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KR100449677B1 - Il-6 활성 저해 물질 - Google Patents

Il-6 활성 저해 물질 Download PDF

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KR100449677B1
KR100449677B1 KR1019970708022A KR19970708022A KR100449677B1 KR 100449677 B1 KR100449677 B1 KR 100449677B1 KR 1019970708022 A KR1019970708022 A KR 1019970708022A KR 19970708022 A KR19970708022 A KR 19970708022A KR 100449677 B1 KR100449677 B1 KR 100449677B1
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apre
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오타비아노 세르루피-크레센지
아나리타 페조티
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어플라이드 리서치 시스템스
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Abstract

본 발명은 IL-6 활성을 저해할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 관계하고 치료에서의 이의 용도 및 이를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다. 특히,
i ) 일반 서열이 다음과 같은 APRE 원소인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로써
ZXMYKGKAA
이때, Z는 T 또는 G 를 나타내거나 없는 것일 수도 있고;
X는 T 또는 없는 것일 수도 있고;
M은 C 또는 A 이고, Y는 C 또는 T 이고, K는 T 또는 G 이다.
ii) 프로모터부위에 있는 APRE 원소이외의 전사 인자 결합 부위로 구성된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열이 i )의 것과 결합된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열에 관계한다.

Description

IL- 6 활성 저해물질
IL-6은 사이토킨 그룹에 속하는 단백질로써, 이는 유기체의 면역 반응 및 조혈작용의 자극에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다.
간 및 다른 표적 기관과 세포의 조혈과 임파계에서 IL-6의 많은 생물학적 기능이 발견되었다. 이들 기능중 일부는 유익하고, 반면 일부는 병인 상태와 유관한다. 후자의 기능 중에서, IL-6은 다중 골수종 세포에 대한 성장인자인 것으로 밝혀졌다; 항-IL-6 항체는 백혈병 환자에서 골수종 세포를 일시적으로 차단하는 것으로 밝혀졌다(Klein et al., Blood, 78,(5), pp1198-1204 and Lu et al., Eur. J. Immunol., 22, pp.2819-24, 1992).
상승된 IL-6 수준은 류머티스 관절염, 사구체신염, 건선 및 카스텔맨 질환과 같은 자가 면역 및 염증 질환과 상관한다(Graeve et al., Clin. Investig., 71, pp.664-71, 1993). IL-6은 또한 골 손실과 과칼슘혈증에서 직접적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Poli et al., Embo J., 13, (5) pp.1189-96 and Yoneda et al., Cancer Res., 53, pp.737-40, Feb.1993).
따라서, IL-6 활성의 저해물질 개발은 새로운 연구 목표가 되었다. 이를 위해 여러 가지 연구 방식이 개발되었는데, 여기에는 IL-6(Klein et al., above)에 대한 항체, gp130 또는 gp80의 이용; 가용성 gp130의 이용; 또는 IL-6 뮤테인이나 IL-6 수용체의 이용이 포함된다.
이와 같은 방식들은 임상적인 시도에서 특별한 부작용을 수반하기 때문에, IL-6 활성을 저해하는 추가적인 전략을 마련하는 것이 바람직하다.
따라서, 출원인은 IL-6 시그날을 중재하는 분자내 단백질을 차단함으로써 IL-6 활성을 저해하는 다른 방식을 연구하였다.
반응성 세포에서 IL-6 시그날의 전달은 상당히 연구되어 왔다. Fowlkes et al.(PNAS USA, 81, pp 2313-6, 1984)은 쥐 피브리노겐 유전자에 인접하는 IL-6에 특이적인 DNA 반응성 요소를 처음으로 의심하였다.
이후, Kunz et al(Nuc. Ac Res., 17(3), 1121-37, 1989)은 쥐 α2-마크로글로블린 유전자에서 IL-6에 반응하는 쥐 피브리노겐 유전자(CTGGGA)에서와 동일한 코어 서열을 갖는 반응성 요소를 보였다.
전술한 것과 연관된 서열을 가지는 DNA 반응성 요소는 사람 C 반응성 단백질(CRP)(Tonoatti et al., Mol.Biol. Med., 7, pp. 199-212, 1990), 사람 햅토글로빈(Oliviero et al., Embo J. 6, (7), pp 1905-12, 1987) 및 IL-6에 의해 유도되는 추가 급성 상 단백질을 코딩하는 유전자에서 정의되었고(Heinrich et al., Biochem. J., 265, pp. 621-36, 1990), 이로써 코어 공통 염기서열 CTGGGAW 또는 CTGGRAA로 정의되었다(이때, W는A 또는 T를 나타내고 R은 A 또는 G를 나타낸다).
Hocke et al.,(Mol. Cell. Biol., 12, (5), pp.2282-94, 1992)에서는 상기 전술한 코어 서열과 유사한 다중 연관된 코어 서열이 IL-6에 반응하는 야생형 조절 영역에 존재하고, 이와 같은 다중성이 리포터 유전자 검사로 기능적으로 분석하는 경우에 반응의 증폭을 유인한다고 시사하였다.
Wegenka et al.,(Mol. Cell. Biol., 13 (1), pp. 276-88, 1993)에서는 간암 세포에서 활성을 보이는 급성 상 반응 요소(APRE)인 코어 공통 염기서열의 확대된 버전을 최근에 나타내었는데, 이는 KTMYKGKAA로 나타내고, 여기서 M은 C 또는 A를 나타내고 K는 T 또는 G를 나타내고, Y는 C 또는 T를 나타낸다.
Yuan et al(Mol. Cell. Biol., 14(3), pp 1657-68, 1994)은 이와 같은 APRE-유사 염기 서열이 최근에 클론된 APRF라 불리는 약 90KD의 분자량을 가지는 단백질 전사 인자에 결합한다는 것을 보여주었다(Akira et al., Cell, 77 pp.63-71, 1994). 실제 APRE 서열에 활성화된 APRF의 결합은 IL-6-반응성 세포에서 IL-6-유도성 유전자(APRE의 서열 포함)의 활성화를 유도한다.
이 결과로 APRE 요소는 다음과 같은 방식으로 IL-6 반응성 세포에서 표적 유전자의 인헨서로써 APRE 요소를 이용할 수 있다; IL-6 반응성 세포에서 IL-6으로 치료를 하면 APRF 단백질이 합성이 되고 이는 APRE 요소에 결합되고 이와 같은 결합은 표적 유전자의 발현을 활성화시킨다.
Serlupi Crescenzi et al.,(Poster at the 12th European Immunol., Meeting, Barcelona, 14-17 June, 1994)은 APRE DNA 서열의 8회 반복서열(M8)이 HepG2 사람 간암 세포에서 IL-6에 의한 리포터 유전자의 50-100배 유도를 담당한다는 것을 보였다. 이와 같은 단일 전사 인자에 대하여 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 나타난다.
본 발명은 IL-6 활성을 저해할 수 있는 뉴클레오티드 서열 및 치료에서 이의 용도와 이를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다.
도 1은 플라스미드 pM8SV의 작제 전략을 도시한다. pM8SVL은 Sal I과 Hind III로 절단하고, 점착성 단부는 클리노우 반응으로 절두형 단부로 전환시킨다. 생성된 3.2kb DNA 단편은 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 자가-결찰시킨다. 따라서, 생성된 플라스미드 pM8SV는 M8 염기서열(약 170bp)과 SV40 바이러스 초기 프로모터(약 190bp)를 포함하나 루시페라제 유전자가 결핍된다.
도 2는 플라스미드 pM8SV의 BamH I-Hind III 저해물질 DNA 단편의 염기서열을 도시한다. 도시된 뉴클레오티드 서열의 위쪽 연속선은 M8 염기서열을 나타낸다. 뉴클레오티드 서열의 아래쪽 굵은 연속선은 SV40 프로모터 염기서열을 나타낸다.BamH I과 Hind III 제한효소부위 또한 표시한다.
도 3은 T47D와 M1 세포에서 IL-6 리포터 유전자 검사를 나타낸다. 상이한 M8을 포함하는 플라스미드의 테스트. 기록된 광 방출 값은 형질감염된 세포로부터 얻은 30초간 통합된 cps 이중 값의 평균을 나타낸다(AUC=Area Under the Curve) 각 막대는 3회 형질감염의 평균 ±SEM을 나타낸다.
도 4는 IL-6으로 처리한 후에 형질감염된 HepG2 세포의 루시페라제 유도성을 시간별로 나타낸 것이다. 플라스미드 pM8SVL은 양성 리포터 유전자 플라스미드로 이용되었다. 각 막대는 2회 형질감염의 평균 ±SEM을 나타낸다. 2가지 실험은 도면에 나타낸다.
도 5는 IL-6에 대한 HepG2 리포터 유전자 검사를 나타낸다. 리포터 유전자 플라스미드인 pM8SVL에 대한 저해 플라스미드로서 pM8의 테스트. 각 막대는 3회 형질감염의 평균 ±SEM을 나타낸다. 4가지 실험은 도면에 나타낸다.
도 6은 IL-6에 대한 HepG2 리포터 유전자 검사를 나타낸다. 리포터 유전자 플라스미드인 pM8SVL에 대한 저해 플라스미드로서 pM8SV의 테스트. 각 막대는 3회 형질감염의 평균 ±SEM을 나타낸다. 결과는 저해 플라스미드 없이 운반체 플라스미드 pC로 형질감염된 HepG2세포와 비교하여 저해 %로 나타낸다.
도 7은 IL-6에 대한 HepG2 리포터 유전자 검사를 나타낸다. pM8SVL 리포터 유전자 플라스미드에 대한 저해 플라스미드로서 pSV와 pM8SV의 테스트. 각 막대는 3회 형질감염의 평균 ±SEM을 나타낸다. 결과는 저해 플라스미드없이 운반체 플라스미드 pC로 형질감염된 HepG2세포와 비교하여 저해 %로 나타낸다.
도 8은 사람 햅토글로빈 유전자 프로모터로부터 IL-6 유도성 조절 서열의 제어하에 루시페라제 유전자에 기초한 HepG2리포터 유전자 검사에서 저해 플라스미드 pM8과 pM8SV에 의한 IL-6 활성의 저해 테스트를 나타낸다. 각 막대는 3회 형질감염의 평균 ±SEM을 나타낸다. 결과는 저해 플라스미드 없이 운반체 플라스미드 pC로 형질감염된 HepG2세포와 비교하여 저해 %로 나타내었다. 형질감염은 0.1㎍ 리포터 플라스미드 DNA 및 도시된 과량의 저해 플라스미드로 실시하였다. 운반체 플라스미드로 형질감염된 DNA의 총 함량은 일정하였다. 형질감염된 세포는 IL-6 1ng/㎖으로 18시간동안 처리하였다.
본 발명의 주요 목적은 IL-6 활성을 저해할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것인데, 이는 다음과 같이 구성된다.
(i) 서열 ZYMYKGKAA로 구성되는 APRE 요소인 하나이상의 뉴클레오티드 서열, 여기서, Z는 T 또는 G를 나타내거나 또는 없을 수 있고;
X는 T 또는 없을 수 있고;
M은 C 또는 A이고, Y는 C 또는 T이고, K는 T 또는 G이다;
(ii) APRE 요소를 제외하고 전사 활성 결합부위를 구성하는 하나이상의 뉴클레오티드 서열.
이들 후자 뉴클레오티드 서열에는 TATA 박스 및 AP-1(Riabowol et al., PNAS USA, 89, pp 157-61, 1992), AP-2, HNF-1(Clusel et al., Nuc. Ac. Res., 21(15), pp 3405-11), Sp-1(Wu et al., Gene, 89, pp.203-9, 1990), NF-KB(Bielinska et al., Science, 250, pp. 997-1000, 1990), Oct-1, E-2 및 SRF 전사 인자와 같은 전사 인자 결합 부위가 포함된다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 상기 APRE 요소 (i)와 뉴클레오티드 서열(ii)은 각각 적어도 2회, 바람직하게는 3 내지 10회, 가장 바람직하게는 8회 반복된다.
본 발명의 적절한 구체예에서는 요소(i)는 적어도 2개의 상이한 APRE 요소로 구성되고, 뉴클레오티드 서열(ii)은 APRE 요소를 제외하고 전사 인자 결합 부위를구성하는 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열로 구성된다.
뉴클레오티드 서열(ii)은 적절하게는 SV40 초기 프로모터이다.
APRE 요소(i)는 다음의 뉴클레오티드 서열: TTCTGGGAA로 구성된다.
도 2 에서는 적절한 구체예에 따라 본 발명의 영역에 속하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이와 같은 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No:1로 보고되고, 본 발명의 한 요부를 구성한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 제시하는 것이다.
본 발명의 또 다른 특징은 IL-6이 병인적 역할을 하는 질환에서 IL-6의 작용을 저해하는 치료요법적인 도구로서 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 용도를 제시하는 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 이와 같은 조성물은 경구용, 직장용, 정맥용 또는 국소용으로 조제될 수 있다. 본 발명의 조제물에는 바이러스 중재된 유전자 전달, 리포좀 조성물, 수용체-중재된 DNA 전달 또는 본 발명에 따른 아령 구조의 활성 뉴클레오티드 저해성 서열 등을 임의 병용하는 것이 포함된다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열의 저해 활성은 리포터 유전자 검사로 확인할 수 있다.
본 발명의 리포터 유전자 검사는 IL-6 반응성 세포에서 임의 유전자의 인헨서로 기능하는 APRE 요소의 능력에 기초한다(전술한 것과 같음). 이런 경우에,APRE 요소는 IL-6 반응성 세포(예, HepG2와 같은 간세포)에서 표적 리포터 유전자(예, 루시페라제 유전자)의 인헨서로 이용된다. 이후, 세포는 IL-6으로 처리한다; 생산된 충분한 양의 APRF 단백질이 본 발명에 따른 과량의 뉴클레오티드 서열에 의해 포획되는 경우에 표적 유전자는 활성을 상실하게 된다.
이와 같은 검사에 따라, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 저해 플라스미드를 만든다. 이와 같은 플라스미드의 예는 작제 전략과 함께 도 1에 제시한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이런 플라스미드는 본 발명의 다른 구체예를 구성한다.
본 발명은 다음의 실시예로 설명하나, 이는 본 발명을 한정하지 않는다. 실시예는 하기에 명시된 도면을 참고로 한다.
실시예 1: 플라스미드 작제
IL-6-반응성 루시퍼라제 리포터 유전자 플라스미드는 화학적 합성을 통하여, 5' 평활 단부에 절단되지 않은 BamHI 부위를 갖는 38bp의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열 및 3'단부에 Bgl II와 BamH I 부위와 양립할 수 있는 4개 뉴클레오티드 서열로 구성되는 돌출된 하부 가닥을 만듦으로써 작제하였다. 이와 같은 합성된 올리고뉴클레오티드 서열은 M2라고 하는데, 이는 쥐 α2-마크로글로블린 유전자 프로모터 영역으로 두 개의 동일한 APRE 서열을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 서열(상측 가닥, 5'-3')은 다음과 같다:
Figure pct00001
이런 올리고뉴클레오티드 서열은 플라스미드 pGL2-pv(Promega Corporation)의 Sma I-Bgl II 부위에 클론시켰는데, 여기서 루시페라제 리포터 유전자의 발현은SV40 바이러스 초기 프로모터에 의해 구동되고 따라서 자가-결찰 이후에 플라스미드pM2SVL가 만들어진다.
합성된 올리고뉴클레오티드 서열은 5' 평활 단부를 통하여, 동일한 플라스미드 pGL2-pv의 Sma I 부위에 결찰시키고, 이후 생성된 선형 결찰 생성물은 Hind III로 절단한다. 생성된 선형 벡터는 다음과 같은 DNA 단편을 클론시키기 위한 수용 물질로 사용한다: 1) 플라스미드 pM2SVL로부터 238bp BamH I-Hind III 단편, 따라서 자가-결찰 이후에 플라스미드 pM4SVL가 만들어진다; 2) 플라스미드 pM4SVL로부터 280bp BamH I-Hind III 단편, 따라서 자가-결찰 이후에 플라스미드 pM6SVL이 만들어진다; 3) 플라스미드 pM6SVL로부터 322bp BamH I-Hind III 단편, 따라서 자가-결찰 이후에 플라스미드 pM8SVL이 만들어진다.
플라스미드 pM8L은 pM8SVL을 Sfan I로 절단시키고 Kleenow 효소를 이용하여 필-인 반응에 의해 점착성 단부를 절두형 단부로 전환시킨다. BamH I으로 절단한 이후, 163bp의 생성된 M8 DNA 단편은 16bp BamH I-Kpn I 합성 어뎁터와 결찰시키고 pGL2-b 벡터(Promega Corporation)의 Sma I + Kpn I 절단에 의해 생성된 5.6Kb DNA 단편에 클론시킨다. 플라스미드 pGL-2b는 pGL2-b에서 SV40 프로모터 서열이 없는 것을 빼고는 전술한 pGL2-pv 플라스미드와 동일하다. 16bp 어뎁터에는 다중 클로닝 부위이 포함되는데, 이는 다음의 염기서열을 이용한 화학적 합성으로 만들 수 있다; 상부 가닥-서열: 5'CGCGGCCGCCTCGAGG3'(SEQ ID NO: 3);
하부 가닥-서열: 5'GATCCCTCGAGGCGGCCGCGGTAC3;(SEQ ID NO: 4).
상기 작제로부터 생성된 플라스미드는 pM8L인데, 이는 프로모터 없는 M8 DNA서열을 보유하고 루시페라제 유전자의 상류에서 다중 클로닝 부위에 삽입된다.
루시페라제 리포터 유전자 플라스미드 pM8TKL은 플라스미드 pGEM-TK-CAT(Cohen et al., EMBO J., 7(5), pp.1411-9, 1988에 상술됨)를 Xba I와 Bgl II로 절단하여 만든다. 바이러스 HSV 티미딘 카이나제 유전자의 TK 프로모터 서열을 포함하는 생성된 181bp 단편은 M8과 루시페라제 DNA 서열사이에서, pM8L 벡터의 5.8Kb Nhe I-Bgl II 단편과 결찰시킨다.
루시페라제 리포터 유전자 플라스미드 pHPSVL은 사람 게놈 DNA로부터 햅토글로빈 유전자 프로모터 영역에서 841bp PCR 증폭으로 작제하였다. 증폭된 PCR 단편의 3'단부는 사람 햅토글로빈 유전자의 전사 시작으로부터 -36위치에 상응한다(Maeda et al., J. Biol. Chem., 260(110, pp.6698-709, June 10, 1985). 이와 같은 PCR 생성물은 각각 Mlu I와 Bgl II 제한효소부위를 가지는 상측(서열 5)과 하측 프라이머(서열 6)로 만든다. 햅토글로빈 프로모터 영역의 게놈 증폭을 위하여 합성된 DNA 프라이머는 다음과 같다;
상측 프라이머: 5'CTACGCGTGCAGTATTGACCCTTCCTCCT3'(SEQ ID NO: 5)
하측 프라이머: 5'CGCAGATCTAGCTCACTTCTCCCCCTTC3'(SEQ ID NO: 6).
이렇게 수득된 PCR 단편은 SV40 초기 프로모터의 상류에서 전술한 루시페라제 리포터 유전자 플라스미드 pGL2-pv의 Mlu I와 Bgl II 부위에 삽입된다. 생성된 플라스미드는 pHPSVL이다.
저해 플라스미드 pM8을 작제하기 위하여, 상기 플라스미드 pM8L은 Sal I 와 Bgl II로 절단하고, 생성된 점착성 단부는 Kleenow 반응으로 절두형 단부로 전환시킨다. 루시페라제 유전자 서열이 결핍된 3.1kb 생성 단편은 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고 이후 자가-결찰시켜, 저해 플라스미드 pM8을 만든다.
저해 플라스미드 pM8SV는 도 1에 나타낸 바와 같이 만든다. pM8SVL는 Sal I 와 Hind III로 절단하고 점착성 단부는 Kleenow 반응으로 절두형 단부로 전환시킨다. 생성된 3.2kb DNA 단편은 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고, 이후 자가-결찰시킨다. 이렇게 만들어진 플라스미드 PM8SV는 M8 서열(약 170bp)과 SV40 바이러스 초기 프로모터로부터의 서열(약 190bp)을 포함하고 루시페라제 유전자가 결핍된다.
저해 플라스미드 pSV는 상기 pGL2-pv로부터 루시페라제 유전자를 포함하는 단편을 Sal I와 Hind III로 절단하여 작제하였다. 생성된 3.1kb 단편은 Kleenow 효소로 필-인 반응을 시키고 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하며 자가-결찰시켜, SV40 바이러스 초기 프로모터를 포함하나 루시페라제 유전자가 결핍된 플라스미드 pSV를 얻는다.
운반체 플라스미드 pC는 상기 플라스미드 pGL2-b를 Sal I와 Hind III 제한효소로 절단하여 만든다. 생성된 2.9kb 단편은 Kleenow 효소로 필-인 반응을 시키고 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하며 자가-연결시켜, SV40 바이러스 초기 프로모터를 포함하나 루시페라제 유전자가 결핍된 플라스미드 pC를 얻는다.
전술한 모든 플라스미드 구조체는 표준 기술로 대장균 XL1-블루로 형질 전환시키는데 이용하였다(Ausubel R et al.,Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). 플라스미드 DNA는 소량으로 준비한 알칼리 용해 방법으로, 형질 전환된 클론으로부터 추출하였다(Ausubel). 플라스미드 DNA는 제한효소분석과 아가로즈 겔 전기영동으로 제어할 수 있다. 예상된 패턴의 클론을 선별한다. 포유류 세포의 형질감염에 사용하기 위한 정제된 플라스미드 준비물을 수득하기 위하여, 선별된 대장균 XL1-블루 형질 감염체의 300㎖ 배양액을 준비한다. 이후, 플라스미드는 제조업자의 지시에 따라 QIAGEN tip 500 이온-교환 미니칼럼으로 정제한다.
실시예 2: 세포주와 배양 조건
HepG2 사람 간암 세포(ATCC)는 10% FCS, 5mM L-글루타민, 20mM HEPES, 100U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 MEM에 배양시켰다. T47D 사람 유방암 육종 세포(ATCC)는 10% FCS, 5mM L-글루타민, 20mM HEPES, 100U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM에 배양시켰다. M1 생쥐 골수성 백혈병 세포(ATCC)는 10% FCS, 5mM L-글루타민, 20mM HEPES, 100U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI에 배양시켰다. 상기 세포주의 배양은 하기에서 명시하는 적량의 IL-6(Interpharm Laboratories에서 CHO-유도된 hIL-6)의 존부하에 실행한다.
실시예 3: 일시적인 형질감염 및 루시페라제와 β-갈락토시다제 분석
표준과정에 따라 HepG2 사람 간암 세포와 T47D 사람 유방암 육종 세포의 일시적인 형질감염은 Hepes 완충액에서 인산칼슘-DNA 침전법으로 실시하였다(Ausubel R. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience, New York). 생쥐 M1 골수성 백혈병 세포의 일시적인 형질감염은 표준과정(Ausubel)에 따라 DEAE-덱스트란을 이용하여 실시하였다.
루시페라제와 β-갈락토시다제 활성을 감지하기 위하여, 세포는 1㎖/세포 106의 추출 완충액(25mM TRIS-인산염 pH 7.8, 2mM DTT, 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100)으로 실온에서 15분간 배양하여 in situ 추출하였다. 루시페라제 활성의 경우에, 20㎕ 세포 추출액은 루시페라제 검사 완충액(20mM 트리신, 1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2-5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1mM EDTA, 33.3 mM DTT, 0.27mM 공효소, 0.47mM 루시페린, 0.53mM ATP)으로 직접 검사한다. β-갈락토시다제 활성의 경우에, 10㎕ 세포 추출액은 100㎕ Lumigal 기질(Lumigen)과 함께 1 시간동안 37℃에서 배양시킨다. Lumigal과 루시페라제 판독은 BertholdAutolumat LB953 루미노미터를 이용하여 실시하고, 결과는 루시페라제의 경우에는 30초간, β-갈락토시다제의 경우에는 15초간 통합된 cps(count per seconds)이다.
리포터 플라스미드 pM8SVL은 HepG2 세포의 일시적인 형질감염 이후에, 루시페라제 활성의 발현을 50-100배 증가시킴으로써 IL-6 반응성을 제공하는 것으로 밝혀졌다(Serlupi Crescenzi et al., Poster at the 12th European Immunol.,Meeting, Barcelona, 14-17 June, 1994).
T47D 사람 유방암 육종 세포와 생쥐 M1 골수성 백혈병 세포에서 이 플라스미드를 테스트하였다. M1 세포는 DEAE/덱스트란을 이용하여 0.5㎍ DNA/106세포로 형질감염시키고, 2.5㎍ DNA/105세포는 T47D 세포의 인산 칼슘 형질감염에 이용된다.
이들 두 세포주는 사람 IL-6에 대한 통상적인 반응을 제외하고는 매우 제한된 특징만을 공유한다. 결과(도 3)에서는 pM8SVL 플라스미드에서 M8 DNA 분자가 IL-6 처리 후에 이들 두 세포주에서 상당히 활성이 보인다는 것을 나타낸다. 도 3에 도시한 바와 같이, IL-6에 대한 현저한 반응은 리포터 유전자 플라스미드 pM8TKL을 보유하는 M1 세포에서도 관찰되는데, 여기서 M8 분자는 pM8SVL에 존재하는 SV40 프로모터와는 상이한 티미딘 카이나제 프로모터에 접한다.
IL-6 처리(1ng/㎖)이후에 형질감염된 HepG2 세포에서 루시페라제 유도성의 시간별 과정을 테스트하였다. 플라스미드 pM8SVL은 양성 리포터 유전자 플라스미드(0.2 ㎍/105세포)로 사용되었다. 세포는 하룻밤동안 형질감염시키고 분할시키며 IL-6 처리에 노출시킨다. 결과는 도 4에 나타내는데, 이들 결과는 IL-6 처리이후 두 시간만에 IL-6에 대한 거의 완전한 반응을 달성될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4: 저해 플라스미드 pM8의 테스트
M8 DNA 분자에 의한 IL-6 활성의 저해는 i) IL-6에 반응하는 pM8SVL 리포터 유전자 플라스미드와 ii) pM8 저해 플라스미드에 삽입된 M8 분자를 HepG2에 공동-형질감염시킨 이후에 측정하였다. 후자 플라스미드는 M8 염기서열을 포함하지만 IL-6에 대한 반응성을 제공하는 능력이 없다. HepG2 세포는 다양한 농도의 IL-6 존재하에 최대 2.5㎍/105세포의 IL-6-반응성 리포터 플라스미드 pM8SVL(M8과 루시페라제 유전자를 포함) 및 10 또는 50배 과몰량의 pM8로 형질감염시킨다. 형질감염당 DNA 총 함량은 운반체 플라스미드 pC을 이용하는 경우에 일정하게 유지된다. 상기pC는 pM8과 동일하지만, 전자 플라스미드에서 특이적인 165bp-길이 M8 DNA 단편이 없다는 점은 예외로 한다.
도 5에 도시한 바와 같이, 저해 플라스미드는 50배 과몰량의 pM8 저해 플라스미드에서도 네 가지 실험동안 IL-6 활성의 현저하고 재현가능한 특이적 저해를 나타내지 않았다. 이들 실험에서 IL-6-반응성 리포터 유전자 플라스미드 pM8SVL는 0.1㎍/105세포 농도로 사용되었고, 형질감염에 사용된 전체 DNA의 일정한 함량은 5㎍/105세포이다. 이들 실험에서 사용된 최적이하 적량은 1ng/㎖이다. 도 5에 도시한 바와 같이, 별도의 형질감염이 다양성의 불가결한 원인이라는 점에서, 이와 같은 실험조건에서 다양성은 수용가능하다.
실시예 5: 저해 플라스미드 pM8SV의 테스트
도 5에 보고된 결과는 다소 놀라운 것인데, 그 이유는 저해 플라스미드 pM8의 활성 M8 저해물질 DNA 염기서열이 pM8SVL 리포터 유전자 플라스미드의 활성 염기서열과 동일하기 때문이다. 따라서, 공동-형질감염이후에 상이한 플라스미드에 존재하는 이들 두 개의 동일한 M8 서열간 경쟁이 예상되는데, 이는 리포터 유전자 검사에서 IL-6 활성의 저해를 결과하였다.
또한, 전술한 결과는 M8 저해 DNA 분자에 의해 충분히 중화되지 않은 과량의 활성화된 IL-6 특이적 전사 인자의 존재에 의해 설명되지 않는데, 그 이유는 이와 같은 데이터가 제한된 양의 IL-6 존재하에서 수득되었기 때문이다. 또한, 공지의 전사인자(26-30)에 대한 DNA 결합 부위에 실시한 유사한 실험에서 공개된 데이터는도 5에서의 보고된 결과와 일치하지 않는다.
도 5에서 도시한 결과의 대안적 설명은 리포터 유전자 플라스미드에서 M8이외의 염기서열이 IL-6-특이적인 시그날 전달에 기여할 수 있다는 것이다. 이들 서열은 pM8 저해 플라스미드에서 상실되어야하지만, 양성 리포터 유전자 플라스미드 pM8SVL(예, 일반적인 전사인자에 결합할 수 있는 SV40 초기 유전자 프로모터의 서열)에는 존재해야 한다. 따라서, 저해 플라스미드 pM8은 리포터 유전자 플라스미드 pM8SVL와의 경쟁에서 효과적이지 못하다.
이와 같은 가설을 검증하기 위하여, IL-6-저해물질 DNA 서열로서 M8 서열 및 SV40 프로모터 서열을 포함하는 저해 플라스미드(pM8SV)를 작제하였다(도 1 참조). 이와 같은 저해 플라스미드는 HepG2 세포로 IL-6 리포터 유전자 검사에서 테스트하였다. 네 가지 독립적인 실험을 실시하였는데, 각 실험마다 이중 형질감염을 실시하였다. 형질감염은 도 6에서 도시된 0.1㎍ 리포터 플라스미드 DNA와 과몰량의 저해 플라스미드로 실시한다. 형질감염된 DNA의 총 함량은 운반체 플라스미드의 경우에 일정하게 유지된다. 형질감염된 세포는 IL-6 1ng/㎖으로 18시간동안 처리한다.
도 6에 도시된 결과에서는 pM8SV 저해 플라스미드에 의해 IL-6의 활성이 분명하게 약량 의존성으로 저해된다는 것을 보여준다. 도 6의 데이터는 표 1에서 제시한다. 각 실험동안 저해 플라스미드 약량당 삼중 형질감염을 실시한다. 각 실험에서, 단일 열에 도시된 유도된 값과 유도되지 않은 값은 동일 형질감염으로부터 유래한다. 제시된 광 방출 값은 30초간 통합된 cps이다. 표1에서 볼 수 있는 바와 같이, 이들 실험동안 특히 낮은 농도의 저해 플라스미드의 경우에 약간의 다양성이관찰되지만, 일반적으로 반복 형질감염의 CV는 20% 이하이다.
pM8SV 저해 플라스미드에 의해 제공되는 IL-6 활성의 저해가 M8과 SV40 서열의 조합이 아닌 SV40 프로모터 DNA 서열에만 기인하는 것을 배제하기 위하여, 추가로 저해 플라스미드를 작제하고 리포터 유전자 검사에서 테스트한다. 상기 플라스미드는 M8 저해 염기서열과 루시페라제 유전자 없이, IL-6 활성 저해물질로서 SV40 DNA 서열만을 포함한다.
형질감염은 도 7에서 도시된 0.1㎍ 리포터 플라스미드 DNA와 과몰량의 저해 플라스미드로 실행하였다. 형질감염된 DNA의 총 함량은 운반체 플라스미드의 경우에 일정하게 유지된다. 형질감염된 세포는 IL-6 1ng/㎖으로 18시간동안 처리하였다. 도 7에서 보고된 결과는 저해 플라스미드(pSV)가 부분적으로 IL-6 활성을 저해한다는 것을 입증하는데, 이런 저해 활성은 결코 40% 이상을 넘지 못하고 약량 의존성도 아니다. 여기에서 SV40 DNA 염기서열 단독으로는 IL-6 활성을 효과적으로 저해하는데 충분하지 않다는 것을 결론내릴 수 있다. 다른 한편, 루시페라제-포함 리포터 플라스미드 pGL2-pv는 SV40 프로모터 염기서열을 포함하지만 M8 염기 서열은 포함하지 않고, 따라서 IL-6에 의해 추가로 유도되지 않는 기본적인 루시페라제 발현수준만을 보인다. 이와 같은 플라스미드에서 기본적인 루시페라제 발현 수준은 pM8SV 저해 플라스미드에 의해 저해되지 않고, 따라서 pGL2-pv의 SV40 프로모터 부분에만 특이적으로 결합하는 전사 인자가 pM8SV 플라스미드에 의해 효과적으로 제거되지 않는다는 것을 입증한다. 실제로, 후자 저해 플라스미드가 존재하는 경우에 리포터 플라스미드 pGL2-pv로부터 루시페라제 활성은 저해 플라스미드가 없는 경우보다 훨씬 더 높다(나타내지 않음).
실시예 6: 리포터 유전자 플라스미드 pHPSVL에 의해 제공되는 IL-6 활성의 pM8SV에 의한 저해
IL-6에 대한 추가 리포터 유전자 검사에서 저해 플라스미드 pM8SV를 테스트하였는데, 여기서 리포터 유전자 플라스미드에서 IL-6 시그날을 중개하는 표적 DNA 염기서열은 M8 저해 염기서열과 완벽하게 일치하지는 않았다. 따라서, HepG2세포는 SV40 프로모터와 루시페라제 유전자에 접하는 사람 햅토글로빈 유전자의 프로모터 염기서열로부터 841 염기쌍을 포함하는 플라스미드 pHPSVL로 형질감염시켰다. 이 플라스미드에는 햅토글로빈 프로모터 서열로부터 하나의 APRE 부위가 존재한다(Maeda et al., J. Biol. Chem. 260(11), pp 6698-709, June 10, 1985). 앞서 살펴본 바와 같이, 이 플라스미드는 루시페라제 발현의 6-8배 증가로 IL-6에 반응한다(Serlupi Crescenzi et al., Poster at the12th European Immunol., Meeting, Barcelona, 14-17 June, 1994).
도 8에서는 삼중 형질감염으로부터의 실험 결과를 나타낸다. 50배 초과물량의 운반체 플라스미드와 리포터 유전자 플라스미드 pHPSVL의 공동-형질감염이후에 IL-6에 의한 유도성은 기본 수준과 비교하여 4배 더 높은 루시페라제 발현을 결과하였다. 반대로 50배 초과몰량의 저해 플라스미드 pM8SV로 공동 형질감염시키면 IL-6에 의한 유도성이 완전히 제거된다. 따라서 pM8SV 저해 플라스미드는 pM8SV와는 다른 IL-6-반응성 리포터 유전자 플라스미드(예, 리포터 플라스미드 pHPSVL)를 테스트하는 경우에도 IL-6 활성을 저해할 수 있다.
실시예 7: T47D 세포에서 저해 플라스미드 pM8SV의 테스트
T47D 사람 유방암 육종 세포를 이용하여 pM8SVL 리포터 유전자 검사에서 pM8SV 저해 플라스미드을 테스트하였는데, 여기서 IL-6 시그널의 전달은 간암 세포에서와 상이하였다. 전술한 것과 같이, pM8SVL 리포터 유전자 플라스미드를 이용한 IL-6 리포터 유전자 검사는 최적은 아니지만 상기 세포주에 사용할 수 있다. 검사의 감도는 T47D세포에서 다소 낮기 때문에, 형질감염은 상대적으로 높은 플라스미드 DNA 수준인 1㎍ 양성 리포터 유전자 플라스미드/105세포로 실행하였다. 따라서, 과량의 운반체 또는 저해 플라스미드가 존재하는 경우에 비-특이적인 저해가 관찰되고, 이는 IL-6 특이적인 저해의 다양성이 더 크게 된다.
결과는 표 2에 제시한다. 두 가지 실험으로부터 이중 형질감염의 표준편차와 평균(AVG)을 나타낸다.
각 형질감염의 기본값으로부터 폴드(fold) 유도의 평균값을 계산한다. 각각 실험 1과 2에서 105형질감염된 세포당 1과 0.5㎍ 리포터 유전자가 이용하였다.
이들 실험에서 운반체 플라스미드와 저해 플라스미드의 개별 형질감염을 실행하였는데, 이들 두 플라스미드는 리포터 플라스미드와 비교하여 지정된 과몰량으로 이용하였다.
형질감염이후에 세포는 IL-6 1ng/㎖로 18시간동안 유도하였다. 광 방출 값은 30초간 통합된 cps이다. 이 실험에서 IL-6 특이적 저해는 과량의 저해 플라스미드 존재하에 수득된 유도와 상응하는 함량의 운반체 플라스미드 존재하에 수득된 유도를 비교하여 평가하였다.
또한, 비-특이적 저해로 인하여 루시페라제 발현의 기저 수준은 검사의 정량 한계에 근접한다. 표 2에 보고된 결과에서 삼중 형질감염이후에, IL-6 활성의 관련된 특이적인 저해가 20배 과몰량의 저해 플라스미드 pM8SV에서 수득되지만 약 10배 과몰량에서는 수득되지 않는다는 것을 알 수 있다. 50배 과몰량의 저해 플라스미드는 본 실험에서 테스트하지 않았는데, 그 이유는 비-특이적인 저해가 너무 많이 발생하기 때문이다.
이와 같은 결과는 0.5 ㎍ DNA/105세포를 이용한 추가 실험에서 재현되지 않는다(표 2, 실험 2). 이와 같은 재현성 부족은 T47D 리포터 유전자 검사의 상대적으로 높은 다양성과 낮은 감응성 때문이다. 대안으로, 차등적인 표적 세포 선택성으로 이와 같은 결과를 설명할 수 있다.
실시예 8: 최소 DNA 저해 서열의 정의
IL-6 유도성과 연관된 전사 인자의 결합을 저해하는 능력을 보유하는 최소 DNA 염기서열을 동정하기 위하여, 일렉트로포레틱 이동성 변환 검사(EMSA)를 실험적으로 사용하였다. 이런 최소 염기서열에 의해 부여되는 기능적인 저해에 대한 테스트는 실시예 3 및 다음의 실시예에 언급된 리포터 유전자 검사를 이용하도록 설정할 수 있다. 리포터 유전자 검사에서 IL-6 활성을 기능적으로 저해하는 것으로 밝혀진 최소 DNA 염기서열은 저해 플라스미드 pM8SV의 350bp BamH I-Hind III 단편인데, 이는 APRE DNA 염기서열의 8개 반복 및 SV40 초기 프로모터 염기서열을 포함한다. 이 후자 서열은 AP-1 유사 부위(Zenke et al., EMBO J., 5(2), pp.387-97, 1986)와 같은 일반적인 전사 인자에 대한 결합부위 및 Sp-1 부위(Dyne et al.,Cell, 35, pp.79-87, 1983)의 6개 반복을 포함하는 것으로 공지되어 있다. BamH I-Hind III DNA 단편은 PCR 또는 뉴클레아제 처리(Ausubel에 따른)와 같은 통상적인 수단으로 5'단부 또는 3'단부를 결실시켜, 두 개의 APRE 염기서열 및 SV40 초기 프로모터로부터 특이적인 전사 인자에 대한 한 개의 또는 수 개의 결합 부위를 포함하도록 한다. 생성된 DNA 염기서열은 HepG2 세포에서 pSVM8L-기초한 리포터 유전자 검사의 저해 검사에 이용할 수 있다.
또한, IL-6 시그날을 기능적으로 저해하는 완전한 능력을 보유하고 있는 최소 DNA 단편은 단부-라벨링 또는 Kleenow 반응과 같은 통상적인 수단으로,32P뉴클레오티드로 DNA에 라벨링시켜 EMSA에 이용할 수 있다. 이와 같은 라벨된 DNA 단편은 IL-6 처리이후에 HepG2 세포로부터 핵 추출물과 함께 배양할 수 있다.
BamH I-Hind III 저해 DNA단편으로부터 전술한 결실로 인하여 생성된 라벨안된 임의의 DNA 단편과 같은 경쟁 DNA 서열의 양을 증가시키면서 공동-배양할 수 있다. 배양이후에, 혼합물은 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한다. 라벨된 테스트 DAN 단편에 대한 관련된 전사 인자의 결합은 결합되지 않은 라벨된 DNA에서 예상되는 겔 이동성의 변화(지체)로 확인된다. 경쟁물질인 라벨되지 않은 DNA 염기서열의 존재하에 이런 결합의 저해는 옮겨간 겔 밴드의 특이적인 소멸로 확인된다.
[표 1]
IL-6에 대한 HepG2 리포터 유전자 검사. pM8SVL 리포터 유전자 플라스미드에 대한 pM8SV 저해 플라스미드의 테스트.
Figure pct00002
[표 2]
IL-6에 대한 T47D 리포터 유전자 검사
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008

Claims (11)

  1. IL-6 활성을 저해할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 있어서,
    서열은 i)APRE 부분과 ii) 전사 인자 결합 부분으로 구성되며,
    이때, APRE 요소는 서열 ZXMYKGKAA로 구성되며,
    여기서, Z는 T 또는 G를 나타내거나 또는 없을 수 있고;
    X는 T 또는 없을 수 있고;
    M은 C 또는 A이고; Y는 C 또는 T이고;
    K는 T 또는 G이 되는 것을 특징으로 하는 IL-6 활성을 저해할 수 있는 뉴클레오티드 서열.
  2. 제 1 항에 있어서, 서열 (i)은 TTCTGGGAA인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  3. 제 1 항에 있어서, APRE 요소(i)는 적어도 2회 반복되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  4. 제 3 항에 있어서, APRE 요소는 3 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  5. 제 4 항에 있어서, APRE 요소는 8회 반복되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  6. 제 1 항에 있어서, 서열 (i)은 적어도 두 개의 상이한 APRE 요소로 구성되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  7. 제 1 항에 있어서, 서열 (ii)은 전사 인자 결합부위를 구성하는 올리고뉴클레오티드 서열로 SV40 초기 프로모터로 구성되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  8. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:1에 제시된 서열인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  9. 제 1 항 내지 제8항중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터에 있어서, 벡터는 pM8SV이고 이의 제한효소 지도는 도 1에 제시된 것과 같은 것을 특징으로 하는 플라스미드 벡터.
  10. IL-6 활성을 저해 조절하여, 류마티스 관절염, 사구체신염, 건선 및 자가면역 질환을 경감시킬 수 있는 약학조성물에 있어서, 활성성분으로 제 1 항 내지 제8항중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 하나이상의 제약학적 수용가능한 담체 또는 부형제로 구성되고, 활성 성분은 IL-6 활성을 방해하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염, 사구체신염, 건선 및 자가면역 질환을 경감시킬 수 있는 약학 조성물.
  11. IL-6 활성을 저해 조절하여, 류마티스 관절염, 사구체신염, 건선 및 자가면역 질환을 경감시킬 수 있는 약학조성물에 있어서, 활성성분으로 제 9 항에 따른 플라스미드 벡터를 포함하고, 하나이상의 제약학적 수용가능한 담체 또는 부형제로 구성되고, 활성 성분은 IL-6 활성을 방해하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염, 사구체신염, 건선 및 자가면역 질환을 경감시킬 수 있는 약학 조성물.
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