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KR100508724B1 - 트레할로오스및당알코올의제조방법 - Google Patents

트레할로오스및당알코올의제조방법 Download PDF

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KR100508724B1
KR100508724B1 KR10-1998-0042198A KR19980042198A KR100508724B1 KR 100508724 B1 KR100508724 B1 KR 100508724B1 KR 19980042198 A KR19980042198 A KR 19980042198A KR 100508724 B1 KR100508724 B1 KR 100508724B1
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다카시 시부야
시게하루 후쿠다
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가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
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Abstract

소르비톨, 말티톨 및 말토트리이톨로 된 군으로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가 당질 혼합물을 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 단계와, 트레할로오스 고함유 획분 및 당알코올 고함유 획분을 이러한 순서로 계속적으로 용출시켜 회수하는 단계를 포함하는 상기 수소첨가 당질 혼합물로부터의 트레할로오스 및/또는 당알코올의 제조방법 또는 분리방법.

Description

트레할로오스 및 당알코올의 제조방법
본 발명은 트레할로오스 및 당알코올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소르비톨, 말티톨 및 말토트리이톨로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유하는 수소첨가 당질 혼합물로부터의 트레할로오스 및/또는 당알코올의 제조방법 및 트레할로오스와 당알코올의 분리방법에 관한 것이다.
트레할로오스는 그 환원성기에 두개의 글루코오스 분자가 결합한 비환원성 당질인데, 자연계, 즉, 박테리아, 균류, 조류(algae) 및 곤충 등에 널리 분포되어 있다. 대표적인 감미료인 수크로오스와 비교해 볼 때, 트레할로오스는 수크로오스 보다 훨씬 안정성이 있고, 감미의 질과 그 온화함에 있어서 수크로오스 보다 우수하다. 따라서 트레할로오스는 식품, 화장품, 의약품 등의 분야에서 수크로오스 대체품으로서 극히 필요로 하고 있다.
재료에 따라 구분할 경우 트레할로오스 제조방법에는 두가지 상이한 타입이 존재한다. 즉, 그 첫번째 방법은 본 발명과 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허공개 제143,876/95호 공보 및 같은 제213,283/95호 공보에 개시된 바와 같이 트레할로오스 유리효소와 비환원성 당질 생성 효소를 전분 또는 전분 부분 가수분해물에 작용시키는 방법이고, 그 두번째 방법은 본 발명과 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허공개 제170,977/95호 공보에 개시된 바와 같이 말토오스/트레할로오스 변환효소를 말토오스에 작용시키는 방법이다. 두번째 방법은 원료인 말토오스를 입수할 수만 있다면 단일 효소에 의해서도 트레할로오스를 용이하게 제조할 수 있다는 가장 큰 장점이 있다. 더욱이 이러한 효소반응은 평형반응이므로 반응 생성물인 트레할로오스와 기질인 말토오스 모두가 다량 함유된 당질 혼합물을 생성하게 된다.
그러나 이러한 당질 혼합물로부터 트레할로오스를 분리할 수 있는 공업적으로 유익한 조작방법은 아직까지 확립되어 있지 않다. 당질을 분리하는데 가장 효과적으로 사용되고 있는 칼럼 크로마토그래피에 의해서도 트레할로오스와 동일한 분자량을 가진 말토오스와 트레할로오스를 분리할 수 없는데, 그 이유는 대부분의 칼럼 크로마토그래피는 당질의 분자량 차이에 따라 당질을 분리하기 때문이다.
상기한 당질 조성물은 비환원성 당질과 환원성 당질의 혼합물이어서 그 이용가치를 크게 저하시킨다. 상기한 바와 같이 말토오스/트레할로오스 변환효소를 사용하는 방법은 단일 효소만으로 트레할로오스를 생산할 수 있는 장점이 있다하더라도 트레할로오스를 함유한 당질 혼합물 또는 트레할로오스의 제조방법으로서는 실제로 아직까지 이용되지 않고 있다.
본 발명자들은 비환원성 당질과 환원성 당질을 함유한 상기한 당질 조성물의 이용값을 향상시키고자 연구를 계속한 결과, 이러한 당질 혼합물을 특정 조건하에서 수소첨가 반응시키면 혼합물중의 비환원성 당질인 트레할로오스를 실질적으로 분해함이 없이 말토오스를 포함한 이러한 환원성 당질을 말티톨을 포함한 당알코올로 효과적으로 변환함으로써 비교적 높은 수율로 유용성이 높은 당질을 제조할 수 있음을 발견하였다. 이 사실에 근거하여 본 발명자들은 환원성이 거의 없는 당질과 그 제조방법 및 용도를 확립하였고, 일본국 특허공개 제73,482/96호 공보에 개시하였다. 즉, 말토오스/트레할로오스 변환효소를 사용하는 방법에서 존재하는 한가지 문제를 해결한 것이라 할 수 있다.
상기 공개공보에 개시된 방법은 말토오스 등의 환원성 당질과 트레할로오스를 함유한 당질 혼합물의 이용가치를 향상시키는데 목적을 둔 것이지만, 트레할로오스를 함유한 유용한 당질의 분리 및 제조에 목적을 둔 것은 아니다. 이러한 이유로 해서 트레할로오스와 당알코올을 함유하고, 상기 공보에 개시된 방법으로 얻게되는 수소첨가된 당질 혼합물로부터의 트레할로오스 제조방법의 확립에 의해 말토오스/트레할로오스 변환효소를 사용하여 트레할로오스를 제조하는 트레할로오스의 공업적 제조를 위한 길을 개척하는 것이 기대되고 있다. 또한 수소첨가된 당질 혼합물로부터 당알코올을 비교적 높은 수율로 제조하는 방법이 확립되기만 하면 말토오스/트레할로오스 변환효소를 사용하는 방법에 대해 보다 효과적인 유용성을 부여하게 될 것이라는 것이 크게 기대되고 있다.
상기한 점들을 고려하여 본 발명의 제1과제는 트레할로오스와 당알코올을 함유한 수소첨가된 당질 혼합물로부터의 트레할로오스 및/또는 당알코올의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 제2과제는 트레할로오스와 당알코올을 함유한 수소첨가된 당질 혼합물로부터 트레할로오스와 당알코올을 용이하게 분리하기 위한 수단을 제공함에 있다.
본 발명자들은 말티톨 등의 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가 당질 혼합물로부터 트레할로오스를 효과적으로 분리하는 방법에 대해 계속 연구한 결과, 강산형 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 상기한 수소첨가 당질 혼합물로부터 트레할로오스를 용이하게 분리할 수 있음을 뜻밖에 독자적으로 발견하였다. 트레할로오스와 거의 동일한 분자량을 가진 말토오스의 수소첨가 화합물인 말티톨은 상기한 칼럼 크로마토그래피에 의해 트레할로오스로부터 분리할 수 있다는 사실은 이 분야에서 인정된 상식을 뒤엎는 뜻밖의 사실이었다. 이에 근거하여 본 발명자들은 더욱 연구하여, 결국에는 상기한 과제들을 해결하는 제조방법 및 분리방법을 확립하였다.
본 발명은 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가된 당질 혼합물을 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 공급하는 단계와, 트레할로오스 및/또는 당알코올 고함유의 획분을 수득하여 회수하는 단계를 포함하는 트레할로오스 및/또는 당알코올의 제조방법에 의하여 본 발명의 제1과제를 달성하는 것이다.
본 발명은 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가된 당질 혼합물을 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 공급하는 단계와, 트레할로오스 고함유 획분과 당알코올 고함유 획분의 순서로 용출시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 트레할로오스 및 당알코올의 분리방법에 의하여 본 발명의 제2과제를 해결하는 것이다.
본 발명의 트레할로오스 및/또는 당알코올의 제조방법은 적어도 말티톨을 함유한 당알코올과 트레할로오스를 함유하는 수소첨가 당질 혼합물을 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 공급하는 단계와, 트레할로오스 및/또는 당알코올 고함유의 용출 획분을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에는 적어도 말토오스를 함유한 환원성 당질과 트레할로오스를 함유하는 당질 혼합물을 수소첨가하는 단계를 포함한다. 이 경우에 있어서 수득한 수소첨가 생성물을 수소첨가 당질 혼합물로 사용할 수 있다. 수소첨가 당질 혼합물로서는 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨로부터 선택되는 당알코올(들)과 트레할로오스를 함유하고 있으면 그 제조방법 및 당조성과는 관계없이 어떤 것이라도 본 발명에 사용할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 그것이 강산형 양이온 교환수지를 사용하는 것이면 어떤 것이라도 본 발명에 사용할 수 있다.
수소첨가 당질 혼합물은 적어도 말토오스를 함유한 환원성 당질과 트레할로오스를 함유하는 당질 혼합물을 제조한 다음, 이 당질 혼합물을 수소첨가 함으로써 얻을 수 있다. 당질 혼합물의 제조방법에 대해서는 특히 제한은 없으며, 보다 구체적으로는 본 발명의 방법은 말토오스 또는 말토오스 함유의 전분 부분 가수분해물에 말토오스/트레할로오스 변환효소를 작용시켜 얻게되는 당질 혼합물 및 이 당질 혼합물로부터 트레할로오스 결정을 분리한 후에 얻게되는 잔존 당밀에 대해 쉽사리 적용할 수 있다.
말토오스/트레할로오스 변환효소와 그 용도에 대해서는 일본국 특허공개 제170,977/95호 공보, 같은 제263/96호 공보 및 같은 제149,980/96호 공보에 상세히 기재되어 있다. 상기한 당질 혼합물 외에도 본 발명에서 사용할 수 있는 기타의 당질 혼합물로서는, 예컨대 일본국 특허공개 제216,695/83호 공보에 개시된 바와 같이 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 병용하여 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 방법에 의해 제조되는 것들, 및 예컨대 본 발명과 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허 제143,876/95호 및 같은 제213,283/95호에 개시된 바와 같이 전분 부분 가수분해물에 비환원성 당질생성 효소와 트레할로오스 유리효소를 작용시키는 방법에 의해 제조되는 것들이 있다.
수소첨가 방법에 대해서는 특히 제한은 없으며, 당질 혼합물중의 트레할로오스를 분해함이 없이 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스 등의 환원성 당질 분자중의 알데히드기에 수소원자를 첨가할 수만 있으면 어떤 방법이라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 수소첨가 방법의 예로서는 수소화 붕소 나트륨과 수소화 알루미늄 리튬을 사용하는 화학 환원 반응을 이용하는 방법 및 분자상 수소를 사용하는 첨가반응을 이용하는 방법이 있다. 특히 후자의 반응은 적당한 촉매 존재하에 실시하는 방법인데, 즉 접촉 수소첨가 반응을 이용하는 방법을 본 발명에서 유리하게 채용할 수 있다. 종래부터 사용되고 있는 금속 촉매, 금속 산화물 촉매, 금속 황산염 촉매 및 금속 착물 촉매를 그대로 촉매로서 본 발명에서 유리하게 사용할 수 있다. 더욱 상세하게는 라네이 촉매, 우루시하라(Urushihara) 니켈 촉매, 및/또는 붕소화 니켈 촉매를 들 수 있다. 이들 촉매중에서 라네이 촉매에 속하는 라네이 니켈은 그 반응성이 만족하게 높으므로 만족스럽게 사용할 수 있다.
수소첨가 반응조건은 사용되는 반응계 및 촉매 종류에 따라 적절히 선택한다. 예컨대 라네이 촉매를 사용하는 접촉 수소첨가 반응의 경우에서는 통상적으로 당질 혼합물을 고형물 기준으로 30w/w% 이상의 농도, 바람직하게는 40∼75w/w%의 농도("w/w%"을 이후부터는 간단히 "%"로 표기하고, "시럽의 고형물 농도"를 간단히 "농도"로 함)를 가진 시럽상으로 제조한 다음, 수득한 혼합물에 적어도 1%의 라네이 촉매, 바람직하게는 2∼15%를 가하고, 수소압을 20kg/cm2 이상, 바람직하게는 80∼160kg/cm2으로 조정하고, 온도를 80℃ 이상, 바람직하게는 90∼150℃로 상승시킨다.
본 발명에서 사용되는 반응장치로서는 외부로부터 탱크속으로 가스를 공급하고, 탱크내의 압력과 온도를 소요의 레벨로 제어하는 종래 형식의 것들이 있으며, 회분식(bath-wise) 장치 및 연속식 장치를 임의로 사용할 수 있다. 교반장치를 사용하여 반응속도를 양호하게 촉진할 수 있다. 이들 조건하에서 반응계는 트레할로오스를 실질적으로 분해함이 없이 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스 등의 환원성 당질의 수소첨가를 효과적으로 촉진하므로 이 반응계를 본 발명에서 가장 유리하게 사용할 수 있다. 이 조건하에서 당질 혼합물중의 환원성 당질은 실질적으로 분해되지 않으면서 그 알데히드기들이 수소첨가되기 때문에 유용한 당질로서의 당알코올을 효율적으로 얻을 수 있는 장점이 있다.
따라서 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가 당질 혼합물을 얻게 된다. 수소첨가 당질 혼합물중의 고형물 함량에 대한 각 당질의 백분율(%)(이하, 고형물 함량에 대한 각 당질의 백분율(%)은 그 "함량" 또는 "순도"를 뜻하는 것으로 함)에 대해서는 특히 한정되지 않는데, 통상적으로 트레할로오스와 당알코올의 함량은 각각 10∼80% 및 20∼90%이고, 보다 바람직하게는 30∼80% 및 20∼70%이며, 이들은 본 발명에서 임의로 사용된다.
필요한 경우, 본 발명의 방법에서 상기와 같이 하여 수득한 수소첨가 당질 혼합물을 종래의 여과, 원심분리, 탈색, 탈염 및/또는 농축 등의 방법으로 처리하여 칼럼 크로마토그래피에 공급한 다음, 트레할로오스 및/또는 당알코올 고함유 용출획분을 회수한다. 상기한 칼럼 크로마토그래피에서의 칼럼에 충전되는 분리용 수지의 예로서는 강산형 양이온 교환수지에 속하는 것들이 있는데, 알칼리 금속형 및 알칼리 토류 금속형 수지의 것들도 유리하게 사용할 수 있다. 특히 기재로서 가교도가 2∼8%인 스티렌/디비닐벤젠 폴리머로 된 알칼리 토류 금속 수지는 트레할로오스와 당 알코올을 효과적으로 분리한다. 가교도는 기재 제조시에 사용된 원료 혼합물중의 총 단랑체에 대한 디비닐벤젠의 중량%로 나타낼 수 있다. 본 발명에서는 종래의 회분식, 의사이동(pseudo-moving) 및 모노 및 멀티 칼럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
가교도가 2∼8%인 스티렌/디비닐벤젠 폴리머 기재로 된 알칼리 토류 금속 형태의 강산형 양이온 교환수지를 사용하는 회분식 크로마토그래피를 적용할 때 사용되는 조작 조건으로서 추천할 수 있는 것은 다음과 같다. 즉, 농도가 최소한 30%, 바람직하게는 40∼75%인 시럽상 수소첨가 당질 혼합물을 수지 체적에 대해 30v/v% 이하, 바람직하게는 1∼15v/v%의 체적으로 칼럼에 가하고, 칼럼 온도에 비교할 수 있는 온도까지 가열된 이동상(moving phase)으로서의 물을, 칼럼 온도를 50℃ 이상, 바람직하게는 60∼90℃로 유지하면서 공간속도(S'V) 0.01∼1, 바람직하게는 SV 0.05∼0.5에서 칼럼에 가한다. 수지층(resin bed)의 체적은 처리되는 각 성분에 따라 달라지는데, 원료 당액으로서의 수소첨가 당질 혼합물의 1일당 출력이 고형물 기준으로 약 10톤이 필요한 경우에는 직경 3.5∼5.5m의 칼럼에 수지를 주입하여 다수의 이 칼럼을 직열로 연결함으로써 총 겔층(gel bed) 깊이가 약 7m 이상, 바람직하게는 8∼20m인 칼럼을 구성하는 것이 바람직하다. 기타 종류의 수지와 조작방식을 채용하는 칼럼 크로마토그래피에 사용되는 가장 최선의 조작 조건은 상기한 조건을 관찰하면서 실시한 예비 실험에 근거하여 설정할 수 있으며, 용출획분 각각의 당조성을 분석한 후의 트레할로오스 및/또는 당알코올의 함량은 박층 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피 등의 종래의 방법에 의해 측정한다.
트레할로오스 및/또는 당알코올 고함유 획분을 상기한 칼럼 크로마토그래피에서 용출된 획분으로부터 분리 채취한다. 용도에 따라서는 채취되는 획분은 적당히 분리되는 용출획분 모두 또는 각각의 당조성을 분석하여 소요의 성분의 함량을 구함으로써 원료 당액보다 높은 레벨의 소요의 성분을 함유한 것들 중에서 선택할 수 있다. 크로마토그래피에 있어서 트레할로오스 고함유 획분이 먼저 용출되고, 이어서 당알코올 고함유 획분이 용출된다. 회수되는 획분은 목적으로 하는 성분을 다량 함유한 것들이어야 하며, 특히 순도가 90% 이상인 트레할로오스를 함유한 것들은 비교적 고순도의 트레할로오스를 제조하는데 유리하게 사용할 수 있다. 필요한 경우에는 수득한 획분을 종래의 여과, 원심분리, 탈색, 탈염, 농축, 재결정, 분리, 건조, 분말화 및/또는 절삭 등의 방법으로 처리하여 소요의 트레할로오스를 얻을 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 방법에 의하여 트레할로오스와 당알코올을 함유한 수소첨가 당질 혼합물로부터 비교적 고순도의 트레할로오스, 보다 바람직하게는 순도 90% 이상의 트레할로오스를 공업적 규모로 용이하게 제조할 수 있다. 트레할로오스와 말토오스를 함유한 당질 혼합물로부터 트레할로오스를 결정으로 석출시키고, 생성한 트레할로오스 결정을 제거한 후에 잔존하는 당밀을 수소첨가 반응시켜 제조되는 수소첨가 당질 혼합물에 대해 본 발명의 방법을 적용하여도 트레할로오스의 수율을 증대시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스에 작용시켜 제조한 당질 혼합물을 수소첨가함으로써 얻은 수소첨가 당질 혼합물로부터 트레할로오스를 제조하는 방법으로서 극히 유용하다. 본 발명에 의해 수소첨가 반응단계를 추가로 포함하는 상기한 방법은 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스에 작용시켜 제조한 당질 혼합물로부터 트레할로오스를 제조하는 방법으로서 극히 유용하다.
이렇게 하여 얻은 고순도 트레할로오스는 실질적으로 환원성이 전혀 없고 온화한 감미를 가지므로 그대로 또는 조성물을 형태로 감미료, 감미 개선제, 안정제, 부형제, 보조제 및 충전제로서 널리 사용할 수 있다. 상기한 트레할로오스는, 예컨대 본 발명과 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허공개 제319,486/94호, 제213,283/95호, 제298,880/95호, 제66,187/96호, 제336,338/96호 및 제9,986/97호 등의 공보에 개시된 바와 같이 음식물, 화장품, 의약품 등의 산업분야에 유리하게 사용할 수 있다.
칼럼 크로마토그래피로부터 회수한 획분들이 당알코올 고함유의 것일 경우에는 소프비톨, 말티톨, 말토트리이톨 등의 비교적 고순도의 비환 환원성 당알코올을 용이하게 얻을 수 있다. 더욱 상세하게는 당알코올 고함유 획분으로서 고형물 기준으로 말티톨 90% 이상을 함유한 획분을 사용하여 고순도 말티톨을 유리하게 제조할 수 있다. 필요로 하는 당알코올은 수득한 획분들을 여과, 원심분리, 탈색, 탈염, 농축, 결정화, 분리, 건조, 분말화 및/또는 절삭 등의 종래의 처리에 의해 처리함으로써 제조할 수 있다. 이렇게 하여 수득한 당알코올은 저칼로리 감미료 및 충치유발성이 낮은 감미료로서 유리하게 사용할 수 있다. 예컨대 일본국 특허공고 제13,699/72호 공보 및 제26,817/92호 공보에 개시된 바와 같이 당알코올을 음식물, 화장품, 의약품 등의 분야에 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가 당질 혼합물로부터 트레할로오스와 당알코올을 분리하는 방법이 제공된다. 본 발명의 분리방법의 특징은 트레할로오스와 당알코올을 함유한 수소첨가 당질 혼합물을 강산형 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 분획하여 트레할로오스 고함유 획분과 당알코올 고함유 획분의 순서로 칼럼으로부터 용출하는 것이다. 본 발명의 분리방법에 있어서 수소첨가 당질 혼합물은 수소첨가 혼합물의 당조성과 그 제조방법과는 관계없이 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨 등의 당 알코올과 트레할로오스를 함유하고 있으면 어떠한 것이라도 본 발명에 사용할 수 있다. 특히 본 발명에 사용되는 상기한 수소첨가 당질 혼합물을 본 발명의 분리방법에서 만족스럽게 사용할 수 있다. 강산형 양이온 교환수지를 사용한다면 어떤한 종류의 칼럼 크로마토그래피라도 본 발명에 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 방법에 사용된 상기한 칼럼 크로마토그래피를 본 발명의 분리방법에 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 분리방법은 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스로부터 선택되는 환원성 당질과 트레할로오스를 함유한 당질 혼합물중의 트레할로오스의 함량을 정량적으로 쉽게 분석하는 방법으로서 유리하게 사용할 수 있다. 예컨대 강산형 양이온 교한수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로서의 고속 액체 크로마토그래피 등의 종래의 방법을 사용함으로써 당질 혼합물을 수소첨가하여 수소첨가 당질 혼합물을 얻은 다음, 본 발명의 방법으로 처리하여 당질 혼합물중의 트레할로오스를 극히 용이하게 정량적으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 분리방법은 트레할로오스와 말토오스를 함유한 제품의 품질관리에 유리하게 이용할 수 있으며, 또한 트레할로오스와 말토오스를 함유한 제품을 제조하는 공정단계 관리에 이용할 수도 있다.
아래의 바람직한 실시예들을 본 발명은 더욱 상세히 설명하는 것이다.
실시예 1
"MALTOSE H"(일본국의 Hayashibara Biochemical Laboratories사 판매의 순도 94.0%의 말토오스 제품) 10 중량부를 물 40 중량부에 용해하고, 이 용액을 온도 15℃ 및 pH 7.0으로 조정한 후, 여기에 본 발명과 동일한 출원에 의해 출원된 일본국 특허공개 제170,977/95호에 개시된 피멜로박터(Pimelobacter) sp. R48, FERM BP-4315 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물당 말토오스 1g에 대해 2단위 가하고 48시간 효소반응시킨 다음, 100℃에서 10분간 가열하여 잔존 효소를 실활하였다. 이 반응 혼합물을 종래 방법으로 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온 교환수지를 사용하여 탈염함으로써 정제한후, 농축하여 트레할로오스와 말토오스를 함유하는 농도 50%의 시럽상 당질 혼합물을 얻었다. 본 발명과 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허공개 제170,977/95호에 개시된 방법에 따라 당질 혼합물을 트리메틸실릴화 하고, 일본국의 GL Sciences사 판매의 "SILICONE OV-17/CHROMOSORB W"(이하, 간단히 "GLC"라 함) 2%를 충전한 칼럼을 사용한 가스 크로마토그래피로 분석한 결과, 이 혼합물은 트레할로오스 약 65%와 말토오스 약 26% 및 소량의 글루코오스와 말토트리오스를 함유하고 있음이 판명되었다. 이 당질 혼합물의 일부를 상기한 분석법에 사용하고, 나머지를 오토클레이브에 넣고, 여기에 고형물 기준으로 라네이 니켈 약 10%를 가한 다음, 교반하면서 90∼120℃로 가열하고, 수소압을 20∼120kg/cm2로 증가시켜 수소첨가 반응시켰다. 그 후, 라네이 니켈을 반응 혼합물로부터 제거하여 얻은 혼합물을 탈색하고 탈염하여 정제한 다음 농도 약 50% 되도록 조정함으로써 시럽상 수소첨가 당질 혼합물을 얻었다.
이렇게 하여 얻은 트레할로오스, 말토오스, 글루코오스 및 말토트리오스를 함유한 위에서 얻은 수소첨가 당질 혼합물과 상기한 당질 혼합물의 일부를 각각 농도 약 2% 되도록 희석한 다음, 이 희석액에 대해 아래의 장치를 사용하고 아래의 조건하에서 고속 액체 크로마토그래피(이하, 간단히 "HPLC"라 함)로 분석하였다:
HPLC용 장치: "CCPD SYSTEM"(일본국의 Tosoh사 판매)
분석용 칼럼: 가교도 8%의 "MCI GEL CK08EC, Ca++형" 이 충전된 칼럼으로서 칼럼 사이즈: 직경 8.0mm, 길이 300mm(일본국의 Mitsubishi Chemical Industries사 판매)
유속: 이동상(moving phase)인 물로서 0.6ml/min.
검출기: 시차(示差) 굴절계 사용
당질 혼합물과 수소첨가 당질 혼합물의 분석결과는 각각 도 1과 도 2에 나와 있다.
도 1로부터 명백한 바와 같이 당질 혼합물중의 트레할로오스와 말토오스는 분리하기가 거의 어려웠고, 도 2로부터 명백한 바와 같이 수소첨가 당질 혼합물을 함유한 트레할로오스는 말티톨, 소르비톨 및 말토트리이톨로부터 분리하기가 쉬웠음을 알 수 있다. 도 2의 결과에 근거하여 HPLC를 사용하는 본 발명의 분리방법에 의해 트레할로오스를 용이하게 정량적으로 검출할 수 있음이 판명되었다. 이 결과로부터 구한 당조성은 표 1에 나와 있다.
[표 1]
위에서 얻은 수소첨가 당질 혼합물을 가교도 4%의 강산형 알칼리 금속 양이온 교환 수지인 "50W X4, CA++형"(미합중국의 Dow Chemical사 판매)을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 즉, 직경 3cm의 자켓부 스테인레스강제 칼럼에 수지를 충전하고 이들 칼럼을 직열로 연결하여 총 겔층 깊이를 약 4m되게 하였다. 이들 칼럼의 내부 온도를 80℃로 유지하면서 이들 칼럼속에 수소첨가 당질 혼합물을 수지 체적에 대하여 5v/v%의 체적으로 가하고, 또한 여기에 80℃의 열수를 SV 0.15로 가하였다. 용출하는 순서로 트레할로오스 함량이 90% 이상인 획분을 먼저 회수한 다음, 연속적으로 용출되는 말토트리이톨, 말티톨 및 소르비톨을 함유한 획분들을 제거하였다. 이 단계에서의 고형물 함량의 수율은 고형물 기준으로 약 50% 이었다.
트레할로오스 고함유 획분을 H형 및 OH형 이온 교환수지를 사용하여 정제하고 농도 약 76%가 되도록 농축한후, 종래의 방법으로 이 농축물을 결정화기에 넣고, 교반하면서 여기에 트레할로오스 함수결정을 고형물당 약 1% 가하여 트레할로오스를 결정으로 석출시켰다. 수득한 매스키트(massecuite)를 분리한 다음, 수득한 결정을 소량의 물을 분무하여 세정함으로써 트레할로오스 함수결정을 얻었다. 칼럼 크로마토그래피에서 얻은 트레할로오스 고함유 획분으로부터의 트레할로오스의 수율은 고형물당 약 70% 이었다. "MCI GEL CK08EC, Ca++형"을 충전한 상기한 칼럼을 사용하여 HPLC 분석을 한 결과, 이 생성물의 트레할로오스 순도는 99.2% 이었다. 이 제품은 실질적으로 환원성이 전혀 없고 온화한 감미를 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 맛개선제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 및 희석제로서 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 2
실시예 1의 방법에 따라 "MALTOSE HHH"(일본국의 Hayashibara Biochemical Laboratories사 판매의 순도 99.5%의 말토오스 제품) 10 중량부를 원료로 하여 여기에 피멜로박터(Pimelobacter) sp. R48, FERM BP-4315 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소를 작용시켜 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환수지를 사용하여 탈염함으로써 정제한후 농도 약 78% 되도록 농축하였다. 이렇게 하여 시럽상 당질 혼합물을 얻은 다음, 결정화기에 넣고 실시예 1의 방법에 따라 트레할로오스 함수결정을 결정화함으로써 매스키트를 얻은 다음, 순도 약 99.8%의 트레할로오스 함수결정 약 3 중량부를 분리하였다. 분리후의 당밀로 생성된 시럽을 농도 약 50% 되도록 조정하고, 이 농축액을 실시예 1의 방법에 따라 수소첨가 반응시킨 다음 다시 정제하여 시럽상 수소첨가 당질 혼합물을 얻었다. "MCI GEL CK08EC, Ca++형"을 충전한 상기한 칼럼을 사용하여 HPLC 분석을 한 결과, 이 혼합물은 트레할로오스 약 67%, 말티톨 약 29% 및 소량의 소르비톨을 함유하고 있음이 판명되었다.
수소첨가 당질 혼합물을 "CG6000, Ca++형, 가교도 6%"(일본국의 Japan Organo사 판매의 알칼리 토류금속 강산형 양이온 교환수지)를 사용한 칼럼 크로마토그래피 처리하였다. 즉, 내경 5.4cm의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4개에 수지를 충전하고 총 칼럼 겔층 깊이가 20m 되도록 직열로 연결하였다. 이들 칼럼속으로 수소첨가 당질 혼합물을 수지 체적에 대하여 5v/v%의 체적으로 가한 다음, 여기에 이동상으로서의 80℃로 가열된 열수를 SV 0.15로 가하고, 트레할로오스 함량이 90% 이상인 트레할로오스 고함유 획분과 말티톨 함량이 90% 이상인 말티톨 고함유 획분을 연속적으로 회수하였다. 원료인 수소첨가 당질 혼합물로부터 회수한 이들 획분중의 고형물 함량의 수율은 고형물 기준으로 각각 약 55% 및 약 18% 이었다.
이렇게 하여 수득한 트레할로오스 고함유 획분을 H형 및 OH형 이온 교환수지를 사용하여 탈염함으로써 정제하고 농도 약 83%가 되도록 농축하였다. 교반하면서 이 농축물에 씨결정으로서의 트레할로오스 함수결정을 약 2% 가하여 트레할로오스를 결정으로 석출시켰다. 수득한 결정을 알루미늄제 용기에 옮겨 실온에서 숙성하여 블록을 형성하였다. 수득한 블록을 절삭하고, 분말화한후 진공건조하여 분말상 트레할로오스 함수결정을 얻었다. 이 단계에서의 고형물 함량의 수율은 고형물 기준으로 약 94% 이었다. 이 생성물의 트레할로오스 순도는 약 94% 이었다. 이 제품은 실질적으로 환원성이 전혀 없고 온화한 감미를 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 및 희석제로서 유리하게 사용할 수 있다.
말티톨 고함유 획분을 농도 약 90% 되도록 미리 농축한 이외는 상기한 트레할로오스 고함유 획분 처리시에 사용된 방법에 따라 상기한 말티톨 고함유 획분으로부터 말티톨 순도가 약 93%인 결정질 분말을 얻었다. 이 단계에서의 고형물 함량의 수율은 고형물 기준으로 약 90% 이었다. 이 제품은 실질적으로 환원성이 전혀 없고 예리한 감미를 가지고 있다. 더욱이 이 제품은 비교적 낮은 칼로리값을 가지며 충치 유발성이 비교적 낮으므로 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 3
15% 전분 현탁액(pH 5.5)에 "SPITASE HS"(일본국의 Nagase Biochemicals사 판매의 α-아밀라아제 표품)를 고형물 기준으로 전분 1g당 2단위 가한 다음, 이 현탁액을 교반하면서 내용물을 가열하여 호화(糊化)하고 액화한후, 수득한 혼합물을 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하고 온도 50℃ 및 pH 5.0으로 조정하였다. 이렇게 하여 얻은 혼합물에 이소아밀라아제(일본국의 Hayashibara Biochemical Laboratories사 판매의 표품)를 고형물 기준으로 전분 1g당 500단위 및 β-아밀라아제(일본국의 Nagase Biochemicals사 판매의 표품)를 고형물 기준으로 전분 1g당 2단위를 가하여 혼합하고 24시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물에는 고형물 기준으로 말토오스를 약 92% 함유하고 있었다. 이 혼합물을 100℃에서 20분간 가열하고 온도 50℃ 및 pH 7.0으로 조정한후, 여기에 일본국 특허공개 제170,977/95호 공보에 개시된 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), ATCC 33923 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물 1g당 1.5단위 혼합하여 72시간 효소반응시켰다.
이 반응 혼합물을 95℃에서 10분간 인큐베이트하고 냉각한 다음, 수득한 혼합물을 종래 방법으로 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염하여 정제한후 농도 약 50%로 농축하였다. 따라서 트레할로오스와 말토오스를 함유한 시럽상 당질 혼합물을 얻었다. 실시예 1에 기재된 GLC 분석을 한 결과, 이 당질 혼합물은 트레할로오스 약 64%, 말토오스 약 25% 및 소량의 글루코오스와 말토트리오스를 함유하고 있음이 판명되었다.
상기한 당질 혼합물을 오토클레이브에 넣고 여기에 고형물 기준으로 10% 라네이 니켈을 혼합하여 교반하에 90∼120℃에서 가열하고 수소압을 20∼120kg/cm2까지 증가시켜 수소첨가한 다음, 라네이 니켈을 제거하고, 이 혼합물을 통상의 방법으로 탈색, 탈염함으로써 정제하였다. 정제된 용액을 고형물 기준으로 약 50% 농도의 시럽상 수소첨가 혼합물이 되도록 농축하였다. 실시예 1에 기재된 HPLC 분석을 한 결과, 수소첨가 당질 혼합물중에는 트레할로오스 약 64%, 말티톨 약 25%, 및 소르비톨, 말토트리이톨 등의 기타의 당알코올을 소량 함유하고 있음이 판명되었다.
수소첨가 당질 혼합물을 "CG6000, Ca++형, 가교도 6%"(일본국의 Japan Organo사 판매의 알칼리 토류금속 강산형 양이온 교환수지)를 사용한 칼럼 크로마토그래피 처리하였다. 즉, 내경 5.4cm의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4개에 수지를 충전하고 총 칼럼 겔층 깊이가 20m 되도록 직열로 연결하였다. 이들 칼럼속으로 수소첨가 당질 혼합물을 수지 체적에 대하여 5v/v%의 체적으로 가한 다음, 여기에 이동상으로서의 80℃로 가열된 물을 SV 0.15로 가하여 트레할로오스 함량이 90% 이상인 트레할로오스 고함유 획분과 말티톨 함량이 90% 이상인 말티톨 고함유 획분을 연속적으로 회수하였다. 원료인 수소첨가 당질 혼합물로부터 회수한 이들 획분중의 고형물 함량의 수율은 고형물 기준으로 각각 약 50% 및 약 15% 이었다.
이렇게 하여 수득한 트레할로오스 고함유 획분을 H형 및 OH형 이온 교환수지를 사용하여 탈염함으로써 정제하고 농도 약 70%가 되도록 농축하였다. 이 농축물에 씨결정으로서의 트레할로오스 함수결정을 고형물당 약 2% 가하여 혼합함으로써 트레할로오스를 결정으로 석출시켜 결정화도 약 45%의 매스키트를 얻었다. 분무 건조기에서 상부로부터 내용물에다 85℃의 열풍을 송입하면서 분무 건조기의 상부에 장치된 노즐로부터 150kg/cm2의 고압으로 매스키트를 분무하는 방식으로 하여 이 매스키트를 분무건조하고, 분무 건조기의 하부에 장치된 이송 컨베이어망 위에 결정질 분말을 회수함과 아울러 45℃로 가열된 공기를 컨베이어 아래에서 송입하면서 숙성탑으로부터 서서히 배출하였다. 이렇게 하여 수득한 결정을 숙성탑속으로 주입하여 그 속에서 열풍을 통풍시키면서 10시간 동안 숙성하여 분말상 트레할로오스 함수결정을 얻었다. 이 단계에서의 고형물 함량의 수율은 고형물 기준으로 약 90% 이었다. 이 제품의 트레할로오스 순도는 약 95%이고, 실질적으로 환원성이 없고 온화한 맛을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 및 희석제로서 유리하게 사용할 수 있다.
말티톨 고함유 획분을 농도 약 80% 되도록 미리 농축한 이외는 위에서 얻은 말티톨 고함유 획분을 트레할로오스 고함유 획분 처리를 위한 상기한 방법에 따라 처리함으로써 순도가 약 93%인 결정질 말티톨 분말을 얻었다. 이 단계에서의 고형물 함량의 수율은 고형물 기준으로 약 85% 이었다. 이 제품은 실질적으로 환원성이 전혀 없고 예리한 감미 및 비교적 낮은 충치 유발성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 4
실시예 3의 방법에 따라 트레할로오스를 약 64% 함유한 농도 약 50%의 수소첨가 당질 혼합물을 얻은 다음, "CG6000, Ca++형, 가교도 6%"(일본국의 Japan Organo사 판매의 알칼리 토류금속 강산형 양이온 교환수지)를 사용한 의사(擬似) 이동층 칼럼 크로마토그래피 처리를 하였다. 즉, 각각 직경 13cm 및 길이 1.6cm의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 10개를 직열로 연결하고, 각 칼럼의 상부에 원료당 및 이동상 공급용 유입구를 설치하고, 각 칼럼의 하부에 트레할로오스 고함유 획분 및 당알코올 고함유 획분 회수용 유출구를 설치함으로써 유입구와 유출구의 on/off 밸브를 컴퓨터 작동식으로 한 의사 이동층 칼럼 크로마토그래프를 구성하였다. 칼럼 내부온도를 80℃로 유지하고, 상기한 수소첨가 당질 혼합물을 원료당으로 한 그 공급속도를 6.8리터/시간으로 설정하며, 물을 이동상으로 한 그 공급속도를 20리터/시간으로 설정하고, 트레할로오스 고함유 획분의 회수속도를 16리터/시간으로 설정한 조건하에서 칼럼 크로마토그래피를 조작하였다. 각각의 칼럼을 21분의 간격으로 스위칭하였다. 의사 이동상 칼럼 크로마토그래피에 의하여 고형물 기준으로 트레할로오스를 90% 이상 함유하는 트레할로오스 고함유 획분과 고형물 기준으로 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨을 함유하는 당알코올을 90% 이상 함유한 당알코올 고함유 획분을 얻었다. 수소첨가 당질 혼합물으로부터의 이들 획분중의 각 고형물 함량의 수율은 각각 약 55% 및 약 18% 이었다. 실시예 3과 마찬가지로 트레할로오스 고함유 획분을 결정화하여 분무건조함으로써 트레할로오스 함수결정 분말을 얻었다. 이 제품은 트레할로오스를 약 95% 함유하고 실질적으로 환원성이 전혀 없으며 온화한 맛을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 및 희석제로서 유리하게 사용할 수 있다. 이렇게 하여 수득한 당알코올 고함유 획분을 종래의 방법으로 탈염하여 정제하고 농도 약 70% 되게 농축함으로써 당알코올 고함유 시럽을 얻었다. 이 제품은 실질적으로 환원성이 전혀 없고 예리한 맛과 비교적 낮은 칼로리값 및 비교적 낮은 충치 유발성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 유리하게 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명은 말토오스 등의 환원성 당질과 트레할로오스를 함유한 당질 혼합물로부터 트레할로오스의 분리가 곤난한 것으로 생각되었던 것을 환원성 당질을 함유한 당질 혼합물을 수소첨가하여 얻은, 말티톨 등의 당알코올과 트레할로오스 함유의 수소첨가 당질 혼합물에 대하여 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 적용함으로써 쉽사리 분리할 수 있었다는 신규의 자체 발견에 근거하여 된 것이다. 본 발명자들은 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨로 된 군으로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가 당질 혼합물을 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 트레할로오스 고함유 획분과 당알코올 고함유 획분의 순서로 용출시키며, 트레할로오스 고함유 획분 및/또는 당알코올 고함유 획분을 회수하는 단계를 포함하는 트레할로오스 및/또는 당알코올의 제조방법을 확립하였다. 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스 등의 환원성 당질과 트레할로오스를 함유한 당질 혼합물을 수소첨가하여 얻은 수소첨가 당질 혼합물에 본 발명의 방법을 적용했을 경우, 수소첨가 당질 혼합물로부터 트레할로오스 및/또는 당알코올을 공업적으로 극히 용이하게 제조할 수 있다. 말토오스 등의 환원성 당질과 트레할로오스를 함유한 당질 혼합물을 수소첨가하는 단계를 추가로 포함하는 본 발명에 의한 제조방법에 의하여 수소첨가 당질 혼합물로부터 트레할로오스 및/또는 당알코올을 공업적으로 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법의 확립은 비환원성 당질로서의 트레할로오스와 당알코올을 공업적 규모로 용이하게 제공할 수 있는 새로운 길을 개척하는 것이다. 따라서 감미료를 포함한 식품분야 및 화장품, 의약품 분야와 농업, 수산업, 목축업, 화학공업 등의 분야에 미치는 본 발명의 영향은 헤아릴 수 없다.
도 1은 적어도 말토오스를 함유한 환원성 당질과 트레할로오스를 함유하는 당질 혼합물에 대해 적용된 알칼리 토류 금속 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 HPLC에 의한 분석 결과의 크로마토그램.
도 2는 적어도 말티톨을 함유한 당알코올과 트레할로오스를 함유하는 수소첨가 당질 혼합물에 대해 적용된 알칼리 토류 금속 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 HPLC에 의한 분석 결과의 크로마토그램.

Claims (12)

  1. 소르비톨, 말티톨 및 말토트리이톨로 된 군으로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가 당질 혼합물을 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 상기 트레할로오스의 고함유 획분 및/또는 상기 당알코올의 고함유 획분을 회수하는 단계를 포함하는 트레할로오스 및 당알코올의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수소첨가 당질 혼합물은 상기 트레할로오스와 상기 당알코올을 고형물 기준으로 각각 10∼80w/w% 및 20∼90w/w% 함유하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 강산형 양이온 교환 수지는 알칼리 금속형 또는 알칼리 토류금속형인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 강산형 양이온 교환 수지는 기재로서 스티렌/디비닐벤젠 폴리머를 사용하여 제조되고 가교도가 2∼8%의 것인 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 칼럼 크로마토그래피는 상기 트레할로오스 고함유 획분과 상기 당알코올 고함유 획분을 이러한 순서로 용출시킴으로써 실시되는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 고형물 기준으로 트레할로오스를 90w/w% 이상 함유하는 획분을 상기 트레할로오스 고함유 획분으로서 회수하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 고형물 기준으로 말티톨을 90w/w% 이상 함유하는 획분을 상기 당알코올 고함유 획분으로서 회수하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 글루코오스, 말토오스 및 말토트리오스로 된 군으로부터 선택되는 환원성 당질과 트레할로오스를 함유한 당질 혼합물을 수소첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 수득한 수소첨가 생성물을 수소첨가 당질 혼합물로 사용하는 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 당질 혼합물은 전분 또는 말토오스에 1종 이상의 효소를 작용시켜 제조되는 것인 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 효소가 비환원성 당질생성 효소, 트레할로오스 유리효소, 말토오스/트레할로오스 변환효소, 말토오스-포스포릴라아제 및 트레할로오스-포스포릴라아제인 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 당질 혼합물은 적어도 말토오스를 함유한 당질에 말토오스/트레할로오스 변환효소를 작용시켜 수득되는 것인 제조방법.
  12. 소르비톨, 말티톨 및 말토트리이톨로 된 군으로부터 선택되는 당알코올과 트레할로오스를 함유한 수소첨가 당질들의 혼합물을 강산형 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 상기 트레할로오스의 고함유 획분 및 당알코올의 고함유 획분을 이러한 순서로 용출시키는 단계를 포함하는 트레할로오스 및 당알코올의 분리방법.
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