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KR100464601B1 - 페이로드를 증가시키고, 분리/결합율을 제어하기 위한 거대 분자 결합체 및 복합응집체의 생장, 시험 및 사용방법 - Google Patents

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KR100464601B1
KR100464601B1 KR10-2000-7007020A KR20007007020A KR100464601B1 KR 100464601 B1 KR100464601 B1 KR 100464601B1 KR 20007007020 A KR20007007020 A KR 20007007020A KR 100464601 B1 KR100464601 B1 KR 100464601B1
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KR
South Korea
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lipid
insulin
concentration
molecules
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케에베그레고르
Original Assignee
이데아 악티엔게젤샤프트
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Publication date
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Abstract

본 발명은 필요하다면 변형된 다양한 양친매성 거대 분자(폴리펩티드, 단백질 등) 또는 다른 사슬분자(예를 들어, 부분적으로 소수성화된 적당한 폴리뉴클레오티드나 폴리사카라이드 등)와 극성 및/또는 하전된 양친매성 물질의 혼합물로 이루어지고 자유롭게 현탁되거나 지지될 수 있는 확장된 표면을 형성하는 응집체와의 조합체의 생장, 시험, 제조 및 용도에 대한 적합한 원리 및 과정을 기재하고 있다. 기재된 방법을 약간의 활성이나 유용한 기능을 나타내는 사슬 분자와 결합시킨 후에 상기 응집체를 사용할 수 있는데, 이는 예를 들어 약물의 전달이나 진단학 또는 생체/가수분해 등의 분야에 비트로나 비보상태로 사용하는 것이 적당하다. 상세한 예로, (결합된) 인슐린, 인터페론, 인터류킨, 신경 생장 인자, 칼시토닌, 및 면역글로불린 등을 함유하고 있는 지질로 이루어지는 소포형태의 액적 혼합물이 설명되어 있다.

Description

페이로드를 증가시키고, 분리/결합율을 제어하기 위한 거대 분자 결합체 및 복합응집체의 생장, 시험 및 사용방법{METHOD FOR DEVELOPING, TESTING AND USING ASSOCIATES OF MACROMOLECULES AND COMPLEX AGGREGATES FOR IMPROVED PAYLOAD AND CONTROLLABLE DE/ASSOCIATION RATES}
또한, 본 발명의 표면에 하전된 계면활성제를 첨가하여, 상기 표면에 대한 단백질의 결합 공정을 가속화하고, 거대 분자-막의 결합 속도 및 정도를 제어하는 수단을 제공한다. 이것은 상기한 바와 같이 널리 공지되어 있는 계면활성제가 단백질의 결합을 억제한다는 사실과 모순된다. 한편, 상기 표면으로부터 계면활성제를 적어도 부분적으로 제거하는 것은 거대 분자 탈착 공정을 가속화하고, 일부 거대 분자를 유리시킨다. 이것은 또한 공지된 사실과 반대된다. 본 발명자들은 본 발명의 연질의 변형가능한 표면, 특히 대응하는 막에 대한 거대 분자의 흡착이 변형성이 떨어지는 표면에 대한 흡착 보다 강력하다는 것을 알아내었다. 일련의 문헌은 연질의 막은 그렇지 못한 막보다 좀 더 친수성을 지니고, 상호 반발성이 크다고 기재하고 있으므로, 이러한 발견은 예상과 완전히 반대되는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 크고, 때로는 단백질과 같은 거대 분자의 양친매성 분자, 또는 다른 종류의 적당한 사슬 분자 및 복합흡착제 표면 사이의 결합을 최대화하는 조건을 상술하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 복합체 표면에 대한 분자의 흡착 속도 또는 상기 표면으로부터의 대응하는 탈착 속도를 제어하는 유리한 인자를 정의하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (생명)공학 및 의학분야에 적합한 제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 얻어지는 제제를 실용화하여 사용하기에 특히 적당한 양식을 서술하고 있다; 즉, 본 발명은 예를 들어 의학이나 수의학과 같은 분야에서 진단학, 분리공정 및 (생물학적)공정, 생명공학, 유전자 증식, 제재 안정화 처리, 농축 및 운반등의 용도에 사용되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 양친매성을 나타내고, 양친매성 액매와 접촉할 경우에, 특히 막 표면과 같은, 확장된 표면을 형성할 수 있는 물질들의 조합체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 상기 표면과 다른 양친매성 물질과의 분자 수준의 결합체에 관한 것인데, 이러한 상기 다른 양친매성의, 표면 결합 물질은, 전형적으로 올리고머 및 폴리머와 같은 반복 서브 유니트를 갖는 거대한 분자이고, 이것은 종종 생물학적 활성 성분의 군으로부터 유래한다.
본 발명은 또한 상기 표면의 제조 방법, 상기 거대 분자 및 표면 사이의 결합체의 제조방법, 및 더 나아가 상기 표면 및 결합체들의 다양한 용도에 관한 것이다.
단백질과 같은 양친매성 사슬 분자 및 이와 관련된 거대 분자는 대부분의 경우에, 동일한 양은 아니더라도, 다양한 형태로써 어떤 종류의 표면에도 흡착된다. 본 발명은 본 기술을 설명하고, 유연하고 복합적인 표면과 거대 분자의 결합을 최적화하고, 제어하기 위한, 새로운 원리를 제공한다. 이것은 미래의 생물학, 생물공학, 약학, 치료 및 진단 상의 용도에 가치가 있을 것이다.
흡착제 표면(흡착제/흡착질 결합체)에 (고)분자를 흡착/결합시키는 것은 다음의 단계-공정으로 행해진다:
i) 제1단계는 흡착제/용액 계면에 흡착질의 재분배, 바람직하게는 축적시키는 단계이다. 본 단계는 일반적으로 고속이고, 제어된 확산 속도를 갖는다.
ii) 제2단계에서는, 흡착질 분자가 소수성을 띠면서 연질 (막) 표면과 결합한다. 본 공정은 부분적인 분자 결합 및 순차적인 재배치와 같은 다단계로 이루어지는데, 본 단계의 적어도 일부는 종종 느리게 진행된다.
"연질"의 지질막에 끼워진 표면 부착 리간드에 거대 분자가 특이적으로 결합할 확률이 계면의 근접성에 의해 감소되는 문제가 논의되어 왔다(Cevc, G., Strohmaier, L., Berkholz, J., Blume, G. Stud. Biophys. 1990, 138: 57ff). 이러한 현상은 인접하는 지질막의 콜로이드 붕괴를 방지하는 동일한 비-쿨롱, 수화의존력에 기인하는 것으로 보인다. 이 모든 힘은 지질-용액 계면의 강성 및 친수성이감소함에 따라서 감소한다(Cevc, G., Hauser, M., Kornyshev, A. A. Langmuir 1995, 11: 3103-3110).
지질 이중층에 대한 비-특이적인 단백질의 흡착 정도는 막 내에서 단백질에 대한 소수성 결합자리들의 이용가능성에 비례한다는 사실이 또한 추정되어 오고 있다(Cevc, et al., op. cit.:1990). 지질 이중층에서 결함 부위를 기계적으로 만들거나(예를 들어, 초음파 분해 처리에 의해), 지질 상전이를 유도함으로써 막과 결합되는 단백질의 양을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
일반적으로, 표면이 보다 소수성을 띠면 띨수록 양친매성 거대 분자의 흡착정도가 증가한다고 알려져 있다. 예를 들면, K. Prime 및 G. M. Whitesides(Sci ence, 1991, 252:1164-1167)는 소수성 아미노산 결합을 통하여 단백질의 흡착을 계통적으로 변화시키기 위하여, 소수성이 상이한 말단기를 갖는 긴 사슬 형태의 알칸의 자가 집합한 단일 층을 사용하고, 이러한 "규칙" 또는 "원리"를 확인하였다. 따라서, 오늘날까지 "소수성 인력"은 단백질의 흡착에 있어서 지배적인 힘으로 간주되고 있다.
한편, 중성의 pH의 수용액에 침지시킨, 단백질과 같은 친수성 거대 분자와 유리나 몬모릴로나이트 점토와 같은 친수성 표면 사이에 존재하는 순 거시적인 수준의 상호 작용은 강한 반발력에 의해 지배된다는 사실이 일반적으로 알려져 있다. 따라서, 반데르발스, 루이스 산-염기, 및 전기적 이중층 상호 작용의 거시적인 척도의 규칙이 적용될 수 있는 조건 하에서, 친수성 광물질 표면 위에 친수성 단백질이 흡착되는 일은 통상 미미하다(H. Quiquampoix et al, Mechanisms and Consequences of Protein Adsorption on Soil Mineral Surfaces, Chapter 23 in Proteins at Interfaces(PAI), T. A. Horbett and J. L. Brash, eds., ACS Symposium Series 602, 1995, New York: 321-333). 친수성 단백질은, 비록 소수성 표면 상에 흡착되는 것보다는 성기게 흡착되기는 하지만, 용액으로부터 유리 위에 일부가 흡착되고; 이러한 단백질은 또한 몬모릴로나이트 점토 표면 상에 흡착된다. 이러한 중요한 현상을 설명하기 위하여, 단백질이, (음으로) 하전된 친수성 단백질에 결합되는 다가성 짝이온(예를 들어, 칼슘)을 통하여, 수용성 매질에 침지된 동일하게(예를 들면, 음으로) 하전된 친수성 광물성 표면에, 균일하게 결합할 수 있다는 사실이 제안되고, 실험적인 데이타로 입증되었다. 기타 미세한 전하 효과는 수소결합의 형성, 단백질의 염용(salting-in), 및 짝이온들의 결합을 수반한다. 예를 들면, 단백질 분자내에서의 "구조적인 재배열, 흡착제 표면의 탈수, 하전된 기의 재분포 및 단백질 표면의 극성"이 단백질의 흡착에 영향을 줄 수도 있는 사실이 이미 제안되어 있다(Haynes, C. A. et al, Colloids Surface B: Biointerface, 2, 1994: 517-566). 이러한 맥락에서, 쿨롱의 상호 작용은 중요하기는 하지만 일반적으로는 고체 표면에 대한 단백질 흡착을 지배하지는 않으며, 이것은 단백질이 실질적인 알짜 음전하를 수반하는 조건하에서 PS(폴리스티렌)에 대한-LA(알파-락트알부민)의 강한 흡착과 동일한 양태이다. 최근의 다른 연구보고서에서는 "단백질의 흡착에 대한 전하효과 정도에 대해서 현재까지 어떠한 확실하게 정립된 사실이 없다" 는 결론을 내린 바 있다(Reversibility and the Mechanism of Protein Adsorption, W. Norde and C. Haynes, Chapter 2 in (PAI), op. cit.: 26-40).
막과 같은 연질의 표면에 있어서, 단백질 흡착의 적어도 제1단계가 정전기적으로 유도되고/거나, 전하의 지배를 받는다는 견해가 현재 지배적이다(예를 들어, Deber, C. M.; Hughes, D. W.; Frasez, P. E.; Pawagi, A. B.; Moscarello, M. A. Arch. Biochem. Biophys. 1986, 245: 455-463; Zimmerman, R. M., Schmidt, C. F., Gaub, N. H. E. J. Colloid Int. Sci. 1990, 139: 268-280; Hernandez-Caseldis, T.; Villalaain, J.; Gomez-Fernandez, J. C. Mol. Cell. Biochem. 1993, 120: 119-126.). 일선 전문가들은 또한 분비성 포스포리파제가 다양한 지질응집체에 결합할 때 정전기력이 중요한 작용을 한다는 결론을 내렸다(Scott, D. L.; Mandel, A. M.; Sigler, P. B.; Honig, B. Biophys. J. 1994, 67:493-504).
지금까지, 본 분야의 전문가들은, 흡착시에 단백질의 형태학적인 변화로 인하여 얻어지는 엔트로피와 조합하여 이온력이 또한 일부 작용하기는 하지만, 최종적인 단백질 흡착의 주요한 결정인자는 소수성 인력이라고 믿어 왔다.
일반적으로, 단백질은 동일한 전하를 띠는 표면에는 흡착되지 않고, 반대 전하를 띠는 표면에 강하게 흡착한다. 단백질 흡착에 있어서의 pH 의존성은 이러한 사실을 반영하고 있다. 상기 전하 효과는 작은 다가성 짝이온과 같은 숨어 있는 인자에 의해 종종 혼동될 수 있는데, 이는 통상 서로 반발할 것으로 기대되는 유사한 전하를 갖는 표면 자리와 단백질을 가교시킬 수 있다.
흡착된 단백질의 최종적인 형태는 최초의 형태와 거의 일치하지 않는다. 이는 단백질 흡착에 있어서의 대부분의 모델은 가역적으로 흡착된 상태로부터 보다 견고하게 고정된 상태로의 전이를 야기시켜, 결과적으로 표면 위의 단백질의 분자재배치나 이완을 야기시키기 때문이다. 흡착시의 거대 분자 재배치는 종종 치명적이며, 단백질의 변성에 있어서는 더욱 더 그러하다. 흡착 상태에서 효소 및 항체가 적어도 그들의 생물학적인 활성의 일부를 보유한다는 사실과 생물학적인 활성이 본래 구조의 유지에 정교하게 의존한다는 사실로부터, 흡착된 단백질 형태의 변화가 종종 시간과 범위에 있어 한정된다는 결론을 얻을 수 있다. 단백질의 폴딩은 소수성 상호 작용에 의해 강하게 영향 받는다. 단백질의 결합 및 형태 변화와 같은 2 가지 현상 모두는 계면활성제 및 인지질과 같은 특정한 양친매성 물질의 존재에 대하여 민감하다. 이러한 분자들의 첨가에 의해, 단백질 흡착이 감소하거나, 또는 역전된다고 여겨진다.
따라서, 비특이적인 단백질의 흡착 및 손실을 최소화하기 위해서, 단백질을 단백질 단리 중에 계면활성제와 자주 혼합시킨다. 한 특정한 연구에서, 그래프트 된 플루로닉(pluronic) 계면활성제의 표면농도가 증가함에 따라, 단백질의 흡착은 무시할 만한 정도로까지 감소된다. 계면활성제의 단량체 부사슬에서의 에틸렌-글리콜(EG) 단위의 수는 4, 9 및 24이고, EG 단위(4)를 최소로 갖는 단량체가 혈액성분에 대하여 가장 "비활성"이다(Analysis of the Prevention of Protein Adsorption by Steric Repulsion Theory, T. B. McPherson et al., Chapter 28 in PAI, op. cit.: 395-404).
표면에 공유결합적으로 부착된 짧은 중합체는 계면 두께 및 친수성을 증가시키고, 이로 인해 하부의 소수성 결합자리의 이용가능성을 저하시키며, 변성된 표면에 대한 단백질의 결합 확률 및 변성된 표면에 있어서의 변성 확률을 저하시키는 것이 입증되었다.
또한, 종종 한 말단에 짧은 중합체 단편을 함유하는 계면활성제가 다양한 표면에 대한 단백질의 결합을 방해하거나 또는 심지어 부분적으로 역전시킬 수도 있다는 사실은 상기 언급한 발견과 일치한다. 상기 현상은 아마도 계면활성제-표면 상호 작용 및 계면활성제-단백질 결합의 상대적인 강도에 의존하는, 단백질의 가용화 또는 치환을 수반하고, 통상 이러한 인자들은 일정 정도의 역할을 가진다.
다른 실험에서는, 10-4중량%의 농도 범위에서 pH 7.0인 수성 상에 브리즈(Brij)형 비이온성 계면활성제(알칼리-폴리옥시에틸렌 에테르)를 첨가하여 공기/물 계면으로부터 단백질이 실질적인 전위를 유발하였다(T. Arnebrant et al, op. cit.).
계면활성제로 미리 흡착된 단백질을 제거하는 것이 집중적으로 연구되어 왔다(Protein-Surfactant Interaction at Solid Surfaces, T. Arnebrant et al. Chapter 17 in PAI, op. cit.: 240-254). 이와 관련된 3 가지 종류의 상호 작용이 확인되었다:
i) 정전기적 또는 소수성 상호 작용에 의한 알파-락토글로불린이나 알부민 혈청과 같은 단백질 내의 특정 자리들에 대한 계면활성제 결합;
ii) 큰 형태학적 변화가 없는, 단백질에 대한 계면활성제의 협동적인 흡착; 및
iii) 형태학적인 변화가 수반되는, 단백질에 대한 계면활성제의 협동적인 결합.
예를 들면, 메틸화된 (소수성) 실리카 표면으로부터 단백질의 제거는, 상이한 계면활성제들의 경우에도 마찬가지이며, 계면활성제의 더 높은 표면 활성으로 인한 치환을 통하여 단백질이 제거되는 것을 나타낸다. 다른 계면활성제의 경우에도 마찬가지이다. 계면활성제 헤드그룹 효과는 친수성 표면에서 가장 잘 발현되고, 소수성 표면에서는 별로 중요하지 않다고 결론지을 수도 있다(Protein-Surfactant Interaction at Solid Surfaces, T. Arnebrant et al. Chapter 17 in PAI, op. cit.,: 240-254).
다른 지질에 대해서도 유사한 결론이 유지된다. 플라스틱 표면 상에 흡착되는 플라즈마 단백질의 양은 DPPC 리포좀 현탁액으로 전처리함으로써 감소하고, 카테터 표면 상의 인슐린 흡착도 같은 경향을 나타냄이 밝혀졌다.
본 발명자들은 예상외로, 양친매성 물질, 특히 거대 분자는 계면활성 분자를 함유하지 않는 지질 응집체에 대하여 보다 지질 및 계면활성제의 혼합물을 함유하는 연질 표면에 대하여 보다 효과적으로 흡착한다는 사실을 발견하였다. 보다 일반적으로 말하자면, 일반적으로(반드시는 아님) 지질 소포(리포좀) 형태의 안정적인 막을 형성하는 분자 및 적어도 1종의 강력한 양친매성의, 즉, 비교적 고수용성인 2중층-불안정화 성분(종종 계면활성제)의 배합물은, 순수한 인지질 표면, 특히, 인지질만으로 구성되거나 또는 콜레스테롤 등과 같은 1종 이상의 이중층 지질 안정화 계열의 물질을 또한 포함하는 리포좀 또는 소포 등의 경우 보다, 단백질과 같은 양친매성 물질과 결합하기가 보다 쉽다. 또한, 결합되는 양친매성의 거대 분자(단백질)의 상대적인 수는 흡착체의 알짜 전하와 동일한 부호를 갖는 알짜 전하를 보유하는 표면에서 더 높다는 것을 예상 외로 알게 되었다. 이것은 정전기적인 결합은 그 결합이 더 강력해지기 위해서는 상호 작용하는 실재물 상에서 반대 전하를 필요로 한다고 알려진 기존의 공지된 정보와는 명백히 모순되는 것이다.
본 발명자들은 초분자(예를 들어, 약물-캐리어) 결합에 관한 상기 개선 사항을 달성하기 위한 요건 중의 하나는 흡착제 표면의 일반적인 흡착가능성임을 제안한다. 이러한 흡착 촉진력은 흡착성 거대 분자가
i) 먼저, 국소적으로 서로 끌어당기는 전하-전하 및 다른 상호 작용으로 인하여 흡착제 근방의 표면을 크게 하는 것을 가능하게 하고,
ii) 그 다음으로, 흡착제 표면에 대한 비-정전기적인 상호작용/결합을 최적화한다(후자의 과정은, 일반적으로 소수성 결합 및 수소결합 결합자리의 존재를 필요로 하고, 이 자리는 표면-유연성 및/또는 적합성에 의해서 발생되거나 얻을 수 있다.
이러한 요구사항을 충족하며, 제어가 가능한 (거대 분자)약물-캐리어 결합물은 실용적으로 사용하는 데에 가장 적합하다.
또한, 본 발명자들은 연질의 표면에 대한 단백질의 흡착에 관한 각 공정단계는 가변적이기는 하지만, 막-용액 계면상 또는 내면에서의 소수성 결합자리의 근접성 및 다수성에 의존하는 것을 제안한다. 따라서, 거대 분자 및 결합 표면 사이의 소수성 결합의 속도는 계면활성 성분 및 막의 유연성의 존재에 의해 증가하는 접근가능한 결합자리의 수에 민감하다.
흡착성 (고)분자가 다수의 결합자리에 형태학적으로 맞춰질 수 있는 속도 또한 중요하다. 예를 들면, 하전되지 않은 유연성이 있는(Transfersomeⓡ) 막의 경우, 소수성 상호 작용이 인슐린-표면 결합의 중요한 원인이 된다. 상기 일련의 다단계 결합은 대개 실질적인 시스템 재배치가 필요하지만, 완결되는데 있어서 긴 흡착 시간이 요구된다. Transfersomeⓡ-인슐린 복합체 형성의 최적의 항온배양 시간은 결과적으로 다소 길어질 수 있다.
전 단락에서 설명된 흡착 개요는 상세한 자료에 기재되어 있는 기본적인 흡착 시나리오와 일치한다. 이러한 사실에도 불구하고, 여러가지 차이점 및 심지어는 반대되는 사항들이 본 발명을 현재까지 공지된 사실과 명확하게 구분되도록 한다.
본 발명의 이러한 문제에 대한 해결책은 첨부된 독립항에서 정의한다.특별한 이점을 제공하는 유용한 해결책은 종속항에서 정의한다.
정의
본원에 사용된 정의에 의해 "결합체"라는 것은 둘 이상의 다른 분자들 간의 복합체이고, 그 분자의 적어도 하나는, 공유결합을 제외하고, 다른 하나 또는 다수의 잘 규정된 표면(들)과 응집체를 형성한다. 이종 분자들간의 결합은 인캡슐레이션(예를 들어, 표면-형성 분자로 구성되는 소포에 포함됨), 삽입(예를 들어, 표면상 및 표면 아래의 응집체층으로의 혼입) 또는 흡착(응집체 표면 상의)을 근간으로 이루어진다고 할 수 있다; 또한, 이러한 원리들을 둘이상 조합하여 사용할 수 있다.
상기 언급했던 맥락에서, 본원에 사용되는 "흡착질", "흡착성 (고)분자", "접합성 (고)분자", "결합성 (고)분자" 등은 확장된 표면을 형성하지 않는 분자들과 "흡착제"나 "결합성 표면" 등 간의 결합을 설명하기 위해 호환적으로 사용된다.
"캐리어"라는 것은, 그의 특성 또는 그것의 발생원과는 상관없이, 인체나 동물체로의 전달체 또는 그에 대한 적용과 같은 실용적인 목적으로 사용되는 하나 이상의 거대 분자와 결합할 수 있는 응집체를 의미한다.
본 발명에서의 의미로 "지질"이라는 것은 지방의 특성과 유사한 특징을 보유하는 어떠한 물질을 의미한다. 대개, 이러한 유형의 분자는 확장된 무극성 영역(사슬, X), 및 대부분의 경우에는, 또한 소위 헤드그룹(Y)이라고 불리는 수용성이고, 극성이며, 친수성을 띠는 기를 보유하고 있다. 상기 물질의 기본적인 구조식1은 하기와 같다.
X-Y n (1)
여기서, n은 0이상이다. n=0인 경우에 그 지질을 무극성 지질이라고 한다; n1이면 지질은 극성을 띠게 된다. 이러한 맥락에서, 글리세리드, 글리세로포스포리피드, 글리세로포스피노리피드, 글리세로포스포노리피드, 설포리피드, 스핑고리피드, 이소프레노이드리피드, 스테로이드, 스테린 또는 스테롤 등과 같은 모든 양친매성 물질들 및 탄수화물 잔기를 함유하고 있는 모든 지질은 단순히 지질이라고 명명한다. 보다 정확한 정의를 위해서는, PCT/EP91/01596을 참조한다.
본원에서 " 표면 활성" 물질 또는 "계면활성제"라는 것은 가장자리, 돌출부 또는 기타 심하게 굴곡진 구조 및 결함이 많은 영역을 형성하는, 시스템의 성향을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 통상적인 계면활성제에 추가로 보다 더 통상적인 계면활성제의 존재하에 지질의 용해화를 촉진하는 다른 분자 및 보조-계면활성제가 이러한 범주에 포함된다. 또한 흡착체(헤테로) 응집체 내에 (적어도 부분적으로는 소수성인) 결함의 형성을 야기하거나 촉진하는 분자도 마찬가지로 포함된다. 관련 분자에 대한 직접적인 계면활성제 작용이나 (부분적인)분자 탈혼합의 (간접적인) 촉매작용, 또는 그 밖의 계면활성제로 야기된 형태학적인 변화가 종종 상기 효과의 원인이 된다. 결과적으로, 다수의 올리고- 및 폴리카보하이드레이트, 올리고- 및 폴리펩티드, 올리고- 및 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것들의 유도체와 같은 비대칭이고 따라서 양친매성인 분자 및 중합체 뿐만 아니라, 다수의 용매들은, 종래의 계면활성제에 더하여 상기 언급한 범주 내에 포함된다. 매우 폭넓게 사용되는 표준 계면활성제, 적당한 용매(소위, 보조-계면활성제라고도 함), 및 다수의 다른 적당한 가장자리 활성 물질의 비교적 광범위한 리스트가 PCT/EP91/01596에 기재되어 있는데, 본 발명에서 이것을 예시적으로 참조한다. 보다 더 완벽한 리스트는 Handbook of Industrial surfactants(Michael Ash, Irene Ash, eds., Gower Publishing, 1993)에 기재되어 있다.
"사슬 분자" 또는 "거대 분자"는 "흡착성 표면"에 대하여 다른 친화도를 나타내는 기를 2종 이상 또는 2가지 상태 이상 보유하는 임의의 직쇄나 측쇄의 분자이다. 본 발명의 대응하는 대안(청구항 2)을 제시하거나 조합(청구항 3)하는 관점에 있어서 특별히 요구되는 것은 상기 기의 1종 이상이 도너 용액 및/또는 흡착성 표면에서 (부분적으로) 하전되어야만 한다는 것이다. 각 기에 대한 상기 표면-친화도의 차이는 종종 그들의 상이한 양친매성, 즉, 상이한 친수성/소수성에서 비롯된다. 상이한 기들은 사슬을 따라서 임의로 분포될 수 있지만, 대부분의 경우에 다수의 물리적으로 연관된(예를 들어, 다수의 친수성 또는 하나 이상의 소수성)기가 하나의 사슬단편에 위치하게 된다.
본 원에서의 "거대 분자"는 하기의 것들을 의미한다.
기본식 CX(H2O)y로 표시되는 탄수화물류, 예를 들면, 설탕, 전분, 셀룰로오스 등(탄수화물의 보다 확실한 정의는 PCT/EP91/01596을 참조한다)은, 본 발명의 목적에 있어, 본 발명에서 접합성 표면에 대한 부가적인 친화력을 얻도록 유도체화될 필요가 있다. 이는, 예를 들어, (부분적으로) 소수성을 띠는 표면과 결합하게 되는 탄수화물에 소수성 잔기를 부착시킴으로써, 또는 보다 친수성을 띠는 접합성 표면과 다른 비-쿨롱 상호 작용(예를 들어, 수소결합)에 참여할 수 있는 기를 도입함으로써 이루어질 수 있다.
데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)의 호모나 헤테로 사슬과 같은 올리고 또는 폴리뉴클레오티드와, 그것들의 화학적, 생물학적 또는 분자 생물학적 (유전자) 변형체(보다 상세한 정의는 PCT/EP91/01596에 기재되어 있는 리스트를 참조한다)가 있다.
올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 3-250, 종종 4-100, 흔하게는 10-50개의 같거나 다른 아미노산을 포함하고, 아미드 결합을 통하여 자연적으로 쌍을 이루나, 단백질 유사물질의 경우에 다른 중합 반응 개요에 따라 변화할 수도 있고, 심지어 부분적으로 또는 완전하게 고리형일 수도 있다; 선택적으로 순수한 화합물 또는 라세믹 혼합물을 사용하는 것도 가능하다(보다 상세하고 완벽한 정의를 위해서 PCT/EP91/01596를 참조한다.).
그들의 상세한 형태나 중합반응의 정확도와는 상관없이 긴 폴리펩티드 사슬을 일반적으로 단백질이라 한다. 본 명세서에서 개설한 바와 같이, 단백질은 전부는 아닐지라도 대부분 표면과 비교적 효율적으로 결합한다. 따라서, 여기에서는 관련 물질을 인용하지는 않고, 부분적인 리스트로 PCT/EP91/01596 및 최근까지 게재된 전문분야의 논문을 참조로 한다.
단지 설명을 목적으로, 약간의 관련 군들을 하기 간단하게 요약한다.
효소에는 옥시도리덕타제(다양한 데하이디드로게나아제, (퍼)옥시다아제, (수퍼옥시드)디스뮤타아제 등), 트랜스퍼라아제(아실-트랜스퍼라아제, 포스포릴라아제 및 기타 키나아제), 트랜스펩티다아제(에스터라아제, 리파아제 등), 리아제(디카르복실라아제, 이소머라아제 등), 다양한 프로테아제, 보조 효소 등이 있다.
본래의 형태 또는 화학적, 생화학적, 또는 유전학적으로 증폭된 형태의 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM군의 면역글로불린 및 그의 모든 서브 타입, Fab- Fab2-단편과 같은 그것들의 단편, 가변 또는 고도 가변성 영역과 같은, 단일 사슬 항체 또는 그 일부가 본 발명으로부터 얻어질 수 있다. 여기에는 IgG-감마 사슬, IgG-F(ab')2 단편, IgG-F(ab), IgG-Fc 단편, Ig-카파 사슬, Ig-s의 경사슬(예를 들어, 카파 및 람다 사슬)이 포함되고, 또한, 가변 또는 고도 가변성 영역과 같은 보다 작은 면역 글로불린 단편, 또는 임의의 이러한 물질이나 단편의 변형체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 이외에 면역학적으로 활성인 거대 분자(엔도톡신, 사이토킨, 림포킨 및 다른 거대한 면역조절물질이나 생물학적 전달체) 또한 비상동성 사슬분자군에 속한다. 피토해마글루틴, 렉틴, 폴리이노신, 폴리사이티딜산(폴리 I:C), 에리트로포이에틴, "과립백혈구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 1~18의 인터류킨, 인터페론(알파, 베타 또는 감마 및 그것들의 (생)합성된 변성체), 종양 괴사 인자, (TNF-s); 충분히 크고 양친매성인 조직 및 식물체 추출물, 그것들의 화학적, 생화학적 또는 생물학적 유도체 및 대체물, 그것들의 일부 등도 같은 군에 속한다. 결과적으로, 상기 모든 분자는 본 명세서에서 기재한 바와 같이 복합체 표면과 편리하고 효율적으로 결합될 수 있다.
생물학적으로 관련된 또 다른 예에는 염기성 섬유아세포 생장인자(BFGF), 내피세포 생장인자(ECGF), 표피 생장인자(EGF), 섬유아세포 생장인자(FGF), 인슐린, 인슐린 유사 생장인자(LGF I 및 LGF II 등), 신경-생장인자(NGF-beta, NGF 2,5s, NGF 7s 등), 혈소판 유래의 생장인자(PDGF) 등과 같은 국소적이거나 일반적인 생장에 영향을 주는 물질이 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해서 특히 유용하게 사용되는 유도체화는, (생)화학적으로, 생물학적으로, 또는 유전학적으로 이루어지는 지 여부에 상관없이, 흡착질이 탄소수 1~24인 아릴, 알킬, 알케닐, 알케노일, 히드록시알킬, 알케닐히드록시 또는 히드록시아실 사슬과 같은 다수, 종종은 3이상의, 무극성(소수성) 잔기로 치환되는 변형 또는 적당하게는, 흡착제와 흡착질 사이의 다른 비쿨롱 상호 작용을 일으키는 경향이 증가하는 반응이다. 거대 분자가 소수성화하는 경우, 측쇄당 비교적 소수(1-8이거나 바람직하게는 1-4)인 탄소수가 바람직하다. 이에 관련된 과학자료는 사슬 분자가 각기 다른 목적으로 어떻게 소수성화하는지에 대한 충분한 정보를 제공해 주고 있다. 본 명세서의 목적을 위해서는, 이미 다른 문헌에 기재된 바 있는(예를 들어, Torchilin, V. P.;Goldma cher, V. S.; Smirnov, V. N. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1978, 85: 983-990), 상기 흡착제의 강한 고정은 그의 종래 기술에 기인한 특성 뿐만 아니라 빈약한 가역적인 결합을 일으키는 경향이 있으므로 배제된다.
당 분야에서, 양친매성 물질로 만들어진 막에 계면활성제를 첨가하면 상기 막의 적합성을 변경시킨다는 사실은 이미 공지되어 있다. 또한, 제제를 대응하는 막으로 둘러싸이고, 적당한 액매 내에 현탁된 소형 액적내로 혼입시킴으로써, 배리어 내의 한정된 구멍을 통한 제제의 이동을 개선시키는 데 이러한 사실이 이용될 수 있다는 것이 이미 제안되어 있다. 이것은 이전의 출원 PCT/EP 91/01596, PCT/EP 96/04526에 매우 상세하게 기재되어 있다.
배리어 구멍을 관통하기 위한 목적으로, 매우 순응성이 있는 막을 갖는 상기 소포를 최적화하기 위해서 행해지는 선택 사항은, 일반적으로 사슬분자와 상기 막 사이의 결합 속도 및 정도를 제어하거나, 제어가능하게 하기 위해서 취해지는 공정과 동일하지 않다. 또한, 상기 소포를 둘러싸는 상기 막 표면의 3차원적 적합성(및 그에 따른 소포 자체의 변형성)은, 예를 들어 거대 분자체가 결합하는 상기 표면이 고체에 의해 지지된 경우에는 결합 공정에 반드시 적절한 것은 아니며, 따라서 지지되지 않은 막의 3차원적 적합성을 보유하지 않는다.
표면과 결합하는 거대 분자체의 결합 공정을 제어하기 위해서 및/또는 가능케 하기 위한 목적으로, 본 발명이 주목하고 있는 상기 기재한 두가지의 주요한 효과를 이용할 수 있다.
첫번째 중요한 현상은 양친매성 분자, 말하자면 이미 언급한 거대 분자나 사슬분자와 같은 분자는, 확장된 표면을 형성하는 특성이 있는 1종 이상의 양친매성 물질, 및 현탁용 액매 내에서 보다 용해성이 높고, 상기 양친매성 물질보다 확장된 표면을 형성하려고 하는 특성이 덜한 1종 이상의 물질로 이루어져 있는 확장된 표면과 더 잘 결합한다는 것이다. 즉, 상기 언급한 물질 보다 용해성이 더 높고, 표면을 불안정화하는 특성이 있는 제2물질의 존재 하에서, 용해성이 더 낮은 표면-형성 물질로부터 형성되는 대응하는 표면과 비교하여, 표면을 불안정화하는 특성이 있는 물질의 존재는 표면-용액 계면이 흡착성 거대 분자를 좀 더 끌어당기게 된다. 본 발명의 견지에서, 2차원에 있어서 상호 표면 여기의 전개 및/또는 진행이 일어나는 경우, 표면이 확장될 것이라고 추정하고 있다. 소포의 표면은, 표면을 파동치게 하거나 동요시키면 이와 같은 특성을 충족하게 되고, 막 유연성에 따라, 평균 소포 직경 20nm~수백nm가 이를 위해 필요하게 된다. 적어도 어느 한 방향으로도 상기한 치수에 이르지 못하는 (혼합된) 지질 미셀은 이러한 요건을 충족시키지 못하며; 따라서, 이러한 표면은 본 발명의 견지에서 확장된 것이라고 여겨지지 않는다.
보다 가용성이고, 표면을 불안정화하는 제2 물질은 일반적으로 표면 활성 물질이나 계면활성제이다.
새로 공개된 제2의 효과는, 예상과는 대조적으로 전기적으로 하전된 거대 분자 또는 사슬 분자는 같은 전하로 하전된(예를 들면, 둘다 음극이거나 둘다 양극인 경우) 표면과 보다 용이하게 잘 결합하고, 후자가 복합체이고 2 종 이상의 양친매성 물질로 이루어지는 경우, 그 중 하나는 다른 하나보다 용해성이 높고, 또한, 용해성이 더 낮은 물질로 형성된 표면을 불안정화시키는 경향이 있다는 것이다. 말하자면, 같은 전하는 서로 반발한다고 일반적으로 알려져 있지만, 결합하는 물질 및 기질 표면 중의 하나가 음인 경우, 결합 공정에 관여하는 두가지 물질이 순 양전하를 보유하는 경우, 동일한 전하로 하전된 표면과 더 잘 결합할 수 있다. 단, 하전된 거대 분자나 사슬 분자는, 그 표면 복잡성으로 인하여 필수적으로 분자내 및 분자간의 재배치를 가능하게 한다는 조건이 있다. 이러한 명백한 사실을 바탕으로, 음으로 하전된 거대 분자가 양으로 하전된 표면과 결합하는 경우, 및 그 반대의 경우, 즉, 정전기적인 인력의 도움을 받는 경우, 그 결합이 더 용이하고 더 강력해지리라고 예상할 수 있다.
상기 기재한 두가지 효과는 청구항 3에서 상세하게 설명한대로 효과적으로 조합하여 사용될 수 있다.
양친매성 표면-형성물질의 선택은, 막이나 표면을 함께 형성하고, 거대 분자나 사슬분자가 그에 결합되며, 대개 액매 내에 현탁된 소포의 형태를 갖는 참여물질들의 용해도 차에 의해 규정될 수 있다. 본 발명의 효과는, 일반적으로, 관여하는 분자간의 용해도 차가 더욱 더 커질 경우에 더 현저해진다. 즉, 결합성 거대 분자의 표면인력이 더 상승한다. 상기 용해성이 보다 높은 막성분은 용해성이 보다 낮은 표면-형성 성분 보다 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상 용해성이 있어야 한다. 따라서, 인지질과 같은 양친매성 표면-형성물질을 물 등의 적당한 액매내에서 계면활성제와 같은 제2물질과 조합시키는 경우, 제2성분으로 보다 물에 더 잘 녹는(정량적으로) 인지질 계면활성제를 사용하는 것이 훨씬 더 좋다.
한편, 수행되어야 하는 선택을 표면 곡률 측면에서 규정할 수 있다. 물(액매로 사용됨) 중에서 계면활성제(용해성이 보다 높고, 표면을 불안정화하는 제2 성분으로서)와 혼합시킨 인지질(기본적인 표면-형성물질로서)의 상기 언급한 예를 사용하면, 그에 따라 얻어지는 소포가 특징적인 표면 곡률을 달성한다. 일반적으로 말해서, 상기 (평균)곡률은 의도한 표면으로 봉쇄된 영역의 평균 반경의 역수로 정의된다. 일반적으로, 계면활성제를 첨가하면, 어떠한 계면활성제도 함유하고 있지 않은 인지질 소포의 곡률과 비교해서, 혼합된 지질 소포 표면의 곡률이 증가할 것이다. 곡면 표면의 안정도를 파국적으로 위태롭게 하지 않는 계면활성제의 포화 농도가 존재하는 경우, 최적의 계면활성제 농도는 일반적으로 상기 포화농도를 기준으로 해서 99% 이하에서 선택되고; 대부분 포화농도를 기준으로 해서 1~80몰%에서 선택되며, 보다 바람직하게는 포화농도를 기준으로 해서 10~60몰%에서 선택되고, 가장 바람직하게는 포화농도를 기준으로 해서 20~50몰%에서 선택된다.
한편, 계면활성제를 첨가한 후 포화농도에 도달하기 이전에 표면이 붕괴되는 것에 기인하여 각 시스템에서 포화농도까지 도달하는 것이 불가능한 경우에는, 사용되는 계면활성제의 양은 용해되는 농도의 99% 미만이 일반적이다. 또한, 시스템내에서의 계면활성제의 최적 농도는 종종 흡착제 표면의 형태를 제한하는 농도를 기준으로 하여 1%~80%, 대부분은 10%~60%, 바람직하게는 20%~50%이며, 즉, 예를 들어, 용해되고 혼합된 지질 응집체의 확장된 표면이 훨씬 더 작은 평균 표면으로 대체되는 농도 이상이다.
또한, 간편하고 실용적으로 유용하게 사용되는 물질의 배합물을 상기 표면의 평균 곡률의 측면에서 정의할 수 있다. 청구항 7에서 언급한 바와 같이, 상기 표면은 15㎚~5000㎚ 사이, 바람직하게는 30㎚~1000㎚ 사이, 더욱 바람직하게는 40㎚~300㎚ 사이, 그리고, 가장 바람직하게는 50㎚~150㎚ 사이의 평균 반경에 대응하는 평균 곡률(상기 표면으로 봉쇄된 영역의 평균 반경의 역수로 정의됨)을 갖는다. 하지만, 흡착제 표면의 곡률이 반드시 흡착제 막의 특성에 의해 결정되는 것은 아니라는 것을 강조해 둘 필요가 있다. 고체로 지지된 표면을 사용할 경우, 본 발명에 따라 선택된 양친매성 물질의 배합물로부터 표면을 형성할 때, 상기 표면의 평균 곡률은 통상적으로는 지지 고체의 표면 곡률에 의해 결정된다.
또한, 적어도 유사한 전하 사이의 결합을 사용하는 경우에는, 표면-관련 하전된 성분의 상대적인 농도의 측면에서 본 발명을 표시할 수 있다. 상기 표면-관련 하전된 성분의 상대 농도는 동시에 얻어지는 또는 표면-형성 양친매성 물질의 농도를 기준으로 해서, 5몰%~100몰%, 보다 바람직하게는 10몰%~80몰%, 가장 바람직하게는 20몰%~60몰%이다. 순 표면 전하 밀도의 측면에서 표시하자면, 상기 표면은 0.05Cb/m2~0.5Cb/m2, 보다 바람직하게는 0.075Cb/m2~0.4Cb/m2, 및 가장 바람직하게는 0.10Cb/m2~ 0.35Cb/m2의 값으로 특징지어진다.
바람직하게는 다가 이온을 포함하는, 배경 전해액의 농도 및 성분을 소망의 결합에 대한 전하-전하 상호 작용의 긍정적인 효과를 최대화하도록 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 벌크 이온 강도를 I=0.001~I=1로, 바람직하게는 I=0.02~I=0.5, 훨씬 더 바람직하게는 I=0.1~I=0.3인 범위로 유지시켜 준다.
본 발명의 또 다른 유용한 정의는 유체로 된 작은 액적을 둘러싸는 막 형태의 흡착제 표면에 관한 것이다. 상기 막은 종종 2중층 상태이고, 액적을 현탁시키기 위해서 사용되는 액매(바람직하게는 수성) 내에서의 용해도 차가 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상인 (자가)응집성 양친매성 물질을 적어도 2 종류 또는 2 형태를 포함한다. 그러한 경우에, 막을 형성하는 물질의 선택은 용해성이 보다 높은 물질의 동종 응집체의 평균 직경, 또는 두가지 물질로 구성되는 이종 응집체의 직경을 용해성이 보다 낮은 물질만을 함유하는 동종 응집체의 평균 직경 보다 작게 함으로써 구체화될 수 있다.
특히 상기 조성물은 주로 의학적인 목적으로 인체나 동물체에 적용되는 제제를 제조하는 데 사용되며, 표면을 형성할 수 있는, 시스템 내의 모든 양친매성 물질의 전체 함량은, 전체 건조 중량을 기준으로 해서, 0.01중량%~30중량%가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1중량%~15중량%가 좋고, 가장 바람직하게는 1중량%~10중량%이다.
예를 들어, 확장된 표면을 형성할 수 있는 물질과 같은, 표면-형성 또는 표면-지지 물질은, 특히 상기 흡착제 표면이 2중층 형태의 구조를 보유하는 경우에, 생물학적으로 호환성이 있는 극성이나 비극성의 지질 중에서 선택하여도 좋다. 상세하게 말하자면, 상기 확장된 표면 형성 물질에는 임의의 적당한 생물학적 공급 원으로부터 취한 지질이나 리포이드; 또는 이에 상응하는 합성 지질; 또는 이러한 지질의 변형물, 바람직하게는 글리세리드, 글리세로포스포리피드, 이소프레노이드리피드, 스핑고리피드, 스테로이드, 스테린이나 스테롤, 황이나 탄수화물-함유 지질, 또는 2중층을 형성할 수 있는 임의의 다른 물질, 특히 반-양성자화 유체 지방산, 바람직하게는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린이나 스핑고포스포리피드, 글리코스핑고리피드(예를 들어, 세레브로사이드, 세라마이드폴리헥소사이드, 설파티드, 스핑고플라즈마로겐), 강글리오사이드 또는 기타 글리코리피드, 또는 합성 지질, 특히 디올레오일-, 디리놀레일-, 디리놀레닐-, 디리놀레노일-, 디아라키도일-, 디라우로일-, 디미리스토일-, 디팔미토일-, 디스테아로일, 또는 대응하는 스핑고신 유도체, 또는 다른 글리코리피드나 디아실-, 디알케노일-또는 디알킬-;의 군으로부터 선택할 수 있다.이외에도, 표면을 불안정하게 하고, 용해성이 보다 높은 물질로는 계면활성제가 효과적으로 사용되고 있는데, 비이온성, 쯔비터이온성, 음이온이나 양이온성 세제군이 유용하게 사용될 수도 있다. 상세하게는, 긴사슬형의 지방산이나 알콜, 알킬-트리/디/메틸-암모늄 염, 알킬설페이트염; 콜레이트, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트나 타우로콜레이트의 단가염; 특히 도데실-디메틸-아미노옥사이드와 같은 아실- 또는 알카노일-디메틸-아미노옥사이드; 알킬- 또는 알카노일-N-메틸글루카미드; N-알킬-N,N-디메틸글리신; 3-(아실디메틸암모니오)-알칸설포네이트; N-아실-설포베타인; 특히 노나에틸렌-글리콜 -옥틸페닐 에테르와 같은 폴리에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르; 노나에틸렌-도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르; 특히, 옥타에틸렌글리콜-이소트리데실 에테르와 같은 폴리에틸렌글리콜-이소아실 에테르; 특히 옥타에틸렌도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르; 폴리에틸렌글리콜-20-모노라우레이트(트윈20)이나 폴리에틸렌글리콜-20-소르비탄-모노올레이트(트윈 80)과 같은 폴리에틸렌글리콜-소르비탄-아실 에스테르; 폴리히드록시에틸렌-4 또는 6 또는 8이나 10이나 12 등-라우릴 에테르(브리즈 시리즈 중에서)나 예를 들어 폴리히드록시에틸렌-8-스테아레이트(미리즈 45), -라우레이트, 또는 -올레이트형과 같은 대응하는 에스테르 또는 폴리에톡시화 캐스터 오일 40(크레모퍼 EL)에서와 같은, 폴리히드록시에틸렌-라우릴, -미리스토일-, -세틸스테아릴이나 -올레오일 에테르와 같은 폴리히드록시에틸렌-아실 에테르; 특히 소르비탄-모노라우레이트(알라셀 20, 스판 20)과 같은 소르비탄-모노알킬레이트(예를 들어, 알라셀이나 스판 중에서); 데카노일-이나 도데카노일-N-메틸글루카미드와 같은 아실-이나 알카노일-N-메틸 글루카미드; 라우릴-이나 올레오일-설페이트와 같은 알킬설페이트(염); 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 글리코데옥시콜레이트, 나트륨 올레이트, 나트륨 타우레이트나트륨 엘라이데이트, 나트륨 리놀리에이트, 나트륨 라우레이트와 같은 지방산염; 예를 들어, 라우릴이나 올레오일-글리세로-포스파티딜산, -포스포릴글리세롤 또는 -포스포릴세린, n-테트라데실-글리세로-포스파티딜산, -포스포릴글리세롤 또는 -포스포릴세린의 n-옥타데실렌(=올레오일)-글리세로포스파티딜산, -포스포릴글리세롤이나 -포스포릴세린, n-아실-과 같은 리소포스포리피드, 대응하는 팔미토엘오일-, 엘라이도일-, 바세닐-리소포스포리피드; 또는 대응하는 짧은 사슬의 포스포리피드; 또는 그 밖의 표면-활성 폴리펩티드가 있다.
하전된 막 성분의 농도는, 전체 막-형성 성분의 양을 기준으로 해서 1-80몰%의 상대적인 범위에 있고, 바람직하게는 10-60몰%, 가장 바람직하게는 30-50몰% 범위에 있게 된다.
포스파티딜콜린 및/또는 포스파티딜글리세롤을 표면-지지 물질로서 선택하고, 리소포스파티딜산이나 메틸포스파티딜산, 리소포스파티딜글리세롤이나 리소포스파티딜콜린과 같은 리소포스포리피드; 또는 부분적으로 N-메틸화한 리소포스파티딜에탄올아민; 콜레이트, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트의 단가 염; 또는 임의의 다른 충분히 극성인 스테롤 유도체; 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올레이트, 팔리톨레이트, 엘라이데이트; 또는 일부의 다른 지방산 염 및/또는; 트윈-; 미리즈-; 또는 브리즈형; 그 밖의 트리톤; 지방성-설포네이트, 또는 -설포베타인, -N-글루카미드나 -소르비탄(아르락셀이나 스판) 계면활성제를 확장된 표면을 덜 형성하는 물질로 선택하는 것이 바람직하다.
상기 확장된 표면으로 둘러싸인 영역의 평균 반지름으로는 15~5000㎚의 범위에 있지만, 바람직하게는 30~1000㎚의 범위에 있으며, 더욱 바람직하게는 40~300㎚의 범위에 있고, 가장 바람직하게는 50~150㎚의 범위에 있는 것이 유리하다.
일반적으로, 다른 두가지 물질(필요에 따라, 제3, 제4, 제5 물질 등)과 조합함으로써 형성되는 확장된 표면과 결합하는 제3 물질은, 반복 서브 유니트를 갖는 분자, 특히 사슬분자의 형태인 임의의 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 제3 물질은 올리고머나 폴리머가 될 수 있다. 특히, 800 달톤 이상, 바람직하게는 1000 달톤 이상이고, 대부분의 경우에는 1500 달톤 이상의 평균 분자량을 갖는 양친매성 거대 분자 물질이 될 수 있다. 일반적으로, 상기 물질은 생물에서 취한 물질이거나 그와 유사한 물질이고, 유리하게는 생물학적 활성을 갖는 것, 즉, 생물학적 제제이다.
상기 제3 물질은 바람직하게는 특히 막과 액매 사이의 계면(또는 계면들) 내로 삽입시킴으로써, 본 발명의 막 형태의 확장된 표면과 결합하고, 상기 계면(들)은 상기 막들의 필수 부분이다.
상기 언급한 제3의 물질(분자)이나 대응하는 사슬분자의 함량은, 흡착제 표면의 질량을 기준으로 해서, 일반적으로 0.001~50중량% 사이에 있다. 종종, 함량은, 유사한 상대적인 단위를 사용하여 0.1~35중량%, 보다 바람직하게는 0.5~25중량%, 가장 바람직하게는 1~20중량%의 범위에 있고, 이로써, 흡착하는 (사슬)분자의 몰질량의 증가에 따라 고유비가 감소하는 것을 알 수 있다.
흡착성 거대 분자 또는 사슬분자가 단백질이거나 단백질의 일부이기만 하면, 이러한 물질들은 일반적으로 본 발명의 맥락에서 흡착하는 표면과 결합할 수 있는 것이 알려져 있으나, 단, 흡착제 표면과 결합하려고 하는 특성이 있는 3개 이상의 단편이나 관능기를 포함하여야 한다.
본 발명에 따른 거대 분자나 사슬분자는 본래 형태 또는 약간의 적당한 화학적, 생화학적 또는 유전학적 변형 후의, 적어도 부분적으로 표면을 끌어당기는 성질이 있는 DNA나 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드나 폴리사카라이드군에 속하는 양친매성물질로부터 형성되는 확장된 표면과 결합하려는 경향이 있다.
확장된 표면과 결합하는 사슬분자로는 다양한 생리학적 기능을 가질 수 있고, 하기 열거하는 물질로서 작용할 수 있다: 예를 들어, 아드레노코르티코스타티쿰,-아드레놀리티쿰, 안드로겐이나 안티안드로겐, 안티파라시티쿰, 아나보리쿰, 아나에스테티쿰이나 아날게시쿰, 아날렙티쿰, 안티알레르지쿰, 안티아르히스미쿰, 안티아르테로스크레로티쿰, 안티아스마티쿰 및/또는 브론코스파스몰리티쿰, 안티바이오티쿰, 안티드레프레시붐, 및/또는 안티사이코티쿰, 안티디아베티쿰, 안티도트, 안티에메티쿰, 안티에피렙티쿰, 안티피브리놀리티쿰, 안티컨불시붐, 안티콜리네르지쿰, 효소, 보조 효소 또는 대응하는 억제제, 안티히스타미니쿰, 안티하이퍼토니쿰, 약물 활성의 생물학적인 억제제, 안티하이포토니쿰, 안티코아굴란트, 안티미코티쿰, 안티미아스테니쿰, 모르버스 파킨슨이나 모르버스 알츠하이머에 대항하는 성분, 안티플로지스티쿰, 안티피레티쿰, 안티류머티쿰, 안티셉티쿰, 호흡에 관여하는 아날레티쿰이나 호흡 자극제, 브론콜리티쿰, 카르디오토니쿰, 케모테라퓨티쿰, 혈관 확장제, 사이토스타티쿰, 디우레티쿰, 강글리움-차단제, 글루코코르티코이드, 흐름 방지 성분, 헤모스타티쿰, 하이프노티쿰, 면역글로불린이나 그것의 단편 또는 다른 면역학적으로 활성인 물질, 생활성인 탄수화물(유도체), 피임약, 안티-마이그레인 성분, 미네랄로-코르티코이드, 몰핀-길항제, 근육이완제, 나르코티쿰, 뉴로테라피티쿰, 뉴로렙티쿰, 뉴로트랜스미터나 그 길항제, 펩티드(유도체), 옵탈미쿰, (파라)-심퍼티코미메티쿰이나 (파라)심퍼티콜리티쿰, 단백질(유도체), 프소리아시스 /뉴로데르미티스 약, 마이드리아티쿰, 사이코스티뮬란트, 리놀로지쿰, 수면-유도제나 그 길항제, 안정제, 스파스몰리티쿰, 튜버클로스타티쿰, 우롤로지쿰, 혈관수축제나 혈관이완제, 바이러스타티쿰 또는 임의의 상처-치유 물질이나 상기 성분의 임의의 조합이다.
본 발명은 또한 제3물질이 생장 조절 물질일 경우에 유용하게 활용될 수 있다.
보다 유용한 구현예로는 제3물질이 면역 조절 물질로부터 선택되고, 이 면역 조절 물질에는, 예를 들어 항체, 사이토킨, 림포킨, 케모킨 및 식물의 대응하는 활성부위, 박테리아, 바이러스, 파토겐이나 그 밖의 면역 항원이나 또는 이들의 일부 또는 변형체, 효소나 보조효소 또는 다른 종류의 생체촉매; 특히 아드헤린, 항체, 카테닌, 셀렉틴, 셰퍼론이나 그 일부와 같은 인지분자; 호르몬 및 특히 인슐린을 포함한다. 특히, 활성물질로 인슐린을 사용하는 경우에는, 본 발명의 조성물에 함유되는 인슐린의 양이 1~500 I.U.(인슐린/밀리리터), 보다 바람직하게는 20~400 I.U.인 것이, 가장 바람직하게는 50~250 I.U.이다. 약제의 형태로는 인간 재조합 인슐린 또는 인간화 인슐린이 바람직하다.
본 발명의 기타 유용한 용도로는 인터류킨이나 인터페론 등의 다양한 사이토킨으로 사용하는 것이 있는데, 인체나 동물에 적합하게 사용할 수 있는 상기 인터류킨에는 IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12가 있고, 마찬가지 용도로 사용가능한 상기 인터페론에는 IF 알파, 베타 및 감마가 있는데, 여기에만 한정되는 것은 아니다.
상기 조합은 주로 0.01㎎~20㎎(인터류킨/㎖)을 포함하지만, 바람직하게는 0.1~15㎎(인터류킨/㎖)이며, 가장 바람직하게는 1~10㎎(인터류킨/㎖)을 함유하고, 필요에 따라 최종적으로 희석하여 실용적으로 사용가능한 약제의 농도범위로 한다.
상기 조합은 주로 20 상대 중량%이하의 인터페론을 함유하고, 바람직하게는 0.1~15㎎(인터페론/㎖), 가장 바람직하게는 1~10㎎(인터페론/㎖)이며, 만약 필요하다면 최종적으로 희석시켜 실용적으로 사용가능한 약제의 농도범위로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 제3활성 물질로서 본 발명의 표면과 결합하는 신경 생장 인자(NGF)의 투여에 대해서 설명한다. 이러한 성분의 바람직한 형태는 인간 재조합 NGF이고, 그 용도를 위한 최적 농도 범위는 현탁액 상태로는 25㎎ 신경생장 인자(NGF)/㎖이하, 또는 성분으로는 25 상대중량% NGF 이하, 바람직하게는 0.1~15 상대중량% 단백질 및 가장 바람직하게는 1~10 상대중량% NGF을 함유하고, 이것을 필요에 따라 사용전에 희석시켜서 사용해도 좋다.
손상되지 않은 항체, 항체의 일부나 다른 일부의 생물학적으로 허용가능하고 활성인 그것의 변형체의 형태로 면역 글로불린(Ig)을 투여하는 데에 본 명세서상에 기재한 본 발명의 기술을 사용할 수 있다. 상기 현탁액이 25㎎(면역 글로불린(Ig)/㎖ 현탁액) 이하, 또는 전체 지질에 대한 25 상대중량% 이하의 Ig, 바람직하게는 0.1~15 상대중량%의 Ig, 가장 바람직하게는 1~10 상대중량% Ig 양으로 사용하는 것이 좋다.
본 발명은 상기 생물학적으로, 화장품용으로 및/또는 약학적으로 활성인 제제와 같은 특히 활성물질의 제제로서 상기 정의한 조합물을 제조하는 방법을 기재하고 있는데, 이러한 방법은 적당한 액매에서 용해도 차가 있고, 적어도 결합된 경우, 상기 매질과 접촉하여 확장된 표면을 형성할 수 있는, 적어도 2종의 양친매성 물질의 선택을 포함한다. 이러한 방법의 바람직한 선택 기준은 상기 양친매성 물질은 상기 표면과의 결합을 지지하고, 활성성분을 유인할 수 있는 물질들을 조합함으로써 형성되는 확장된 표면을 사용하는 것이다. 이때 전제조건은 ① 다른 물질보다 그 자체상에 보다 확장된 표면을 형성하는 두가지 물질 및/또는 적당한 액매에서 용해도 차가 있는, 선택된 2개 이상의 물질의 표면만으로부터 형성되는 표면보다 상기 성분에 대하여 더 유인력이 있어야 한다는 것과, ② 적어도 결합될 경우에, 이러한 물질들이 상기 액매와 접촉하는 특히 막형태의 표면인 확장된 표면을 형성할 수 있어야 한다는 것과, ③ 두가지 물질의 조합물로 이루어지는 상기 표면이 좀 더 유인력이 있고, 다른 물질 보다 더 확장된 표면을 형성하는 두가지 물질로부터 형성되는 표면 보다 활성성분과 더 잘 결합할 수 있어야 한다는 것과, 마지막으로 상기 성분 뿐만 아니라 표면이 알짜 전하를 띠고 있고, 그 성분과 표면이 평균적으로, 둘 다 음전하로 하전되거나 둘 다 양전하로 하전되어야 한다는 것이다.
본 발명의 확장된 표면을 형성하는 바람직한 방법에는, 공정 중에 형성되는 표면과 결합하게 되는 상기 성분 분자의 존재하에서, 여과, 압력변화나 기계적인 균질화, 흔들기, 교반하기, 혼합 또는 다른 조절되는 기계적인 파쇄와 같은, 물질들의 대응하는 혼합물에 대한 기계적인 조작을 포함한다.
선택적으로 조합된 표면 형성 물질을 적당히 지지하는 고체 표면상에 선택적으로 결합물을 흡착시키거나, 다른 방식으로 상기 고체 표면과 영구적으로 접촉시키고, 이어서, 이 물질을 차례대로 아니면 한꺼번에 첨가하여 액매와 영구적으로 접촉시킴으로써, 하나 이상의 후 표면-형성 공정을 고체에 지지된 표면과 순차적으로 결합하는 성분의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다.
액매 내 현탁되어 있거나, 고체에 의해 지지되거나에 상관없이, 표면 형성 분자를 순차적으로 혼합하여 흡착성 표면이나 그것들의 전구체를 먼저 제조하고, 상기 결합성 분자를 첨가하여 상기 표면에 결합되도록 하고, 필요에 따라, 하기 처리들로 형성되는 표면이 손상되지 않는다는 조건 하에서, 교반, 혼합이나 항온배양을 부수적으로 행하는 것이 유리하다.
본 발명에서, 특히 인체나 동식물의 손상되지 않은 피부조직을 통해, 다양한 성분의 비침습용 제제를 제조하기 위한 본 발명의 바람직한 방법은, 1종 이상의 양친매성 물질, 1종 이상의 친수성 유체, 1종 이상의 표면 활성물질이나 계면활성제 물질, 및 1종 이상의 성분을 포함하는 복합체 내에서 성분 분자와 결합할 수 있는 표면을 형성하도록 하는 것이다. 또한, 이러한 성분들은 비침습형 성분 용도에 적합한 제제를 생성하며, 소망의 특성과 최종 제조시의 안정성을 도모하기 위하여 다른 종래에 사용되던 성분들을 필요하고 적당한 양으로 첨가할 수도 있다.
상기 방법을 실행함에 있어서, 상기 선택된 성분들을 각각 혼합하고, 필요에 따라 용액 내에 성분을 함께/용해한 다음, 얻어지는 혼합물(들) 또는 용액(들)을 조합시켜, 바람직하게는 상기 기재한 대로 기계적인 힘을 이용하여 최종적으로 성분-결합 물질이나 표면의 형성을 유도한다.
본 발명에서 기재한 목적에 적당한, 양친매성 물질은 그대로 사용하거나, 또는 물과 같은 생리학적으로 허용되는 극성 유체에 용해시켜 사용하기도 하고, 이러한 용매와 혼화성인 유체, 또는 바람직하게 1종 이상의 표면 활성 물질이나 계면활성제를 포함하는 극성 용액과 함께 용매화 매개 성분 내에서 용해될 수도 있다.
성분을 유인하는 표면의 형성을 유도하는 다른 바람직한 방법으로는 유체상에 물질을 첨가하는 것이다. 또 다른 방법으로는 역상(亦相)으로부터 증발시키는 것, 주입이나 투석 또는 흔들기, 교반, 동요시킴, 균일화하기, 초음파처리(예를 들어, 초음파에 노출시키는 것), 전단, 냉동 및 해동 또는 간편하고 적당한 구동압하에서 여과하는 것과 같은 기계적인 스트레스를 가해주는 것이 있다. 여과시에, 여과재로는 그 공극의 크기가 0.01~0.8㎛, 바람직하게는 0.02~0.3㎛, 보다 바람직하게는 0.05~0.15㎛인 것을 선택하는 것이 좋다. 바람직한 표면 형성 효과를 얻고, 제조시의 속도나 용이함을 최대화시키기 위하여, 다수의 필터를 적절하게 순차적으로 또는 병행하여 사용할 수 있다.
흡착성 표면을 형성시킨 후에, 상기 성분이나 캐리어를 적어도 부분적으로 결합시키는 것이 바람직하다.
실용적인 목적으로 얻어진 제제를 사용하기 직전에, 성분 분자와 결합성 표면 사이에 결합체를 형성시킬 수 있다. 그리고 나서, 적당한 농축물이나 동결건조체를 사용하여 개시할 수 있다.
본 발명은 특히 약물의 전달, 약물 데포제(depot)나, 다른 종류의 의학이나 생물학적인 용도를 목적으로 한 성분-캐리어의 제조방법을 기재하고 있다. 따라서, 본 발명은 배리어 공극 투과 측면에서 또한 사용할 수 있다; 이러한 경우, 본 분야에 공지된 기술로, 미세한 액적을 둘러싸는 양친매성 분자에 의해 형성된 막의 형태인 상기 결합성 표면을 제공하는 것이 유리하고, 상기 액적 표면과 결합하는 성분 분자는, 상기 배리어 공극의 평균 직경이 액적이나 소포의 평균 직경 보다 작거나, 훨씬 작은 경우에도, 그 배리어 내 공극을 통하여 초분해성 액적을 전달한다. 그러나, 최적 결합 특성과 최고 막 적합성 사이에서 절충이 필요하다. 상기한 두가지의 특성이 반드시 동일하지는 않으나, 대개 공극 통과에 대한 소포 막 적합성으로 정의되는 최적의 조성물 특성이 실제로 다르지 않기 때문이다.
또한, 본 발명의 결합물은 생명공학 분야, 유전자 증식 뿐만 아니라 (생)가공처리나 진단을 목적으로 하는 분리 기술에 사용된다. 여기서, 효소 공정 및 촉매반응을 포함한 기타의 용도에 있어서도, 결합성 표면이 막과 같은 소포의 형태를 취하는 것보다 오히려 지지된 고체일 수도 있다는 측면에서 본 발명의 관점을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 이로써, 본 발명의 표면을 그 고체 지지체에 고정시키는 것이 가능하고, 예를 들어, 이러한 종류의 표면과 결합하는 촉매 활성 거대 분자를 가능한 정도로 고체 지지체 상에 최대한 고정시키며, 이후 통상적으로 처리, 부착, 분리, 농축시키는 등의 과정을 행한다. (유도체화)단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드나 폴리사카라이드와 같은 적어도 상기 분자가 관계되는 촉매 반응 공정에서, 적어도 부분적으로 양친매성인 표면-결합 분자, 특히 사슬 분자를 안정화시킬 수 있고/거나, 표면이 결합된 상태에서 이러한 촉매화 분자를 안정화시킬 수 있다.따라서, 촉매로 활성화되고, 대단히 잘 결합하거나 선택적인 반응성이 있는 거대 분자로 채워진 컬럼을 제조하기 위해서 본 발명의 기술을 사용할 수도 있다고 사료된다. 이것의 한 예로, 예를 들면 용액 중의 적당한 보조-반응 물질(들)을, 비-공유적으로 결합되고, 고체 지지체를 둘러싸는 활성분자가 있는 고체-지지된 표면을 포함하는 컬럼을 통하여 통과시킴으로써 행해지는 화학 반응을 들 수 있으며, 이 때 상기 용액이 부동화된 거대 분자를 통과할 때, 상기 활성 거대 분자와 반응한다. 또 다른 예에서는, 용액으로부터 분리되는 적어도 일부의 분자용액을 고체로 지지된 흡착제 표면의 현탁액으로 채워진 컬럼에 통과시키거나 또는 접촉시킨다. 이러한 목적으로, 목적분자를 기질 표면과 결합시킨 후, 원심분리, 침전, 부유(원심분리와 함께 또는 원심분리 없이), 전기적, 또는 자기적 흡착제 입자의 분리 등을 포함하는 임의의 방법으로 유체 분획과 고체 분획을 분리한다.
본 발명의 또 다른 용도는, 적당한 양친매성 물질과 조합시킴으로써, 상기 표면 결합성 분자와, 본 발명에 따라 형성된 복합체의 적합성있는 표면 사이의 결합이나 해리의 가역성 및/또는 속도를 제어하는 것에 관한 것인데, 이로써, 보다 높은 표면 전하 밀도 및/또는 보다 큰 표면 유연성 및/또는 표면 결함 밀도로 하여금 결합을 가속화하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 이는 대응하는 물리량의 감소로 결합 속도를 저하시키거나, 부분적이거나 완전한 해리를 유도하는데 사용될 수도 있다.
제제 온도 및 보존 온도는 좀처럼 0~95℃의 범위 밖으로 벗어나지 않는다. 특히 다양한 거대 분자의 많은 중요한 성분들은 온도에 대하여 민감하기 때문에, 70℃ 미만의 온도, 특히 45℃에 훨씬 못 미치는 온도가 바람직하다. 비수성 용매, 극저온 또는 열안정제를 사용함으로써, 상기 해당 온도 이외의 온도 범위에서도 사용이 가능하게 할 수 있다. 일반적으로, 실제 이용은 실온이나 생리학적인 온도에서 행해지지만, 그 이외의 다른 온도 범위에서도 사용가능하고, 이는 제제화 또는 이용을 위해 요망될 수도 있다. 또 보다 더 높은 온도에서 상기 흡착하는 표면 적합성(유연성, 전하의 부호, 및/또는 전하 밀도)의 유지가 이를 가능하게 하는 이유가 된다; 저온에서 상기 성분을 활성 형태로 유지하는 것은 가능한 다른 실시예를 제공한다.
제제의 특성은 가장 민감한 시스템 성분에 적응되는 것이 타당하다. 저온(약, 4℃)에서 저장하는 것은 비활성기체(예를 들어, 질소)를 사용하는 것만큼 효율적일 수 있다.
개시된 제제는, 흡착제나 흡착질 중 어느 것이 더 중요한 지에 따라 특이적인 과정을 사용하여 적용 장소에서 처리할 수 있다(포스포리피드 기재의 흡착제의 예는 "Liposomes"(Gregoriadis, G., ed., CRC Press, Boca Raton, FI., Vols 1-3, 1987); 'Liposomes as drug carriers' Gregoriadis, G,. ed., John Wiley & Sons, New York, 1988; 'Liposomes, A Practical Approach', New, R., Oxford-Press, 1989에 기재되어 있다). 상기 물질은 또한 희석되거나 농축될 수도 있다(예를 들어, 초원심분리나 한외여과에 의함).
상기 성분을 사용할 때나 그 전에, 얻어지는 제제의 화학적 또는 생물학적인 안정성, 거대 분자 결합성이나 그 해리성, 해리/결합시의 속도를 증가시키기 위해, 투여의 용이성, 응답 등을 개선하기 위하여 첨가제를 도입할 수 있다.
흥미로운 첨가제에는 다양한 시스템을 최적화하는 용매(소망의 시스템 특성을 유지시키거나 이루는 것에 의해 한계치를 초과하지 않는 농도), 화학적 안정화제(예를 들어, 항산화제 및 기타 스캐빈저(scavenger)), 완충액, 흡착 촉진제, 생물학적으로 활성인 보조 분자(예를 들어, 살균제, 바이러스 증식 억제제) 등이 있다.
상기 언급한 목적으로 사용되기에 적당한 용매에는 치환 또는 비치환, 예를 들어 할로겐화, 지방족, 고리형 지방족, 방향족, 또는 방향족-지방족 탄화수소, 예를 들면, 벤졸, 톨루올, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄이나 클로로포름, 메탄올이나 에탄올, 프로판올, 에틸렌글리콜, 프로판디올, 글리세롤, 에리쓰리톨과 같은 알콜, 아세트산과 같은 짧은 쇄 탄소산에스테르, 디에틸에테르, 디옥산 또는 테트라하이드로퓨란과 같은 산알킬에스테르 등과 이들의 혼합물이 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
그것을 제조한 후나 그것을 사용하기 전에 흡착제/흡착질 혼합물의 pH 값을 조절하는 것이 또한 편리할 수도 있다. 이렇게 하는 것은 각 시스템 성분 및/또는 결합체의 열화를 저지한다. 얻어지는 혼합물의 생물학적인 활성이나 생리학적인 호환성을 증가시킬 수도 있다. 비보나 비트로 상태에서 생물학적 용도로 혼합물을 중화시키기 위해서, 응용분야의 종류나 목적에 따라서 다르지만, 3-12의 pH값, 더욱 바람직하게는 5~9의 pH값, 가장 바람직하게는 6~8의 pH값의 범위에 있는 생체 허용성 산이나 염기를 사용한다. 생리학적으로 허용가능한 산은, 예를 들어, 염산, 황산이나 인산과 같은 미네랄산, 및 예를 들어, 아세트산 등의 카르복실알칸산과 같은 유기산을 희석시킨 수용액이다. 생리학적으로 허용가능한 염기로는 예를 들어 희석시킨 수산화나트륨, 적당하게 이온화된 인산 등이 있다.
간략하게 언급하거나, 자세하게 언급했던 모든 지질 및 계면활성제는 공지되어 있다. 거대 분자와 결합하여 적당한 응집체를 형성하는 지질 및 인지질은 예를 들어 'Phospholipids Handbook'(Cevc, G., ed., Marcel Dekker, New York, 1993), 'An Introduction to the Chemistry and Biochemistry of Fatty acids and Their Glycerids'(Gunstone, F. D., ed.) 및 다른 참고문헌에 기재되어 있다. 화학적인 계면활성제에 관한 보고서가 'Mc Cutcheon's, Emulsifiers & Detergents'(Manufacturing Confectioner Publishing Co.) 및 다른 관련된 참고문헌에 기재되어 있다(예를 들어, Handbook of Industrial Surfactants, M. Ash & I. Ash, eds., Gower, 1993). 이와 연관된 활성제의 조합체가 'Deutsches Arzneibuch', The British Pharmaceutical Guide, European Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia, The United States Pharmacopoeia 등에 기재되어 있다. 관련되는 거대 분자는 제조업체의 카탈로그, 적당한 과학 정기 간행물 및 산업이나 연구를 목적으로 하는 특정한 참고문헌에 기재되어 있다.
본 발명을 일부 선택된 폴리펩티드/단백질 및 인지질/계면활성제 혼합물을 예로 들어, 결합체의 일부 관련 특성을 기재한다. 일반적인 결론의 효력은 제시된 선택 사항에 제한되지 않고, 얻어지는 결합체가 의학 및 수의학의 분야에서만 유용한 것도 아니다.하기 실시예는 본 발명을 그에 고정하거나 한정하지 않으면서 설명한다. 모든 온도는 섭씨 온도 기분이고, 캐리어 크기는 나노미터 기준이고, 비 및 %는 몰 단위이다. 또한, 달리 언급이 없으면 표준 SI 단위를 사용한다.
복합체 소포에 대한 인슐린의 결합력을 측정하기 위한 목적으로 하기 실험들을 행하였다. 다양한 조성의 소포 조성물을 사용하였다. 소포상으로/내로 알짜 전하를 도입시키기 위한 다양한 계면활성제와 지질, 다양한 지질/세제 비율, 다양한 전체 지질 함량 및 다양한 인슐린의 종류와 농도를 변화시켰다.
제1실시예로써, 인지질/생체 계면활성제 혼합물을 포함하는 복합체 지질 소포를 다양한 단백질/지질 비율로 인슐린에 결합시켜 결합의 최대치를 구하였다. 종래의 단일 성분의 소포(리포좀)를 참고로 사용하였다.
실시예 1~27
고변형성의, 유연성이 있는 소포(트랜스퍼좀TM):
출발 현탁액:
대두콩으로부터 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린,
125.6㎎ 나트륨 콜레이트, 및
pH 7.1의 9㎖ 인산염 완충액으로 이루어진
10중량% 함량의 전체 지질(TL).
최종 현탁액 A:
상기 지질 및
0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4㎎ 인슐린/100㎎ TL로 이루어진
5중량% 함량의 TL
필요한 농도로 희석하기 위해서, 인슐린 원액(4㎎/㎖ 아크트라피드TM노보-노르디스크사 제품)을 하기와 같이 완충액과 혼합하였다.
단위:(㎎인슐린/100㎎지질) 완충액 인슐린액(4㎎/㎖;아크트라피드)
4 -- 3㎖
3 0.75㎖ 2.25㎖
2 1.5㎖ 1.5㎖
1 2.25㎖ 0.75㎖
0.5 2.265㎖ 0.375㎖
0.1 2.925㎖ 0.075㎖
최종 현탁액 A를 2.5㎖의 출발 지질 현탁액(10% TL) 및 2.5㎖의 적당한 인슐린 희석액을 혼합시켜서 제조하였다.
최종 현탁액B:
상기 지질 및
단위:(㎎인슐린/100㎎지질) 얻어진 최종 TL(중량%) 출발 현탁액(10% 지질) 완충액
4 5 3㎖ --
5 4 2.4㎖ 0.6㎖
6.67 3 1.8㎖ 1.2㎖
10 2 1.2㎖ 1.8㎖
20 1 0.6㎖ 2.4㎖
40 0.5 0.3㎖ 2.7㎖
80 0.25 0.15㎖ 2.85㎖
2.5㎖ 아크트라피드 HM(4㎎/㎖ 인슐린)과 2.5㎖의 적당하게 희석시킨 지질 현탁액을 혼합하여 최종 현탁액B를 제조하였다.최종 현탁액C
상기 지질 및
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 및 160㎎ 인슐린/100㎎ TL로 이루어지는 2.5중량%~0.125중량%의 TL 함량.
인용된 인슐린/지질 비율을 얻기 위해서, 하기 피펫팅 표를 사용하였다:
단위:(㎎인슐린/100㎎지질) 최종 TL 농도(중량%) 5중량% 지질로희석된출발지질 현탁액 인슐린액(4㎎/㎖;아크트라피드) 완충액
4 2.5 2.5㎖ 1.25㎖ 1.25㎖
5 2.5 2.5㎖ 1.563㎖ 0.938㎖
6 2.5 2.5㎖ 1.875㎖ 0.625㎖
7 2.5 2.5㎖ 2.188㎖ 0.313㎖
8 2.5 2.5㎖ 2.5㎖ --
9 2.2 2.222㎖ 2.5㎖ 0.278㎖
10 2 2㎖ 2.5㎖ 0.5㎖
15 1.3 1.333㎖ 2.5㎖ 1.167㎖
20 1 1㎖ 2.5㎖ 1.5㎖
30 0.67 0.667㎖ 2.5㎖ 1.833㎖
40 0.5 0.5㎖ 2.5㎖ 2㎖
50 0.4 0.4㎖ 2.5㎖ 2.1㎖
80 0.25 0.25㎖ 2.5㎖ 2.25㎖
160 0.125 0.125㎖ 2.5㎖ 2.375㎖
테스트 시리즈 C에서, 완충액으로 현탁액을 1:1의 부피비로 희석하고, 여과하여 동결 건조 과정을 하기한 바와 같이 행하여, 5% 소포 현탁액을 10%의 원현탁액으로부터 조제하였다.
흡착제/흡착질 혼합물의 조제
통상적인 방법으로 완충액을 조제하고, 0.2㎛의 멸균 필터를 통과시켜 여과하였다(이후에도 사용하기 위해서, 상기 액을 유리용기에 저장하였다). 멸균된 유리용기내에 있는 완충액에 지질 혼합물을 현탁하고, 실온에서 2일 동안 자기 교반기로 교반하였다. 그리고 나서, 상기 현탁액을 400㎚, 100㎚, 및 50㎚의 미세한 공극 사이즈를 갖는 에칭된 트랙(etched-track) 폴리카보네이트 막(뉴클레오포어형: Nucleopore type)을 통과시켜 순차적으로 압출하였다. 0.6MPa~0.8MPa의 구동압으로, 각 회마다 3회씩 통과시켰다. 이렇게 하여 만들어진 소포현탁액을 -70℃~+50℃의 각 온도에서 5회 동결건조하였다. 바람직한 소포 크기를 얻기 위해서, 상기 현탁액을 재압출하여, 0.7MPa에서 100㎚의 필터를 4회 통과시켰다. 마지막 단계로, 변형성이 매우 큰 소포를 200㎚의 공극을 갖는 멸균된 주사형 필터를 통과시켜 여과시킴으로써 멸균하였다. 이후에도 사용하기 위해서 소포를 4℃의 살균시킨 폴리에틸렌 용기에 저장하였다.
pI=5.4 이상의 양으로 하전된 아미노산에 비하여 음으로 하전된 아미노산이 과도하게 많기 때문에, 각 인슐린 분자는 중성의 pH 영역에서 알짜 음전하를 수반한다.
시판되는 인슐린액(노보-노르디스크사 제품인 아크트라피드TM)을 이것을 포함한 다수의 결합체의 연구에 사용하였다. 결과적으로, 출발 단백질액은 4㎎ 인슐린/㎖ 및 3㎎ m-크레졸/㎖을 함유하였다. 상기 용액의 적당량을 흡착제 소포의 현탁액에 첨가시켰더니, 다양한 인슐린/지질 비가 얻어졌다. 실험에 따라, 실온에서 얻어진 캐리어/인슐린 혼합물을 주의 깊게 완전히 혼합시키고, 2시간 이상 항온배양하였다.
테스트 시리즈 A에서, 최종 현탁액을 아크트라피드로 소포 현탁 원액을 희석하여 최종 현탁액을 조제하여, 최종 지질 농도 50㎎ TL/㎖ 및 다양한 단백질/지질 비율을 얻었다. 테스트 시리즈 B에서, 인슐린/TL 비율에 따라서 최종지질 농도를 2.5~40㎎/㎖의 범위에서 변화시켰다. 테스트 시리즈 C에서, 최종 지질 농도를 1.25~25㎎/㎖ 범위에서 변화시켰다. 비교예로, 지질 현탁액 대신에 완충액으로 사용하여 유사한 현탁액 시리즈를 조제하였다.
4㎖의 인슐린/소포 혼합물에 대하여 각각 시험 측정을 행하였다. 2시간 후에, 얼마나 많은 양의 인슐린이 지질 소포와 결합하는지(방식에 상관없이), 그리고 수성 서브-상 내에는 얼마나 많은 양의 인슐린이 결합되지 않고 남아있는 지를 측정하기 위해서 수성 서브-상으로부터 지질 소포를 분리하였다. 이러한 목적으로, 컷 오프 분자량이 100,000 Da인 CENTRISART I-초원심분리관을 사용하였다. 현탁액을 함유하고 있는 인슐린 1㎖를 각각 희석시키는데 3가지 관을 사용하고, 3시간 동안(T=10℃) 2000g에서 원심분리하였다. 얻어진 광학적으로 투명한 상청액(단지, 완충액, 인슐린 및 일부 혼합된 지질(포스파티딜콜린/콜레이트) 미셀을 용해된 세제와 함께 함유하고 있다고 추정됨)의 인슐린 농도를 측정하였다. 광학적으로 투명하지 않은 상청액은 CENTRISART I-필터내의 결함부를 통과한 지질 소포로 오염되었음을 나타내므로 폐기하였다. 여기서 언급된 모든 인슐린 측정에는 표준 HPLC 공정을 사용하였다. 측정은 2회로 행하였다.
원희석액을 포지티브 콘트롤시켰다. 네거티브 콘트롤에서는, 시험기에 대한 비-특이적인 인슐린 흡착을 정량하였다. 상기 비-특이적인 결합을 보정한 후에, 상청액 내의 출발 및 최종 인슐린 농도차를 계산하였다. 상기 "유실된" 인슐린을 소포와 결합한 것으로 추정하고, 절대 또는 상대적으로 표시하였다.
상기 실험의 결과를 도1에 표시하였다. 이는 6㎎/100㎎ TL의 인슐린/지질 비율, 첨가된 단백질의 80~90% 미만의 양으로 상기 소포와 결합한다는 것을 나타낸다. 좀 더 높은 인슐린/지질 비율인 경우, 단백질-표면 결합의 상대적인 효율이 감소하여, 2/5(40㎎/100㎎)로 희석시킨 경우 단지 5%의 결합률에 이르게 된다. 말하자면, 고희석률 및 고단백질/지질의 비율에서 각각 40㎎의 인슐린 중 2㎎이 고변형성 소포의 형태로 100㎎의 지질과 결합하게 된다.
항온배양 시간을 약간 연장하는 것이나 첨가된 현탁액의 농도를 증가시키는 것은 상기 현상을 개선시킨다(도2 및 3).
실시예 28~45
표준 소포(리포좀), 출발 현탁액:
대두에서 추출한 1g 포스파티딜콜린
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액 A
상기 지질 및
0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4㎎인슐린/100㎎TL
(0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 상대중량%)로 이루어지는 5중량%의 TL 함량
최종 현탁액B
상기 지질 및
4, 5, 6.67, 10, 20, 40, 및 80㎎인슐린/100㎎ TL로 이루어지는 5~0.25중량%의 TL 함량.
실시예 1~27에 기재한 대로 출발 지질 현탁액을 제조하였다. 다만, 충분히 작은 리포좀을 조제하여 충분하게 단분산된 제제를 얻기 위해서, 100㎚의 필터를 통과하여 6회 압출하였다.
시험하는 리포좀에 결합되는 인슐린은 매우 적은 것으로 나타났다. 첨가된 약물의 단 2~5%만이 표준 지질 소포와 4㎎/㎖~100㎎/㎖-희석범위내에서 결합한다(이에 관한 자료는 도시되지 않음).
변형성이 큰 복합체 소포 조성물에 대한 희석된 현탁액의 효과를 검사하고, 실험적으로 배제하기 위해서, 하기 실험을 행하였다.
실시예 46~59:
출발 현탁액:
대두로부터 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트(10부피% TL 함량으로 주어짐)
pH 7.1인 9㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액:
최종 현탁액 조성은, 최종 지질 농도를 감소시키는 것을 포함하여, 실시예1~27의 시리즈 B 및 C와 같다.
측정된 인슐린/지질 비율은 하기와 같다: 4, 8, 10, 20, 40, 80, 160㎎ 인슐린/100㎎ TL
희석액을 10mM의 콜레이트를 함유하는 아크트라피드 및/또는 5~20mM 콜레이트를 함유하는 콜레이트(대조와 시험용 샘플용)중의 어느 하나로 조제하는 것을 제외하고는, 상기 기재한 인슐린/지질 비율에 대하여 실시예 1~27에서 주어진 설명에 부합하도록 소포 현탁액을 조제하였다. 이렇게 하여, 모든 샘플내에 있는 최종 콜레이트 농도는 본 세제의 CMC에 근접한 값인 5mM가 되는데, 이로써, 희석시킨 후에 소포막으로부터 콜레이트 해리가 방지된다.
소포로부터 콜레이트가 유실되는 것을 방지시킴으로써, 본래의 활성 소포 조성물 뿐만 아니라, 소포 표면의 평균전하 밀도가 유지된다. 이러한 개선된 효과는 결합시에도 반영된다.
이러한 연속된 시험의 실시예에 있어서, 본 발명자들은 피펫팅 공정 전체에 걸쳐서 콜레이트의 농도를 5mM 이하로 유지시키면, 특히 전체 지질농도가 낮을 때 발생되는 부주의한 소포의 가용화가 방지된다는 사실에 특별히 주의하였다.
단백질/지질 중량비 10 % 이하에서 첨가되는 인슐린의 80~90%가 지질 소포 표면과 결합한다는 결과가 도시되어 있다(도4). 이것은 흡착제-흡착질 결합은 거의 완벽하고, 단백질이 결합하는 효율이 대단히 크다는 것을 의미한다. 단백질과 결합하는 지질 퍼센트 양은 단백질/지질 비율이 증가함에 따라 서서히 감소하여, 1.6㎎인슐린/1㎎지질에서 7%에 달한다.
캐리어와 결합하는 인슐린의 절대량은 약 0.4㎎인슐린/1㎎ 지질에서 최대치에 이르는데, 여기서 첨가된 40㎎의 인슐린중의 15.6㎎은 변형성이 큰 소포의 형태로 100㎎의 전체지질과 결합하는 것으로 밝혀졌다. 최대 생산량은 0.2㎎ 인슐린/1㎎ 전체지질의 상대비에서 얻어지지만, 여기서 첨가된 20㎎중 14㎎은 혼합된 지질 소포와 결합하는 것으로 측정된다. 이러한 결과가 도4에 도시되어 있다.
콜레이트 분자를 완충액이나 인슐린액과 함께 혼합된 지질 소포 현탁액에 도입시킬 경우 유사한 결과가 얻어진다.
실시예 60~71:
출발 현탁액(20% TL):
대두에서 추출한 1099.7㎎의 포스파티딜콜린
900.3㎎의 트윈 80
pH7.4의 8㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액:
상기 지질 혼합물 및
2, 4, 8, 10, 20, 및 40㎎인슐린/100㎎ TL로 이루어짐.
교반시간이 7일로 연장되는 것을 제외하고는, 실질적으로 실시예1~27에 기재한 것과 동일하게 하여 소포 현탁액을 조제하였다. 아크트라피드TM(노보-노르디스크)를 모든 경우에 있어서 흡착성 인슐린으로 사용하였다.
인슐린 농도를 4㎎/㎖로 고정시켜 사용하기 위해서, 8㎎/㎖~100㎎/㎖로 최종 전체 지질 농도가 변화하는 인슐린/지질 비율을 조제하였다. 비교예로써(희석효과가 존재할 수 있다고 간주함), 최종 전체 지질 농도를 10㎎/㎖(1중량%)로 고정시키는 것을 제외하고는, 유사한 조성의 소포를 다양한 인슐린/지질 비율로 조제하였다. 단백질-소포 결합시간을 3시간으로 선정하였다.
소포와 결합한 단백질로부터 결합하지 않은 인슐린을 분리하는데 소요되는 원심분리시간은 6시간이었다(1000g에서). 기타의 다른 실험에 관계된 세부사항은 제1 시험 시리즈에서와 동일하다(실시예1~27).
비이온성 계면활성제(트윈-80)을 함유하는 막에 결합하는 인슐린양은, 일반적으로 하전된(콜레이트를 함유하는) 막과 결합하는 인슐린양 보다 적다는 사실과는 상관없이, 양 흡착제 시스템의 정량적인 특성은 유사하다(실시예1~27을 참고).
상대적 인슐린/지질비 0.04㎎인슐린/1㎎지질일 때, 막과 결합하는 인슐린의 양은 약 50%이다. 최대로 결합하는 상대농도 0.2㎎인슐린/1㎎지질은 전체적으로 첨가되는 20㎎의 인슐린에 결합하는 단백질 5.2㎎에 대응한다. 말하자면, 이러한 시험 시리즈에서 절대적 최적치는 즉, 최대 수율은 0.04㎎인슐린/1㎎지질에서 얻어진다.
실시예72~76:
출발 현탁액(10% TL):
대두로부터 추출한 874.4㎎ 포스파티딜콜린
125.6㎎ 나트륨 콜레이트
pH7.1(-7.4)인 9㎖의 인산염 완충액(이러한 완충액을 사용하여, 상기 출발 현탁액의 pH는 7.3~7.6의 범위에 있다. 바람직한 pH 범위는 7.3~7.4이기 때문에, 계면활성제로서 콜레이트를 사용하는 하기 테스트 시리즈에서는 pH가 7.1인 완충액을 사용하였다)
인슐린 용액 A:
pH 7.4인 인산염 완충액 4㎎/㎖, 8㎎/㎖, 10㎎/㎖, 20㎎/㎖
30㎕ HCL(1M)/㎖ 용해된 건조 인슐린, 및 이어서,
30㎕ 1M NaOH/1㎖ 용액인슐린 B:
pH 7.4인 4㎎ 아크트라피드/㎖ 인산염 완충액
인슐린-소포 혼합물
5중량%의 전체 지질 농도
0.04, 0.08, 0.1 및 0.2㎎ 건조 인슐린/1㎎ 전체지질
(4, 8, 10, 20 상대중량%)유사한 막 조성물을 사용하여 실시예1~27에서 기재한 대로 소포현탁액을 조제하였다. 그러나, 최종 전체 지질 농도가 상당히 높은 건조 인슐린을 사용하여 높은 인슐린/지질의 비율을 얻기 위해서는, 시판되는 용액에 사용되는 것보다 더 높은 농도에서 용해시킨다.
동결건조된 인간 재조합 인슐린은 pH 7.4인 인산염 완충액에서 쉽게 용해되지 않는다. 인슐린 용액을 조제하기 위해서, 아크트라피드TM과 유사한 건조, 동결건조한 인간 재조합 인슐린 "분말"을 먼저 2㎖의 완충액에 첨가하고, 완전히 와동시켰다. 일시적으로 산성화시킨(60㎕의 HCL을 첨가함) 후에, 인슐린을 충분히 용해시켜 맑은 용액을 만들고, 60㎕의 NaOH를 첨가하여 pH를 7.4로 다시 돌아가도록 하는데, 여기서 인슐린은 안정하고(헥사머로), 분해/탈아미드화가 방지된다. pH 7.4인 2㎖의 완충액에 8㎎의 인슐린을 직접적으로 용해시켜서 추가 용액을 조제하였다.
소포 현탁액(2㎖)과 인슐린액-A(2㎖)을 완전히 혼합하여, 상기 주어진 인슐린/지질 비로 12시간 동안 항온배양하였다. 모든 경우에 있어서, 최종 전체 지질 농도는 50㎎/㎖였다. 용액 B를 참고 용액으로 사용하였다. 나머지 실험은 실시예1~27에 기재된 대로 행하였다.
결과:
건조 단백질 분말(이것은 적어도 일시적으로 단량체 용액이 되기도 함)로 만들어진 용액의 인슐린 결합량은 실시예1~27(도 5)의 아크트라피드의 인슐린으로 측정한 것과 비슷하다. 이는 50㎎/㎖ 농도에서 지질 소포 현탁액과 다량의 인슐린이 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 인슐린 결합 최대치는 단백질/지질의 중량비가 1/5가 되는 값 근방에서 발견되며, 첨가되는 인슐린의 대략 16 mg이 혼합된 지질막과 결합한다.
이와 유사한 단백질 농도에서, 용해된 ad hoc와 시판되는 인슐린용액을 사용하여 측정하면 동일한 결과가 얻어진다.
하기 연계된 실험에서, 다양하게 하전되거나 하전되지 않은, 유체, 혼합된 지질막에 대한 인슐린 흡착을 비교하였다.
실시예 77-92:
종래의 소포, SPC 리포좀, 중성상태(TL=10중량%):
알짜 전하가 없고, 쯔비터이온성 인지질 함유
대두에서 추출한 1g의 포스파티딜콜린
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액.종래의 소포, 하전된 SPC/SPG 리포좀(TL=10중량%):
25몰%의 음이온성 포스파티딜글리세롤의 알짜 음전하
대두에서 추출한 750㎎의 포스파티딜콜린
대두에서 추출한 250㎎의 포스파티딜글리세롤
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액고변형성의 중성상태 소포(TL=10중량%):
알짜 전하가 없고, 쯔비터이온성 인지질과 비이온성 계면활성제 함유
대두에서 추출한 550㎎ 포스파티딜콜린
450㎎의 트윈 80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
고변형성의 하전된 소포A(TL=10중량%):
25몰%의 음이온성 콜레이트로 인해서 알짜 음전하로 하전됨.
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액.
고변형성의 하전된 소포B(TL=10중량%):
25몰%(PC의 상대량)의 음이온성 포스파티딜글리세롤로 인해서 알짜 음전하로 하전됨.
대두에서 추출한 포스파티딜콜린 284.3㎎
대두에서 추출한 포스파티딜글리세롤 94.8㎎
620.9㎎ 트윈 80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
인슐린-소포 혼합물은 각각
50, 25, 10, 5㎎전체 지질/㎖ 최종현탁액
0.04, 0.08, 0.1 및 0.2㎎ 인슐린/1㎎ 전체지질
(4, 8, 10, 20 단백질의 상대중량%)
모든 소포를 상기 기재한 바와 같이 조제하였다. 트윈-함유 소포를 7일 동안 교반하였다. 상기 콜레이트-함유 소포 및 리포좀을 2일 동안 교반하였다. 아크트라피드 100 HMTM(노보-노르디스크사 제품)을 인슐린 원으로 하였다. 이로 인해, 최종 단백질 및 얻어지는 최종 지질 농도가 변화한다(50, 25, 10 및 5㎎ TL/㎖). 그러나, SPC-리포좀을 사용하여, 4상대중량%의 샘플을 조사하였다.
실험 프로토콜은 실시예 1~27에 기재한 것과 같다. 항온배양 시간은 3시간으로 하고, 비교를 좀 더 용이하게 하기 위해 전 조제공정에 있어서 원심분리시간을 6시간(500g에서)으로 하였다. 측정결과가 도6에 도시되어 있다.
알짜 음전하로 하전되어 있음에도 불구하고, 결과는 인슐린이 음전하로 하전된 표면과 가장 잘 결합한다는 사실을 명백하게 나타낸다. 소포가 매우 잘 변형되도록 하는 대단히 유연한 막을 사용하는 것도 또한 좋다.
고유연성의, 하전된 막을 만들기 위한 상대적인 결합 효율은 80~90%이다. 조사한 인지질-계면활성제 혼합물의 두가지 타입 모두 인슐린/지질의 중량비가 1/25인 경우에, 매우 큰 단백질 막 결합도가 관찰된다. 인지질과 비이온성 계면활성제로 이루어지는 하전되지 않은 막은 비교가능한 인슐린/지질비에서 50%의 상대결합을 나타낸다. 그러나, 첨가된 인슐린의 2.5%(실시예 28-45)사이에서만 하전되지 않은 포스파티딜콜린 리포좀과 결합하는 것으로 계산된다. 이러한 최악의 결과는 단백질/지질의 중량비 1/25에서 첨가된 인슐린의 10~20%와 결합되는, 하전된 리포좀에 대한 단백질 결합에 의해 극복된다. 그러므로, 종래부터 사용되고 있는 하전된 지질 이중층은 하전되지 않은 리포좀 막과, 더 유연하지만 중성인(트랜스퍼좀TM) 막 사이의 중간 정도이다.
이러한 사실로부터, 순 표면전하(하전된 지질이나 다른 하전된 막-결합 성분으로부터 비롯됨)는 표면- 또는 캐리어-단백질 결합을 최대화하는 막의 유연성(세제 및 흡착제내에 관련된 다른 분자가 있음으로 해서 촉진됨)과 관련이 있다는 것을 알 수 있다. 상기 "유연화"가 단백질이 계면 영역으로 쉽게 삽입되는 것과, 전하가 흡착성 분자(일부)를 밀어내는 이유이다.
실시예 93~95:
종래의 소포, SPC 리포좀, 중성상태(TL=10중량%):
알짜 전하가 없고, 쯔비터이온성 인지질로만 이루어져 있음
대두에서 추출한 1g의 포스파티딜콜린
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액고변형성의 하전된 소포A(TL=10중량%):
25몰%의 음이온성 콜레이트로 인해 알짜 음전하로 하전됨
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎ 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 9㎖ 인산염 완충액
고변형성의 하전된 소포B(TL=10중량%):
25몰%(PC에 대하여 상대적임)의 음이온성 포스파티딜글리세롤로 인해 알짜 음전하로 하전됨.
대두에서 추출한 284.3㎎의 포스파티딜콜린
대두에서 추출한 94.8㎎의 포스파티딜글리세롤
620.9㎎의 트윈 80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
인슐린-소포 혼합물은 각각
50, 25, 10, 5㎎전체 지질/㎖최종현탁액
0.04, 0.08, 0.1 및 0.2㎎ 인슐린/1㎎ 전체지질
(4, 8, 10, 20 단백질의 상대중량%)
조제막과 혼합된 포스파티딜콜린 트윈 80에 대한 인슐린 흡착의 속도를 연구하기 위하여 시간에 따른 측정을 행하였다. 시험용 소포를 대응하는 상기 실시예에서 기재한 바와 같이 조제하였다. 단백질 용액과 지질 현탁액을 혼합한 후에 제1 데이타 포인트를 얻는데 2시간이 소요되었다. 중성의 고변형성 막에 있어서, 다음번 포인트까지는 3시간이 소요되었다. 모든 현탁액의 다른 샘플들에 있어서도, 4~5일 및 5~6주 동안 항온배양을 행하였다.
결과
전하를 띠지 않는 SPC/트윈 혼합 막에 대한 인슐린의 흡착은 명확한 시간 의존성을 나타내었다(일부 대표적인 데이타를 도9에 표시함). 결합 공정시에 초기에 관찰되는 결합효율은 2시간이 경과한 후에 30%, 3시간이 경과했을 때는 50%까지 증가하였는데, 이때 인슐린/지질 중량비는 1/25였다. 4일이 경과했을 때는, 결합효율이 64%까지 증가하나, 5주가 경과한 후에도 결합효율은 58%에 그치기 때문에, 이러한 변화량은 중요하지 않을 수 있다.
단순한 포스파티딜콜린 리포좀에 대한 인슐린의 결합은 3시간이 경과한 후에는 2.5%이고, 6주가 경과한 후에는 5%로 증가한 것으로 측정되었다.
상기 막과 결합하는 단백질의 양이 2시간 후에 64%에서 6주후에는 76%로 증가하는 것에서 알 수 있듯이, 하전된 SPC/SPG/트윈 80 혼합물에 대한 인슐린의 흡착은 중성상태의 막인 경우보다 매우 빠르고 더 강하다. 처음 1시간 동안 결합하는 양과 비교해서 볼 때, 2시간째의 증가량이 작다는 것은, 결합 속도가 보다 빠르다는 것을 나타낸다.
인슐린의 결합 속도는 하전된 SPC/콜레이트 혼합된 막에서 훨씬 더 높다. 상기와 같은 하전된 소포를 사용하여 행한 시험에서, 혼합된 지질막에 대한 단백질의 흡착은 전혀 시간에 대한 의존성을 가지지 않는다는 것을 알았다. 2시간이 경과한 후에, 실험적인 오차가 없다면, 상기 결합은 이미 5주 동안 항온배양시킨 것과 같이 결합율이 높아진다. 이는, 하전되고, 유연한 막에 대한 인슐린 흡착이 하전되지 않은 막에 비해서 훨씬 더 빠른 것을 나타낸다. 방해 요인으로서, 본 발명자들은 무시할 수 없는 정전기적 상호 작용이 또한 단백질 분자의 탈착에 영향을 미칠 수도 있음을 제안한다. 포스파티딜콜린 막과 인슐린의 결합이 매우 약하고/또는 더딘 것은 소수성 결합만이 높은 페이로드를 이루는데 충분하지 못하다는 것을 나타낸다. 이것은 지질 이중층의 표면에서 적당한 결합 위치를 찾는 인슐린 분자 능력의 한계에 기인한 것일 수 있다. 매우 소량으로, 불리한 상태로 흡착된 단백질 분자와 이웃하는 불안정한 흡착질 사이의 반발력도 또한 중요하다.
실시예 96~100
다양한 전하 밀도(TL=10중량%)를 갖는 고변형성 소포 현탁액:
25, 33, 50, 67, 75몰% 포스파티딜글리세롤로 인해서 알짜 음전하로 하전됨
대두에서 추출한 137㎎, 205㎎, 274㎎, 343㎎, 411㎎ 포스파티딜글리세롤
대두에서 추출한 411㎎, 343㎎, 274㎎, 205㎎, 137㎎ 포스파티딜콜린
452㎎의 트윈80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
2㎎ 인슐린/㎖ 최종현탁액상기 실시예 93~95에 기재한 대로 지질 소포를 조제하였다. 도4에 도시되어 있는 것과 같이, 막 내에서 하전된 지질의 상대농도의 증가는 소포-인슐린과의 결합을 촉진시키고, 최종현탁액의 점도를 허용가능한 정도 안에서 크게 증가시켰다.
실시예 93~95에서 조제한, 더 높은 SPG/SPC 몰비의 지질 현탁액은 더 점성이 있고, 다루기가 어렵다. 하전된 지질 조성물의 상대농도가 더 커지면 인슐린과 결합하는 소포의 상대량이 증가하였다. 이것이 도7에 도시되어 있다.
하전된 지질 함량을 변화시키면 복잡한 방식으로 단백질의 결합 효율에 영향을 미친다. 먼저, 소포와 결합하는 인슐린의 상대량이 증가한다. SPC/SPG 비 50 근방일때, 최대 상대 결합량이 관찰된다. 이는 계면 밀집효과 및/또는 단백질 흡착 속도에 관한 표면전하의 영향 때문에, SPG 함량이 매우 커지면 효과적인 인슐린의 결합에 장애가 된다는 것을 나타낸다(후자의 경우, 표면에서 거대 분자 재배치를 허용할 정도로 속도가 빠르지 않아, 최대 패킹 밀도에 이르게 된다.)
실시예 101~104:
인슐린과 1/1로 혼합된 대단히 유연성이 있는 하전된 막(TL=10중량%)
대두에서 추출한 874.4㎎ 포스파티딜콜린
125.6㎎ 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 9㎖의 인산염 완충액
4㎎ 인슐린/㎖ 출발용액
소포를 제조하기 위하여 다른 방법들을 사용하였다: 상기 실시예1~27에서 기재한 압출과 동결-건조 사이클 이외에도, 훨씬 더 간단한 프로토콜(상기 현탁액을 단지 순차적으로만 압출시킴)을 또한 시험하였다. 혼합된 지질막에 대한 단백질 흡착효율의 현저한 차이는 확인되지 않았다(도8). 하지만, 상기 "공극 관통 평가"로 정의한 지질 소포의 형태 적응성은 다른 배치(batch)의 경우와 달랐다: 상기 실시예1~27에서 조제된 소포의 변형은 매우 큰 것으로 발견되었다.
실시예 105~106:
다양한 첨가제를 첨가시킨 유연성이 높은 하전된 막
(최종 현탁액)
대두에서 추출한 437㎎ 포스파티딜콜린
63㎎의 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 1㎖의 인산염 완충액
2㎎ 인슐린/㎖(최종현탁액 중)
첨가제 A
m-크레졸 1.5㎎/㎖(최종)
첨가제 B
벤질 알콜 2.5㎎/㎖(최종)
나트륨 콜레이트를 함유하는 트렌스퍼좀ⓡ에 첨가되는 보조-용매는 최종 막-결합 인슐린의 양에 영향을 준다. m-크레졸의 존재하에서 상대적인 결합효율은 60%이고, 시험 현탁액으로 벤질 알콜을 도입시킨 후의 효율은 90%이다.
실시예103~104에 사용된 첨가제는 또한 보존제로서 작용할 수 있다.
실시예107~110:
다양한 공급원으로부터 취한 다양한 인슐린을 갖는 유사막:
대두로부터 추출한 437㎎의 포스파티딜콜린
63㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 1㎖의 인산염 완충액
2mg 인슐린/㎖ (아크트라피드 100HMTM, 노보-노르디스크사 제품)
본래 건조 상태인, 인간 재조합체(노보-노르디스크사 제품),
본래 건조 상태인, 포르신(시그마 케미컬 인더스트리사 제품), 및
리스프로TM에서 취한 인슐린 유사체(화이자사 제품)
유사막에 대한 다양한 단백질 흡착효율에서 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 이것은 다양한 탈착/흡착 속도의 가능성을 배제하는 것은 아니다.
특히, 산성 완충액에 용해되고, 중성 pH 범위로 복귀시킨 건조 상태의 인슐린은 아크트라피드TM(노보-노르디스트사 제품) 용액으로부터의 인슐린 만큼이나 효율적으로, 혼합된 지질막에 흡착한다.
실시예111~118:
연질의, 하전되지 않은 막
출발 현탁액(10% TL):
대두에서 추출한 1099.7㎎의 포스파티딜콜린
900.3㎎의 트윈 80
pH7인 19㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액:
상기한 바와 같이 지질 혼합물과 혼합한 8.4㎍의 IF를
1.84㎎ TL/㎖~18.4㎍ TL/㎖을 사용하여 도10에 주어진 바와 같이 인터페론의 상대량을 증가시킴.
제제는 증가한 몰비로 혼합된 단백질/지질 혼합물을 함유하고, 실시예 60~71에서 기재한 바와 같이 제조하였다. 첫단계는, 센트리스아트 분리관(컷-오프 100kDa)으로 행하는데, 이는 이러한 테스트 시리즈에서 항상 알부민(40㎎ BSA/㎖ 완충액을 함유하는 용액으로부터 취함)으로 전-코팅되어 비-특이적인 단백질 흡착을 15% 이하의 수준으로 감소시킨다. BSA로 항온배양시킨 후에, 상기 완충액으로 2회 세척을 행하고, 적당한 농도의 인터페론 용액으로 충전시켰다(동일한 완충액에서 원액을 희석시켜서 조제함). 최종적인 단백질의 농도를 평가하기 위해서, IF용의 시판되는 ELISA 면역정량법을 사용하였다. 동일한 과정으로 소포와 결합하는 인터페론의 양을 측정하기 위해서, 실시예 1~18에서 기재한 대로의 방법을 사용하였다. 따라서, 단백질의 결합도는 상청액으로부터 2회 또는 3회 반복하여 취한 "단백질의 손실량"과 일치하였다.
얻어진 결과를 도10에 표시하였다. 이것으로 인슐린의 결합에 대하여 기재된 것과 정성적으로 유사한 도면이 얻어진다는 것을 알 수 있다.
실시예 119~134:
고유연성의, 하전된 막
출발 현탁액
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH 7.1의 9㎖ 인산염 완충액으로 이루어지는 10중량%의 전체 지질(TL)함량최종 현탁액
도10에 기재한 지질/단백질 혼합물
(실시예111~118에서 주어진 것에 대응하는 다른 데이타)도10에 도시되어 있는(다이아몬드와 사각형을 채워져 있음) 두개의 다른 실험 시리즈의 결과로부터, 단백질 분자에 대하여 알짜 음전하를 띠고 있다고 하더라도 고변형성 이중층에 결합하는 인터페론의 효율에 대하여 막의 음전하가 바람직한 작용을 하고 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 135~145:
출발 현탁액(10% TL):
연질의, 하전되지 않은 막
SPC/Tw80
대두에서 추출한 550㎎의 포스파티딜콜린
450㎎ 트윈80
pH6.5인 9㎖의 인산염 완충액
연질의, 하전된 막
SPC/NaChol
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액
최종현탁액:
상기 기재한 것과 같은 비를 갖는 지질, 및
10000IU의 인터류킨-2(IL-2)로 이루어짐.
시간 함수로 표시한 변형성이 매우 높은 소포와 결합하는 인터류킨의 효율
1일 6일
SPC/NaChol(IU) (%) SPC/Tw80(IU) (%) SPC/NaChol(IU) (%) SPC/Tw80(IU) (%)
출발량 10000 69 10000 190 10000 154 10000 364
결합량 8000 55 1000 19 5750 88 750 27
유리량 6500 45 4250 81 750 12 2000 73
회수량 14500 100 5250 100 6500 100 2750 100
출발치와 최종치(전체 회수된 단백질) 간의 편차는 소포/IL-2을 분리하는 동안의 단백질의 손실 및 지질의 존재에 의한 변성된 단백질의 활성에 부분적으로 기인한다.
다양한 표면전하 밀도를 갖는 인터류킨과, 이전에 조제된 고변형성 지질 소포와의 단기간의 결합은 상기 표에 기재한 것(데이타는 표시되지 않음) 보다 전하효과에 덜 민감한 것으로 판명되었다.
실시예 146~148:
종래의 중성상태의 소포(출발 현탁액):
대두에서 추출한 1g의 포스파티딜콜린
pH6.5인 9mM의 인산염 완충액고변형성인 중성상태의 소포(출발물질):
대두에서 추출한 550㎎의 포스파티딜콜린
450㎎의 트윈 80
pH6.5인 9㎖ 인산염 완충액
고변형성의 하전된 소포(출발물):
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
1%의 5.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 9㎖의 인산염 완충액
소포(최종 현탁액)와 혼합한 칼시토닌(예를 들어, 연어)
100㎎ 전체지질/㎖ 최종현탁액
1㎎ 단백질/100㎎ 전체지질상기 기재한 바와 같이 전체 지질 현탁액을 조제하였다. 처리한 소포에 단백질(소량의125I-표지 단백질로 극파(棘波)시키고, 사용하기 전에 단기간에 정제한 것)을 첨가하고, 적어도 24시간 동안 항온배양하였다; 대체적으로, 상기 지질에 단백질액을 첨가하고, 현탁액 제조 중에 초미세한 구멍이 있는 필터를 통과시켜 함께 압출시켰다.
막에 결합하는 폴리펩티드의 상대적인 효율을 측정하기 위해서, 단백질/소포 혼합물을 순차적인 방사성 검출이 가능한 크기-배제 겔 크로마토그래피를 사용하여 크로마토그래피하였다. 이로써 두개의 피크는 소포와 결합하는 방사선-표지된 단백질을 용액 내에 각각 함유하도록 할 수 있다. 곡선 이하의 영역은 약 30%이며, 종래의 소포의 경우에는 70%이고, 중성 상태의 연질막에 있어서는 60~70% 및 40~30%이고, 하전된 고유연성 막에 있어서는80%이고20%이다.
실시예 149~152:
고변형성의 중성상태 소포(출발물질):
대두에서 추출한 550㎎의 포스파티딜콜린
450㎎의 트윈80
pH6.5인 9㎖의 인산염 완충액
고변형성의 하전된 소포(출발물질):
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액
소포와 혼합시킨 면역글로불린 G(최종현탁액):
100㎎ 전체 지질/㎖ 최종현탁액
0.5㎎ 및 1㎎ 단백질/100㎎ 전체 지질
상기 기재한 바와 같이 전체 지질 현탁액을 조제하였다.
상기 면역 글로불린(플루오레세인에 대하여 직접적으로 작용하는 모노클로날 IgG)을 미리 형성된 소포 현탁액에 첨가시킴으로써 성분 내에 함유시켰다. 결합된 소포 및 유리된 면역 글로불린의 양을 분리시킨 후에, 분리된, 원래의 대조 용액 중에 형광 담금질(quenching)하여 전자로부터의 상대적인 기여량을 측정하였다. 이것으로 각각의 최종적인 IgG 농도가 유지될 수 있다.
IgG 캐리어 막 결합 효율을 측정하였더니, 하전된 고변형성 소포의 경우에는 약 85% 이상이었고, 중성상태의 연질의 막의 경우에는 약 10% 더 낮았다. 관찰된 차이가 적은 것은 IgG가, 심지어 막 연화, 결함 생성 성분이 존재하지 않는 경우에도 지질 막 내로 쉽게 도입되는, 다량의 소수성 Fc 영역을 함유하기 때문이라고 추정된다.
실시예 153~154:
고변형성의 하전된 소포, C형:
대두에서 추출한 130.5㎎의 포스파티딜콜린
19.5㎎의 콜레이트, 나트륨염
0.1㎖ 에탄올
고변형성의 하전되지 않은 소포, T 타입:
대두에서 추출한 75㎎ 포스파티딜콜린
75㎎의 트윈 80
0.1㎖의 에탄올
인슐린, 인간 재조합체:
1.35㎖ 아크트라피드TM100(노보-노르디스크사 제품)
제제화 시험
균일한 인지질 용액을 얻을 때까지, 특정 지질 혼합물을 알콜에 녹였다(주의: 나트륨 콜레이트는 완전히 녹지 않음). 상기 혼합물을 인슐린 용액에 주입하여 완전하게 혼합하였다. 약 12시간 동안의 노화 처리 후에, 우수한 샘플 균질화를 얻기 위하여, "조 소포 "의 얻어진 현탁액을 0.2㎛의 필터(사르토리우스, 괴팅겐)를 통하여 수차례 여과하였다. 최종 인슐린 농도는 80 IU/mL였다.
시험
건강한 남자 볼론티어(75㎏, 42세)를 제1 글루코스 농도를 측정하기 전에 17시간 동안 공복시켰다. 볼론티어의 혈액 중 글루코스 농도의 일시적 변동을 따라가기 위하여, 볼론티어의 팔에 설치한 연질의 정맥 카테터를 통하여 매 10분~20분마다 2~4㎖의 샘플을 회수하였다. 70분의 초기 시험기간이 경과한 후에, 평균 혈액 글루코스 농도가 78.4였을 때, C 타입의 트랜스퍼설린ⓡ 현탁액을 다른쪽 앞팔 안쪽의 손상되지 않은 피부 표면에 도포하고(45IU) 균일하게 문질러서 도포 면적이 56㎠이 되게 하였다. 시험 현탁액을 도포한 후, 30분 후에는, 피부 표면은 육안으로 보아 건조해 보이며, 또 30분 후에는 상기 현탁액의 단지 희미한 흔적만이 식별가능하였다.
표준 글루코스-탈수소화효소 분석평가(머크, 글루크-DH)를 사용하여 혈당 농도를 측정하였다. 각 검체는 3가지의 별개의 샘플을 함유하고, 각 측정은 3회 이상씩 측정하였다. 이렇게 하여 측정된 평균 표준 편차는 5㎎/㎖를 넘지 않고, 전형적인 오차는 3mg/dL였다.
결과
트랜스퍼좀ⓡ(트랜스퍼설린ⓡ)과 결합된 인슐린을 피부 투여한 후에, 혈당이 정상치인 볼론티어에서의 혈당 농도 변화는 인슐린 용액을 피하 주사하여 얻은 것보다 언제나 느렸다.
트랜스퍼설린ⓡ을 피부 투여한 후에 혈당 농도의 최대 감소량은 일반적으로 대응하는 피하 주사하여 얻은 것의 10%를 초과하고, 참고로서 공지된 데이터를 사용하는 곡선의 아래의 면적이 최소 20%이었다. t＞3h의 현탁액 C의 경우 혈액 내 혈당농도의 평균 억압량은 약 18㎎/㎗였다.
현탁액 T의 결과는 현탁액 C로 측정한 데이타에 비해서 약 35%정도로 불량하였다. 포스파티딜글리세롤(포스파티딜콜린에 대하여 상대적으로 15중량%)을 주입하였더니 C타입과 T타입의 제제 간의 차이가 25%(데이타는 표시되지 않음)로 감소하였다.
그러나, 이온토포레시스(Meyer, B. R., Katzeff, H. L., Eschbach, J., Trimmer, J., Zacharis, S. R. Rosen, S., Sibalis, D. Amer. J. Med. Sci. 1989, 297:321~325)나 트랜스나살 스프레이를 사용하는 것과 같은 현재까지 이용가능한 다른 비침습형 인슐린 전달방법의 경우에도, 각각 인슐린 분자의 5% 미만 및 10% 미만을 혈액 순환 계로 도입하게 된다.
실시예 155:
고변형성의 하전된 소포:
실시예 72~76에서 사용된 조성물
인슐린, 인간 재조합체:
실시예 72~76에서 사용된 아크트라피드TM(동결건조체)(노보-노르디스크사 제품)
실시예 61~65에 기재한 바와 같이 제제를 제조하였다. 이전 실시예에서 기재한 바와 같이 투여를 필수적으로 행하나, 공복 시간을 더 지속하고, 혈액 샘플링을 더 빨리 시작하였다(따라서, 실험은 모니터되지 않은 12시간 공복에서 시작되고, 어떠한 처리도 하지 않고 혈당 수준을 모니터하면서, 또 다시 12시간 공복시키고, 이 기간 중에는 시험대상자에게 아무것도 주지 않고 공복시키면서 피부 트랜스퍼설린ⓡ으로 처리하는 동안 16시간 가량 모니터하였다). 도포 면적이 단지 10㎠이라는 약간의 차이가 있었다.
인슐린을 투여하기 전에, 불규칙적으로 샘플을 취하였다. 트랜스퍼설린ⓡ을 투여한 후에, 최초 4시간에 걸쳐서 20분 마다 혈액 샘플을 취하고 그 이후에는 30분 마다 취하였다. 자가-진단 장치인 애쿠트렌드(독일, 뵈링거-맨하임사 제품)로 모든 샘플을 분석하였다. 매 시간 포인트에 3~5개의 기록값을 취하였다. 도12에 표시되어 있는 결과는 혈당 농도 변화의 평균값에 대응한다. 대쉬 라인들은 95%의 신뢰 한계를 제공한다.
두번째의 "무처리" 기간에서의 평균 혈당 농도는 83.2㎎/㎗였다. 고적합성의 혼합된 지질 소포를 사용하여 약물을 피부 투여한 다음 1시간 이내에, 혈당 농도의 저하가 명확하게 관찰된다. 글루코다이나믹 프로파일은 상기 테스트 시리즈에서 측정된 것과 유사하고, 아마도 후자의 시험물질 테스트에서의 훨씬 더 높은 약물의 농도로 인하여 전반적인 효과가 다소 강해지게 된다.
실시예 156~158:
고변형성의 하전된 소포:
실시예 153의 조성물
인슐린, 인간 재조합체:
도2에 주어진 배치, 아크트라피드TM(노보-노르디스크사 제품).
테스트 시리즈에서, 동일한 트랜스퍼좀ⓡ 배치를 사용하여, 인슐린에 대한 내부-배치의 변화에 따른 효과를 연구하였다. 상기 실시예에 기재한 바와 같이 투여하였다. 면적당 투여량을 상기 실시예에서 사용한 것과 같이 하였다.
3개의 실험 모두에서 평균 혈당농도가 거의 같았다. 이러한 현저한 실험의 결과는 인슐린 배치들간에 매우 다양하였다. 하나의 배치는 매우 효과적이었지만, 다른 배치는 그렇지 않았다; 세번째의 것은 중간 결과를 나타내었다.
인슐린의 작은 배치에서 배치로의 변화(이것은 공지되어 있으나, 대부분은 보고되어 있지 않고, 특히 대량 흡착성 (캐리어) 표면의 존재하에서 특히 현저하다)는 인슐린-캐리어 상호 작용의 속도 및/또는 효율에 영향을 미치는 것 으로 추정된다. 약물의 유리도의 변화율은 특히 현상에 민감하다고 일반적으로 알려져있다. 따라서, 면밀한 생물학적 테스트를 행하기 전에, 지질과 결합하는 캐리어의 양과, 약물 유리 속도를 측정하는 것도 중요하다. 마우스나 래트와 같은 시험동물에서, 주입 후 제제의 특성으로서 글루코다이나믹을 측정하는 것도 이러한 목적을 위해서는 유용하다. 3개의 다른 트랜스퍼설린ⓡ을 투약한 후에 혈당치가 정상인 볼론티어의 글루코다이나믹은 트랜스퍼좀ⓡ과 동일한 배치를 갖지만, 다른 인슐린 배치는 최종 제제의 생물학적인 활성에 대한 본래 약물의 특성의 작은 변화에도 상대적으로 강력한 효과를 명확하게 나타낸다.
본 발명은 복합체 표면에 대한 거대 분자의 흡착 또는 상기 표면으로부터의 대응하는 탈착율을 제어하는 유익한 인자를 정의함으로써, (생명)공학 및 의학분야에 적합한 형태로 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 또한 본 발명은 결과적인 형태로 실용화하여 사용하기에 특히 적당한 물질의 특성을 기재하고 있는데, 예를 들어 의학이나 동물의학과 같은 분야에서 진단학, 분리공정 및 (생)가공처리, 생명공학, 유전자 증식, 제재 안정화처리, 농축 및 운반등의 용도에 사용되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.

Claims (107)

  1. 적당한 액매와 접촉시 양친매성을 나타내고, 상기 액매 내에서 용해도가 서로 다른 2종 이상의 물질로 이루어지며, 상기 액매와 접촉시, 확장된 표면을 형성할 수 있어 양친매성의 제3물질 분자들이 상기 표면과 결합하는 조합체로서:
    상기 액매에 용해성이 더 높은 물질은 표면 활성 물질, 계면활성제 및 이들의 조합체로부터 선택되고, 표면 불안정화 특성을 가지며,
    상기 액매에 용해성이 더 낮은 물질은 지질 또는 지질 유사 물질로부터 선택되고, 표면 형성 특성을 가지며,
    상기 제3물질의 분자들은 사슬 분자 및 거대 분자로부터 선택되고,
    조합체 내의 상기 용해성이 더 높은 물질의 존재는 용해성이 더 낮은 물질 및 용해성이 더 높은 물질에 의해 형성된 확장된 표면이 제3물질의 분자들을 결합하는 능력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용해성이 더 높은 물질 및 용해성이 더 낮은 물질과 상기 제3물질에 의해 형성된 상기 확장된 표면은 알짜 전하를 수반하며, 상기 확장된 표면의 알짜 전하 밀도와 상기 확장된 표면과 결합되는 제3물질의 분자들의 알짜 전하가 동일한 부호를 갖는 것을 특징으로 하는 조합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제3물질의 분자 뿐만 아니라, 상기 확장된 표면은 모두 음으로 하전되거나, 또는 모두 양으로 하전되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 표면을 형성하도록 자가 응집 가능한 1종 이상의 양친매성 물질로서, 다른 조합체 성분과 혼합될 때 보다 유연해지는 물질을 포함하고, 상기 2종 물질은 상기 액매 내에서 용해도 차가 10배 이상인 것을 특징으로 하는 조합체.
  5. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 표면을 형성하도록 자가 응집 가능한 1종 이상의 양친매성 물질, 및 상기 표면에 혼입될 경우 상기 표면의 증가된 곡률을 유지하는 1종 이상의 양친매성 물질을 포함하며, 상기 곡률을 증가시키는 물질의 농도는 포화농도 또는 그를 넘는 경우 표면을 형성할 수 없는 농도의 99% 이하인 것을 특징으로 하는 조합체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 용해성이 보다 높거나, 또는 곡률을 증가시키는 물질의 농도는 제5항에서 정의한 상대 농도의 0.1% 이상인 것을 특징으로 하는 조합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 표면은 15㎚~5000㎚의 평균 반경에 상응하는 평균 곡률(표면에 의해 둘러싸인 영역의 평균 반경의 역수로 정의함)을 갖는 것을 특징으로 하는 조합체.
  8. 제5항에 있어서, 상기 표면이 고체에 의해 지지되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  9. 제2항 또는 3항에 있어서, 표면과 연관된 하전 성분의 상대적인 농도는, 모든 표면 형성 양친매성 물질을 모두 합한 농도를 기준으로 하여, 5~100 상대몰%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  10. 제2항 또는 3항에 있어서, 상기 표면의 평균 전하 밀도는 0.05 Cb/m2~0.5 Cb/m2인 것을 특징으로 하는 조합체.
  11. 제2항 또는 3항에 있어서, 단가나 다가 이온을 포함하는 배경 전해질 조성 및 농도는, 요구되는 결합에 대한 전하간 상호 작용의 상승 효과를 최대화하도록 선택되고, I=0.0001~1의 이온강도(I)에 상응하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  12. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템 내에서 표면-형성 또는 전하 수반 양친매성 물질이며 액매 내에서 용해성이 더 낮은 물질은 지질 또는 지질 유사 물질이고, 표면 곡률, 유연성이나 적합성을 증가시키는 물질 또는 전하 수반 물질이며 액매 내에서 용해성이 더 높은 물질은 계면활성제이거나 또는 제3의 결합 물질과 동일한 것을 특징으로 하는 조합체.
  13. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 액매 내에서 현탁되거나 분산된, 또한 2종류 또는 2가지 형태 이상의 자가 응집성 양친매성 물질의 1층 또는 수개의 층의 막과 같은 코팅에 의해 둘러싸인 미세한 액적 형태의 분자 배열을 포함하고, 상기 2종 이상의 물질은 수성 액매에서 그 용해도가 서로 10배 이상의 차이를 가져서, 상기 용해성이 보다 높은 물질의 동종 응집체 또는 2가지 물질의 이종 응집체의 평균 직경이 상기 용해성이 보다 낮은 물질의 동종 응집체의 평균 직경 보다 작은 것을 특징으로 하는 조합체.
  14. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 표면을 형성할 수 있는 모든 양친매성 물질의 전체 함량은, 상기 조합체가 인체나 동물에 사용될 경우에, 응집체의 전체 건조 중량을 기준으로 하여, 0.01~30중량%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  15. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 보다 확장된 표면을 형성하는 물질로서, (생체)허용가능한 극성 또는 비극성 표면-지지 지질을 1종 이상 함유하고, 상기 조합체에 의해서 형성되는 표면이 이중층 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 확장된 표면 형성 물질은 생물학적 공급원으로부터 취한 지질이나 리포이드; 또는 이에 상응하는 합성 지질이거나; 또는 지질의 변형체; 또는 이중층을 형성할 수 있는 기타 지질인 것을 특징으로 하는 조합체.
  17. 제12항에 있어서, 상기 계면활성제가 비이온성, 쯔비터이온성, 음이온성이거나 양이온성의 계면활성제인 것을 특징으로 하는 조합체.
  18. 제12항에 있어서, 조합체로부터 형성된 상기 표면이 하전된 막 성분을 1~80몰% 범위의 상대농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  19. 제12항에 있어서, 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜글리세롤은 표면-지지 물질이고, 리소포스파티딜산이나 메틸포스파티딜산, 리소포스파티딜글리세롤이나 리소포스파티딜콜린과 같은 리소포스포리피드; 또는 부분적으로 N-메틸화한 리소포스파티딜에탄올아민; 콜레이트, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트의 단가 염; 또는 임의의 다른 충분히 극성인 스테롤 유도체; 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올레이트, 팔리톨레이트, 엘라이데이트; 또는 일부의 다른 지방산 염 또는; 트윈-; 미리즈-; 또는 브리즈형; 그 밖의 트리톤; 지방성 설포네이트, 또는 -설포베타인, -N-글루카미드나 -소르비탄(아르락셀이나 스판) 계면활성제는 확장된 표면을 덜 형성하는 물질인 것을 특징으로 하는 조합체.
  20. 제11항에 있어서, 상기 확장된 표면으로 둘러싸인 영역의 평균 반경은 15~5000㎚인 것을 특징으로 하는 조합체.
  21. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 표면과 결합할 수 있는 제3물질은, 올리고머나 폴리머와 같은 사슬분자의 형태이고, 평균분자량이 800달톤 이상인 반복 서브 유니트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  22. 삭제
  23. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질은 상기 막과 이에 접촉하는 액매 사이의 계면내에 그자체로 삽입되어, 막과 같은 확장된 표면과 결합하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  24. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질에 상응하는 사슬분자의 함량은, 흡착제 표면의 질량과 비교하여, 0.001~50 상대%이고, 이로써 고유비값은 상기 사슬분자의 몰 질량 증가에 따라 감소하게 되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  25. 제21항에 있어서, 상기 사슬분자는 단백질이고, 상기 사슬분자의 적어도 일부가 상기 표면과 결합하며, 단, 상기 사슬분자의 일부는 상기 표면에 결합하는 특성이 있는 관능기나 단편을 3개 이상 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
  26. 제21항에 있어서, 상기 사슬분자는 본래 형태, 또는 화학적, 생화학적 또는 유전학적인 변형 후의 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드군에 속하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  27. 제21항에 있어서, 상기 사슬분자는 본래 형태, 또는 화학적, 생화학적 또는 유전학적인 변형 후의 어느 하나의 형태로 상기 표면과 적어도 부분적으로 상호작용하는 특성을 갖는 폴리사카라이드군에 속하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  28. 제21항에 있어서, 상기 사슬분자는 아드레노코르티코스타티쿰,-아드레놀리티쿰, 안드로겐이나 안티안드로겐, 안티파라시티쿰, 아나볼리쿰, 아나에스테티쿰이나 아날게시쿰, 아날렙티쿰, 안티알레르지쿰, 안티아르히스미쿰, 안티아르테로스크레로티쿰, 안티아스마티쿰 또는 브론코스파스몰리티쿰, 안티바이오티쿰, 안티드레프레시붐 또는 안티사이코티쿰, 안티디아베티쿰, 안티도트, 안티에메티쿰, 안티에피렙티쿰, 안티피브리놀리티쿰, 안티컨불시붐, 안티콜리네르지쿰, 효소, 보조 효소 또는 대응하는 억제제, 안티히스타미니쿰, 안티하이퍼토니쿰, 약물 활성의 생물학적인 억제제, 안티하이포토니쿰, 안티코아굴란트, 안티미코티쿰, 안티미아스테니쿰, 모르버스 파킨슨이나 모르버스 알츠하이머에 대항하는 성분, 안티플로지스티쿰, 안티피레티쿰, 안티류머티쿰, 안티셉티쿰, 호흡에 관여하는 아날레티쿰이나 호흡 자극제, 브론콜리티쿰, 카르디오토니쿰, 케모테라퓨티쿰, 혈관 확장제, 사이토스타티쿰, 디우레티쿰, 강글리움-차단제, 글루코코르티코이드, 흐름 방지 성분, 헤모스타티쿰, 하이프노티쿰, 면역글로불린이나 그것의 단편 또는 다른 면역학적으로 활성인 물질, 생활성인 탄수화물(유도체), 피임약, 안티-마이그레인 성분, 미네랄로-코르티코이드, 몰핀-길항제, 근육이완제, 나르코티쿰, 뉴로테라퓨티쿰, 뉴로렙티쿰, 뉴로트랜스미터나 그 길항제, 펩티드(유도체), 옵탈미쿰, (파라)-심퍼티코미메티쿰이나 (파라)심퍼티콜리티쿰, 단백질(유도체), 프소리아시스/뉴로데르미티스 약, 마이드리아티쿰, 사이코스티뮬란트, 리놀로지쿰, 수면-유도제나 그 길항제, 안정제, 스파스몰리티쿰, 튜버쿨로스타티쿰, 우롤로지쿰, 혈관수축제나 혈관이완제, 바이러스타티쿰 또는 임의의 상처-치유 물질이나 상기 성분의 조합으로 작용할 수 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
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  34. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합체는 1~500 I.U.인슐린/mL을 함유하고, 상기 인슐린은 인간 재조합이나 인간화된 인슐린인 것을 특징으로 하는 조합체.
  35. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합체는 0.01mg~20mg 인터류킨/mL을 함유하고, 상기 인터류킨은 IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12과 같은, 인체나 동물에 사용하기에 적합한 것을 특징으로 하는 조합체.
  36. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합체는 20상대중량% 이하의 인터페론을 함유하고, 상기 인터페론은 IF 알파, 베타 및 감마와 같은, 인체나 동물에 사용하기에 적합한 것을 특징으로 하는 조합체.
  37. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합체는 25mg 신경 생장 인자 (NGF)/mL 현탁액 이하, 또는 성분으로서 25 상대중량% NGF 이하를 함유하고, 상기 NGF는 인간 재조합형의 NGF임을 특징으로 하는 조합체.
  38. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 25mg의 면역글로불린 (Ig)mg/mL 현탁액 이하, 또는 전체 지질에 대하여 25 상대중량% Ig 이하를 함유하고, 이것에 의하여 상기 성분은 손상되지 않은 항체, 항체의 일부분, 또는 생물학적으로 허용가능하고 활성인 그의 변형체의 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  39. 생물학적, 화장품학적 또는 약리학적인 활성 성분과 같은 활성 성분의 제제의 제조 방법에 있어서:
    적당한 액매 내에서 용해도가 서로 다르며, 액매와 접촉시, 적어도 조합된 경우, 확장된 표면을 형성할 수 있는 2종 이상 양친매성 물질을 선택하는 단계; 및
    이로써, 상기 물질의 조합체로 형성된 확장된 표면이, 상기 액매 내에서 용해성이 더 낮은 물질만으로 형성된 표면 보다 훨씬 크게 상기 활성 성분을 유인하여 결합할 수 있으며, 다른 물질만으로 형성되는 경우 보다 확장된 표면을 더 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 표면 형성 물질의 조합체는 상기 성분 분자의 존재하에 여과, 압력 변화, 또는 기계적 균질화, 흔들기, 교반, 혼합, 기타 다른 제어된 기계적 분쇄 수단에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 표면 형성 물질의 선택된 조합체를 적당한 지지용 고체 표면(들)에 흡착시키거나, 또는 다른 방식으로 그 고체 표면에 영구 접촉시킨 다음, 여러 물질들을 차례로 첨가하거나 이들을 한꺼번에 첨가하여 상기 액매와 영구 접촉시킴으로써, 뒤의 표면 형성 단계 중 한 단계 이상이 고체-지지된 표면과 순차적으로 결합하는 성분의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 흡착성 표면 또는 그 전구체를, 액매 중에 현탁되거나 고체에 의해 지지되거나에 관계 없이, 표면 형성 분자들의 순차적 혼합을 포함할 수 있는 단계들에 의해 먼저 제조하고, 이어서, 결합성 분자를 첨가하여 상기 표면과 결합되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제39항 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 분자와 결합하는 표면이 제1항에 대응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제39항 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액매 현탁액의 특성은 제1항에 대응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 인슐린, 인터페론, 인터류킨, 및 면역 글로불린 G와 같은 다양한 성분을 비침습용 제제로 제조하는 방법에 있어서:
    상기 성분 분자와 결합할 수 있는 표면은 1종 이상의 양친매성 물질, 1종 이상의 친수성 유체, 1종 이상의 표면 활성 물질 또는 계면활성제, 및 1종 이상의 상기 성분으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 1종 이상의 표면 활성 물질이나 계면활성제, 1종 이상의 양친매성 물질, 1종 이상의 친수성 유체 및 상기 성분을 별도로 혼합하고, 이어서, 얻어진 혼합물을 조합하여, 기계적인 에너지를 이용하여, 순차적으로 상기 성분 분자와 결합하는 실재물의 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제45항 또는 46항에 있어서, 상기 양친매성 물질을 그대로, 또는 물 또는 물과 섞일 수 있는 생리학적으로 허용가능한 극성 유체, 또는 극성 용액과 함께 용매화 매개제에 용해시켜 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 극성 용액은 1종 이상의 표면 활성 물질 또는 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제45항, 46항, 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 유체 상으로의 물질 첨가, 역상으로부터의 증발, 및 주입 또는 투석에 의해서 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 표면의 형성은 여과에 의해 유도되고, 이때 여과재의 공극 크기는 0.01㎛~0.8㎛이며, 복수개의 필터를 순차적으로 또는 병행하여 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제45항, 46항, 48항, 50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 및 캐리어가, 흡착성 표면의 형성 후에, 적어도 부분적으로 결합되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 삭제
  53. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합체가 약물 캐리어, 또는 약물 데포제(depot) 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합체가 (유도화)단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리사카라이드와 같은 적어도 부분적으로 양친매성인 표면 결합 분자를 안정화시키거나, 표면 결합 상태의 분자를 포함하는 촉매화 공정에 사용되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  57. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합체가, 상기 표면 결합 분자와, 복합체, 적합성 표면 사이의 결합 또는 해리의 속도 또는 가역성에 영향을 미치는 데 사용되어, 보다 높은 표면 전하 밀도, 보다 큰 표면 유연성, 또는 표면 결함 밀도는 결합 속도를 가속화하고, 또는 그에 대응하는 감소는 결합 속도를 저하시키거나 또는 부분적인 분자 해리를 유도하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  58. 제4항에 있어서, 상기 2가지 물질은 상기 액매 내에서 용해도 차가 100배 이상인 것을 특징으로 하는 조합체.
  59. 제6항에 있어서, 상기 용해성이 보다 높거나, 또는 곡률을 증가시키는 물질의 농도는 제5항에서 정의한 상대 농도의 1~80%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  60. 제59항에 있어서, 상기 용해성이 보다 높거나, 또는 곡률을 증가시키는 물질의 농도는 제5항에서 정의한 상대 농도의 10~60%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  61. 제60항에 있어서, 상기 용해성이 보다 높거나, 또는 곡률을 증가시키는 물질의 농도는 제5항에서 정의한 상대 농도의 20~50%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  62. 제7항에 있어서, 상기 표면은 30㎚~1000㎚의 평균 반경에 상응하는 평균 곡률(표면에 의해 둘러싸인 영역의 평균 반경의 역수로 정의함)을 갖는 것을 특징으로 하는 조합체.
  63. 제62항에 있어서, 상기 표면은 40㎚~300㎚의 평균 반경에 상응하는 평균 곡률(표면에 의해 둘러싸인 영역의 평균 반경의 역수로 정의함)을 갖는 것을 특징으로 하는 조합체.
  64. 제63항에 있어서, 상기 표면은 50㎚~150㎚의 평균 반경에 상응하는 평균 곡률(표면에 의해 둘러싸인 영역의 평균 반경의 역수로 정의함)을 갖는 것을 특징으로 하는 조합체.
  65. 제9항에 있어서, 표면과 연관된 하전 성분의 상대적인 농도는, 모든 표면 형성 양친매성 물질을 모두 합한 농도를 기준으로 하여, 10~80 상대몰%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  66. 제65항에 있어서, 표면과 연관된 하전 성분의 상대적인 농도는, 모든 표면 형성 양친매성 물질을 모두 합한 농도를 기준으로 하여, 20~60 상대몰%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  67. 제10항에 있어서, 상기 표면의 평균 전하 밀도는 0.075 Cb/m2~0.4 Cb/m2인 것을 특징으로 하는 조합체.
  68. 제67항에 있어서, 상기 표면의 평균 전하 밀도는 0.10 Cb/m2~0.35 Cb/m2인 것을 특징으로 하는 조합체.
  69. 제11항에 있어서, 배경 전해질 조성 및 농도는 I=0.02~0.5의 이온강도(I)에 상응하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  70. 제69항에 있어서, 배경 전해질 조성 및 농도는 I=0.1~0.3의 이온강도(I)에 상응하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  71. 제13항에 있어서, 상기 2종 이상의 물질의 용해도 차가 100배 이상인 것을 특징으로 하는 조합체.
  72. 제14항에 있어서, 표면을 형성할 수 있는 모든 양친매성 물질의 전체 함량은, 응집체의 전체 건조 중량을 기준으로 하여, 0.1~15중량%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  73. 제72항에 있어서, 표면을 형성할 수 있는 모든 양친매성 물질의 전체 함량은, 응집체의 전체 건조 중량을 기준으로 하여, 1~10중량%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  74. 제18항에 있어서, 조합체로부터 형성된 상기 표면이 하전된 막 성분을 10~60몰% 범위의 상대농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  75. 제74항에 있어서, 조합체로부터 형성되는 상기 표면이 하전된 막 성분을 30~50몰% 범위의 상대농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  76. 제20항에 있어서, 상기 확장된 표면으로 둘러싸인 영역의 평균 반경은 30~1000㎚인 것을 특징으로 하는 조합체.
  77. 제76항에 있어서, 상기 확장된 표면으로 둘러싸인 영역의 평균 반경은 40~300㎚인 것을 특징으로 하는 조합체.
  78. 제77항에 있어서, 상기 확장된 표면으로 둘러싸인 영역의 평균 반경은 50~150㎚인 것을 특징으로 하는 조합체.
  79. 제21항에 있어서, 상기 제3물질은 평균분자량이 1000달톤 이상인 반복 서브 유니트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  80. 제79항에 있어서, 상기 제3물질은 평균분자량이 1500달톤 이상인 반복 서브 유니트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  81. 제24항에 있어서, 상기 제3물질에 상응하는 사슬분자의 함량은, 흡착제 표면 질량과 비교하여, 0.5~25 상대%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  82. 제81항에 있어서, 상기 제3물질에 상응하는 사슬분자의 함량은, 흡착제 표면 질량과 비교하여, 1~20 상대%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  83. 제34항에 있어서, 상기 조합체는 20~400 I.U.인슐린/mL을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  84. 제83항에 있어서, 상기 조합체는 50~250 I.U.인슐린/mL을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  85. 제35항에 있어서, 상기 조합체는 0.1mg~15mg인터류킨/mL을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  86. 제85항에 있어서, 상기 조합체는 1mg~10mg인터류킨/mL을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  87. 제36항에 있어서, 상기 조합체는 0.1mg~15mg인터페론/mL을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  88. 제87항에 있어서, 상기 조합체는 1mg~10mg인터페론/mL을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  89. 제37항에 있어서, 상기 조합체는 0.1~15상대중량% NGF를 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  90. 제89항에 있어서, 상기 조합체는 1~10상대중량% NGF를 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  91. 제42항에 있어서, 상기 흡착성 표면 또는 그 전구체를, 액매 중에 현탁되거나 고체에 의해 지지되거나에 관계 없이, 표면 형성 분자들의 순차적 혼합을 포함할 수 있는 단계들에 의해 먼저 제조하고, 이어서, 결합성 분자를 첨가하고, 상기 표면을 손상시키지 않는 조건 하에서, 교반, 혼합, 또는 항온배양에 의해 상기 표면과 결합되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제45항에 있어서, 상기 표면은 1종 이상의 양친매성 물질, 1종 이상의 친수성 유체, 1종 이상의 가장자리 활성 물질 또는 계면활성제, 1종 이상의 상기 성분, 및 상기 제제를 함께 형성하는 기타 통상의 성분으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제46항에 있어서, 1종 이상의 표면 활성 물질이나 계면활성제, 1종 이상의 양친매성 물질, 1종 이상의 친수성 유체 및 상기 성분을 별도로 혼합하고, 이를 용해시켜 용액을 형성하고, 이어서, 얻어지는 용액을 조합하여, 기계적인 에너지를 이용하여, 순차적으로 상기 성분 분자와 결합하는 실재물의 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제49항에 있어서, 상기 표면은 흔들기, 교반, 진동, 균질화, 초음파처리, 전단, 동결 및 해동, 또는 유리한 작동 압력을 사용하는 여과와 같은 기계적 수단을 보조적으로 사용하여 유체 상으로의 물질 첨가, 역상으로부터의 증발, 및 주입 또는 투석에 의해서 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제50항에 있어서, 상기 여과재의 공극 크기는 0.02㎛~0.3㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 여과재의 공극 크기는 0.05㎛~0.15㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제1항에 있어서, 상기 확장된 표면은 막 표면인 것을 특징으로 하는 조합체.
  98. 제4항에 있어서, 상기 다른 조합체 성분은 상기 자가 응집 물질 보다 액매 내에서 용해성이 더 높은 양친매성 물질인 것을 특징으로 하는 조합체.
  99. 제8항에 있어서, 상기 고체는 적당한 곡률이나 크기를 갖는 지지표면인 것을 특징으로 하는 조합체.
  100. 제16항에 있어서, 상기 지질의 변형체는 글리세리드, 글리세로포스포리피드, 이소프레노이드리피드, 스핑고리피드, 스테로이드, 스테린이나 스테롤과 같은 지질, 황이나 탄수화물-함유 지질인 것을 특징으로 하는 조합체.
  101. 제16항에 있어서, 상기 이중층을 형성할 수 있는 지질은 반양성자화한 유체 지방산인 것을 특징으로 하는 조합체.
  102. 제101항에 있어서, 상기 반양성자화한 유체 지방산은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린이나 스핑고포스포리피드, 글리코스핑고리피드(세레브로사이드, 세라미드폴리헥소사이드, 설파티드, 스핑고플라즈마로겐을 포함), 강글리오사이드, 또는 기타 글리코리피드 또는 합성 지질인 것을 특징으로 하는 조합체.
  103. 제102항에 있어서, 상기 합성 지질은 디올레오일-, 디리놀레일-, 디리놀레닐-, 디리놀레노일-, 디아라키도일-, 디라우로일-, 디미리스토일-, 디팔미토일-, 디스테아로일리피드 또는 대응하는 스핑고신 유도체, 또는 다른 글리코리피드 또는 디아실-, 디알케노일- 또는 디알킬-리피드인 것을 특징으로 하는 조합체.
  104. 제17항에 있어서, 상기 계면활성제는 긴사슬형의 지방산이나 알콜, 알킬-트리/디/메틸-암모늄 염, 알킬설페이트염; 콜레이트, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트나 타우로콜레이트의 단가염; 도데실-디메틸-아미노옥사이드와 같은 아실- 또는 알카노일-디메틸-아미노옥사이드; 알킬- 또는 알카노일-N-메틸글루카미드; N-알킬-N,N-디메틸글리신; 3-(아실디메틸암모니오)-알칸설포네이트; N-아실-설포베타인; 노나에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르와 같은 폴리에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르; 노나에틸렌-도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르; 옥타에틸렌글리콜-이소트리데실 에테르와 같은 폴리에틸렌글리콜-이소아실 에테르; 옥타에틸렌도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르; 폴리에틸렌글리콜-20-모노라우레이트(트윈20)이나 폴리에틸렌글리콜-20-소르비탄-모노올레이트(트윈 80)과 같은 폴리에틸렌글리콜-소르비탄-아실 에스테르; 폴리히드록시에틸렌-4 또는 6 또는 8이나 10이나 12 등-라우릴 에테르(브리즈 시리즈 중에서)나 예를 들어 폴리히드록시에틸렌-8-스테아레이트(미리즈 45), -라우레이트, 또는 -올레이트형과 같은 대응하는 에스테르, 또는 폴리에톡실화 캐스터 오일 40(크레모퍼 EL)에서와 같은, 폴리히드록시에틸렌-라우릴, -미리스토일, -세틸스테아릴이나 -올레오일 에테르와 같은 폴리히드록시에틸렌-아실 에테르; 특히 소르비탄-모노라우레이트(알라셀 20, 스판 20)와 같은 소르비탄-모노알킬레이트(예를 들어, 알라셀이나 스판 중에서); 데카노일-이나 도데카노일-N-메틸글루카미드와 같은 아실-이나 알카노일-N-메틸 글루카미드; 라우릴-이나 올레오일-설페이트와 같은 알킬설페이트(염); 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 글리코데옥시콜레이트, 나트륨 올레이트, 나트륨 타우레이트 나트륨 엘라이데이트, 나트륨 리놀리에이트, 나트륨 라우레이트와 같은 지방산염; 라우릴이나 올레오일-글리세로-포스파티딜산, -포스포릴글리세롤 또는 -포스포릴세린, n-테트라데실-글리세로-포스파티딜산, -포스포릴글리세롤 또는 -포스포릴세린의 n-옥타데실렌(=올레오일)-글리세로포스파티딜산, -포스포릴글리세롤이나 -포스포릴세린, n-아실-과 같은 리소포스포리피드, 대응하는 팔미토엘오일-, 엘라이도일-, 바세닐-리소포스포리피드; 또는 대응하는 단쇄 포스포리피드; 또는 그 밖의 표면-활성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 조합체.
  105. 제39항에 있어서, 상기 확장된 표면은 막 표면인 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제56항에 있어서, 상기 양친매성 표면 결합 분자가 사슬분자인 것을 특징으로 하는 조합체.
  107. 제57항에 있어서, 상기 조합체가, 상기 표면 결합 분자와, 복합체, 적합성 표면 사이의 결합, 해리의 속도 및 가역성에 영향을 미치는 데 사용되어, 보다 높은 표면 전하 밀도, 보다 큰 표면 유연성, 및 표면 결함 밀도는 결합 속도를 가속화하고, 또는 그에 대응하는 감소는 결합 속도를 저하시키거나 또는 부분적인 분자 해리를 유도하는 것을 특징으로 하는 조합체.
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