KR100263845B1

KR100263845B1 - 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물

Info

Publication number: KR100263845B1
Application number: KR1019980707104A
Authority: KR
Inventors: 토마스 웨인 스트릭크랜드; 토마스 에드워드 바이른; 스티븐 조지 엘리오트
Original assignee: 스튜어트 엘.왓트; 키린-암젠 인코포레이티드
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-09
Publication date: 2000-08-16
Also published as: JP2983629B2; CN1063796C; DE69033301T2; NO912281D0; CZ291471B6; IL125175A; DE69033301D1; DE69029370C5; ES2097753T5; DE69029370T2; JPH08151398A; ATE184914T1; DK0668351T3; WO1991005867A1; ES2097753T3; IL125175A0; EP0428267A3; KR100221066B1; AU646822B2; SK497290A3

Abstract

에리트로포이에틴 분자당 특정 수의 시알산을 갖는 에리트로포이에틴 동형체가 개시되어 있다. 또한 이러한 동형체의 혼합물, 이러한 동형체 또는 이들의 혼합물을 함유하는 제약학적 조성물 및 에리트로포이에틴 동형체를 제조하기 위한 방법도 기재되어 있다.

Description

에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는 제약학적 조성물

에리트로포이에틴은 적혈구계 선조 세포가 적혈구로 성숙하는데 관계하는 당단백질 호르몬이다. 이는 혈액순환에서 적혈구 세포의 수준을 조절하는데 필수적이다. 자연적으로 발생하는 에리트로포이에틴은 태아기에는 간에서 생성되고 성인기에는 신장에서 생성되어 혈액 내에서 순환하며 골수에서 적혈구의 생성을 자극한다. 빈혈은 거의 대부분이 신장으로부터의 에리트로포이에틴의 생성이 감소하는데 기인하는 신부전증의 결과이다. 에리트로포이에틴을 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 숙주 세포로부터 단백질 산물의 형질발현을 포함하는 유전자 조작 기술에 의해 생산한 재조합 에리트로포이에틴은 만성 신부전증에 기인하는 빈혈의 치료에 사용하였을 때 효과적이는 것이 밝혀졌다.

최근까지, 에리트로포이에틴의 유용성은 극히 제한되어 왔다. 비록 에리트로포이에틴이 인체의 뇨속에 존재한다 하더라도 치료를 위한 에리트로포이에틴의 실제적인 원료로 하기에는 분비량이 너무 낮다. 재생불량성 빈혈로 고통받는 환자는 건강한 사람에 비해 상승된 수준의 뇨의 에리트로포이에틴을 나타내기는 하나, 이러한 뇨의 제한된 공급 또는 원료로서는 실용적이지 않다. Miyake 등의 J.Biol, Chem., 252, 5558(1977) 문헌에 기술된 인체 뇨의 에리트로포이에틴의 정제방법은 출발물질로서 재생불량성 빈혈 환자로부터 배출되는 뇨를 사용하였다.

에리트로포이에틴을 암호화하는 유전자의 확인, 클로닝 및 형질발현은 Lin의 미국 특허 제 4,703,008호에 기술되어 있다. 예를들어, 재조합 에리트로포이에틴 플라스미드를 포함하는 포유동물 세포의 성장을 원조하는 세포 배지로부터 재조합 에리트로포이에틴을 정제하는 방법이 Lai 등의 미국 특허 제 4,667,016호에 기술되어 있다. 재조합 플라스미드 상의 에리트로포이에틴 유전자를 함유하는 포유동물의 세포 숙주들로부터 생물학적으로 활성인 재조합 에리트로포이에틴을 형질발현시키고 재생함으로써 처음으로 치료학적 적용에 적당한 상당한 양의 에리트로포이에틴을 수득할 수 있었다. 게다가, 이 유전자 서열에 대한 인식과 대량의 정제된 단백질의 입수로 이 단백질의 작용 방식을 보다 더 잘 이해할 수 있게 되었다.

단백질의 생물학적 활성은 그 구조에 의존한다. 특히, 단백질의 1차 구조(즉, 그 아미노산 서열)는 단백질의 합성 과정 동안이나 합성 후의 폴리펩티드에 의한 2차 구조(예를들어, α-헬릭스 또는 β-시트) 및 3차 구조(전체적인 3차원 겹쳐짐)를 형성하게 하는 정보를 제공한다. 돌연변이의 도입 또는 화학적 처리나 효소 처리에 의한 적절한 2차 및 3차 구조의 파괴는 생물학적 활성의 감소를 일으킬 수 있다.

원핵 생물에서, 단백질의 생물학적 활성은 상기한 구조에 의해 크게 지배를 받는다. 원핵 세포로부터의 단백질과는 달리 진핵 세포에 의해 생성된 많은 세포 표면과 분비 단백질은 하나 또는 그 이상의 올리고당류에 의해 변형된다. 글리코실화(glycosylation)로 칭해지는 이러한 변형은 단백질의 물리적 성질에 극적인 영향을 미치고, 또한 단백질 안정성, 분비 및 세포하의 위치 결정에도 중요하다. 적절한 글리코실화는 생물학적 활성에 대해 필수적일 수 있다. 실제로, 진핵 생물로부터의 몇몇 유전자는 단백질을 글리코실기와 결합하게 하기 위한 세포 과정이 결여된 박테리아(예를들어, E. coli) 내에서 발현시킬 때 이들의 글리코실화의 결여로 인해 활성이 거의 없거나 또는 활성이 전혀 없는 단백질을 수득하게 된다.

글리코실화는 폴리펩티드 골격을 따라 특정 위치에서 일어나고, 대개 두가지 형태이다: O-결합 올리고당류는 세린 또는 트레오닌 잔기에 결합하는 반면, N-결합 올리고당류는 Asn-X-Ser/Thr 서열의 일부인 아스파라긴 잔기에 결합하는데, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 아미노산일 수 있다. 각각의 형태에서 발견된 N-결합 올리고당류, O-결합 올리고당류 및 당 잔기는 서로 다르다. 양쪽 모두에서 공통적으로 발견되는 당의 한 형태는 N-아세틸노이라민산(이후, 시알산이라 칭함)이다. 시알산은 대개 N-결합 올리고당류 및 O-결합 올리고당류 두가지 모두의 말단 잔기이며, 그 음전하로 인하여 당단백질에 산의 특성을 부여한다.

인체 에리트로포이에틴의 아미노산 서열 1-165를 갖는, 인체의 뇨에서 유도한 에리트로포이에틴과 재조합 에리트로포이에틴(포유동물의 세포 내에서 형질발현된) 두가지 모두는 세 개의 N-결합 올리고당류 사슬과 하나의 O-결합 올리고당류 사슬을 포함하며, 이들은 당단백질의 총 분자량의 약 40%를 구성한다. N-결합 글리코실화는 위치 24, 38 및 83에 위치한 아스파라긴 잔기에서 일어나는 반면, O-결합 글리코실화는 위치 126에 위치한 세린 잔기에서 일어난다[Lai 등의 J.Biol. Chem, 261, 3116(1986); Broudy 등의 Arch. Biochem. Biophys. 265, 329(1988) 문헌 참조]. 올리고당류 사슬은 말단 시알산 잔기로 변형될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 모든 시알산 잔기를 제거하기 위해 글리코실기와 결합된 에리트로포이에틴을 효소 처리하면 생체내 활성도의 손실을 나타내지만, 시험관내 활성도에는 영향을 미치지 않는다[Lowy 등의 Nature 185, 102(1960); Goldwasser 등의 J. Biol. Chem, 249, 4202(1974) 문헌 참조]. 이러한 특성은 간의 무시알로당단백질 결합 단백질과의 상호작용에 의하여 순환으로부터 제거되는 무시알로에리트로포이에틴의 신속한 감소율에 의해 설명된다[Morrell 등의 J. Biol. Chem. 243, 155(1968); Briggs 등의 Am. J. Physiol. 227, 1385(1974); Ashwell 등의 Methods Enzymol. 50, 287(1978) 문헌 참조]. 따라서, 에리트로포이에틴은 단지 에리트로포이에틴이 간의 결합 단백질에 의한 결합을 피하기 위하여 시알린화되었을 때에만 생체내 생물학적 활성을 갖는다.

에리트로포이에틴의 올리고당류 사슬 내의 다른 성분들의 역할은 잘 알려지지 않았다. 글리코실기와 결합하지 않은 에리트로포이에틴은 글리코실기와 결합한 형태와 비교해 볼 때 생체내 활성은 크게 감소하였으나, 시험관내 활성은 유지되는 것으로 나타났다[Dordal 등의 Endocrinology 116, 2293(1985); Lin 특허, 상기 문헌 참조]. 그러나 또다른 연구에서, 글리코실화 부위인 아스파라긴 잔기 또는 세린 잔기의 돌연변이 유발에 의해 N-결합 또는 O-결합 올리고당류 사슬을 각각 또는 함께 제거하면 포유동물 세포에서 생성되는 변성된 에리트로포이에틴의 시험관내 활성을 크게 감소시켰다[Dube 등의 J. Biol. Chem. 263, 17516(1988) 문헌 참조].

에리트로포이에틴과 같은 당단백질은 등전점 전기영동(IEF)과 같은 기술을 사용하여 상이하게 하전된 형태로 분리할 수 있다. 일부 연구인들은 정제하지 않은 에리트로포이에틴 시료 및 부분적으로 정제한 에리트로포이에틴 시료에 대한 IEF 연구 결과를 보고하였다[Lukowsky 등의 J. Biochem. 50, 909(1972); Shelton 등의 Biochem. Med. 12, 45(1975); Fuhr 등의 Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930(1981) 참조]. 이들 연구에서는 에리트로포이에틴 활성을 갖는 3-4 분획을 IEF로 분리했을뿐, 탄수화물 함량에 대해서는 아무런 특성도 없었다. 이들 분획의 등전점과 생물학적 활성도 사이에는 아무런 상관관계도 없었다.

Miyake 등의 상기문헌에서 논의된 인체의 뇨로부터 뇨의 에리트로포이에틴을 정제하는 동안에, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 (hydroxylapatite chromatography)로부터 Ⅱ 및 ⅢA로 명명한 에리트로포이에틴 두 분획이 동일한 비활성(specific activity)을 갖는다는 사실이 보고되었다. 분획 Ⅱ 및 ⅢA를 탄수화물 분석하여 분획 Ⅱ가 ⅢA보다 평균 시알산 함량이 크다는 것이 밝혀졌다[Dordal 등의 상기문헌 참조].

본 발명의 목적은 한정된 시알산 함량과 생물학적 활성을 갖는 분리된 에리트로포이에틴 동형체를 제공하는 것이다. 이러한 분자를 함유하는 제약학적 조성물은 치료학적 잇점을 갖는다.

발명의 요약

본 발명은 에리트로포이에틴 동형체에 관한 것이다. 또한 정제된 에리트로포이에틴을 분리용 등전점 전기영동처리시키고 겔로부터 단일의 동형체를 용리하는 단계를 포함하는 에리트로포이에틴 동형체의 제조방법을 제공한다. 또한 본 발명은 에리트로포이에틴 동형체를 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생성을 증가시키기 위하여 이들 조성물의 치료학적으로 허용되는 양을 투여하는 것을 포함하는, 사람 이외의 포유동물 내의 적혈구 용적 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 에리트로포이에틴을 함유하는 물질을 이온교환 크로마토그래피시키는 것을 포함하는, 분자당 소정 수 이상 또는 다르게는 그 이하의 시알산을 갖는 에리트로포이에틴 분자의 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 에리트로포이에틴을 함유하는 물질을 크로마토포커싱시키는 것을 포함하는, 분자당 소정 수 이상 또는 다르게는 그 이하의 시알산을 갖는 에리트로포이에틴 분자의 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 [Asn⁶⁹] EPO; [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO; [Thr¹²⁵] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO 와 같은 인체 에리트로포이에틴 보다 많은 탄수화물 사슬 결합 부위를 갖는 인체 에리트로포이에틴 유사체를 포함한다.

본 발명은 에리트로포이에틴 동형체 또는 그 혼합물, 특정 동형체 또는 그 혼합물의 제조방법, 그러한 동형체 또는 그 혼합물을 포함하는 제약학적 조성물 및 그러한 동형체와 조성물을 사용한 사람 이외의 포유동물에 대한 치료방법에 관한 것이다.

도 1은 각각의 재조합 에리트로포이에틴 동형체의 분석적 등전점 전기영동 겔을 보여주는 것이다. 겔의 레인 1-11은 레인 1의 약산성(높은 pI)으로부터 레인 11의 보다 강한 산성(낮은 pI)까지 걸쳐 있는 동형체를 나타낸다. 동형체 9-14의 혼합물을 함유하는 정제된 재조합 에리트로포이에틴은 겔의 최좌측 레인과 최우측 레인에 도시되어 있다.

도 2는 에리트로포이에틴 동형체당 시알산의 수 및 단위/㎎ 에리트로포이에틴 폴리펩티드로 나타내는 각 동형체의 생체내 비활성 사이의 관계를 나타내고 있다. 도 2A에서 각 에리트로포이에틴 동형체의 농도는 브래드포드 단백질 검정(Bradford protein assay)을 통해 측정하였고, 도 2A에서 에리트로포이에틴 동형체의 농도는 280nm에서의 흡광도로 측정한 것이며, 도 2C에서 에리트로포이에틴 동형체의 농도는 방사선면역측정법(Radioimmunoassaay:RIA)에 의해 측정한 것이다.

도 3은 서로 다른 조건하에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 제조한 재조합 에리트로포이에틴 동형체의 혼합물을 구분하는 분석적 등전점 전기영동 겔을 나타낸다. 겔 레인 1-6은, Q-세파로스 고속 컬럼을 각각 pH4.7의 150mM 아세트산, 150mM 아세트산(비완충), pH4.7의 200mM 아세트산, pH4.7의 250mM 아세트산, pH4.7의 300mM 아세트산 또는 300mM 아세트산(비완충)으로 세척한 후, 고농도의 염 세제에서 용리한 에리트로포이에틴 동형체를 나타낸다. DEAE-아가로스 크로마토그래피를 Q-세파로스 크로마토그래피로 대체한 것을 제외하고는 Lai 등의 상기문헌의 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 수득한 동형체 혼합물을 포함하는 정제된 재조합 에리트로포이에틴은 겔의 최좌측 레인에 도시되어 있다.

도 4는 세포 조정 배지를 Q-세파로스 컬럼에 가하여 pH의 감소 및 이온 강도의 증가 구배에 따라 에리트로포이에틴 동형체 8-12를 분리하였다. 분획 2-분획 40의 짝수 번호 분획의 분취량으로 분석적 등전점 전기영동을 실시하였다. DEAE-아가로스 크로마토그래피를 Q-세파로스 크로마토그래피를 대체한 것을 제외하고는 Lai 등의 상기문헌의 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 수득한 동형체 혼합물을 포함하는 정제된 재조합 에리트로포이에틴이 겔의 최좌측 레인에 또한 나타나 있다.

도 5는 인체 에리트로포이에틴의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 사각형은 탄수화물 사슬이 결합된 아스파라긴 잔기를 나타내고, 별표는 탄수화물로 변형된 트레오닌 및 세린 잔기를 나타낸다. 실시예 6의 유사체에서 제공된 부가적인 글리코실화 부위는 아스파라긴, 세린 및 트레오닌에 돌연변이를 일으켜 표시하였다.

도 6A, 도 6B 및 도 6C는 인체 에리트로포이에틴 유사체의 구성 및 분석을 위한 플라스미드 생성에 사용하는 일련의 클로닝 단계를 보여주는 것이다. 이들 유사체는 도 5에 나타난 바와 같이 부가적인 글리코실화 부위를 제공하는 변이된 아미노산을 갖는다.

도 7은 인체 에리트로포이에틴 서열과 지적한 에리트로포이에틴 유사체의 COS 세포 상청액의 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis)을 보여주는 것이다. 유사체 [Asn⁹, Ser¹¹] EPO, [Asn⁶⁹] EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO는 실시예 6에 기술한 바와 같이 구성한다. 부가적인 탄수화물 사슬을 함유하지 않는 유사체 [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO, [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸] EPO 및 [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO는 대조용으로 나타내었다.

도 8은 N-글리카나제로 처리한 후, 인체 에리트로포이에틴 서열과 지적한 에리트로포이에틴 유사체의 COS 세포 상청액의 웨스턴 블럿 분석을 보여주는 것이다. 유사체 [Thr¹²⁵] EPO, 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO는 실시예 6에 기술한 바와 같이 구성한다. 유사체 [Val¹²⁶] EPO, [Pro¹²⁴] EPO, [Pro¹²⁵] EPO, [Thr¹²⁷] EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO 및 [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO는 대조용으로 나타내었다.

도 9는 [Thr¹²⁵] 돌연변이체를 포함하는 에리트로포이에틴 cDNA로 형질감염시킨 CHO 세포의 성장을 지지하는 세포 배지의 Q-세파로스 및 C4 역상 크로마토그래피를 통해 수득한 풀 2, 3 및 4의 등전점 전기영동 겔을 도시하는 것이다. DEAE-아가로스 크로마토그래피를 Q-세파로스 크로마토그래피로 대체한 것을 제외하고는 Lai 등의 상기문헌의 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 수득한 동형체 혼합물을 포함하는 정제된 재조합 에리트로포이에틴은 겔의 좌측 및 우측 레인에 도시되어 있다.

본 발명에 의해 에리트로포이에틴 동형체를 제공하였다. 등전점 전기영동(IEF)은 전하에 의해 단백질을 분리한다. pH 구배를 형성해 놓고 전기장을 걸면, 단백질은 실효전하가 없는 지점으로 이동하여 그곳에 머무른다. 이것이 단백질의 등전점(pI)이다. IEF 상에서 관찰된 각각의 독특한 밴드는 특정의 pI와 결과적으로 동일한 전체 하전을 갖는 분자들을 나타내고, 이를 동형체라 칭한다. 분원에서 사용한 "에리트로포이에틴 동형체"라는 단어는 단일 pI 및 동일한 아미노산 서열을 갖는 에리트로포이에틴 제제를 나타낸다.

바람직한 실시예에서 에리트로포이에틴은 비-인체 진핵숙주 세포내로 형질감염시킨 외인성 DNA 서열의 형질발현 산물 즉, 바람직한 실시예에서 에리트로포이에틴은 "재조합 에리트로포이에틴"이다. 재조합 에리트로포이에틴은 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lin 소유 미국 특허 제 4,703,008호에 기술된 방법에 따라 용이하게 생산된다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lai 등의 소유 미국 특허 제 4,667,016호의 실시예 2에 기술된 일반적인 방법에 따라, 혹은 선택적으로 DEAE-아가로스 크로마토그래피를 Q-세파로스 크로마토그래피로 대체한, 실시예 2에 기술된 방법에 따라 재조합 에리트로포이에틴을 용이하게 정제하였다. Q-세파로스 컬럼의 변형에서, 완충용액 내의 25mM NaCl 대신에 55mM NaCl을 사용하여 컬럼을 중성 pH로 맞추고, 완충용액 내의 75mM NaCl 대신에 140mM NaCl을 사용하여 컬럼으로부터 에리트로포이에틴을 용리하였다. 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분석할 때, 이 물질은 단일 종(즉, 밴드)으로 이동한다. 정제된 에리트로포이에틴으로 IEF를 실시할 때, 다른 전하 형태의 당단백질이 존재함을 나타내는 다중 밴드가 겔에 나타난다.

뇨에서 유도한 인체 에리트로포이에틴의 아미노산 서열을 갖는 재조합 에리트로포이에틴의 각각의 동형체는 1-14개의 시알산을 갖는 에리트로포이에틴 분자에 대응되고, 각 동형체는 동형체가 함유하는 시알산의 수에 관계된 생체내 활성을 갖는 정제된 재조합 에리트로포이에틴 내에 존재한다. 본원에서 사용한 에리트로포이에틴"은 자연적으로 발생하는 에리트로포이에틴, 뇨에서 유도한 인체 에리트로포이에틴 뿐만 아니라 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생성을 증가시키는 생체내 생물학적 특성을 갖도록 자연적으로 발생하는 에리트로포이에틴의 아미노산 서열을 충분히 글리코실화한 복제체 및 그 아미노산 서열을 갖는 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩티드까지 포함한다.

에리트로포이에틴의 정제하지 않은 제제는 많은 동형체를 가지나, 예를들어, Lai등의 상기 특허의 실시예 2에서와 같이, 정제된 물질은 IEF에 의해 분석하였을 때, 주로 6가지 동형체를 포함한다. 게다가, 보다 산성인 적어도 하나의 부가적인 동형체가 실시예 4에 기술된 크로마토그래피 방법을 사용하여 검출되었다(IEF 겔 상에서 14개 이상의 시알산이 이동하는 보다 산성인 형태는, 시알리다아제 절단에 대한 일부 전하의 저항을 통해 나타난 바와 같이, 비시알산 음전하를 포함한다. 이들 동형체는 시알산 함량에 의해 서로 구별된다. 실시예에서 나타난 바와 같이, 분리용 IEF를 통해 이들 동형체중 10개를 분리하여 그중 5개의 시알산 함량을 결정함으로써 설명하였다. 시알산 함량에 대해 분석된 이들 동형체중 5개의 동형체가 9, 10, 11, 12 또는 13개의 시알산 잔기를 함유하는 것으로 밝혀졌다.

에리트로포이에틴의 생체내 상대적 비활성도와 동형체 5-11의 에리트로포이에틴 분자당 시알산 잔기의 수는 서로 관계가 있다(본원에서 각 동형체는 에리트로포이에틴 분자당 시알산의 수로 표시하였다). 동형체 11-14는 거의 동일한 생체내 상대적 비활성도를 갖는다. 동형체 5-14는 초저산소성 다혈구증 마우스 생체 검정을 통해 생체내 활성도를 분석하고, 존재하는 각 동형체의 양은 280㎜에서의 흡광도를 조사하는 브래드포드 단백질 검정 또는 에리트로포이에틴에 대한 방사선면역측정법(RIA)에 의해 결정한다. 단위/㎖로 표시되는 RIA 결정법[Egrie 등의 Immunobiology 172, 213,(1986) 문헌 참조]은 212,770 단위/㎎ 에리트로포이에틴 폴리펩티드로 나누어 떨어지고, 분리된 동형체 또는 동형체 혼합물의 단백질 농도를 얻기 위하여, RIA 에 의해 결정한 바와같이, 정제된 에리트로포이에틴의 평균 비활성도는 ㎎ 에리트로포이에틴 폴리펩티드/㎖로 표시하였다. 실시예에 나타난 바와같이, 생체내 상대적 비활성도는 동형체 5부터 동형체 11까지 단계적으로 증가한다(표 2 참조).

본원에서 언급한 생체내 비활성도는 생체내 상대적 비활성도를 측정한 것이며, 생체내 절대적 비활성도를 측정한 것은 아니다. 이러한 응용을 위하여, 동일한 검정법을 사용하고, 동일한 내부 표준과 동물의 동일한 형태를 포함하는 동일한 조건을 사용하며, 비활성도를 계산하는데 사용하는 데이터의 동일한 분석법, 단백질 함량을 결정하기 위한 동일한 검정법으로 분석한 동형체의 상대적 활성도를 비교하는 데에만 비활성도를 이용하였다. 어떠한 동형체에 대해 보고한 어떤 생체내 비활성도의 수치도 그 동형체의 고유의 또는 절대적인 값을 나타내기 위한 것은 아니다.

본 발명은 에리트로포이에틴 동형체를 제공한다. 본 발명에 의해 수득한 에리트로포이에틴의 특정 동형체 및 그들의 특성은 출발물질의 원료에 따라 달라질 수 있다. 예를들어, 뇨에서 유도한 인체 에리트로포이에틴 동형체는 재조합 에리트로포이에틴 동형체와는 다르다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 에리트로포이에틴 분자당 특정수(즉, 0보다 큰 고정수)의 시알산을 갖는 에리트로포이에틴 동형체에 관한 것이고, 상기의 수는 1-14 중에서 선택한다. 바람직하게, 상기 수는 9, 10, 11, 12, 13 또는 14이다. 또다른 실시예에 있어서, 상기 수는 14이상이고, 바람직하게는 16-23이다.

본 발명은 또한 둘 또는 그 이상의 에리트로포이에틴 동형체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시예의 조성물은 에리트로포이에틴 분자당 소정 수보다 큰 시알산을 갖는 동형체 혼합물, 예를들어 에리트로포이에틴 분자당 11개 이상의 시알산을 가지거나 동형체 12, 13 및 14의 혼합물 같이 분자당 12개 이상의 시알산을 갖는 동형체 혼합물을 포함한다. 또다른 실시예의 조성물은 에리트로포이에틴 분자당 소정 수의 시알산을 갖는 동형체 혼합물, 예를들어 동형체 9, 10 및 11의 혼합물과 같이 분자당 12 이하, 8이상의 시알산을 갖는 동형체 혼합물을 포함한다. 본 발명은 또한 동형체의 상대적 양이 동일하거나 다른 에리트로포이에틴 동형체의 조성물을 제공한다. 예를들어, 동형체 9, 10 및 11의 혼합물은 1:1:1, 2:3:1 또는 20:20:1과 같이 다양한 비율로 존재한다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 4가지 이하의 동형체 혼합물, 예를들어 동형체 11, 12 및 13의 혼합물, 12와 14의 혼합물 또는 7과 13의 혼합물을 포함할 수 있다.

에리트로포이에틴 동형체의 혼합물을 생산하기 위하여, 본 발명은 또한 선택된 에리트로포이에틴 동형체를 동시에 분리하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 분리용 등전점 전기영동 같은 기술을 이용하여 각각의 동형체를 분리하는 방법 또는 이온교환 크로마토그래피나 크로마토포커싱 같은 기술을 이용하여 분자당 소정 수의 시알산(예를들어, 11개 이상)을 갖는 동형체 혼합물을 분리하는 방법을 포함한다. 이들 모든 기술은 전하에 따른 단백질의 분리에 근거한다.

일반적으로, 이온교환 크로마토그래피 및 크로마토포커싱은 에리트로포이에틴의 일부 또는 전부가 수지에 결합하도록 하는 조건하에서 정제하지 않은 인체 에리트로포이에틴(세포 조정 배지) 또는 정제한 물질을 컬럼 수지에 가하는 것을 포함한다. 정제하지 않은 에리트로포이에틴 제제에 대해서는 약 pH7에서 단백질을 컬럼에 가하는 것이 바람직한 반면에, 정제한 제제에 대해서는 pH7- 약 pH4에서 단백질을 컬럼에 가하는 것이 바람직하다. 약 pH4에서 완충용액으로 컬럼을 세척한 후, 이온교환 컬럼에 결합되어 남아 있는 이들 에리트로포이에틴 동형체를 완충용액 내의 pH 및 염 농도를 증가시켜 가면서 용리하거나 또는 약 pH4에서 pH를 감소시키고 이온 강도를 증가시켜 가면서 구배를 형성하여 용리한다. 크로마토포커싱의 경우, pH의 점진적 감소에 의해서 또는 고농도의 염으로 컬럼을 세척하여 컬럼으로부터 동형체를 용리한다.

본 발명의 한 실시예는 예를들어 분자당 10개 이상의 시알산을 갖는 것과 같이 특정수 이상을 갖는 에리트로포이에틴 동형체를 우선적으로 합성하는 포유동물(예를들어, 차이니즈 햄스터 난소, CHO) 숙주 세포에 관한 것이다. 에리트로포이에틴 분자는 분자의 시알산 함량을 제한할 수 있는 N-결합 또는 O-결합 올리고당류 구조를 갖는다. 예를들어, 4-촉수모양(4개의 가지달린)의 N-결합 올리고당류는 시알산의 결합에 대해 대부분 4개의 가능한 부위를 제공하는 반면에, 4-촉수모양의 형태에 대해 아스파라긴-결합 부위에 치환할 수 있는 2-촉수모양 및 3-촉수모양의 올리고당류 사슬은 대개 2개 또는 3개의 시알산 결합 부위를 갖는다. O-결합 올리고당류는 대개 시알산 결합에 대해 2개 부위를 제공한다. 따라서, 에리트로포이에틴 분자는 세 개의 N-결합 올리고당류 모두 4-촉수모양으로 제공되어 전체 14개의 시알산 잔기를 수용할 수 있다. 우선적으로 재조합 에리트로포이에틴에 4-촉수모양의 사슬을 가하고, 그 결과 시알산 결합 부위의 수가 최대로 되는 세포를 포유동물의 세포 배양물에서 선별한다.

뇨의 에리트로포이에틴의 N-결합 올리고당류는 갈락토스에 α 2, 3 및 α 2, 6 결합으로 시알산을 함유한다[Takeuchi 등의 J. Biol. Chem. 236, 3657(1988) 참조]. 전형적으로 α 2, 3 결합의 시알산은 만노스 α 1, 6 가지 상의 갈락토스에 가해지고, α 2, 6 결합의 시알산은 만노스 1,3 가지 상의 갈락토스에 가해진다. 이들 시알산을 가하는 효소(β-갈락토시드 α 2, 3 시알릴트랜스퍼라제 및 β-갈락토시드 α 2, 6 시알릴트랜스퍼라제)는 각각 만노스 α 1, 6 및 만노스 α 1, 3 가지에 시알산을 가하는 데 가장 효과적이다.

디히드로엽산환원효소(DHFR) 결핍 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포는 대개 재조합 에리트로포이에틴을 포함하는 재조합 당단백질의 생산에 대한 숙주 세포로 사용된다. 이들 세포는 효소 β-갈락토시드 α 2, 6 시알릴트랜스퍼라제를 발현시키지 못하므로 이들 세포에서 생산된 당단백질의 N-결합 올리고당류에 α 2, 6 결합의 시알산을 가하지 못한다[Mutsaers 등의 Eur. J. Biochem. 156, 651(1986); Takeuchi 등의 J. Chromatogr. 400, 207(1987)참조]. 따라서, CHO 세포 내에서 생산된 재조합 에리트로포이에틴은 갈락토스에 2, 6 결합의 시알산이 결핍되어 있다[Sasaki 등의 (1987), 상기문헌; Takeuchi 등의 (1987), 상기문헌 참조]. 본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 동형체를 생산하는데 사용된 에리트로포이에틴은 기능적인 β - 갈락토시드 α 2, 6 시알릴트랜스퍼라제 유전자로 형질감염시킨 CHO 세포 내에서 제조되어 α 2, 6 결합 내의 시알산을 갈락토스에 결합시킨다. 변형된 CHO 세포 또는 다른 포유동물의 숙주 세포를 생산하는 기술의 상세한 설명에 대해서는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lee 등의 J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989)를 참조하라.

특정한 인체 에리트로포이에틴 유사체도 또한 본 발명에 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "인체 에리트로포이에틴 유사체" 라는 말은 인체 에리트로포이에틴의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상을 변환시켜 시알산 결합을 위한 부위의 수를 증가시킨 에리트로포이에틴을 말하는 것이다. 글리코실화에 유효한 부위를 변형시키는 아미노산 잔기의 부가, 결실 및 치환을 갖는 특정 부위 돌연변이 유발에 의해 유사체를 생산하였다. 이러한 유사체는 인체 에리트로포이에틴보다 큰 수의 탄수화물 사슬을 갖는다.

증가된 생물학적 활성을 갖는 유사체는 에리트로포이에틴 분자의 시알산 함량을 증가시켜 구성하였다. 인체 에리트로포이에틴에서 발견되는 것보다 높은 시알산 수준을 갖는 유사체는 생물학적 활성에 필요한 2차 또는 3차 입체형태를 교란시키지 않는 글리코실화 부위를 가함으로써 생성한다. 바람직하게, 인체 에리트로포이에틴의 유사체는 N-글리코실화 또는 0-글리코실화를 위한 1, 2 또는 3개의 부가적인 부위를 가지고 있다. 예를 들어, 위치 69의 로이신을 아스파라긴으로 치환하여 N-글리코실화에 대한 4번째 부위로 사용되는 Asn - Les - Ser 서열을 제공한다. 이러한 변화는 대개 분자당 4개 이상의 부가적인 시알산을 제공한다. 부가적인 N - 또는 0 - 글리코실화 부위를 생성하는 다른 변화의 예로는 위치 125 및 127의 알라닌을 각각 아스파라긴 및 세린으로, 위치 125의 알라닌을 각각 프롤린 및 트레오닌으로 변형시키는 것이다. 본 분야의 숙련자에 의하여 인지되는 바와 같이, 본 발명은 글리코실화를 위한 부가적인 부위를 갖는 다른 많은 인체 에리트로포이에틴을 포함한다.

본 발명은 에리트로포이에틴 치료에 유용한 보조제 및/또는 담체, 적당한 희석제를 함께 치료학적 유효량의 특정 동형체 또는 동형체 혼합물을 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다. 본원에서 사용한 "치료학적 유효량"은 주어진 조건과 투여섭생에 대해 치료학적인 효과를 제공하는 양을 말한다. 에리트로포이에틴 동형체의 투여는 비경구 경로로 하는 것이 바람직하다. 특정 경로는 치료 대상의 상태에 따라 선택된다. 에리트로포이에틴 동형체의 투여는 인체 혈청 알부민과 같은 적절한 담체, 완충된 식염수와 같은 적절한 희석제 및/또는 적절한 보조제를 포함하는 제제형의 일부로 실시하는 것이 바람직하다. 필요한 복용량은 치료 대상의 적혈구 용적 수준을 증가시키기에 충분한 양이 될 것이고, 또한 치료 대상의 상태의 심한 정도, 사용되는 투여 방법 등에 의해 변할 것이다.

다음의 실시예는 본 발명을 보다 충분히 설명하기 위해 제공하는 것이지 본 발명의 양상을 제한하고자 함은 아니다. 실시예에서 사용된 생체내 생물학적 검정에서 사용한 에리트로포이에틴 표준은 부분적으로 정제된 뇨의 에리트로포이에틴 표준에 대해서 표준화한 재조합 에리트로포이에틴 표준이다. 따라서 생체내 상대적 비활성도만을 측정하였다. 또한 생체내 비활성도는 "단위/ml", "단위/mg" 및 "IU/A₂₈₀"으로 표현하고, "IU/ml", "IU/mg" 및 "IU/A₂₈₀"으로 표현하지는 않는다. 왜냐하면, 사용한 에리트로포이에틴 표준은 존재하는 어떠한 국제 기준 (International standard)과도 직접적으로 관계가 없기 때문이다.

실시예 1 :재조합 에리트로포이에틴 유사체의 분리

Lin, 상기문헌에 기술된 바와 같이 재조합 에리트로포이에틴을 생성한다. 첫째 및 셋째 동형체의 분리에 출발물질로 사용되는 재조합 에리트로포이에틴은 Lai 등의 상기문헌의 실시예 2에 기술된 방법에 따라 정제한다. 둘째 및 다섯째 유사체를 분리하기 위한 출발물질은 Lai 등의 상기문헌에 Q- 세파로스 크로마토그래피를 변형한 방법에 따라 정제한다. 이들 제제는 뇨에서 유도한 인체 에리트로포이에틴과 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 에리트로포이에틴 동형체 혼합물을 포함하며, 주로 9-14의 동형체를 포함한다. 네 번째 동형체의 제조를 위한 출발물질은 Lai등의 실시예 2에서 음이온 교환 컬럼을 5mM 아세트산/1mM 글리신/6M 요소로 세척하는 동안에 용리되는 물질이다. 이 분획은 9개 또는 그 이하의 시알산을 갖는 동형체를 포함하며, 분리용 등전점 전기영동 방법을 사용하기에 앞서 Lai 등의 실시예 2에 기술된 바와 같이 겔 여과 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. 4-13개의 시알 잔기를 갖는 재조합 에리트로포이에틴의 정제된 제제의 출발물질로 여섯 번째 동형체 제제를 사용하였다. 출발물질에 존재하는 대부분의 동형체를 보존할 수 있도록 이온교환 컬럼을 변형(pH 8.4의 염화나트륨 구배로 에리트로포이에틴을 용리하고, 아세트산/요소 세척을 생략)하는 것을 제외하고는 Lai 등의 실시예 2에 의하여 이 물질을 정제하였다.

각각의 동형체의 서로 다른 여섯 개의 제제는 LKB 응용 설명서 198과 같이 과립형 겔 베드(LKB에서 구입한 울트로덱스)에서 분리용 등전점 전기영동을 실시한다. 파말라이트(파마시아에서 구입) 2.5-5 양쪽성 전해질(파마시아에서 구입)을 사용하며, 겔 베드는 5M 요소를 포함한다.

첫 번째 제조에서, 6.8ml의 20mM 시트르산 나트륨/100mM 염화나트륨, pH7.0 내에 있는 약 20mg의 재조합 에리트로포이에틴을 겔에 가하고, 약 16시간 동안 8와트(W)로 전기영동한다. 등전점 전기영동을 실시한 후에, 겔 베드의 종이 밀착인쇄(paper contact print)로 겔 내의 동형체 밴드를 가시화한다. 인쇄된 후에 정착액(40% 메탄올/10% 아세트산/10% TCA/3.5% 술포살리실산)을 3회(실온에서, 각각 약 10분) 스며들게 하여 고정시킨다. 40% 메탄올/10% 아세트산(30-60℃)으로 1회(약 10분) 실시하고, 60℃에서 0.125% 쿠마지에 블루 R-250/40% 메탄올/10% 아세트산에서 15분동안 염색한 다음, 분리한 동형체를 가시화하기 위해 7.5% 메탄올/10% 아세트산에서 탈색시킨다. 동형체를 포함하는 과립형 겔 베드 부위(수지의 50% 이하)를 제거하고, 물을 가하여(∼16㎖), 13.97 x 62.23㎝의 트레이(tray)에 슬러리(slurry)를 넣고 정미 중량(net weight)이 40g 이하가 될 때까지 증발시킨다. 본 제제를 다시 전기영동하고 겔 베드의 밀착인쇄를 앞서 기술한 바와 같이 제조한다. 여섯 가지 구별할 수 있는 동형체 각각을 포함하는 겔의 부분을 겔 베드로부터 제거한다.

겔에서 동형체를 용리하기 위해, 슬러리를 생성하는 각 동형체에 pH7.0의 10mM 트리스-HCl/5mM 챕스(Chaps)를 포함하는 용액을 첨가한다. 작은 컬럼에 슬러리를 넣고 트리스-챕스 완충용액을 사용하여 세척한다. 유출량을 완전히 모으고, pH7.0의 20% 에탄올/10mM 트리스-HCl에 맞춘 바이닥(Vydac) C4역상 수지를 포함하는 작은 컬럼(개방된 컬럼 형태)에 각각 넣는다. pH7.0의 20% 에탄올/10mM 트리스-HCl, pH7.0의 35% 에탄올/10mM 트리스-HCl 및 pH7.0의 65% 에탄올/10mM 트리스-HCl을 사용하여 컬럼을 단계적으로 전개시킨다. 10mM 트리스-HCl을 사용하여 65% 에탄올/10mM 트리스에서 부분 용리한 것을 1:1로 희석하고, 다시 농축한 후에 센트리콘-10(아미콘) 미량농축기를 사용하여 pH7.0의 10mM 트리스-HCl로 완충교환하였다. 5M 요소를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 내에 서발라이트 3-5 암폴린(Servalyte 3-5 ampholines)(서바에서 구입)을 사용한 LKB 기술 설명서 250에 기술된 바와 같이 본 제제의 분석적 등전점 전기영동을 실시하였다.

두 번째 제조에서, 약 26㎎의 재조합 에리트로포이에틴이 함유된 탈염수 6.5㎖를 겔에 가한 후 35분간 2.5와트에서, 약 17시간 동안 10와트에서 전기영동한다. 11개의 다른 풀(pool)과 같이 겔 베드에서 볼 수 있는 전기영동한 단백질의 밴드를 제거한다. 각 풀을 약 7.5㎖의 탈염수에 넣고, 각 20㎖의 수득한 풀 상청액으로 상기한 바와 같이 분석적 등전점 전기영동을 실시한다. 각각의 풀에 상청액으로 상기한 바와같이 분석적 등전점 전기영동을 실시한다. 각각의 풀에 pH8.8, 1.5M의 트리스-HCl 5㎖를 첨가하고, 작은 컬럼에 슬러리를 넣은 후 액상이 컬럼을 통해 흐르도록 한다. pH7, 0.5M의 트리스-HCl 부피의 약 3배로 수지를 세척하고 이 세척 용액을 완전히 흐르게 한 용액과 합한다. 용리액을 농축하고, 10,000 달톤의 분자량 차단장치를 갖는 아미콘 디스포서블(disposable) 초원심분리기를 사용하여 pH7.0의 20mM 시트르산 나트륨/100mM 염화나트륨으로 완충교환한다. 그런다음, 농축된 용액(약 0.5㎖)을 0.22 마이크론 차단장치를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 필터에 통과시킨다. 분석적 등전점 전기영동에 기초를 둔 다섯 개의 풀이 우선적으로 단일 동형체 10, 11, 12, 13 및 14를 포함하는 것을 알 수 있다.

세 번째 제조에서, 약 30㎎의 재조합 에리트로포이에틴이 함유된 증류수 21.8㎖를 겔에 가한 후 25분간 2 와트에서, 20시간 동안 10와트에서, 15분간 15와트에서 전기영동한다. 개개의 동형체에 해당하는 단백질 밴드를 시각적으로 관찰한 후 겔 베드에서 제거한다. 슬러리를 생성하는 겔-분리 동형체에 증류수를 가하여 그 결과 생성되는 상청액을 분석적 등전점 전기영동으로 분석한다. 각 슬러리에 pH7.2, 1M 트리스-HCl과 같은 부피를 가하고, 현탁액을 분리용 작은 컬럼 내에 넣은 후, 동형체를 용리하기 위해서 액상이 컬럼을 통해 흐르도록 한다. 컬럼을 통해 흐른 각각의 용액을 농축하고, 10,000달톤의 분자량 차단장치를 갖는 아미콘 디스포서블 초원심분리기를 사용하여 pH7.0의 20mM 시트르산 나트륨/100mM 염화나트륨으로 완충교환한다. 분석적 등전점 전기영동 겔은 우선적으로 단일 동형체 9, 10, 11, 12, 13 및 14를 포함하는 풀을 수득하였음이 밝혀졌다.

네 번째 동형체 제조에서는 동형체 3-9개(상기한 바와같이 제조함)를 포함하는 에리트로포이에틴을 출발물질로 사용하였다. 상기 제조 1-3과 마찬가지로 분리용 등전점 전기영동을 실시하기에 앞서, 출발물질이 더 낮은 등전점을 갖는데 보다 적합한 양쪽성 전해질의 범위를 산출하기 위해 액상 등전점 전기영동 셀인 로토퍼(미국 캘리포니아 리치몬드에 소재하는 바이오-래드에서 구입)로 양쪽성 전해질(파말라이트 2.5-5)을 미리 분류하였다. 15g의 요소와 6.7mL의 파말라이트 2.5-5를 혼합하여 부피가 50mL가 되도록 정제수를 가함으로써 선(先) 분류를 실시하였다. 10와트, 1℃, 5시간 30분동안에 각각 양극액으로 0.1M 인산을 사용하고 음극액으로 0.1M 수산화나트륨을 사용하여 이 혼합물을 로토퍼로 분류한다. 등전점 전기영동의 플랫-베드에서 pH가 4.5- 약 6으로 측정되는 양쪽성 전해질 분획을 사용하였다.

다음의 매개변수를 사용한 센트리일루터(Centrieluter)(미국 메사츄세츠 댄버에 소재하는 아미콘에서 구입) 및 10,000MW 차단장치인 센트리콘(아미콘에서 구입)을 사용하여 동형체에서 양쪽성 전해질을 제거하였다: pH8.8의 트리스 완충 용액, 100볼트, 25-30mA, 3시간 동안. 동형체는 세파덱스 G-25(파마시아에서 구입)를 사용한 겔 여과에 의해서 0.1M의 염화나트륨으로 완충교환하였다. 분석적 등전점 전기영동으로 형성한 다섯 개의 풀이 동형체 4, 5, 6, 7 및 8을 포함하는 것으로 나타났다. 동형체 4는 몇몇 분해에서 얻은 것과 같은 여러 개의 밴드로 나타났다.

등전점 전기영동 방법의 플랫 베드에 예비-전기영동(pre-focusing) 단계를 첨가하여 다섯 번째 제조 방법을 변형하였다. 본 변형에 있어서, 전기영동에 앞서 양쪽성 전해질/요소/겔 혼합물에는 단백질을 가하지 않고, 겔 베드 내에 pH 구배를 생성한 다음에 등전점 전기영동 장치에 단백질을 가하였다. 75분간(1500볼트-시간) 예비 전기영동한 후에, 음극에서 2.25-4.25㎝의 겔 베드 단면을 제거하였고 에리트로포이에틴 용액과 혼합하여 다시 겔 베드에 가하였다. 등전점 전기영동 다음에, 겔 베드로부터 동형체 10, 11, 12, 13 및 14를 용리하고, 센트리콘-10(아미콘에서 구입) 장치를 사용한 초원심분리에 의해 양쪽성 전해질로부터 상기 동형체를 분리하였다.

출발물질인 재조합 에리트로포이에틴의 자외선 흡광도와 제조한 동형체의 자외선 흡광도가 보다 유사하도록 하기 위해서 예비-전기영동 방법을 변형하였다. 분리된 동형체의 280 및 260 nm에서의 흡광비를 측정하여 스펙트럼 특성을 활용할 수 있다. 제조 2 및 3(예비-전기영동하지 않음)의 동형체에 대해 280nm의 흡광비로 260nm의 흡광비를 나눈(A₂₈₀/A₂₆₀) 평균비는 1.36±0.11인 반면에, 제조 5 및 6(예비-전기영동함) 동형체의 A₂₈₀/A₂₆₀의 평균비는 1.68±0.20이다. 계산에서 동형체 #14를 제외시켰을 때, 제조 2 및 3의 A₂₈₀/A₂₆₀의 평균비는 1.39±0.11이고, 제조 5 및 6의A₂₈₀/A₂₆₀의 평균비는 1.74±0.09이다(유사체 14는 최소량으로 존재하며, 더욱이 양쪽성 전해질 성분에 의한 미량의 오염물로 방해받기 쉽기 때문에 플랫 베드를 이용한 등전점 전기영동 방법을 실시하는 동안에 전극에 가장 근접하기 때문에 가장 불규칙한 스펙트럼을 갖는다). Lai 등의 실시예 2에 의해서 제조한 재조합 에리트로포이에틴의 A₂₈₀/A₂₆₀의 평균비는(음이온 교환 수지인 Q-세파로스를 사용하여 앞서 기술한 바와같이 변형)는 1.91±0.04이다.

상기한 바와같이 동형체 제조 #6의 출발물질은 동형체 4-13을 포함하는 재조합 에리트로포이에틴 제제였다. 양쪽성 전해질은 네번째 제조에 의해서 로토퍼 장치로 예비 전기영동하였다. pH가 3.7 내지 4.8로 측정되는 양쪽성 전해질 분획을 등전점 전기영동의 플랫 베드로 사용하였다. 런(run) #5에서 플랫 베드를 예비-전기영동하고, 운반체인 양쪽성 전해질을 제거하는 초원심분리(센트리콘-10)후에 동형체 9, 10, 11, 12 및 13을 수득하였다.

실시예 2 : 재조합 에리트로포이에틴 동형체의 시알산 함량

실시예 1에 기술된 바와 같이 동형체를 분리하고, Lai등의 상기문헌에서 기술한 방법에 의해 정제한 에리트로포이에틴(동형체 9∼14의 혼합물)은 0.10-0.15M의 염화나트륨으로 완충 교환하며, Jourdian등의 J. Biol.Chem. 246, 430 (1971) 문헌의 변형 방법에 의해 시알산 함량을 분석한다. 30분간 80℃에서 0.35M의 황산으로 가수분해시켜 당단백질로부터 시알산 잔기를 절단하고 그 용액을 분석하기에 앞서 수산화나트륨으로 중화시킨다. 존재하는 에리트로포이에틴 단백질의 양을 측정하기 위해, 표준으로 인체 에리트로포이에틴 아미노산 서열을 갖는 재조합 에리트로포이에틴을 사용한 브래드포드 단백질 검정[Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976) 문헌참조]은 바이오-래드에서 구입한 검정시약 및 미량법을 사용하여 실시한다. 에리트로포이에틴의 몰당 시알산의 몰로 나타내는 결과는 표 1에 나타나 있다. 몰당 시알산의 수 및 가장 약한 산성(동형체 9) ∼ 가장 강한 산성(동형체 13)의 범위에 따라 동형체를 나타낸다. 도 1의 겔 레인 6-10에 동형체 9-13이 나타나 있다. 동형체 14의 양은 시알산 함량을 정확히 측정하기에는 불충분하다. 다른 동형체에 대한 상대적인 IEF 겔 상에서의 이동으로 이 동형체의 시알산 함량을 추측한다. 마찬가지로, 동형체 5-8 (제조 #4)의 시알산 함량을 측정하지는 않았으나 IEF 겔 상에서의 이동으로부터 그들의 시알산 함량을 추측한다.

에리트로포이에틴 동형체	시알산(몰)/에리트로포이에틴(몰)
동형체 13	12.9 ± 0.5
동형체 12	11.8 ± 0.2
동형체 11	11.0 ± 0.2
동형체 10	9.8 ± 0.3
동형체 9	8.9 ± 0.6
동형체 혼합물(9-14)	11.3 ± 0.2

실시예 3 : 재조합 에리트로포이에틴 동형체의 활성

에리트로포이에틴에 존재하는 재조합 에리트로포이에틴의 양을 결정하기 위해 실시예 1에 기술한 바와 같이 분리한 동형체는 280nm에서의 흡광도, 브래드포드 단백질 검정 및 RIA를 통해 검정하였다. 상대적인 생체내 생물학적 활성도를 결정하기 위해서 초저산소성 다혈구증 마우스 생체 검정[Cotes 등의 Nature 191, 1065 (1961)참조]을 실시하였다. 적은 양의 에리트로포이에틴 농축, 게다가 생체내 가장 음성의 동형체에 대해서 높은 상대적 비활성도를 나타내는 다량의 시알산을 포함하는 동형체는 감소된 면역반응성을 나타내기 때문에, 방사선면역측정법을 사용하여 에리트로포이에틴에 존재하는 에리트로포이에틴 단백질을 정량하는 것은 생체내 어떤 동형체에 대해 높은 상대적 비활성도를 갖는 결과를 낳았다. 단위/mg 에리트로포이에틴 폴리펩티드로 나타내는 생체내 비활성도에 대응하는 단백질 농도로, 단위/ml로 나타내는 마우스의 생체 검정 결과를 나눈다. 표 2에서 "n"은 비활성도 수치에 기여하는 독립적인 동형체 제제의 수이다. 대부분의 경우에 있어서 각 동형체 제제로 생체내 몇가지 검정을 실시한다. 생체내 동일한 데이타는 세 개의 모든 컬럼에 대해서 비활성도를 계산할 수 있으며, 방사선면역측정법의 효력 혹은 브래드포드 단백질 검정의 결과, 280nm에서의 흡광도로 단위/mg 에리트로포이에틴 폴리펩티드를 결정하였다. 브래드포드 단백질 검정에서, 유사체 9-14를 포함하는 정제된 재조합 에리트로포이에틴을 표준으로 사용하였다. 브래드포드 검정을 실시했을 때 몇가지 제제를 이용할 수 없었던 것처럼 "n"은 브래드포드 단백질 검정을 사용하여 얻은 계산에 비해 작을 수도 있다.

Lai등의 상기문헌에 기술된 방법에 의해 정제하고 동형체 9-14의 혼합물을 포함하는 에리트로포이에틴은 방사선면역측정법 및 생체내 검정에 표준으로 사용한다.

단위/mg 에리트로포이에틴 폴리펩티드로 나타내는 상대적 비활성도는 0.807mg 에리트로포이에틴 폴리펩티드/A₂₈₀을 곱해서 단위/A₂₈₀으로 전환할 수 있다. mg 에리트로포이에틴 폴리펩티드/A₂₈₀을 얻기 위해서, 환산 계수는 에리트로포이에틴 당단백질의 단백질 함량[중량의 약 60%, Davis등의 Biochemistry 26, 2633 (1987) 참조]을 에리트로포이에틴의 흡광계수(1.345mg/A₂₈₀)로 곱해서 유도한다(즉, 1.345mg 에리트로포이에틴/A₂₈₀x 0.60mg 폴리펩티드/mg 에리트로포이에틴 = 0.807mg 폴리펩티드/A₂₈₀). 또한 단위/mg 에리트로포이에틴 당단백질로 나타내는 비활성도를 제공하기 위해서 단위/mg 에리트로포이에틴 폴리펩티드로 나타내는 비활성도는 계수 0.60mg 폴리펩티드/mg 에리트로포이에틴 당단백질을 곱해준다.

동형체	단위/mG 폴리펩티드(브래드포드 단백질 검정 결과) n	단위/mG 폴리펩티드(A₂₈₀결과) n	단위/mG 폴리펩티드(RIA 결과) n
14	289,400 ± 3,100 2	205,800±37,700 2	366,700±55,900 2
13	307,600 ± 30,600 4	258,700±59,500 5	337,200±40,200 5
12	275,200 ± 55,600 4	258,400±41,700 5	287,700±42,600 5
11	282,700 ± 41,100 3	255,800±67,300 4	251,400±62,700 4
10	188,000 ± 1,900 1	170,300±34,500 3	171,900±31,600 3
9	-	96,600±46,700 2	113,600±39,600 2
8	65,200 ± 3,800 1	70,600± 4,100 1	61,000± 3,500 1
7	46,200 ± 5,800 1	50,300± 6,300 1	42,800± 5,400 1
5	16,600 ± 1,700 1	18,300± 1,900 1	15,500± 1,600 1

또한, 표 2의 자료는 도 2A, 도 2B 및 도 2C에 그래프로 나타나 있다. 이러한 자료는 동형체 #11 까지의 시알산 함량이 작용하는 것과 같이 생체내 에리트로포이에틴의 상대적 활성도가 증가하는 것을 보여주고 있다. 동형체 11-14는 본질적으로 동일한 생체내 상대적 생물학적 활성도를 갖는다. 이는 브래드포드 검정 수치를 사용하여 동형체 14의 농도를 표현할 때 가장 뚜렷이 나타난다. 동형체 14에 대하여 A₂₈₀의 방법으로는 일반적으로 수득률이 낮고 최종 산물 종결에 어려움이 있으며, 앞서 논의한 바와 같이 매우 음형태인 RIA에서는 반응성이 가장 뚜렷하게 감소되었기 때문에 브래드포드 수치가 보다 정확하다. 시알산을 더 가지고 있는 에리트로포이에틴 동형체의 생체내 상대적 비활성도가 큰 이유는 대부분 이러한 형태의 순환 반감기가 길기 때문인 것 같다. 방사성 요오드(¹²⁵I)로 동형체 9와 13을 표식하고 쥐(rat)에서의 이들의 감소율을 측정하였다. 순환 반감기는 동형체 9보다 동형체 13이 훨씬 더 길었다.

실시예 4 : Q-세파로스 크로마토그래피에 의한 재조합 에리트로포이에틴 동형체 혼합물의 선택

Lin의 상기문헌에 기술된 방법에 의해 재조합 에리트로포이에틴의 생성물로부터 세포 조정 배지를 농축하고 pH 7.2의 10mM 트리스로 투석여과한다. 표준으로 소 혈청 알부민을 사용한 브래드포드 미량단백질 검정으로 단백질 농도를 측정한다. 20μM의 CuSO₄내에서 40mg의 전체 단백질을 포함하는 19.6ml의 용액을 제조하여 0.45 마이크론 차단 필터로 여과하고, 4℃에서 pH 6.8-7.0 의 10mM 트리스로 평형화시킨, 4ml의 베드 부피(높이 1.05cm x 직경 2.2cm)를 갖는 Q-세파로스 고속 컬럼에 적하한다. 시료를 가한 후, 동일한 완충용액을 2배의 컬럼 부피로 컬럼을 세척한다. 컬럼의 유출속도는 약 1ml/분이다. 한정된 에리트로포이에틴 동형체 혼합물을 추출하는 본 방법을 사용하여 여섯 개의 각각의 컬럼을 설치하여 한정된 에리트로포이에틴 동형체 혼합물을 선택한다.

다음과 같이 구성한 낮은 pH 완충용액의 6-9 컬럼 부피로 컬럼을 세척한다 : 컬럼 #1, NaOH를 사용하여 pH 4.7로 맞춘 150mM 아세트산, 1mM의 글리신, 20μM의 CuSO₄, 6M 요소; 컬럼 #2, NaOH를 사용하여 pH 4.7로 맞춘 200mM 아세트산, 1mM의 글리신, 20μM의 CuSO₄, 6M 요소; 컬럼 #3, NaOH를 사용하여 pH 4.7로 맞춘 250mM 아세트산, 1mM의 글리신, 20μM의 CuSO₄, 6M 요소; 컬럼 #4, NaOH를 사용하여 pH 4.7로 맞춘 300mM 아세트산, 1mM의 글리신, 20μM의 CuSO₄, 6M 요소; 컬럼 #5, 150mM 아세트산, 1mM의 글리신, 20μM CuSO₄, 6M 요소; 컬럼 #6, 300mM 아세트산, 1mM의 글리신, 20μM CuSO₄, 6M 요소.

10mM 트리스-HCl, 55 mM NaCl, 20μM CuSO₄, pH 7의 8-11 컬럼 부피로 각각의 컬럼을 세척하여 컬럼의 pH를 약 pH 7까지 증가시킨다. pH 7.0의 10mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 20μM CuSO₄로 세척함으로써 한정된 에리트로포이에틴 동형체 혼합물을 컬럼으로부터 용리한다.

각각의 컬럼에서 용리한 동형체 풀을 농축하고 아미콘 센트리콘-10의 미량농축기를 사용한 물로 용매를 교환하였다. 이들 농축된 풀의 분석적 등전점 전기영동 결과는 도 3에 나타나 있다. 겔 레인 1-6은 각각 컬럼 1-6에서 용리한 한정된 에리트로포이에틴 동형체 혼합물을 나타낸다. 도 3의 최우측 겔 레인에 나타나 있는 "동형체 혼합물"은 상기한 바와 같이 Q-세파로스 컬럼에 가하는 세포 배지를 나타내며, 5mM 아세트산, 1mM의 글리신, 20μM CuSO₄, 6M의 요소로 컬럼을 세척하고, 상기한 방법을 사용하여 컬럼에서 에리트로포이에틴 동형체 혼합물을 용리하였다. 분석적 등전점 전기영동에 앞서 Lai등의 상기문헌에 기술된 방법에 따라 용리된 동형체 혼합물을 더 정제한다.

실시예 5 : Q-세파로스 상의 낮은 pH 구배를 사용한 재조합 에리트로포이에틴 동형체의 분획화

또 다른 방법으로, pH 감소 구배 및 이온강도 증가 구배를 사용하여 에리트로포이에틴을 분리한다. 배지를 포함한, 농축하고 투석여과한 에리트로포이에틴을 약 40mg의 총 단백질/mL 겔의 비를 갖는 Q-세파로스 컬럼에 적하한다. 그런 다음, 컬럼 부피의 약 두배가 되는 pH 7.0의 10mM 트리스 HCl 용액을 사용하여 컬럼을 세척한 후, 컬럼 부피의 10배가 되는 2mM 아세트산/1mM의 글리신/20μM CuSO₄/6M 요소(약 pH 8.4)로 세척하여 오염된 단백질 및 약 7개 이하의 시알산 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴 동형체를 제거한다. 6M 요소/1mM의 글리신/약 2mM ∼40mM 아세트산 구배의 20μM CuSO₄/6M 요소/1mM의 글리신/20μM CuSO₄(약 pH 4)가 되도록 제조한 용액을 사용하여 컬럼에서 시알산 약 8개 - 약 12개를 포함하는 동형체를 용리한다. 구배의 전체 부피는 컬럼 부피의 약 40배 이고, 모아진 분획이 낮은 pH에서 장기간 노출되는 것을 피하기 위해서, pH 6-8.5의 범위를 갖기에 충분한 트리스 완충용액 부피를 포함하는 요기에 각각의 컬럼 부피 만큼의 분획을 보은다. 분획의 분취량을 분리시키기 위해 분석적 등전점 전기영동을 실시한다. 도 4는 이러한 방법으로 이루어질 수 있는 동형체 8-11의 분리를 나타내고 있다. 10mM 트리스-HCl, 140mM의 NaCl, 20μM CuSO₄로 이루어진 완충용액(pH 7.0)으로 세척함으로써 구배의 끝에서 컬럼에 결합한 동형체 12-14를 용리한다. Lai등의 실시예 2에서 기술된 바와 같이 역상 크로마토그래피 후에 겔 여과 크로마토그래피를 통해 동형체(구배로 분리하거나 염화나트륨 용액으로 용리한)에서 오염된 단백질을 제거한다.

실시예 6 : 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 인체 에리트로포이에틴 유사체

A. 인체 에리트로포이에틴 유사체의 구성

에리트로포이에틴 아미노산 서열 내에서 제안된 탄수화물 결합 부위의 존재와 위치는 도 5에 나타나 있고, 이들 부가적인 글리코실화 부위를 생성하는 방법을 도 6A 내지 도 6C에 요약해서 나타내고 하기하였다.

실험관내 돌연변이유발에 사용하기 위해서 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:

밑줄친 코돈은 괄호 안에 있는 아미노산의 야생형 아미노산으로 대치된, 잘못대응된 부위를 나타낸다.

[Asn⁴, Ser⁶] EPO를 구성하여 Asn4에 N-글리코실화 부위를 가하였다. [Asn⁹, Ser¹¹] EPO를 구성하여 Asn9에 N-글리코실화 부위를 가하였다. [Asn⁶⁹] EPO를 구성하여 Asn69에 N-글리코실화 부위를 가하였다. [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO를 구성하여 Asn125에 N-글리코실화 부위를 가하였다. [Thr¹²⁵] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO를 구성하여 Thr125에 O-글리코실화 부위를 가하였다.

시험관내 돌연변이유발에 사용하기 위해서 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성한다:

[Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNA에서 출발하여 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO를 생성하는데에 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3'를 사용한다. 그런 다음, [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO를 생성하는데에 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3'를 사용한다.

[Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO 및 [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO를 구성하여 Asn69에 N-글리코실화 부위를 가하고 그 부위에 N-글리코실화를 강화하였다. [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO, [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹] EPO, [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO 및 [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO를 구성하여 Asn125에 N-글리코실화 부위를 부가하고 그 부위에 글리코실화 증가시켰다. [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶,Ser¹³¹] EPO를 구성하여 Thr125에 O-글리코실화를 부가하고 그 부위에 글리코실화를 증가시켰다.

시험관내 돌연변이 유발을 위한 에리트로포이에틴 DNA 원료는 pUC8 내의 인체 에리트로포이에틴 cDNA 클론인 플라스미드 Hu13이었다. [Law 등의. Proc Natl. Acad. Sci. 83, 6920 (1986) 참조] BstEII 및 BglII 제한효소로 Hu13에서 유도한 플라스미드 DNA를 절단하여 그 결과 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동하였고, 제조자(바이오 101, 인코포레이티드)에 의해서 제공된 방법 및 GeneClean^TM키트를 사용하여 겔에서 810 염기쌍(bp)의 에리트로포이에틴 DNA 단편을 분리하였다. Lin 특허, 상기문헌에 기술된 바와 같이, 플라스미드 pBRgHuEPO는 pBR322의 유도체 내로 삽입된 BamHI 단편 처럼 에리트로포이에틴 게놈 유전자를 포함한다. 또한, pBRgHuEPO를 BstEII 및 BglII로 절단하여 6517bp의 벡터 단편을 회복하였다. 두 단편을 결합시켜 그 결과 IGT1이 되었다. BamHI 으로 pDSVL(Lin 특허, 상기문헌에 기술되어 있고, 도 5B에 나타나 있음)을 절단하고 거기에 에리트로포이에틴 cDNA를 포함하는 IGT1에서 분리된 2.8 킬로베이스(kb) BamHI 단편을 결합시켜 pEC-1을 구성하였다.

시험관내 돌연변이를 유발시키기 위한 단일 가닥의 DNA를 생성하기 위해서, BamHI 및 BglII로 pEC-1을 절단하여 820bp의 에리트로포이에틴 cDNA 단편을 분리하였다. m13mp18의 BamHI 부위에 그것을 결합시켜 m13-EC-1을 얻었다. Kunkel 등의 Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) 및 Messing, Methods in Enzymol. 101, 20 (1983)에 기술된 바와 같이, m13-EC-1에 감염된 E. coli 균주 RZ1032 (ATCC 번호 제39737호)의 상청액에서 단일 가닥의 DNA를 회복하였다. 시험관내 돌연변이를 유발시키기 위해서 약 1μg의 단일가닥 DNA 및 0.2 pmole의 상기 합성 프라이머 중 하나를 6ml의 완충용액(pH 7.8의 250mM 트리스, MgCl₂50mM 및 디티오트레이톨 50mM)과 혼합하였다. 주형에 프라이머를 어닐링할 경우, 물을 사용하여 반응물의 부피를 10μl로 조절하였고, 65℃에서 5분동안 혼합물을 가열한 후에 실온까지 냉각하였다. 신장 반응(elongation reaction)을 위해, 각각의 dTTP, dATP, dGTP, dCTP 및 ATP(모두 10μM)를 2.5ml 씩 가한 다음, 1μl(1 단위)의 E. coli DNA 중합효소(클레노 단편) 및 1μl(1 단위)의 T4 DNA 리가아제를 가하였다. 그런 다음, 14℃에서 혼합물을 밤새 항온하였고, Messing, 상기문헌에 기술된 바와 같이 E. coli JM109 (ATCC 번호 제 53323호) [Yanisch-Perron 등의 Gene 33, 103 (1985) 문헌참조]를 형질변환시키는 데 사용하였다.

차동혼성화 방법(differential hybridization)으로 돌연변이 클론을 확인하기 위해서, 영양 한천상의 플라크를 유전자 선별 필터(Gene Screen filter)(New England Nuclear에서 구입)에 옮겼다. 필터를 열 램프하에서 건조시킨 후에, 60℃에서 1% SDS를 포함하는 6 x SSC에서 1시간 동안 항온하였다. 혼성화시키기 위해, γ³²P-표지 ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 말단-표지하였으며, [Asn¹²⁴] 돌연변이의 경우에는 37℃에서, [Asn⁴, Ser⁶] 돌연변이의 경우에는 55℃, [Thr¹²⁵] 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] 돌연변이의 경우에는 65℃, [Asn⁹, Ser¹¹] 및 [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵] 돌연변이의 경우에는 70℃, 100mg/ml의 연어 정자 DNA 및 0.5% SDS를 포함한 6 x SSC 내에서 필터와 밤새 항온하였다. 다음날, 필터를 실온에서 6 x SSC로 3회 세척하였고, 오토래디오그래피를 실시하였다. 그런 다음 필요하다면, 야생형의 에리트로포이에틴 cDNA 서열을 갖는 플라크가 검출되는 혼성화가 거의 혹은 전혀 검출되지 않을 때까지 온도를 증가시켜서 6 x SSC로 필터를 세척하였다. 이러한 조건하에서 양성의 혼성화 시그날을 나타낸 클론을 확인하여 이를 JM109 내로 다시 형질감염시켜 순수한 클론을 분리하였다. 디데옥시 사슬 종결 서열을 분석하여 아스파라긴, 세린, 트레오닌 및 프롤린 잔기의 돌연변이가 존재함을 알아내었다.

[Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹, Ser¹¹], [Asn⁶⁹], [Asn¹²⁴], [Asn¹²⁵], [Ser¹²⁷], [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵] 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] 변이를 수반하는 이중가닥의 m13EC-1 DNA는 형질감염시킨 JM109 세포로부터 비등 방법(boiling method) [Holmes 등의 Anal. Biochem 117, 193 (1981) 참조]에 의해 회복하였다. BstEII 및 XhoII로 DNA를 절단하여 810bp의 에리트로포이에틴 DNA 단편을 분리하였다. BstEII 로 pEC-1을 절단한 다음 BglII로 부분적으로 절단한 후, 그 결과 생성된 단편의 5' 말단을 pH 8, 10mM 트리스 용액 내에서 60℃, 60분 동안 박테리아 알칼리성 포스파타아제로 탈인산화시킨다. 810bp의 BstEII-BglII 단편이 결핍된 7Kb 벡터 단편을 분리하여 이를 상기 에리트로포이에틴 단편에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드 (pEC-X로 나타내며, 여기서 X는 특정 돌연변이를 나타낸다)는 지정된 위치에서 변이된 아미노산 잔기를 갖는 인체 에리트로포이에틴을 포함한다.

인체 에리트로포이에틴 서열의 cDNA 클론과 [Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹, Ser¹¹], [Asn⁶⁹], [Asn¹²⁴], [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷], [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵] 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] 의 에리트로포이에틴 cDNA 클론에 대응하는 유사체를 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해서 COS-1 세포 (ATCC 번호 제 CRL-1650 호) 내로 전이시켰다. 반-융합접시(Semi-confluent dish)에서 COS-1 세포를 수확하여 이 세포를 배지 [5% 송아지 태아 혈청 및 1% L-글루타민/페니실린/스트렙토마이신 (어빈 사이언터픽에서 구입함)을 포함하는 둘베코 필수 배지의 변형 배지]로 세척하였으며, 4 x 10⁶세포/ml로 재현탁하였다. 1ml의 세포를 일렉트로포레이션 큐벳(바이오-래드에서 구입)에 옮기고, 100-200μg의 담체 DNA와 에리트로포이에틴 유사체를 암호화하는 2-20μg의 플라스미드 DNA의 존재하에 25μFarads, 1600볼트에서 바이오래드에서 구입한 Gene PulSer^TM으로 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션된 세포를 5ml의 배지에서 60mm의 조직 배양 접시당 2 x 10⁶세포로 평판배양하였다. 평판배양한 지 2-4시간 후, 5ml의 신선한 배지로 다시 평판배양하였다. 일렉트로포레이션 후, 3-5일 경과시 조정 배지를 모았다.

B. 에리트로포이에틴 유사체 활성도의 검정

Egrie 등의 상기문헌에 따라 RIA를 실시하였다. 초저산소성 다혈구증 마우스의 생체 검정(Cotes 등의 상기문헌 참조)에 의해서 생체내 에리트로포이에틴 유사체의 생물학적 활성도를 측정하였다.

Iscove 등의 J. Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) 문헌에 기술된 바와 같이 적혈구계 군체 형성 검정에 의해 시험관내 에리트로포이에틴 활성도를 측정하였다. 피콜-파크 쿠션(ficoll-paque cushion)상에서 인체 골수 세포로부터 단핵세포를 부분 정제하고, 평판배양하기 전에 이스코브 배지에서 세척하여 부착 세포를 제거하였다. 배양 배지는 0.9%의 메틸셀룰로오스는 함유하지만, 소 혈청 알부민은 전혀 함유하고 있지 않았다. 배양일로부터 8-10일 후에 적혈구계 군체의 수를 세었다.

A 부분에 기술된 바와 같이 COS 세포를 형질감염시키고 형질발현된 에리트로포이에틴 유사체를 정제하지 않은 COS 세포 상청액 내에서 RIA 및 적혈구계 군체 형성 검정에 의해서 분석하였다. 인체 서열 에리트로포이에틴은 앞서 언급한 검정에 의해 측정된 RIA 활성도에 비교할만한 시험관내 활성도를 가지고 있다. 시험관내 유사체 [Asn⁶⁹] EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO, [Thr¹²⁵] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO는 RIL 활성에 비교할 만한 활성도를 가지고 있으며, 부가적인 탄수화물 사슬(C 부분에서 측정한 바와 같이)을 갖는다는 증거를 제공하였다. 에리트로포이에틴 유사체를 암호화하는 cDNA 클론을 CHO 세포 내로 형질감염시키고 에리트로포이에틴 유사체를 정제한 후 정제된 유사체의 생체내 생물학적 활성도를 측정함으로써 이들 유사체를 더 분석한다.

C. 웨스턴 블럿 분석

A 부분에 기술된 바와 같이, 에리트로포이에틴 유사체 cDNA로 형질 감염시킨 COS 세포로부터 5-20 단위를 함유하는 다량의 상청액을 토끼 항-에리트로포이에틴 폴리클로날 항체를 사용하여 실온에서 밤새 면역침강시켰다. 면역침강물에 인산염 완충 식염수(PBS) 내의 20-80μl의 1:1 단백질 A-세파로스를 가하여 실온에서 1시간 동안 항온하였다. 시료를 원심분리하여 PBS로 세척하고 N-글리카나아제로 펠릿을 처리하여 N-결합 탄수화물 사슬을 제거하였다. 상기 시료를 15%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하고, 니트로셀룰로오스로 전이시켰으며 마우스 항-에리트로포이에틴 모노클로날 항체의 혼합물을 사용하여 웨스턴 분석을 실시하였다[Burnette 등의 Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981) ; Elliot 등의 Gene 79, 167-180 (1989) 문헌참조]. 그러한 항체 중의 하나인 9G8A는 Elliot 등의 (1989) Blood 74, Supp. 1, A. 1228 문헌에 기술되어 있다.

[Asn⁶⁹] EPO 및 [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO cDNA로 형질감염시킨 COS 세포 상청액의 분석 결과 인체 서열 에리트로포이에틴에 비하여 단백질의 크기가 증가하였음이 밝혀졌다. 증가된 크기는 부가적인 N-결합 탄수화물 사슬을 나타내는 것이다(도 7 참조). [Thr¹²⁵] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNA로 형질감염시킨 COS 세포로부터의 상청액을 N-글리카나아제로 처리한 결과 인체 에리트로포이에틴 서열에 비하여 단백질의 크기가 증가하였음이 밝혀졌다. 증가된 크기는 부가적인 0-결합 탄수화물 사슬을 나타내는 것이다(도 8 참조).

D. 에리트로포이에틴 유사체 동형체의 분리

A 부분에 기술된 바와 같이 에리트로포이에틴 유사체 [Thr¹²⁵] EPO를 구성하였다. BstEII 및 BglII로 [Thr¹²⁵] 돌연변이를 포함하는 플라스미드 pEC를 절단하여 [Thr¹²⁵] 돌연변이를 수반하는 810bp의 에리트로포이에틴 cDNA 단편을 분리하였고, pDSα2의 유도체인 pDEC△에 상기 단편을 결합시켰다. 일반적으로 PDSα2는 본원에서 참고문헌으로 인용한, 공동 소유 미국 특허 번호 출원 제 501,904호에 기술되어 있다. pDEC△는 다음 단계를 걸쳐 pDSα2로부터 유도하였다:

(1) HindIII로 pDSα2 DNA를 절단하고, E. coli DNA 중합효소(클레노 단편) 및 dNTP로 HindIII 점착 말단을 처리하고, 무딘 말단 벡터를 재결찰시킴으로써 PDSα2의 HindIII 부위를 삭제하였다. 그 결과 생성된 플라스미드가 pDSα2△H였다.

(2) pDSα2△H를 Sall으로 절단하고, SV40 스플라이스 시그날의 3' 말단에 결합된 SalI 링커를 수반하는 SV40 스플라이스 시그날을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 상기 SalI으로 절단한 pDSα2△H에 결합시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드는 다음의 서열을 갖는다:

그 결과 생성된 플라스미드는 pDSα2△H 스플라이스였다.

(3) pDSα2△H 스플라이스를 Sall으로 절단하고, T4 DNA 중합효소 및 dNTP로 점착성 말단을 처리함으로써 무딘 말단을 형성하였다. 같은 방법에 의해 820bp의 BamHI-BglII 인체 에리트로포이에틴 cDNA 단편의 무딘 말단을 형성하고, 이를 플라스미드에 결찰시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드는 pDEC 였다.

(4) pDEC를 KpnI 및 PvuII로 절단하고, 뭉 빈 뉴클레아제(mung bean nuclease)로 점착성 말단을 처리함으로써 무딘 말단을 형성하였다. 플라스미드를 재결찰시켜 절단한 KphI-PvuII 단편을 삭제하였다. 그 결과 플라스미드 pDEC△가 생성되었다.

[Thr¹²⁵] 에리트로포이에틴 cDNA를 함유하는 플라스미드 pDEC△ DHFR- 결핍 CHO 세포 내로 형질감염시켰다. 770ml의 CHO 세포 조정 배지를 10,000 달톤 분자량 차단막을 사용하여 농축하고 pH 8.6, 10mM 트리스-HCl로 최종 부피가 34ml가 될 때까지 투석여과하였다. 같은 완충용액으로 평형화시킨 Q-세파로스 고속 컬럼(5ml 의 베드 부피)에 농축액의 분취량인 17ml를 적하하고, pH 8.6, 10mM 트리스-HCl 내에서 직선 구배의 0-250mM NaCl로 용리하였다. N-글리카나아제로 처리되지 않았거나 절단된 컬럼 분획의 분취량을 SDS-PAGE 또는 IEF로 분석하였으며, 유사체 및/또는 그 분획의 탄수화물 조성물을 기초로 풀(2,3,4로 표시된)을 제조하였다. 각각의 풀을 바이닥 C4 컬럼(214 TPB 2030 ; 1cm의 직경; 1.8-2.5ml의 베드 부피 : 0.34ml/분)에 적하하고 pH 7.0, 10mM 트리스-HCl 내의 20% 에탄올의 2배 컬럼 부피로 세척하였다. 컬럼을 pH 7.0, 10mM 트리스 내의 직선 구배 20-94% 에탄올로 용리하였다. 풀을 제조하여 pH 7.0, 10mM 트리스-HCl로 희석한 후 Q-세파로스 고속 컬럼에 적하하였다. pH 7.0, 10mM 트리스-HCl로 세척한 후, 시료를 pH 7.0, 20cm 시트르산나트륨, 250mM NaCl 로 용리하였다. 정제된 [Thr¹²⁵] 풀을 IEF로 분석하여 제 9 도에 나타내었다. Cotes등의 상기문헌에 기술된 바와 같이 EPO 유사체의 생체내 생물학적 활성도를 분석하였다.

본 발명을 바람직한 실시예로 기술하였으나, 이는 첨부된 특허청구의 범위의 의도 및 범위 내의 다양한 대응을 포함하고자 함이지 밝혀진 실시예로 제한하려는 것은 아니며, 상기 범위는 상기 모든 변형과 대응을 포함하는 가장 광범위한 해석을 의미한다.

Claims

에리트로포이에틴 분자당 10, 11, 12, 13 또는 14개의 시알산을 갖고 또 천연 산출의 인체 에리트로포이에틴의 아미노산 서열을 갖는 분리 정제된 에리트로포이에틴 동형체.
제1항에 있어서, 동형체가 인체 이외의 진핵 숙주세포중에서 외인성 DNA의 발현 산물인 분리 정제된 에리트로포이에틴 동형체
제2항에 있어서, 진핵 숙주 세포가 CHO 세포인 분리 정제된 에리트로포이에틴 동형체.
정제된 에리트로포이에틴을 분리용 등전점 전기영동처리시키는 단계; 및 에리트로포이에틴 분자당 10, 11, 12, 13 또는 14개의 시알산을 갖는 단일 동형체를 겔로 부터 용리하는 단계로 이루어지는 제1항 내지 제3항중 어느 하나에 따른 에리트로포이에틴 동형체의 제조방법.
제1항 내지 제3항중 어느 하나에 따른 에리트로포이에틴 동형체의 혼합물.
제5항에 있어서, 11 내지 14개의 시알산 또는 12 내지 14개의 시알산을 갖는 에리트로포이에틴 동형체의 혼합물인 혼합물.
치료 유효량의 제1항 내지 제3항중 어느 하나에 따른 에리트로포이에틴 동형체 또는 제5항 또는 제6항에 따른 혼합물과 함께 제약학적으로 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 포함하는 적혈구 용적 수준을 증가시키기 위한 제약학적 조성물.
에리트로포이에틴을 함유하는 물질을 이온교환 크로마토그래피처리시키는 것을 포함하는 제5항 또는 제6항에 따른 에리트로포이에틴 동형체의 혼합물의 제조방법.