KR100351534B1

KR100351534B1 - 헬리코박터감염의치료또는예방용항원제제

Info

Publication number: KR100351534B1
Application number: KR1019960704542A
Authority: KR
Inventors: 빈센트 도이지 크리스토퍼; 리 애드리언; 제인 벅 피오나; 알렉산더 퀸 찰스; 조지 바 이언; 존 클레이닉 마이클; 피트르자이코프스키 엘리자베스
Original assignee: 시에스엘 리미티드; 더 유니버시티 오브 뉴 사우스 웨일즈
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2003-03-15
Also published as: AU693864B2; WO1995022563A1; HK1004677A1; EP0804489A1; DE69527986D1; NZ281146A; JPH10500102A; NZ329879A; AUPM399594A0; CA2182274A1; ATE222930T1; DE69527986T2; US6663873B2; EP0804489A4; KR970701209A; US20020122794A1; CA2182274C; EP0804489B1; AU1801195A

Abstract

본 발명은 헬리코박터(Helicobacter) 박테리아의 지다당류(LPS), 특히 헬리코박터 필로리(H. pylori) 또는 헬리코박터 펠리스(H felis)의 LPS, 또는 그 면역원성 단편을 포함하는, 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 항원제제에 관한 것이다.

Description

헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 항원 제제

헬리코박터 필로리는 아마도 전세계 인구의 절반의 위 내벽을 감염시키는 박테리아이다. 이 박테리아에 의한 감염은 보통 만성적이며, 위점막의 계속적인 염증을 초래한다. 이 감염은 종종 증상을 나타내지 않는다. 그리나, 기타 보조인자와 연계하여, 감염된 시람중 일부는 위 또는 십이지장의 소화성 궤양, 위의 선암 및 임파종을 포함한 속발증(續發症)이 계속 진행된다. 소화성 궤양의 치료에 관한 연구로부터 헬리코박터 필로리 감염의 치료는 통상 만성적인 이 질병의 재발률을 급격히 감소시키는 것과 관련이 있음을 밝혀냈다. 헬리코박터 필로리에 의한 장기간 감염은 만성적인 위축성 위염을 진행시키는데, 위축성 위염은 위암 진행의 전단계의 병변인 것으로 오랫 동안 인식되어 왔다. 따라서, 다수의 연구는 현재 헬리코박터 필로리 감염을 위암 진행의 위험 증가와 관련시키고 있다. 그러므로 헬리코박터 필로리 감염의 치료 및 예방은 위 십이지장 질병에서 기인한 상당한 이환상태 및 치사상태를 예방하는 효력을 가진다.

헬리코박터 필로리 감염에 대한 새로운 요법 및 백신을 선별하는데에 사용하기 적합한 헬리코박터 필로리 감염에 관한 실험 동물 모델은 없다. 그러나, 위의 헬리코박터 감염에 관한 헬리코박터 펠리스(H. felis) 마우스 모델이 개발되었는데, 이 모델은 새로운 항미생물성 치료 양생법 및 예방접종 프로토콜을 선별하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다(참조 문헌: Lee등, 1990; Dick-Hegedus and Lee, 1991). 헬리코박터 펠리스는 헬리코박터 필로리와 친연성이 매우 큰 나선형 박테리아이다. 이 박테리아는 사람에서의 헬리코박터 필로리와 매우 유사한 방식으로 마우스의 위에서 전이증식한다. 즉, 주요 생태학적 니쉐(ecological niche)는 점액이며, 전이증식은 주로 유문동에서 확인된다. 미생물이 없는 마우스에서 헬리코박터 필로리 감염은 다형핵백혈구 침윤을 수반하는 단핵 세포의 만성적 염증과 함께, 사람의 헬리코박터 필로리 감염과 매우 유사한 위염을 유발한다. 이들중 어느 하나에 의한 감염은 헬리코박터 필로리 및 헬리코박터 펠리스 각각에 대해 유사하게 유발되는 전신성 체액 면역 반응을 야기한다(참조 문헌: Lee등, 1990).

헬리코박터 펠리스 마우스 모델은 사람에서의 항-헬리코박터 필로리의 효과를 매우 잘 예측하는 것으로 입증되었다. 따라서, 에리트로마이신과 같이 높은 생체외 활성을 가진 약제에 의한 단일요법은 에리트로마이신이 생체외에서의 높은 항미생물 효과에도 불구하고 사람에서는 항-헬리코박터 필로리 효과를 갖지 않는 것과 마찬가지로, 마우스에서 헬리코박터 펠리스에 대해 이렇다할 생체내 효과를 나타내지 못한다. 대조적으로, 비스무트 화합물, 메트로니다졸, 및 테트라사이클린 또는 아목시실린의 3중 요법은 헬리코박터 펠리스 감염 마우스에서 매우 높은 박멸률을 나타냈다(참조 문헌: Dick-Hegedus and Lee, 1991) 그러한 3중 요법은 가장 성공적인 사람의 항-헬리코박터 필로리 요법이며, 현재 항-헬리코박터 필로리 요법으로 1차적으로 선택하도록 권장되고 있다. 헬리코박터 펠리스 마우스 모델은 활동성 헬리코박터 펠리스 감염을 치료하고 헬리코박터 펠리스 감염에 대해 보호하기 위해 초음파처리된 세포와 콜레라 독소 보조제로 이루어진 헬리코박터 항원제제로 마우스를 경구적으로 면역화할 수 있음을 입증하는데에도 사용되었다(참조 문헌: 국제 특허 출원 PCT/AU94/00416 호, Czinn등, 1993). 그러나, 이들 제제내에서 보호성 항원(들)이 측정되지는 않았다.

본 발명에 이르른 연구 과정을 통해 헬리코박터 유기체의 보호성 항원이 동정되었는데, 이 항원은 헬리코박터 펠리스-감염된 마우스의 치료에 효과적인 단일클론 항체에 의해 인지되는 것이다.

본 발명은 항원 제제, 구체적으로 사람에서의 헬리코박터 감염, 특히 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염과 관련된 위십이지장 질병의 예방 및 치료에 상기 항원 제제를 사용하는 용도에 관한 것이다.

발명의 요약

일 양태로, 본 발명은 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항원 제제를 제공하는데, 이 제제는 헬리코박터 박테리아의 지다당류(LPS), 또는 그 면역원성 단편을 함유한다.

이 항원 제제는 적어도 부분적으로 정제된 LPS 제제를 함유하는 것이 바람직하다.

본원에서 사용되는 용어 "적어도 부분적으로 정제된"이란 LPS 함량이 헬리코박터 박테리아의 전체 세포 초음파처리물의 LPS 함량보다 더 커서 바람직하게는30%이상, 보다 바람직하게는 50% 이상 더 큰 제제를 의미한다. 이 제제는 LPS가 "거의 순수한" 제제, 즉 LPS 함량이 제제내 총 헬리코박터 항원의 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 제제인 것이 바람직하다.

본 발명은 그 범위가 헬리코박터 박테리아의 LPS를 함유하는 항원 제제 뿐만 아니라, 상기 지다당류의 면역원성 단편, 즉 포유류 숙주에서 특이적 보호성 면역 반응을 유도할 수 있는 LPS 단편을 함유하는 항원 제제에 미친다는 것을 이해하여야 한다. 상기 면역원성 단편은 헬리코박터-특이적 단일클론 항체, 특히 헬리코박터 감염과 관련하여 보호 효과 또는 치료 효과를 가지는 단일클론 항체에 의해 인지될 수도 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 포유류 숙주에서 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용의 백신 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 전술한 바와 같은 넓은 범위의 항원 제제의 면역학적 유효량을 1종 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제와 함께, 선택적으로 보조제와 함께 함유한다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 포유류 숙주에서 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 바와 같은 넓은 범위의 항원 제제의 면역학적 유효량을 선택적으로 보조제와 함께 상기 숙주에게 투여하는 단계를 포함한다.

관련된 양태로, 본 발명은 포유류 숙주에서 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 용도로, 전술한 바와 같은 넓은 범위의 항원 제제의 면역학적 유효량을 선택적으로 보조제와 함께 사용하는 용도를 제공한다.

또 다른 양태로, 본 발명은 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물의 제조에, 전술한 바와 같은 넓은 범위의 항원 제제를 선택적으로 보조제와 함께 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 항원 제제는 숙주에게 경구 투여하며 점액성 보조제와 함께 투여하는 것이 바람직하나, 반드시 그런 것은 아니다. 그러나, 본 발명은 그 범위가 상기 항원 제제의 비경구적 투여에도 미친다.

본 발명은 항체, 특히 전술한 넓은 범위의 항원 제제에 특이적인 단일클론 항체, 및 헬리코박터 펠리스 LPS 및 헬리코박터 필로리 LPS를 비롯한 헬리코박터 박테리아의 LPS에 특히 특이적인 단일클론 항체에도 미친다.

상기 양태에서, 본 발명은 포유류 숙주에서 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 항체, 특히 전술한 바와 같은 넓은 범위의 항원제제에 특이적인 단일클론 항체의 유효량을 투여하여 상기 숙주를 수동 면역(passive immunisation)시키는 단계를 포함한다.

본원에서 헬리코박터 감염의 치료와 관련하여 사용되는 "면역학적 유효량"이란 용어는 그 양을 1회 용량 또는 연속투여의 일부로서 개개의 감염된 숙주에게 투여하는 것이 헬리코박터 감염의 치료에 효과적임을 의미한다. 본원에서 헬리코박터 감염의 예방과 관련하여 사용되는 "면역학적 유효량"이란 용어는 그 양을 1회 용량 또는 연속투여의 일부로서 개개의 숙주에게 투여하는 것이 헬리코박터 감염의 지연, 억제 또는 예방에 효과적임을 의미한다. 상기 유효량은 치료할 개인의 건강 및 신체적 상태, 치료할 개인의 분류학적 군, 개인의 면역계가 항체를 합성하는 능력,목적하는 보호의 정도, 백신의 제형, 의학적 상황의 평가, 및 기타 관련 요소에 따라 달라진다. 그 양은 통상적인 시행을 통해 결정할 수 있는 비교적 넓은 범위를 가질 것으로 예상된다.

본 명세서 및 특허청구의 범위 전체에서 달리 언급하지 않으면 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 정수 또는 정수군을 포함하지만, 임의의 기타 정수 또는 정수군을 배제하지 않음을 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 항원 제제는 헬리코박터 필로리 및 헬리코박터 펠리스의 LPS 제제를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 항원 제제를 점액성 보조제를 포함하는 경구 투여용 백신 조성물에 사용하는 것도 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 양태에서는, 점액성 보조제와 함께 적어도 부분적으로 정제된 헬리코박터 필로리 LPS의 항원 제제를 함유하는 경구용 백신 조성물을 사람 숙주에서의 헬리코박터 필로리 감염의 치료 또는 예방에 사용한다.

선택적으로 그리고 바람직하게, 감염된 숙주에게 적어도 부분적으로 정제된 헬리코박터 LPS 제제와 함께 투여되는 점액성 보조제는 콜레라 독소가 바람직하다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 콜레라 독소 이외의 점액성 보조제로는 콜레라 독소의 비독성 유도체, 예를 들면, 콜레라 독소 아미노산 서열의 변형에 의해 생산되는 B 서브 유닛(CTB), 화학적으로 변형된 콜레라 독소 또는 관련 단백질이 있다. 이들은 헬리코박터 LPS 제제에 첨가하거나 함께 접합시킬 수 있다. 동일한 기술을 에스케리챠 콜리(Escherichia coli)의 열 불안정성 독소와 같이 점액성 보조제 성질 또는 송달 성질을 가진 기타 분자에 적용할 수 있다. 다음과 같은 점액성 보조제 활성 또는 송달 활성을 가긴 기타 화합물을 사용할 수 있다: 담즙: DEAE-덱스트란 및 폴리오르니틴 같은 다가양이온; 나트륨 도데실 벤젠 설페이트와 같은 세제; 지질-접합 물질; 스트렙토마이신과 같은 항생물질; 비타민 A: 및 점막 표면의 구조적 또는 기능적 완전도를 변화시키는 기타 화합물. 기타 점막 활성 화합물로는 MDP; 아크리딘 및 시메티딘과 같은 미생물 구조의 유도체를 들 수 있다.

헬리코박터 LPS 제제는 본 발명에 따라 ISCOMS(immune stimulating complexes, 면역 자극성 복합체), ISCOMS 함유 C7B, 리포좀 형태로 송달하거나, 또는 아크릴레이트 또는 폴리(DL-락타이드-코-글리코사이드)와 같은 화합물내에 캡슐화하여 M 세포에 의해 흡착되기에 적합한 크기의 미소구를 형성할 수 있다. 한편, 마이크로 또는 나노 단위 크기의 입자는 특이적 장 수용체를 가진 비타민 B12와 같은 분자에 공유적으로 부착시킬 수 있다. 헬리코박터 LPS 제제는 유상 유탁액내로 혼입시키거나 경구적으로 투여할 수도 있다. 보조제의 광범위한 개략적인 예는 문헌[Cox and Coulter, (1992)]에서 찾을 수 있다.

통상의 약학적 허용 담체, 부형제, 완충제 또는 희석제 뿐만 아니라 기타 보조제를 본 발명의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 함유시킬 수 있다. 백신 조성물은 예를 들면, 헬리코박터 LPS 제제 및 콜레라 독소 점액성 보조제와 함께 중탄산나트륨 완충제를 포함하는 장용 코팅된 젤라틴 캡슐내에 제형화할 수 있다.

예방 또는 치료용 백신 조성물의 제형화 방법은 당해 분야에 통상의 지식을 가진 자에게는 널리 공지되어 있다. 적합한 약학적 허용성 담체 및/또는 희석제로는 임의의 모든 통상의 용매, 분산매, 충전재, 고체 담체, 수성 용액, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 들 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 약제의 사용 방법은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판, 맥 퍼블리싱 컴퍼니, 미국 펜실베니아]에 기재되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 약제가 활성성분과 비혼화성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 백신 조성물에 이들의 사용을 고려할 수 있다.

본 발명의 헬리코박터 LPS 제제는 백신 조성물내 유일한 활성 면역원으로서 투여될 수 있다. 그러나, 한편으로 백신 조성물은 기타 병원체종에 대해 면역학적 활성이 있는 항원 뿐만 아니라, 기타 헬리코박터 항원을 비롯한 기타 활성 면역원을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 제형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 "단위 제형(dosage unit form)"이란 피치료자에게 단위 투여물로 적합한 물리적으로 구별되는 단위로서, 각 단위는 필요한 약학적 담체 및/또는 희석제와 함께 목적하는 치료 효과를 산출하는 것으로 계산된 예정된 양의 활성 성분을 함유하는 단위를 말한다. 본 발명의 신규한 단위 제형에 대한 상세한 사항은 (a) 활성 성분의 독특한 특성 및 목적하는 구체적 치료 효과, 및 (b) 특정 치료를 위해 상기 활성 성분을 배합하는 분야에 내재하는 제한에 의해 정해지며, 그들에 의해 직접적으로 좌우된다.

본 발명에 이르른 연구 과정에서, 전술한 헬리코박터 펠리스 모델은 SP-2 세포의 융합으로부터 하이브리도마 세포주를 생성시키고, 면역성이 있는 마우스로부터 임파구를 생성시킴으로써 면역화 및 보호된 마우스에서 면역 반응을 검사하는 데 사용하였다. 상기 하이브리도마 세포는 헬리코박터 펠리스를 인지한 단일클론 항체의 생성에 대해 선별하였다. 헬리코박터 펠리스를 인지하고 응집반응하는 IgA 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하여 감염된 마우스를 치료하는 데 사용하였다. 이들마우스는 상당한 비율로 그 감염이 치료되었다. 따라서 단일클론 항체가 인지하는 항원을 보호성 항원으로 동정하였다.

그 다음, 상기 보호성 항원은 생화학적 방법에 의해 박테리아 외막의 지다당류(LPS) 성분으로 동정되었다. 헬리코박터 펠리스와 헬리코박터 필로리 사이의 밀접한 관계는, 헬리코박터 펠리스 LPS가 마우스 모델에서 보호성 항원으로 동정되었고 그리고 헬리코박터 필로리에 의한 예방접종이 후속 헬리코박터 펠리스 감염에 대해 마우스를 보호하기 때문에, 헬리코박터 필로리 LPS는 사람의 감염에서 보호성 항원이라는 것을 나타낸다. 따라서, 활성 예방접종에 의해 헬리코박터 LPS 제제에 대해 포유류 숙주에서 생성된 항체는 기존 감염을 박멸하거나 적어도 억제하거나, 또는 이 숙주에서 새로운 감염의 발생을 예방하는 능력을 가지게 된다. 또한, 헬리코박터 LPS 제제에 대해 생성된 항체를 사용하여 포유류 숙주를 수동 면역시키면, 유사하게 이 숙주에서 기존 감염을 박멸하거나 적어도 억제하거나, 또는 새로운 감염의 발생을 예방하게 된다.

이하 실시예에서 본 발명의 특징을 추가로 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이 상세한 설명은 단지 본 발명을 예시할 목적으로 제시하는 것이며, 상기에제시한 광범위한 설명에 어떠한 제한을 가하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.

실시예 1

실험 동물

7 내지 8주령의 Balb/c 특이 병원체 없는(SPF: specific pathogen free) 마우스 암컷을 NSW 대학교의 애니멀 브리딩 및 홀딩 유닛 SPF 기관에서 입수하였다. 마우스들에게 멸균된 시판 식품 펠렛의 식사를 제공하였다. 멸균수를 무제한으로 제공하였다.

박테리아

헬리코박터 펠리스(CS1)를 세포용해된 말 혈액(5% v/v)과 함께 암포테리신 B(2.5 mg/ℓ ), 트리메토프림(5 mg/ℓ), 폴리믹신(1250 IU L) 및 반코마이신(10 mg/ℓ)을 함유하는 블러드 아가 베이스 No.2 상에서 증식시켰다. 평판을 37℃에서 48시간 동안 미호기성 대기에서 항온배양하였다.

Hf 초음파처리물의 제조

헬리코박터 펠리스(CS1)를 CSA 아가 상에서 증식시키고, 미호기성 환경에서 48 시간 동안 항온배양한 후, 인산염 완충 염수(PBS)에서 평판으로부터 채취하였다. 그 후 현탁액을 원심분리하고, PBS에서 2회 재현탁시켰다. 그 박테리아 현탁액을, 테이퍼를 이룬 마이크로 팁을 가진 브랜슨 450 소니파이어에서 출력 콘트롤 세팅 4, 사용률 50%, 박테리아 현탁액 1 ㎖당 1분의 속도로 초음파처리하였다. 생성된 샘플내 단백질 농도를 바이오래드 DC 단백질 분석법으로 측정하였다. Hf 초음파처리물(sonicates)을 -20℃에서 보관하였다.

하이브리도마의 제조

5 마리의 마우스를 3주에 걸쳐 콜레라 독소(CT)와 함께 헬리코박터 펠리스(Hf)의 초음파처리물로 면역화시켰다. 모든 면역화 용액은 PBS에서 희석하였다.

하이브리도마 선별

비세포(脾細胞), 페이어 패치(Peyer's Patch) 및 장간막 임파절 세포를 SP-2/0-Ag14 세포와 융합시켜서 헬리코박터 펠리스에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성시켰다. 그 절차는 문헌[MacGregor등,(1983)]에 기재된 것과 기본적으로 동일하였다. 융합 결과는 표 1에 요약한다. 3회의 융합으로부터 총 87개의 하이브리도마 세포주를 수득하였다. 이들 세포주 중 24개가 EIA 양성이었고, 96개의 웰평판에서 3T3 Balb/c 공급기층 상에서 제한 희석하여 클로닝하였다. 클로닝후, 특이항체 생성에 대해 세포주들을 재분석하였다. 이 검색 절차에서 EIA 평판상에 코팅된 헬리코박터 펠리스 초음파처리물과 반응되는 항체를 분비한 6개의 안정한 세포주를 수득하였다.

항-헬리코박터 펠리스 항체에 대한 효소 면역분석(EIA)

하이브리도마를 함유하는 웰로부터 취한 배양 상청액은 EIA에 의해 헬리코박터 펠리스에 대한 항체에 대해 검색하였다. 평판들(맥시소프/NUNC, 덴마크)을 pH 9.6의 0.05 M 중탄산염 완충액에서 100 ㎍/㎖(6.22 mg/㎖로부터 희석)의 헬리코박터 펠리스 초음파처리물로 코팅하였다. 4℃에서 하루함 항온배양한 후, 코팅된 평판을 실온에서 1mg/㎖의 카세인으로 1 시간 동안 항온배양하여 차단시키고, 안정화시키고, 건조시키고, 밀봉하였다. 모든 분석에 사용된 희석제는 카세인 함유 PBS-트윈 희석제인 블루 딜류언트(CSL)였다. 하이브리도마 상청액을 가진 두 세트의 평판을 37℃에서 30 분 동안 항온배양하고, 세척한 후, 유사하게 항온배양하였는데, 한 세트의 평판은 HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG 감마 특이 항체(미국 매릴랜드 KPL)와, 그리고 두 번째 세트의 평판은 HRP 접합된 염소 항-마우스 IgA(미국 매릴랜드 KPL)와 함께 항온배양하였다. H2O2 및 테트라메틸벤지딘을 함유하는 기질 용액을 첨가하여 퍼옥시다제 활성을 측정하였다. 실온에서 5분 후, 자동화된 EIA 판독기상에서 0.05 nm를 첨가하여 반응을 중지시켰다.

미소테스트(Misotest) 키트(CSL; 표 1)를 사용하여 6개 하이브리도마 세포주의 아이소타입을 분류하였다.

[표 1]

응합 실험 결과의 요약

1 비장

2 페이어 패치

3 장간막 임파절

하이브리도마 세포주의 치료 효과의 시험

박테리아 현탁액의 응집 및 침전을 통해 현미경에 의해 그리고 육안으로 관찰되는 바와 같이, 하이브리도마 세포주 HP2S 9F4 1B1은 새로이 증식된 헬리코박터 펠리스를 응집시키는 IgA 항체를 분비하였다. IgA는 "면역 배타작용(immune exclusion)"으로 기술되는 과정을 통해 점막 표면에 전이증식하는 박테리아에 작용한다. 점막 박테리아의 표면을 인지하는 IgA 항체의 경우, 중요한 성질은 유기체를 응집시켜 이들이 점막 표면에 전이증식하는 능력을 간섭할 수 있는 능력이다. 그러므로, 특이적 박테리아를 응집시키는 단일클론 IgA 항체의 표적은 보호성 항원이되는 것같다.

마우스들을 헬리코박터 펠리스로 감염시켰다. 감염시킨 후, 마우스군을 하이브리도마 세포주 HP2S 9F4 1B11 또는 FV4 2C6 2B3(음성 대조군으로 사용한 항-인플루엔자 IgA 분비 세포주)으로 접종하였다. 감염 동물의 또 다른 군은 처리하지 않은 채로 두었다. 21 내지 24일후, 마우스를 희생시켜 그 감염 상태를 측정하였다.

헬리코박터 펠리스에 의한 감염

헬리코박터 펠리스(CS 1-87)를 CSA 아가 상에서 증식시킨 후, 브레인 하트 주사(BHI: Brain Heart Infusion) 용액에 평판으로부터 채취하였다. 생성된 현탁액내 나선형 유기체의 총수를 혈구계산기실을 사용하여 산정하였다.

마우스들에게 BHI에서 다음과 같이 생 헬리코박터 펠리스를 3회 투여하였다:

[표 2]

하이브리도마의 투여

30일째에, 코드화된 하이브리도마 현탁액을 PBS에 재현탁시켜 각각 최종 농도 1.0 × 10⁷세포/㎖를 수득하였다. 적합한 현탁액중 1,0 × 10⁶세포(0.1 ㎖)를 26 G의 바늘을 사용하여 각 마우스의 어깨위의 피하에 투여하였다.

샘플의 수집

하이브리도마 세포의 투여 후 21 내지 24일째에 모든 마우스는 상당한 종양 증식을 나타냈는데, 이 동물을 마취시켜 안락사시켰다. 마우스들은 케타민(100mg/㎖)/크실라진(20 mg/㎖)/물의 혼합물(1.5:10)로 마취시켰는데, 각각의 마우스는 27 G 바늘로 혼합물 약 0.15 ㎖를 복강내 투여받았다. 마우스들이 발의 자극에 대한 반응을 나타내지 않을 때, 마우스들에게 PV 카핀의 0.1% 용액 0.1 ㎖을 복강내 투여하여 타액분비를 유도하고, 마우스들을 측면으로 위치시켜 50 ㎕의 마이크로피펫을 사용하여 에펜도르프 튜브내로 5 내지 10분 동안 타액을 수집하였다. 그 후 타액을 -20℃에서 보관하였다.

그 후 마우스들로부터 채혈하고, 그 혈액을 원심분리하여 혈청을 -20℃에서 보관하였다. 그리고나서 경부를 탈구시켜 마우스들을 죽였다. 담낭을 제거하고, 23G 바늘로 찔러서 마우스군내 모든 마우스에게서 담즙을 에펜도르프 튜브내에 풀로서 수집하고, -20℃에서 보관하였다.

각 군의 처음 5 마리 마우스에 대해서는, 비장을 제거하고, PBS에서 세정하고 마이크로퓨지 튜브에 넣고 액체 질소에서 보관하였다. 위를 제거하고, 위소만(lesser curvature)을 따라 개봉하고, 염수에서 격렬히 세척하고, 위의 절반을 조직분석을 위해 포르말린에 넣었다. 위의 나머지 절반으로부터 상악동(antral) 부분을 미량역가 평판내 우레아제 시약의 웰에 넣었다.

조직분석

조직분석을 위해, 포르말린에 고정된 위를 파라핀 왁스에서 처리하고 매립시켰다. 5 ㎛ 단편을 잘라내고 메이 그룬왈드-기엠자(may Grunwald-Giemsa)로 염색하였다. 감염의 우레아제 시험 결과를 확인하기 위해, 각 군의 5 마리 마우스로부터 위 부분을 고전력 상에서 검사하고, 나선형 박테리아의 존재에 대해 등급을 매겼다.

우레아제 분석

우레아제 시약은 지시제로서 0.05% w/v의 페놀레드, 방부제로서 0.02% w/v 아지드화나트륨과 함께 0.01 M 인산나트륨 완충액내 2% w/v의 우레아 용액(pH 6.5로 조정됨)으로 이루어진 것이다.

결과

우레아제 분석 결과

[표 3]

FV4 2C6 2B3 및 HP2S 9F4 1B11 처리군에서 우레아제 양성인 마우스 수사이에는 상당한 차이(P 0.02)가 있다.

조직분석 결과

위 부분의 샘플의 조직학적 분석은 우레아제 시험 결과를 확인시켜 주는데, 즉 감염된 대조군(우레아제 양성)으로부터 얻은 5개 샘플 모두와, 하이브리도마 세포주 FV4 2C6 2B3(인플루엔자 항체)로 접종한 마우스로부터 얻은 5개 샘플 모두에서 유기체가 확인되었고, 하이브리도마 세포주 HP2S 9F4 1B11로부터 얻은 2개의 우레아제 음성 샘플에서는 유기체가 확인되지 않았으며, 3개의 우레아제 양성 샘플에서 유기체가 확인되었다. 모든 조직분석 슬라이드를 마우스 상태에 대해서는 모르는 작동기로 분석하였다.

결론

HP2S 9F4 1B11 하이브리도마 세포주를 투여받고, FV4 2C6 2B3 하이브리도마 세포주를 투여받은 마우스에 비교되는 헬리코박터 펠리스에 대한 항체를 생성하고, 인플루엔자 비루스에 대한 항체를 생성하는 감염된 마우스의 위로부터 유기체가 상당량 특이적으로 제거된다는 사실은 HP2S 9F4 1B11에 의해 분비되는 항체를 유도시키는 항원이 보호성 헬리코박터 펠리스 항원이라는 사실을 입증하는 것이다.

실시예 2

단일클론 항체 HP2S 9F4 1B11에 의해 인지되는 항원의 특성분석

박테리아 균주 헬리코박터 펠리스(CS1) 및 헬리코박터 필로리(921023)를 CSA 아가 평판상에서 증식시켰다. 평판을 긁어서 박테리아를 수집하고 PBS에 재현탁시켰다. 전술한 바와 같이 초음파처리물을 제조하였다. 전체 세포 초음파처리물을 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.

SDS-PAGE 및 면역블로팅 노벡스(캘리포니아 산디에고) 트리스 글리신 프리-캐스트 폴리아크릴아미드 겔을, 12% 균질 겔 또는 4 내지 20% 구배 겔로서, 상기 연구에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 존재하에 환원 조건하에서 작동되는 샘플과 함께 사용하였다. 전기영동시킨 후, 분리된 박테리아 성분을 니트로셀룰로스에 옮겼다. 겔들을 또한 래피드-Ag-스테인 키트(캘리포니아 어빈 ICN)를 사용하여 쿠마시블루로 또는 실버 스테인으로 단백질에 대해서 염색하였다. 니트로셀룰로스를 항체와, 이어서 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-마우스 IgC + IgM + IgA와 항온배양하기 전에 1% 카세인에서 1 시간 동안 차단시켰다. 블롯을 4-클로로-1-나프톨로 현상시켰다.

일부 경우에는 니트로셀룰로스 스트립을 항체와 반응시키기 전에 과요오드산 나트륨으로 처리하였다(참조 문헌: Woodward 등, 1985). 이 방법은 비시날 히드록실기를 포함하는 탄수화물부를 산화시키고, 대부분의 탄수화물 에피토프를 파괴한다. 대조군 스트립을 과요오드산 나트륨 없이 pH 4.5 완충액에서 항온배양하였다.

지다당류(LPS)의 추출

두 가지 방법을 사용하여 LPS를 정제하였는데, 이들은 문헌[Mills 등, (1992)]에 기재된 것과 거의 동일하였다. 프로티나제 K 처리는 히치콕 및 브라운(1983)의 방법을 변형시켰고, 페놀-물 추출 절차는 웨스트팔 및 얀(1965)의 방법을 변형시킨 것이었다. LPS 샘플을 SDS-PAGE 상에서 전개시키고, 일부 경우에는 상기에서 상설한 바와 같이 니트로셀룰로스로 옮겼다.

결과

단일클론 항체 HP2S 9F4 1B11과 반응할 때 헬리코박터 펠리스의 전체 세포 초음파처리물 웨스턴 블롯은 45,000 내지 90,000 MW 범위의 다수의 작은 밴드와 함께, 대략 20,000 내지 23,000의 MW에서 조밀한 넓은 밴드를 나타냈다. 헬리코박터 펠리스의 스트립을 HP2S 9F4 1B11로 탐침을 가하기 전에 과요오드산 나트륨으로 항온배양했을 때, HP2S 9F4 1B11와의 반응성을 보유했던 완충액에서만 항온배양된 스트립과 달리 모든 반응성이 제거되었다.

헬리코박터 펠리스 초음파처리물의 프로티나제 K 처리 및 페놀-물 추출에 의해 모든 단백질은 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 블루 염색에 의해 입증되는 바와 같이 실질적으로 제거되었다. 실버 스테인으로 검출시 잔존한 것은 50 KD 미만의 작은 수의 밴드였다. 이렇게 처리된 재료를 니트로셀룰로스에 옮겨 HP2S 9F4 1B11와 반응시킬 때, 약 20 및 25 KD의 주밴드와 이들 밴드 사이 및 그 위의 다수의 저강도의 밴드로서 다수의 밴드가 확인되었다. 유사한 블롯을 과요오드산 나트륨과 반응시킬 때, 상기 밴드들에 대해 이미 나타났던 모든 HP2S 9F4 1E11 반응성은 상실되었다.

결론

단일클론 항체 HP2S 9F4 1B11이 인지하는 헬리코박터 펠리스의 항원성 결정인자는 LPS이다.

Claims

포유류 숙주에서의 헬리코박터(Helicobacter) 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물로서, 1종 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제와 함께 면역학적 유효량의 항원제제를 함유하며, 이 때 상기 항원 제제는 헬리코박터 박테리아의 지다당류(LPS), 또는 그 면역원성 단편을 포함하는 것인, 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 헬리코박터 필로리(H. pylori) 또는 헬리코박터 펠리스(H. felis)의 LPS, 또는 그 면역원성 단편을 포함하는, 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 부분적으로 정제된 LPS 제제를 포함하는, 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는, 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.
제4항에 있어서, 보조제가 점액성 보조제인, 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.
헬리코박터 박테리아의 지다당류(LPS), 또는 그 면역원성 단편을 포함하는 항원 제제에 특이적인 항체.
제6항에 있어서, 단일클론 항체인, 항원 제제에 특이적인 항체.
포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물로서, 제6항 또는 제7항에 따른 항체를 1종 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제와 함께 포함하는, 포유류 숙주에서의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.