Jalkanen, S., J. Exp. Med. 183:569-579(1996), 어떤 glycosylation부분들이 이용되어지고 무슨 탄수화물에 존재하는가를 결정하기 위해 필요할 것이다. 매우 다른 크기의 VAP-1 mRNA 종들은 Northern blotting에 의해 시험되어진 어떠한 조직들에는 보여지지 않고, 모든 VAP-1 cDNA 복제물들과 분석된 PCR 단편들이 유사한 서열 포함했을 때 변종mRNA들에 의해 엔코딩된 VAP-1형태를 보여주기 위한 결론적인 증거가 없다. 그래서 발명가들은 예전의 면역blotting과 면역 침전에 의해서 연구되어진 VAP-1의 우세한 형태를 엔코딩하는 cDNA를 복제해 왔던 것처럼 여겨졌다. 그러나, 연구된 이 조직들의 거의 대부분이 혈관 조직 뿐만 아니라 혈관내피나 다른 조직으로부터 얻은 평활근을 포함할 때, 만약 매우 비슷한 mRN 형태가 이 조직에 존재하다면 평활근과 endothelial VAP-1을 구분하기는 불가능하다. 그래서 이미 분리된 것과 약간의 차이가 나는 mRNA에 의해서 엔코딩된 VAP-1의 다른 형태가 있을 것이라 생각되어 진다.

흥미롭게도, 투과막 지역을 갖는 VAP-1의 N-말단 지역은 이것들과의 유사한 BSAO로부터 대부분을 다양화하는 분자들의 일부분이었다. BSAO는 혈장에서 높은 단계에서 발견되는 분비된 단백질로 알려져 있고, 분비경로에서 플티오리틱 프로세스(proteolytic process)에 의해서 제거되어진 N-말단에서 분비 신호 염기 서열을 갖고 있다(Mu, D., et al., J.Biol.Chem. 269:9926-9932(1994)). 그래서 BSAO와 VAP-1는 유사한 생리학적 특성을 갖지 않는다. 예비 증거는 쥐 VAP-1은 인간 VAP-1에서 발견된 것과 유사한 투과막 도메인을 갖고, 그래서 인간의 분자들처럼 같은 기능을 갖고 있음을 제안하였다. VAP-1 세포외 도메인은 아민 산화효소 활성을 포함해서 VAP-1는 ecto-효소로서 기능을 할 수 있다. 구리를 포함하는 아민 산화효소는 폭넓은 다른 기질의 특이성을 갖는 효소들 다양한 종류이다. 그러나, 그들은 2가지 형태로 분류되어 질 수 있는데, putrescine, histamine, 단량체 아민 산화제 활성의 VAP-1 종류들처럼 polyamine 들에게 대항하는 활성을 갖는 것들이다. 비록 몇몇의 것들이 있긴 하지만 단량체 아민 산화제의 생리학적 기질은 명백하지 않다.

이 효소들의 다른 특성은 독특한 카르보닐기를 포함하는 보조인자의 존재와 토파퀴논처럼 (6-Hydroxydopa) BSAO와 pea amine에서 그리고 cross로 연결된 라이신 티로실퀴논처럼 라이실 산화효소에서 동일시 되었던 것을 제외하고 토론의 주제가 되었던 화학적 일치성이다. 인간을 포함한 몇몇의 표유동물의 종들에서, 세포막과 혈장의 용해성 형태에서 모두 발견되어진 구리를 포함한 단량체 아민 산화효소는 같은 것으로 밝혀졌다. 이러한 활성은 카르보닐기 반응 매개체들, 예를 들어 Semicabazide, hydroxylamine (Lyles, G,A., Intl..J. Biochem. Cell Biol 28:259-274 (1996))에 의한 저해에 민감하고, 반응하는 효소는 semicarbazide-sensitive 아민 산화제 (SSAO)로 보통 언급되고있다. 우리는 VAP-1이 다른 구리를 포함하는 단량 아민 산화제의 연구들로부터 얻어지고, 구리와 결합된 효소 반응 중에 자가 처리과정(self-processing)에 의해 형태화된 공유적으로 결합된 퀴논을 포함하는 것을 다른 구리 함유 모노아민 산화효소의 연구로부터 보여주고 있다. 이것들의 결과들과 카르보닐과 연관된 매개체들 Semicarbazide 와 Hydroxylamine에 VAP-1 효소 활성의 민감도는 VAP-1이 SSAO에 결합된 막이라는 것을 보여준다. SSAO들의 생리학적 역할들이 실험실상에서 기질들이 알려진 것이 거의 없고 그들의 기질 특이성이 종간에 매우 다양하기 때문에 정의하기가 어려웠다. Endogenous와 Xenobiotic 초기 단량 아민들의 대사작용은 하나의 지원 기능을 나타냈고, 이것은 평활근처럼 내피아닌 위치에 발견된 VAP-1의 기능이라는 것이 가능했다. VAP-1의 SSAO활성이 점착 성질에 어떤 역할을 하는지는 현까까지는 명백하지 않다. Semicarbazide와 hydroxylamin의 존재하 CRL 1998 세포들이 형질전환된 VAP-1과 PBL (외막 혈관 림프구)를 이용해서 실시한 예비의 시험관에서(in vitro) 점착 실험은 효소 활성이 억제제가 존재하는 가운데 감염된 VAP-1 세포에 결합된 PBL의 수가 증가할 때 이 세포사이에서의 점착 상호작용에 음성적인 효과를 가질지도 모른다는 것을 암시한다. 이 결과가 세포에서 사용된 점착 기작에 직접적이고 특이적인 결가를 가지는 효소 활성에 의해 원인이 되는 첫 번째 것인지 아니면 세포의 생리학적인 상태가 모노아님 산화효소 활성의 산물에 역으로 영향을 받아서 그들의 점착 잠재력이 줄어드는 두 번째 것인지는 잘 모른다.

실시예 3

점착 분석법

pcDNA3에서 VAP-1 cDNA는 세포들에 형질전환되기 위해 이용되어졌고, 쥐의 HEV는 CHO세포와 같은 다른 잠재적 숙주들에서 보다 VAP-1에대한 더 자연적인 기능환경을 제공할지모르는 내피세포주에서 추출하였다. 안정한 형질전환체들은 FACS분석(도.6A)에 의해 결정되어진 것처럼 그들의 세포 표면위에서 VAP-1를 발현하는 것들로 얻어졌고 이것들의 림프구 점착 분석법에서 이용되어졌다. 회전 조건(rotatory condition)들 하에서 분석되어졌을 때, VAP-1에 결합된 PBL은 Ax세포들로 형질전환 되는 것이 mock 세포들에 형질전환되는 것보다 25.6배 더 높았다(도.6B 그리고 6C).

VAP-1 형질전환체에 강화된 결합은 비록 완전하지는 않지만, anti-VAP-1 단일 항체(mAb) 처리에 의해서 분명히 저해되는 결과가 통계학적으로 보여진다(저해도 29.6% 10.7%, P=0.05).

이러한 점착 결과는 다섯가지의 독립적인 실험으로 울혈(pool)되었는데, 이는 2-3개의 평행한 형질전환 단일막(monolayer)이 3개의 독립적으로 형질전환된 세포주와 6개의 다른 donor에서 분리한 PBL을 사용하여 여러번 분석되었다.

그러므로 이러한 결과는 VAP-1 cDNA가 형질전환된 세포의 표면에 위치하고, Ax 세포에서 표현될 때 직접적으로 PBL의 결합을 조정할 수 있는 기능성 점착 분자를 엔코드하는 것을 보여준다.

재료 및 방법

VAP-1이 안정적으로 발현된 Ax-cell과 모의 대조 형질 전환체는 젤라틴 전처리한 현미경 슬라이드에 그려진 wax-pen circle에 도말한다. (20 000 cell / 2cm 지름인 원)

이 세포들은 충분하게 자라게 하고 두 번의 washing후에, 10% FCS와 10 mM HEPES(검시용 배지)가 함유된 RPMI 1640 배지 100㎕는 점착성 세포 단일막을 고르게 덮을 수 있도록 각각 wax-pen circle 안에 첨가한다.

반면에 PBL은 Ficollcentrifugation을 이용하여 갓 채취된 혈액으로부터 분리하고, 검시용 배지에서 4010⁶ cell/ml의 농도를 맞춘다. 그런 후 슬라이드를 7도에서 60rpm에서 작동하는 회전형 shaker로 옮긴다. 그리고 5㎕의 PBL용액을 각각 wax-pen circle에 첨가한다. 이 분석은 30분 동안 일정한 회전에서 유지시킨다. 슬라이드는 조심스럽게 윗 부분의 용액을 따르고, 부착된 세포를 떨어뜨리기 위해서 cold RPMI에 한번 담근다. 점착 세포들은 1% glutaraldehyde를 함유한 냉각 PBS에서 하룻밤 동안 수직으로 슬라리드를 배양하여 구역에 고정시킨다.

점착된 세포의 수는 접안렌즈 격자를 이용하여 센다(배율 x200). 격자의 크기는 0.25mm²이다. 형질전환체는 풍부한 단일막을 형성하는 원의 중앙에서 0.25mm²의 9개 미리 정해진 면적을 각 슬라이드에서 counting한다. 각 시료액당(전체 면적 = 4.5 mm²) 두 개의 슬라이드를 가지고 5개의 독립적인 실험에서 counting한다. 어떤 실험에서, 점착 분석실험은 VAP-1에 대한 MAb를 막는 기능을 보여주는 조건에서 행하거나(1B2와 TK8-14의 결합체, 모두 50 ㎍/ml로 검시용 배지에서 희석된 것) , class-matched 음성 mAbs의 조건에서 수행되기도 한다(모두 50 ㎍/ml로 희석된 3G6와 7C7의 결합체).

MAb는 표지된 림프구가 첨가되기 전에 7도에서 30분 동안 형질전환체 단일층과 사전배양(pre-incubation)한다. 점착세포의 수는 상기 기술한 5가지의 독립 실험에 의해 수행된다.

평가

Ax세포에서 발현하는 VAP-1에서 수행된 점착 분석법은 cDNA가 PBL에 그 리간드와 상호작용을 유지할 수 있고 Ax 세포에 PBL의 안정적인 결합을 이끌 수 있는 기능적인 VAP-1을 엔코드할수 있는 것을 나타낼 수 있다. 그러나 항 VAP-1 mAbs 1B2와 TK8-14와 이 증가된 점착의 완전한 저해는 관찰되지 않았고 그것이 그 원래의 환경에서 했을 때처럼 쥐에서 추출된 Ax 세포에서 VAP-1 분자는 반드시 기능을 하지 않는다는 것을 암시한다. 아마 Ax 세포에서 단백질의 탄수화물 변형, 막환경 또는 VAP-1변형은 mAn가 그것의 리간드와 모든 VAP-1 상호작용을 더 이상 방해하지 않는 인간의 HEV에서 그것과는 차이가 있다. 또한, VAP-1분자의 아군집(subpopulation)은 MAb 1B2와 TK8-14에 의해 인지되는 하나 또는 그 이상의 에피토프(epitope)가 결여된 형태에서 형질전환체에서 존재할 수 있다는 것은 가능하다. 결국 안정된 형질전환체의 VAP-1의 장기간 과발현은 Ax-세포표면의 다른 접착분자의 발현을 변화시길 수 있는 가능성이 남는 것이다. 이러한 추정 점착분자는 항 VAP-1 MAb에 의해서 저해 받지는 않을 것이다. HEV 결합 분석에서 VAP-1은 림프구 L selectin에 독립적으로 기능을 보이고 CD4+ PBL 보다는 CD8+ PBL의 결합을 더 많이 매개한다. 면역자성적으로(immunomagnetically) 정제된 L-selection 음성세포와 CD8+와 CD4+세포의 분석이 L-selection이 Ax-형질전환체에 충분하게 결합되는 것에는 불필요하다는 것과 PBL의 구성체인 CD8+이 CD4+보다 VAP-1 형질전환체가 몇 개의 접힌 구조체에 더 잘 부착된다는 것을 보여줄 때 Ax VAP-1 cDNA 형질전환체는 이런 관찰을 재현한다(데이터는 제시하지 않음).

VAP-1을 발현하는 CHO와 Ax 세포에서 아민 산화효소의 평가

㎚이 생성물 min-1㎎-1 단백질에서 세포형태 효소 활성도

기질 CHO VAP-1 CHO 모의 디아민 모노아민 Ax VAP-1 Ax 모의 산화효소 산화효소

푸트레신 0.87±0.17 1.45±0.13 4.87±0.10 0.29±0.00 ND ND벤질아민 26.94±0.70 0.13±0.13 0.57±0.10 8.83±0.00 2.15±0.04 0.80±0.80벤질아민+SC 0.61±0.17 1.32±0.26 ND ND 0.35±0.09 1.00±0.00벤질아미+HA 0.35±0.17 1.32±0.26 ND ND 0.31±0.04 0.90±0.10

각각의 평가는 3번 이루어지고 평균 특정 활성도±SEM이 도시된다. ND, 수행되지 않음.

VAP-1 아민 산화효소 활성도의 기질 특이성

㎚이 생성물 min-1㎎-1 단백질에서 세포형태 효소 활성도

기질 CHO VAP-1 CHO 모의

벤질아민 4.57±0.29 0.18±0.62 메틸아민 4.28±0.22 0.18±0.44 티라민 0.04±0.10 0.09±0.35 트립타민 0.07±0.04 1.35±0.62 β-페닐에틸아민 0.10±0.03 0.26±0.00 히스타민 0.05±0.03 0.20±0.00

실험을 비슷한 결과를 갖는 다른 샘플에서 2번 수행하고 대표 실험의 결과를 도

시한 것이다. 각각의 평가는 3번 이루어지고 평균 특이성±SEM이 제공된다.

본 발명은 특정 실시예와 관련하여 기술되었지만 더 변형될 수 있고, 본 출원이 일반적으로 본 발명원리하에서 발명이 속하는 기술내에서 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 첨부된 청구범위내에서의 어떠한 변형, 사용 또는 적용등도 커버하는 것으로 이해되어야 한다.

여기에 인용된 모든 참고문헌, 특허 출원건, 특허들의 설명은 그 전체가 참고로 여기에 도입되었다.

SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: BioTie Therapies Ltd. (B) STREET: Tykistonkatu 6 (C) CITY: Turku (E) COUNTRY: Finland (F) POSTAL CODE (ZIP): FIN-20520 (ii) TITLE OF INVENTION: Vascular Adhesion Protein-1 Having Amine Oxidase Activity (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/862,433 (B) FILING DATE: 23-MAY-1997 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2501 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: GCCAACAGAG CCCCCGTCTT GCTGGCGTGA GAATACATTG CTCTCCTTTG GTTGAATCAG 60 CTGTCCCTCT TCGTGGGAAA ATGAACCAGA AGACAATCCT CGTGCTCCTC ATTCTGGCCG 120 TCATCACCAT CTTTGCCTTG GTTTGTGTCC TGCTGGTGGG CAGGGGTGGA GATGGGGGTG 180 AACCCAGCCA GCTTCCCCAT TGCCCCTCTG TATCTCCCAG TGCCCAGCCT TGGACACACC 240 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Claims (25)

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22. 아민 산화 효소 활성을 갖는 샘플에 세미카바지드, 하이드록실아민, 프로파르길아민, 이소니아지드, 니알아미드, 하이드랄라진, 프로카르바진, 모노메틸하이드라진, 3,5-에톡시-4-아미노메틸피리딘 및 MDL72145((E)-2(3,4-디메톡시페닐)-3-플루오로알릴아민)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 효과적인 양의 억제제를 제공하는 것을 포함하는, 아민 산화 효소 활성 억제 방법.
23. 삭제
24. 내피세포에서 아민 산화효소의 효소적 활성을 억제시키는 것을 포함하는, 임파구로의 내피세포의 혈관 점착 단백질-1(VAP-1) 매개 결합을 조절하는 방법.
25. 내피세포에서 아민 산화효소의 효소적 활성을 부여하는 것을 포함하는, 임파구로의 내피세포의 혈관 점착 단백질-1(VAP-1) 매개 결합을 조절하는 방법.