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JPWO2010071206A1 - ｓｉＲＮＡ転写／発現用ＤＮＡコンストラクト及びその利用 - Google Patents

ｓｉＲＮＡ転写／発現用ＤＮＡコンストラクト及びその利用 Download PDF

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謙造 廣瀬
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Abstract

本明細書の開示は、細胞へのｓｉＲＮＡの異なる供給形態に対応できるＤＮＡコンストラクトを提供する。本明細書に開示されるＤＮＡコンストラクトは、動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有し、前記第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有する、ハイブリッドプロモーターを備えるようにする。

Description

本願は、２００８年１２月１８日に出願された日本国特許出願 特願２００８−３２２８４６を基礎とする優先権を主張するものであって、その明細書に記載の全内容は、参照により本願の明細書に組み込まれる。
本発明は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ interference）やそのほか遺伝子調節機能を発揮するＲＮＡを、動物細胞内での転写反応によって生体内で発現させるとともに、試験管内の転写反応により生体外で得ることのできる、ＲＮＡ作製用のＤＮＡコンストラクト及びその利用に関する。
細胞内においてタンパク質に翻訳されないＲＮＡが遺伝子調節機構の一部を担っていることが知られている。なかでも、こうした機能的ＲＮＡとしては、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等などの各種ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が知られている。
例えば、ＲＮＡｉは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列からなるセンスＲＮＡとこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡとからなる短鎖の二重鎖ＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）が、標的遺伝子のｍＲＮＡの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制する現象である。ＲＮＡｉはノックダウン細胞や動物の作製による遺伝子機能解析のほか、核酸医薬への応用、創薬標的遺伝子の探索手法として期待されている。また、ｓｉＲＮＡは、配列特異的にｍＲＮＡを分解するが、配列によって大きく発現抑制能が相違する。このため、標的遺伝子中の抑制効果の高い配列を特定するのが重要である。
このようなＲＮＡｉを細胞内で生じさせるにあたり、細胞内にｓｉＲＮＡを供給する形態として大きく分けて２つの態様がある。一つは、細胞外で準備したｓｉＲＮＡを細胞に導入する方法である。この場合、さらに、化学合成による場合と、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等を利用したインビトロ転写反応による酵素的な合成による場合とが挙げられる。
他の一つは、Ｕ６ＲＮＡポリメラーゼ等を利用したｓｉＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入して細胞内での転写反応によりｓｉＲＮＡを発現させる方法である（特許文献１）。この場合には、さらにベクターとしてプラスミドを利用する形態とウイルスを利用する形態が挙げられる。
前者の方法では、合成ＲＮＡはコストが高く多様な標的配列を準備するのが困難であり、インビトロ転写反応による場合であっても、多数の標的配列を転写するためのベクターを準備する必要がある。また、予め抑制効果のある標的配列をデザインするのは困難である。さらに、前者の方法は、ｓｉＲＮＡさえ入手できれば簡易で迅速な方法ではあるが遺伝子発現抑制効果が一過性であり、また導入効率が問題となる場合もある。
一方、後者の方法は、細胞内でのｓｉＲＮＡ発現により継続的なＲＮＡｉ効果が期待できるが、標的配列をデザインする困難性は前者の方法と同様である。
さらに、近年、ＤＮＡからの網羅的なｓｉＲＮＡライブラリの構築方法も開発されてきている（特許文献２）。この方法では、所望の標的遺伝子から網羅的にｓｉＲＮＡ発現構築物を取得し、この構築物を適当なベクターに接続してｓｉＲＮＡライブラリとすることが記載されている。このようなライブラリによれば、網羅的に標的配列を探索できる可能性がある。
再公表２００３−０４１８６号公報 再公表２００５−０６３９８０号公報
以上のように、研究者等は、ｓｉＲＮＡの研究等の目的のために効果的なｓｉＲＮＡの供給形態に応じて異なる手法でｓｉＲＮＡを準備していた。このことは、ＲＮＡｉの各種用途開発において多大な労力を生じさせていた。
すなわち、抑制効果の高い配列の予測は現在までのところ困難であるため、ある特定の標的遺伝子に対して発現抑制効果の高い配列を探索するには、可能性ある標的配列を網羅するｓｉＲＮＡを準備することが望まれる。この場合、一過性の発現抑制効果に基づき抑制効果の高い配列の一次スクリーニングを行い、継続的な発現抑制効果に基づいて二次スクリーニングを行うことが合理的である。
しかしながら、かかる一次スクリーニングのために、上記前者の方法で網羅的に多数のｓｉＲＮＡを作製するには多大なコスト及び労力が必要である。その上、二次スクリーニングのために、一次スクリーニング結果に基づいて別途ｓｉＲＮＡ発現コンストラクトを準備しなければならない。
さらに、上記ｓｉＲＮＡライブラリに含まれる網羅的なｓｉＲＮＡ発現ベクターを利用して最初から継続的な発現抑制効果に基づくスクリーニングを行うこともできるが、細胞内での発現を前提とする以上、やはり迅速な有効な標的配列の選択やノックダウン効果の確認には不向きな場合もある。
同様の問題が、塩基対合依存的に遺伝子調節機能を発揮すると考えられるＲＮＡであるアンチセンスＲＮＡやｍｉＲＮＡにも存在していると考えられる。
そこで、本発明は、より実用的な、すなわち、細胞へのＲＮＡの異なる供給形態に容易に対応できるＲＮＡ作製用のＤＮＡコンストラクト及びその利用を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記した課題を解決するために、in vivo（細胞内）においてもＲＮＡポリメラーゼで転写され、in vitro（試験管内）でもＲＮＡポリメラーゼによって転写されてＲＮＡを取得可能なＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトの構築を目指した。本発明者らは、in vivo及びin vitroで作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応が可能なハイブリッドプロモーターによれば、機能的ｎｃＲＮＡの供給形態に応じて、すなわち、in vitroでｓｉＲＮＡを合成するとともに、in vivo又は細胞内でｓｉＲＮＡを発現させることできることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
本発明によれば、動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有し、前記第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有する、ハイブリッドプロモーター、を備える、ＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトが提供される。
本発明のＤＮＡコンストラクトにおいては、前記第１のプロモーター活性配列は、Ｕ６プロモーター活性を有する配列及びＨ１プロモーター活性を有する配列のいずれかとすることができる。より好ましくは、Ｕ６プロモーター活性を有する配列である。
本発明のＤＮＡコンストラクトにおいては、前記第２のプロモーター活性配列は、Ｔ７プロモーター活性を有する配列、Ｔ３プロモーター活性を有する配列及びＳＰ６プロモーター活性を有する配列からなる群から選択されてもよく、Ｔ７プロモーター活性を有する配列とすることが好ましい。
本発明のＤＮＡコンストラクトにおいては、前記ハイブリッドプロモーターは、前記第１のプロモーター活性配列中にＴＡＴＡボックスボックス配列を有し、該ＴＡＴＡボックス配列より３’側に前記第２のプロモーター活性配列の置換、挿入及び付加のいずれかがなされた塩基配列を有していてもよい。
本発明のＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトは、また、前記ハイブリッドプロモーターは、前記第１のプロモーター活性配列がＵ６プロモーター活性を有する配列であり、前記第２のプロモーター活性配列がＴ７プロモーター活性を有する配列であることが好ましく、さらに好ましくは、前記第１のプロモーター活性配列がＴＡＴＡボックス配列を有し、該ＴＡＴＡボックス配列より３’側に前記第２のプロモーター活性を有する配列が置換、挿入又は付加されていることが好ましい。
本発明のＤＮＡコンストラクトは、前記ハイブリッドプロモーターは、以下のいずれかの配列：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、付加及び挿入のいずれかを有する塩基配列
からなるとすることができる。
本発明のＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであってもよい。本発明のＤＮＡコンストラクトは、さらに、前記ハイブリッドプロモーターの制御下で転写可能に連結されるセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを備えることができる。
本発明によれば、ＲＮＡの作製方法であって、上記いずれかのＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトを用いてin vitro転写反応又は細胞内での発現によりＲＮＡを作製する、方法が提供される。
本発明によれば、細胞にｓｉＲＮＡを供給して標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、上記のＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記標的遺伝子のいずれかの領域のセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡを供給する工程を備える、方法が提供される。
本発明によれば、細胞にＲＮＡを供給して標的遺伝子発現を調節する方法であって、上記のＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内にＲＮＡを供給する工程を備える、方法が提供される。
本発明によれば、ＲＮＡの機能解析方法であって、上記のＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、動物細胞内にＲＮＡを供給する工程と、前記ＲＮＡを供給した前記動物細胞と前記ＲＮＡを供給しない細胞とを対比して前記ＲＮＡの機能を評価する工程と、を備える、方法が提供される。
本発明によれば、動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有し、前記第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有するハイブリッドプロモーターの制御下で転写可能に標的遺伝子のいずれかの領域に対するセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを保持する、細胞が提供される。この種の細胞は、動物細胞であることが好ましい。
本発明によれば、動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有し、前記第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有するハイブリッドプロモーターの制御下で転写可能に標的遺伝子のいずれかの領域に対するセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを保持する、非ヒト哺乳動物も提供される。
本発明によれば、動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有し、前記第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と、前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有する、ハイブリッドプロモーターが提供される。
本発明のハイブリッドプロモーターは、以下のいずれかの配列：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、付加及び挿入のいずれかを有する塩基配列
からなることができる。
本発明によれば、ｓｉＲＮＡライブラリの作製方法であって、標的遺伝子に対してｓｉＲＮＡとして機能する可能性のある二重鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれコードするセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを準備する工程と、前記各ＤＮＡ鎖を、請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡコンストラクトの前記ハイブリッドプロモーターの制御下で転写されて可能性あるｓｉＲＮＡ又はその前駆体を発現可能に連結する工程と、を備える、作製方法が提供される。
本発明によれば、前記ＤＮＡ鎖の準備工程は、前記標的遺伝子を酵素的に分解することを含む工程とすることができる。
本発明によれば、ｓｉＲＮＡライブラリであって、１種又は２種以上の標的遺伝子についての複数種類のセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡのそれぞれを、請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡコンストラクトの前記ハイブリッドプロモーターの制御下で転写可能に備えるコンストラクト含む、ライブラリが提供される。
本発明のライブラリにおいて、前記センスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡは、前記標的遺伝子を酵素的に分解して得られたＤＮＡ断片を含むことができる。
本発明によれば、ＲＮＡｉに有用な標的配列のスクリーニング方法であって、上記いずれかのｓｉＲＮＡライブラリを準備する工程と、前記準備したｓｉＲＮＡライブラリの前記ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び／又は細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記センスコードＤＮＡ及び前記アンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡｓｉＲＮＡを供給する工程と、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を測定する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
本発明によれば、疾患の予防又は治療に有用な標的配列のスクリーニング方法であって、前記疾患に関連する１種又は２種以上の標的遺伝子について、上記いずれかのｓｉＲＮＡライブラリを準備する工程と、前記準備したｓｉＲＮＡライブラリの前記ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び／又は細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記センスコードＤＮＡ及び前記アンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡを供給する工程と、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を測定する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
本発明によれば、疾患の予防又は治療に有用な創薬標的遺伝子のスクリーニング方法であって、前記疾患に関連する可能性のある標的遺伝子について、請求項１５又は１６に記載のｓｉＲＮＡライブラリを準備する工程と、前記準備したｓｉＲＮＡライブラリの前記ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び／又は細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記センスコードＤＮＡ及び前記アンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡを供給する工程と、前記細胞における前記ｓｉＲＮＡの供給前後の変化を測定する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
本発明によれば、疾患の予防又は治療に有用なモデル動物の作製方法であって、前記疾患に関連する可能性のある標的遺伝子について、上記に記載のｓｉＲＮＡライブラリを準備する工程と、前記準備したＲＮＡライブラリの前記ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び／又は細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記センスコードＤＮＡ及び前記アンチセンスコードＤＮＡに由来するＲＮＡを発現可能な胚を作製する工程と、前記胚から個体を作製する工程と、を備える、作製方法が提供される。
本発明のハイブリッドプロモーターの一例を示す図である。 本発明のＤＮＡコンストラクトにおけるセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡの配置例（タンデム型及びステムループ型）を示す図である。 レトロウイルスベクターを示す図である。 レンチウイルスベクターを示す図である。 レトロウイルスベクターの構築スキームを示す図である。 レンチウイルスベクターの構築スキームを示す図である。 ｉｒｅｃｏプロモーター及びその直下の配列とsiRNAコード配列の挿入手法を示す図である。 ｉｒｅｃｏＵ６プロモーターとＵ６プロモーターのＲＮＡｉ効果を示す図であり、グラフの縦軸は相対減少度（平均値±標準偏差 ｎ＝４）、横軸はｉｒｅｃｏＵ６プロモーターもしくはＵ６プロモーターに組込んだｓｉＲＮＡの配列を示す。 in vitro転写反応によって作製したｓｉＲＮＡのＰＡＧＥ解析の結果を示す図であり、Ｍはマーカーを示す。 in vitro転写ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を示す図であり、グラフの縦軸は相対減少度（平均値±標準偏差、ｎ＝４）、横軸はｓｉＲＮＡの配列と濃度を示す。 レトロウイルスベクターを用いて導入したｉｒｅｃｏＵ６プロモーター及びＵ６プロモーターによるＲＮＡｉ効果を示す図であり、グラフの縦軸は相対減少度の平均値を、横軸はｓｉＲＮＡの配列を示す。図１１（ａ）は、マルチコピー感染（推定平均３〜５コピー）によるＲＮＡｉ効果を示し、図１１（ｂ）は、は１コピー感染のＲＮＡｉ効果を示す。 レンチウイルスベクターを用いて導入したｉｒｅｃｏＵ６プロモーターのＲＮＡｉ効果を示す図である。グラフの縦軸は相対減少度（平均値）、横軸はｓｉＲＮＡの配列を示す。
本発明は、in vitro転写反応及び細胞内（in vivo）での発現での双方において必要に応じてＲＮＡを細胞に供給できるハイブリッドプロモーター及びその利用に関し、詳しくは、当該ハイブリッドプロモーター、当該ハイブリッドプロモーターを備えるＲＮＡ作製用のＤＮＡコンストラクト、当該ＤＮＡコンストラクトを用いるＲＮＡの作製方法、ｓｉＲＮＡイブラリの作製方法、ｓｉＲＮＡライブラリ及びスクリーニング方法等に関する。
本発明のハイブリッドプロモーターは、動物細胞内で作動するＲＮＡポリメラーゼIII依存性である第１のＲＮＡポリメラーゼの転写開始配列の上流側に配置され第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有しており、第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有している。
本発明のハイブリッドプロモーターによれば、第１のＲＮＡポリメラーゼ及び第２のＲＮＡポリメラーゼのそれぞれによって認識され、その下流側に連結されたセンスコードＤ名及びアンチセンスコードＤＮＡがそれぞれのＲＮＡポリメラーゼによって転写される。このため、このハイブリッドプロモーターの下流側に標的遺伝子のいずれかの領域の塩基配列に依存して作用する可能性のあるＲＮＡをコードするＤＮＡを連結することで、かかるＲＮＡをin vitro転写反応経由及び細胞内の発現経由でもいずれでも細胞内に供給できるようになる。したがって、標的遺伝子のいずれかの領域のセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡを連結することで、ｓｉＲＮＡをin vitro転写反応経由及び細胞内の発現経由でもいずれでも細胞内に供給できるようになる。
また、本発明のハイブリッドプロモーターを用いることで、容易にｓｉＲＮＡの供給形態を切替えすることができる。すなわち、本発明のハイブリッドプロモーターの制御下にセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを連結することでin vitro転写反応でも細胞内発現でもＲＮＡを取得できるため、細胞外からＲＮＡを供給することによる迅速なノックダウンや標的配列スクリーニングも、細胞内でＲＮＡを発現させることによる効率的かつ継続的なノックダウンも必要に応じて容易に実施できる。従来、こうした異なるＲＮＡの供給のための労力を省略又は低減して効率化することができる。
さらに、本発明のハイブリッドプロモーターを用いることで、ｓｉＲＮＡの細胞への供給形態に応じたｓｉＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトのほか、網羅的に抑制効果の高い可能性あるｓｉＲＮＡを包含するｓｉＲＮＡライブラリの提供、並びにハイスループットなスクリーニング方法の提供が可能となる。
本明細書において、ＲＮＡは、tＲＮＡ、ｒＲＮＡ以外のノンコーデーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を意味しており、好ましくは、塩基配列依存的に遺伝子発現調節に関与するｎｃＲＮＡを意味する。より具体的には、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む）、アンチジーンＲＮＡｉ（ａｇＲＮＡ）を包含する。なお、「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内においてｓｉＲＮＡとして機能するＲＮＡを包含しており、例えば、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含む。これらの各種ＲＮＡの長さ（塩基長）は、その種類に応じて異なるほか、同種のＲＮＡでも大きく異なる場合がある。例えば、ｍｉＲＮＡは、２２塩基程度であることが多く、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ：〜１０００塩基程度になることもあり、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは７０塩基程度であることが多く、アンチセンスＲＮＡは、数１００〜数１０００塩基程度に及ぶこともある。
以下、本発明の各種実施形態を、適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本発明のハイブリッドプロモーターの一例を示す図であり、図２は、本発明のＤＮＡにおけるセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡの配置形態を示す図である。
（ハイブリッドプロモーター）
本発明のハイブリッドプロモーターは、動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有することができる。
動物細胞は、ヒト及び非ヒト動物の双方を含んでいる。非ヒト動物としては、哺乳類であるマウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、サル等が挙げられる。また、脊椎動物としては、魚類、両性類、爬虫類、鳥類が挙げられる。なお、ＲＮＡ干渉は、昆虫や線虫をはじめ、ショウジョウバエ、マウス、ハムスター、ヒト等において確認されている。
第１のプロモーター活性配列としては、公知のＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーターが挙げられる。典型的には、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルス ＶＡ１プロモーター、５Ｓ ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ ＲＮＡプロモーターが挙げられる。
好ましくは、転写開始配列よりも下流側にプロモーター配列を有しないＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーターである。すなわち、転写開始配列の上流側のみにおいてプロモーター配列を有するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターである。こうしたＲＮＡポリメラーゼIIIによれば、プロモーター直後に任意の配列を挿入して転写させることができる。転写開始配列の上流側にのみプロモーター配列を有するプロモーターとしては、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーターが挙げられる。
Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターは、それぞれ低分子核内ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）（Ｕ６）とヒトＲＮアーゼＰ（ｈｕｍａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ）ＲＮＡ Ｈ１のプロモーターであり、ＰｏｌIII転写系のＴｙｐｅIIIに属する。ＴｙｐｅIIIのプロモーターには転写に必要な保存された配列として、近位配列要素（ＰＳＥ：ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、Ｓｔａｆ−結合サイト、遠位配列要素（ＤＳＥ：ｄｉｓｔａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、及びＴＡＴＡボックスが存在する。本発明のハイブリッドプロモーターにおける第１のプロモーター活性配列は、好ましくはＵ６プロモーター配列である。
例えば、ヒトＨ１プロモーター配列としては、GenBankアクセッション番号S68670に開示される配列が挙げられる。また、マウスＵ６プロモーター配列としては、同アクセッション番号X07425に開示される配列が挙げられる。さらに、ヒトＵ６プロモーター配列としては、同アクセッション番号X06980に開示される配列が挙げられる。なお、第１のプロモーター活性配列は、これらに限定されないで、これらの配列に対して１個又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び付加のいずれかあるいは２種類以上がなされたものであってもよい。こうした塩基配列上における塩基の置換等は、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異を導入してもよい。
第２のプロモーター活性配列は、試験管内で作動可能なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの活性を有していればよい。このようなプロモーターとしては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターあるいはそれに類似したプロモーターが挙げられる。こうしたプロモーターとしては、例えば、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、ＳＲ−αプロモーター等が挙げられる。なかでも、試験管内での転写に有利なＴ３プロモーター、Ｔ７プロモーター及びＳＰ６プロモーターが好ましい。本発明のハイブリッドプロモーターにおいては、第２のプロモーター活性配列として、好ましくはＴ７プロモーター配列を用いる。
本発明のハイブリッドプロモーターは、第１のプロモーター活性を有する配列に対して、第２のプロモーター活性を有する配列による置換、挿入及び付加のいずれかがなされた配列を有している。これらのプロモーターは、いずれも同一方向を指向して配列されており、双方の配列の下流側に配置されたセンスコードＤＮＡ及び／又はアンチセンスコードＤＮＡを転写するように構成されている。２種類のプロモーター活性を有する配列を同方向にハイブリッド化し、下流側にセンスコードＤＮＡ及び／又はアンチセンスコードＤＮＡすることで、in vitroでもin vivoでも一つのＤＮＡコンストラクトから容易にＲＮＡを得ることができる。
第１のプロモーター活性を有する配列と第２のプロモーター活性を有する配列とのハイブリッド形態は、第１のプロモーター活性と第２のプロモーター活性とを発揮できる限り特に限定されないが、例えば、第１のプロモーター活性配列が、遺伝子外部にある場合、すなわち、Ｐｏｌ III系のＴｙｐｅ IIIプロモーターの場合、転写に必要な各種要素（近位配列要素、Ｓｔａｆ−結合サイト、遠位配列要素及びＴＡＴＡボックス）以外の領域において第２のプロモーター活性配列が置換、挿入又は付加されていることが好ましい。より好ましくは、第１のプロモーター活性配列の３’側末端近傍に配置において置換されていることが好ましい。なかでも、第１のプロモーター活性配列のＴＡＴＡボックス配列より３’側において第２のプロモーター活性を有する配列により置換されていることが好ましい。ＴＡＴＡボックス配列より下流側における置換においては、第１のプロモーター活性を有する配列のＴＡＴＡボックス配列から転写開始点までの距離を維持して置換されることがより好ましい。
また、第１のプロモーター活性配列に対する転写開始点と第２のプロモーター活性配列に対する転写開始点とを一致させることが好ましい。例えば、第１のプロモーター活性配列（Ｕ６プロモーターやＨ１プロモーター等）に対する転写開始点は、プリン塩基（好ましくはＧである。）であることが好ましいとされていることが多い。また、第２のプロモーター活性配列（Ｔ７プロモーターやＴ３プロモーター等）に対する転写開始点もプリン塩基（Ａ／Ｇ）であることが好ましいとされていることが多い。したがって、第１のプロモーター活性配列及び第２のプロモーター活性配列に対する共通の転写開始点としてプリン塩基を配置することができる。転写開始点を一致させることで、in vitroでもin vivoでも同一配列の転写物を容易に得ることができる。このため、スクリーニング精度も向上される。
第１のプロモーター活性配列と第２のプロモーター活性配列との好ましい組み合わせとしては、以下の表１に示す組み合わせが挙げられる。なかでも、Ｕ６プロモーターとＴ７プロモーターとの組み合わせが好ましい。Ｕ６プロモーターとＴ７プロモーターとのハイブリッドプロモーターにおいては、Ｕ６プロモーターのＴＡＴＡボックス配列の３’側において、Ｕ６プロモーターの転写開始点（＋１）のグアニンにＴ７プロモーターの転写開始点となるグアニン塩基が一致するように置換することが好ましい。このようなハイブリッドプロモーターの配列の一例を図１に示す。
第１のプロモーター活性と第２のプロモーター活性を有している限り、配列番号１で表されるハイブリッドプロモーターの配列に対し１又は複数個の塩基の置換、欠失、付加及び挿入がなされた配列を本発明のハイブリッドプロモーター配列として利用できる。なお、このような塩基配列上の改変は、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異を導入してもよい。
なお、ハイブリッドプロモーターについては、さらに他の改変がなされていてもよい。例えば、第１のプロモーター活性配列として、誘導可能なプロモーターの配列を用いることで、所望のタイミングでＲＮＡを発現させることも可能となる。このような誘導可能なプロモーターとしては、テトラサイクリンで誘導可能なＵ６プロモーター（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．＆ Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｂｙ ａ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｎＲＮＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１，５７７−５８５（２０００））等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモーター、あるいはＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムのようなＤＮＡ組み換えのシステムを用いて、組織特異的にＲＮＡの発現を誘導してもよい。
また、例えば、組換え酵素を用いてＲＮＡの生成を制御してもよい。組換え酵素としてＣＲＥ−ｌｏｘＰの系を用いて、Ｈ１プロモーターやＵ６プロモーター等の第２のプロモーター活性配列中のプロモーター内のＤＳＥとＰＳＥとのそれぞれの近傍にｌｏｘＰ配列を備えさせ、ＤＳＥ−ＰＳＥ間距離をプロモーター活性がオフとなる程度離間させておき、ＣＲＥタンパク質の作用により、ｌｏｘＰ配列間で組換えを生じさせて、ＤＳＥ−ＰＳＥ距離をプロモーター活性がオンとなるようにすることができる。なお、ＣＲＥタンパク質の作用によりプロモーター活性をオフとすることもできる。
（ＤＮＡコンストラクト）
本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のハイブリッドプロモーターを備えている。本発明のＤＮＡコンストラクトは、in vitro転写反応と細胞内での発現によるＲＮＡの供給を必要に応じて便利に切替え利用できるコンストラクトである。したがって、一旦本発明のコンストラクトを構築することで、双方のＲＮＡの供給形態に利用でき、効率的にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ等の各種の機能的ＲＮＡによる遺伝子発現調節作用等に基づく各種アプリケーションを実施できる。特に、in vitro及び細胞内（in vivo）でのＲＮＡ供給を容易に切替できるので、細胞レベルのアプリケーションから動物レベルのアプリケーションまでを広くカバーできる。
本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のハイブリッドプロモーターを備えている限り、どのような形態であってもよい。複数の本発明のハイブリッドプロモーターを備えていてもよい。また、ＤＮＡコンストラクトは、ベクターの形態を採ることが好ましい。本発明のＤＮＡコンストラクトのベクター形態は、後述するＲＮＡｉライブラリに構築に適用する細胞種や導入したい細胞により選択することができる。
ベクター形態を採る本発明のＤＮＡコンストラクトは、例えば、大腸菌等のバクテリアで増幅が可能なプラスミド骨格を備えていることができる。このようなプラスミドとしては、例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ベクターは、導入したい細胞やＲＮＡｉ効果の発現態様などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクター等が挙げられる。
これらのベクターには、必要に応じて薬剤選択マーカーなどを保持させることができる。薬剤選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。また、このほか、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、ＧＦＰなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。
本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のハイブリッドプロモーターの下流側に、ハイブリッドプロモーターの第１のプロモーター活性配列に依存して転写反応を行う公知のＲＮＡポリメラーゼIIIの転写終結配列（ターミネーター配列）を備えることもできる。in vitroでも、ＲＮＡポリメラーゼIIによる転写反応を終結させるには、当該ＲＮＡポリメラーゼの転写終結配列を備えることが好ましい。また、ＲＮＡポリメラーゼII等による転写反応を、ＲＮＡポリメラーゼIIIの転写終結配列で転写終結させるには、ＲＮＡポリメラーゼIIIの転写終結配列の直下に転写終結配列内又はその後端が切断部位となるように、特定の制限酵素による認識配列を形成するような塩基配列にヌクレオチドを連結する。In vitro転写に先立って、所定の制限酵素で表される処理を行うことで、ＲＮＡポリメラーゼIIIの転写終結配列内又はその後端でＤＮＡは切断されるため、そこでin vitro転写反応は確実に停止され、正確な鎖長の転写産物が転写することができる。
例えば、ＲＮＡポリメラーゼIIIの転写終結配列（ＴＴＴＴ等）にＡＡＡを連結してＤｒａＩ認識配列（ＴＴＴＡＡＡ）を形成しておくことで、in vitro転写反応前にＤｒａＩで処理しておけば、Ｔ７ポリメラーゼによる転写を正確に終結させることができる。
本発明のＤＮＡコンストラクトは、ハイブリッドプロモーター内部又は直下にＲＮＡをコードするコードＤＮＡを導入可能な１種又は２種以上の制限酵素の認識配列を備えることができる。これらの制限酵素部位とオリゴヌクレオチドリンカーとを利用して所望のＲＮＡコードＤＮＡをハイブリッドプロモーターの下流（好ましくは直下）に挿入することができる。
本発明のＤＮＡコンストラクトは、上記のような制限酵素部位を利用するなどしてＲＮＡコードＤＮＡを備えることができる。このようなＤＮＡコンストラクトは、直ちにin vitro転写反応及び細胞内での発現に利用できる。
本発明のＤＮＡコンストラクトがｓｉＲＮＡを作製するものであるとき、ＤＮＡコンストラクトは、センスコードＤＮＡ及び／又はアンチセンスコードＤＮＡを備えることができる。一つのＤＮＡコンストラクトがセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを備えていてもよいし、２つのＤＮＡコンストラクトがそれぞれセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡを備えていてもよい。ＲＮＡがｓｉＲＮＡのとき、ＤＮＡコンストラクトが備えるセンスコードＤＮＡは、標的遺伝子のいずれかの領域のセンス鎖をコードするＤＮＡであって、転写によりＲＮＡのセンス鎖を形成するＤＮＡであればよい。また、同様の場合において、アンチセンスコードＤＮＡは、標的遺伝子のいずれかの領域のアンチセンス鎖をコードするＤＮＡであって、転写によりＲＮＡのアンチセンス鎖を形成するＤＮＡであればよい。
また、本発明のＤＮＡコンストラクトがアンチセンスＲＮＡを作製するものであるとき、アンチセンスＲＮＡはＲＮＡのアンチセンス鎖を有していればよいため、アンチセンスコードＤＮＡを備えていれば足りる。さらに、本発明のＤＮＡコンストラクトがｍｉＲＮＡを作製するものであるとき、例えば、１つのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに２つのｍｉＲＮＡがコードされている場合もあり、どちらがセンスでどちらがアンチセンスということがないので、ｐｒｉ−ｍＲＮＡあるいはｐｒｅ−ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを備えていれば足りる。
ハイブリッドプロモーターに対するセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡの配置形態は、ハイブリッドプロモーターの制御下にセンスコードＤＮＡ及び／又はアンチセンスコードＤＮＡをそれぞれ転写でき、最終的にＲＮＡを転写できればよく、特に限定されないが、典型的には、タンデム型、ステムループ型が挙げられる。また、双方向型も知られている（BMC Biotechnology 3, 21, 2003等）。
図２に示すように、タンデム型は、通常、コンストラクト内において配置した２つのハイブリドプロモーターのそれぞれの制御下に、センスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを連結する形態である。なお、２つのハイブリッドプロモーターは、同一方向に配置されていてもよいし、互いに反対方向に配置されていてもよい。また、タンデム型の場合、センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡとは同じコンストラクト上にある必要はなく、２つのＤＮＡコンストラクトからそれぞれ転写されるようにしてもよい。
また、ステムループ型は、一つのハイブリッドプロモーターの制御下に、センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡとをループ配列を挟んで配置する形態である。センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡとは、転写後にループ配列を介してステムを形成するように構成されている。ループ配列としては、in vitroで転写後にリボヌクレアーゼ等によるトリミングによりｓｉＲＮＡを取得可能であるとともに、細胞内においてＲＮＡ干渉を誘導するための効果的な長さとすることが好ましい。例えば、５〜５０ｂａｓｅ、好ましくは６〜２０ｂａｓｅとすることができる。ただし、ここに示す長さ以上のループ配列を用いることもできる。なお、ループ部分に、細胞内で適宜切断されるような塩基配列、ｔＲＮＡ等をコードさせたり、ハンマーヘッドリボザイムなどと組み合わせることにより、細胞内でヘアピンＲＮＡ部分がトリミングされて適切な長さのｓｉＲＮＡ等を生成し得るようにデザインすることもできる。ループ配列は、特に限定はなく、人工的な配列、マイクロＲＮＡ由来の配列のいずれであってもよく、公知の配列から適宜選択して用いることができる。
センスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを準備する場合の本発明のＤＮＡコンストラクトとしては、ステムループ型であることが好ましい。例えば、in vitro転写反応の鋳型として、ステム型は転写産物が分子内アニーリングすることで2本鎖になるのに対し、タンデム型ではＲＮＡセンス鎖とＲＮＡアンチセンス鎖の転写産物の分子間アニーリングが必要とされるため、正しく2本鎖を形成したＲＮＡの収量の低下する傾向がある。また、コンストラクト構築時において、タンデム型では鋳型ＤＮＡ鎖のプラスミド等への組込み操作が通常２回必要となるのに対し、ステムループ型では１回の組込み操作で足りるという利点もある。さらに、タンデム型よりステムループ型の方が高効果であるという報告（Oligonucleotides 13, 325-333, 2003）もある。
なお、タンデム型でセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを本発明のＤＮＡコンストラクトに導入する場合、それぞれの二重鎖ＤＮＡを適切なオリゴヌクレオチドリンカー及び制限酵素等を利用してハイブリッドプロモーターの制御下に連結すればよい。また、ステムループ型でセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡをＤＮＡコンストラクトに導入する場合には、センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡとがヘアピンループ配列を介して反対方向を指向して配置された二重鎖ＤＮＡを準備し、この二重鎖ＤＮＡを適切なオリゴヌクレオチドリンカー及び制限酵素等を利用してハイブリッドプロモーターの制御下に連結する。
タンデム型に用いるセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡは、例えばＤＮＡ合成により、あるいは従来の転写法により取得してもよいし、入手可能なｃＤＮＡ及びｓｉＲＮＡライブラリから取得してもよい。さらには、標的遺伝子に対するランダムな酵素的分解により取得してもよい。また、ステムループ型に用いるセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡは、センスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡをループ配列を介して備えるＤＮＡを準備する。このようなＤＮＡは、ＤＮＡ合成により従来の転写法により取得してもよいし、入手可能なｃＤＮＡ及びｓｉＲＮＡライブラリから取得してもよい。さらには、標的遺伝子に対するランダムな酵素的分解により取得してもよい。
なお、本発明のＤＮＡコンストラクトは、必ずしもベクターの形態を採る必要はない。例えば、本発明のハイブリッドプロモーターの制御下にセンスコードＤＮＡ及び／又はアンチセンスコードＤＮＡを転写可能に備えるとともに、動物細胞等の染色体導入のために必要なＤＮＡ鎖を備える染色体導入型のＤＮＡコンストラクトとすることもできる。
（ＤＮＡコンストラクトの利用）
（in vitro及び細胞内での発現によるＲＮＡの作製）
本発明のＤＮＡコンストラクトであって、ハイブリッドプロモーターの制御下に転写可能に所定のコードＤＮＡを備えるコンストラクト（以下、転写／発現コンストラクト）は、in vitro転写反応及び細胞内での発現の双方によりそれぞれＲＮＡを作製できる。
（in vitro転写反応による各種ＲＮＡの作製・供給）
in vitro転写反応によって得られる各種のＲＮＡは、例えば、転写／発現コンストラクトを、必要に応じて適当な制限酵素で鎖状化した後、必要なＮＴＰと、ハイブリッドプロモーターにおける第２のプロモーター活性依存的に作用するＲＮＡポリメラーゼを含む転写に必要な要素を作用させてin vitro転写反応を行うことで取得できる。このようなin vitro転写反応のためには、商業的に入手可能な各種のin vitroＲＮＡ合成キットを適宜利用することができる。なお、常法により、鋳型となったＤＮＡは、ＤＮaseにより分解することができる。また、ステムループ型コンストラクトにより得られたｓｈＲＮＡは、そのまま細胞等にトランスフェクションしてもよいし、また、ｓｉＲＮＡとして不要である、ループ配列を、トランスフェクション前に、ＲＮase等により処理してもよい。
こうして得られる、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）は各種方法で動物細胞にトランスフェクションできる。動物細胞へのトランスフェクションには、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．４５６（１９７３））、エレクトロポーレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１３１１（１９８７））、リポフェクション法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．１７５（１９８９））、ウイルスにより感染導入方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，ｐ．３４，Ｍａｒｃｈ（１９９４））、ジーンガンなどから選択することができる。
（細胞内発現による各種ＲＮＡの作製・供給）
また、細胞内での発現によるＲＮＡの作製は、ベクター等として構築した転写／発現コンストラクトを、そのまま動物細胞にトランスフェクションして細胞内に導入するほか、ウイルス粒子を調製して細胞に感染させて導入することにより実施できる。動物細胞へのトランスフェクションには、ＲＮＡの細胞への導入と同様の方法等から適宜選択できる。
また、本発明の転写／発現コンストラクトが、ウイルスベクターの場合、ベクタープラスミドのウイルスへの組み込み、パッケージング等によりウイルス粒子を調製して、これらのウイルス粒子を細胞に感染させることにより導入する。
本発明の転写／発現コンストラクトからin vitroで作製したＲＮＡ及び当該コンストラクトが導入された細胞を選択するには、該コンストラクトに特異的なＤＮＡ配列をプローブあるいはプライマーとしてハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどの公知の手法により選択してもよいし、また、コンストラクトが備える選択マーカーを備えている場合には、当該選択マーカーによる表現型を指標としてもよい。
なお、本発明の転写／発現コンストラクトをヒト及び非ヒト動物の生体外にある細胞に対して直接トランスフェクションや感染させてもよいし、ヒト及び非ヒト動物の生体内にある細胞に対して直接トランスフェクションや感染させてもよい。生体外にある細胞は、生体から採取して、トランスフェクション等の後に、再び採取個体に戻してもよい。
なお、本発明のＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトを、胚を構築する精子、未受精卵、受精卵及び体細胞等の各種生殖細胞に導入して、最終的に本発明のＤＮＡコンストラクトを保持する胚を作製することもできる。さらに、こうした胚から生物個体を作製することもできる。胚の作製は当業者に周知の各種方法を利用することができる。
（本発明のＤＮＡコンストラクトを保持する細胞及び非ヒト動物）
本発明のＤＮＡコンストラクトが導入されることで、本発明の細胞を得ることができる。すなわち、細胞内に本発明の転写／発現コンストラクトを保持する細胞を得ることができる。ＤＮＡコンストラクトが細胞内に保持される標的遺伝子に対して当該標的遺伝子の発現抑制に効果的な標的配列を有する場合には、標的遺伝子の発現が抑制された細胞を得ることができる。なお、標的遺伝子の発現が抑制された細胞とは、当該標的遺伝子の発現レベルの部分的に抑制された細胞であれば足り、完全に抑制されていなくてもよい。このような細胞は、機能的ＲＮＡにより発現が抑制された（例えば、ｓｉＲＮＡの場合、ノックダウン）細胞であり、後述するように、これらの細胞における標的遺伝子の発現を測定することにより、使用したＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトに保持させたＤＮＡ鎖に由来するｓｉＲＮＡ等の機能的ＲＮＡの発現抑制効果から抑制効果の高い標的配列をスクリーニングすることができる。また、ｓｉＲＮＡを発現させたノックダウン細胞を用いて遺伝子の機能解析や疾患関連遺伝子の発現が抑制されている場合には創薬スクリーニング等にも用いることができる。
また、本発明のＤＮＡを保持する胚から、非ヒト動物(生物個体)を得ることができる。こうした生物個体は、各種機能的ＲＮＡを発現あるいは選択的に発現可能である。例えば、ｓｉＲＮＡを発現可能な本発明のＤＮＡコンストラクトを保持する胚から作出した非ヒト動物（生物個体）は、ノックダウン動物であってもよい。ノックダウン動物は、遺伝子機能解析や疾患モデル動物として有用である。標的遺伝子の発現を抑制したノックダウン動物の作出手法は特に限定されないで、公知の手法を利用できる。例えば、疾患原因遺伝子等を標的遺伝子とするｓｉＲＮＡを作製するためのＤＮＡコンストラクトを用いて、細胞内でのｓｉＲＮＡを発現させて、前記ｓｉＲＮＡを発現する胚を作製する工程と、前記胚から個体を作製する工程と、を実施してもよい。
（本発明のＤＮＡコンストラクトを含むキット）
本発明のキットは、本発明のＤＮＡコンストラクトを含んでいる。本発明のＤＮＡコンストラクトは、in vitro及びin vivoの双方での転写反応が可能である。したがって、双方の転写反応に用いることができる試薬とともにキットとして提供されることが有用である。in vitro転写反応のために必要な試薬は、当業者に周知であるが、少なくとも本発明のＤＮＡコンストラクトのハイブリッドプロモーターにおける第２のプロモーター活性配列に依存するＲＮＡポリメラーゼ、各種ＮＴＰを含むことが好ましい。このほか、所望のＤＮＡ鎖を導入するためのオリゴヌクレオチドリンカー、各種制限酵素、断片化用の制限酵素、ＤＮase、ＲＮaseなどの酵素及び緩衝液を含むこともできる。また、in vitro転写反応に必要な試薬も、当業者に周知である。
（本発明のＤＮＡコンストラクトの医薬としての利用）
本発明のＤＮＡコンストラクトは、作製するＲＮＡの機能に基づき、医薬として利用できる。例えば、当該ＲＮＡが、疾患原因遺伝子を標的としてその発現を抑制するｓｉＲＮＡである場合等が挙げられる。この場合、本発明のＤＮＡコンストラクトは、患者へのＲＮＡの供給形態、すなわち、ｓｉＲＮＡ等の用法等に応じて使い分けが可能である。例えば、ｓｉＲＮＡを直接的に投与する場合には、転写／発現コンストラクトを、in vitro転写反応によりｓｉＲＮＡを作製し、それを適当な賦形剤とともに組織や患者から採取した細胞や患者内の細胞に投与することができる。この場合、投与形態は従来公知の各種の投与形態が挙げられるが、ｓｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクションにあたって用いられる方法も用いることができる。また、ｓｉＲＮＡを細胞内で発現させる遺伝子治療的に投与する場合には、疾患部位の細胞に転写／発現コンストラクトを供給して細胞内での発現により細胞内で安定してｓｉＲＮＡを発現する細胞を患者に投与することができる。また、患者から取り出した組織や細胞に対して同様に細胞内でｓｉＲＮＡを発現させ、それを患者に戻すようにしてもよい。
（ｓｉＲＮＡライブラリ及びその作製方法）
本発明のｓｉＲＮＡライブラリは、１種又は２種以上の標的遺伝子についての複数種類のセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡのそれぞれを、本発明のＤＮＡコンストラクトハイブリッドプロモーターの制御下で転写可能に備えるコンストラクト含むことができる。本発明のライブラリによればin vitro及びin vivoの双方の転写反応によりｓｉＲＮＡを作製できるため、このライブラリは、標的配列のスクリーニングに有利であり、特に、網羅的に標的配列をスクリーニングできるとともに、活性の高い標的配列を効率的にスクリーニングできる。また、ＲＮＡｉ効果を利用した各種アプリケーション（有用な疾患モデル細胞、疾患モデル動物の作製、これらを用いた創薬スクリーニング、創薬標的遺伝子のスクリーニング等）を効率的に行うことができる。
本発明のｓｉＲＮＡライブラリは、１種又は２種以上の標的遺伝子に対するセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡをハイブリッドプロモーターの制御下に転写可能に備える本発明の転写／発現コンストラクトから構成されている。本発明のｓｉＲＮＡライブラリにおいては、センスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡは一つの転写／発現コンストラクト内に備えられていることが好ましく、より好ましくはステムループ型である。また、センスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡは、標的遺伝子を酵素的に分解して得られたＤＮＡ断片を含むことが好ましい。なお、センスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡは、それぞれ転写物としてのｓｉＲＮＡが有効なＲＮＡｉ効果を発現する程度の長さに設定されることが好ましい。
本発明のｓｉＲＮＡライブラリの標的遺伝子は、動物における遺伝子のコード領域であってもよいし、調節領域などの非コード領域であってもよい。また、染色体ＤＮＡのその他の領域であってもよい。標的遺伝子は、１種類であってもよいし２種類以上であってもよい。ｓｉＲＮＡライブラリの目的に応じて適宜設定される。ＤＮＡ対の数も特に限定されない。例えば、１遺伝子につき、数十種類以上であってもよいし、１００種類以上であってもよいし、１０００種類以上のＤＮＡ対としてもよい。後述するように、標的遺伝子をランダムに酵素的に分解する手法でＤＮＡ対を準備する場合には、遺伝子について任意の種類のＤＮＡ対を準備することができる。
本発明のｓｉＲＮＡライブラリの作製方法は、１種又は２種以上の標的遺伝子に対してｓｉＲＮＡとして機能する可能性のある二重鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれコードするＤＮＡ対（センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡとからなる）を複数個準備する工程と、前記ＤＮＡ対を構成するそれぞれのＤＮＡ鎖を、上記いずれかに記載のＤＮＡコンストラクトの前記ハイブリッドプロモーターの制御下に転写されてｓｉＲＮＡ又はその前駆体を転写可能に連結する工程と、を備えることができる。本発明のｓｉＲＮＡライブラリの作製方法によれば、本発明のハイブリッドプロモーターの制御下に標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡのいずれかの領域を標的としてＲＮＡｉ効果を発揮可能なＤＮＡ対を転写可能に導入することで、一挙に、in vitro転写用のＤＮＡコンストラクトとin vivo発現用のＤＮＡコンストラクトとの双方のライブラリを構築できる。
本発明のライブラリ作製方法では、まず、１種又は２種以上の標的遺伝子のいずれかの領域に対するセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡからなるＤＮＡ対を準備する。ＤＮＡ対を準備する方法は特に限定されない。ある程度の理論的予測に基づいてＲＮＡｉ効果があるとする標的配列を化学合成するなどしてもよい。また、入手可能なｃＤＮＡ及びｓｉＲＮＡライブラリから取得してもよい。さらには、標的遺伝子に対するランダムな酵素的分解により取得してもよい。
ＤＮＡ対は、標的遺伝子を少なくとも酵素的に分解するステップを経て準備することが好ましい。標的遺伝子を酵素的に分解することで、標的遺伝子のいずれかの領域に対応するセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを網羅的に取得できる。標的遺伝子を分解する酵素は、転写物がｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖として機能する程度の長さに断片化できる１種又は２種以上の制限酵素を用いることが好ましい。
ＤＮＡ対は、また、以下のような加工がされていてもよい。すなわち、酵素的に分解して生成した二重鎖ＤＮＡ断片のそれぞれの端部にヘアピン型アダプターと断端型アダプターと連結して１本鎖のヘアピンＤＮＡを作製する。この１本鎖ヘアピンＤＮＡを、プライマー伸長反応により、センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡとがヘアピン型アダプターに由来するヘアピンループ配列を介して逆方向に配置する２本鎖ＤＮＡに変換することができる。こうすることで、容易にステムループ型のｓｉＲＮＡライブラリを構築できる。なお、この方法は、既述の特許文献２（再公表２００５−０６３９８０号公報）に詳細に開示されており、当該公報に準じて実施できる。
次に、こうしたＤＮＡ対を本発明のＤＮＡコンストラクトのハイブリッドプロモーターの制御下に転写可能に連結する。連結手法は、本発明のＤＮＡコンストラクトに関して説明したように、オリゴヌクレオチドリンカーと制限酵素を利用するなどしてハイブリッドプロモーターの制御下に連結する。このとき、第１のプロモーター活性に依存する転写開始点及び第２のプロモーター活性配列に依存する転写開始点が一致するように連結することが好ましい。
（ＲＮＡｉに有用な標的配列のスクリーニング方法）
本発明のＲＮＡｉに有用な標的配列のスクリーニング方法は、本発明のｓｉＲＮＡライブラリを準備する工程と、前記準備したｓｉＲＮＡライブラリを構成する前記ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記センスコードＤＮＡ及び前記アンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡを供給する工程と、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を測定する工程と、を備えることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、ｓｉＲＮＡを必要に応じてin vitro及び／又は細胞内の発現によりｓｉＲＮＡを細胞に供給できる。ｓｉＲＮＡを細胞に供給して得られる標的遺伝子の発現を測定して、当該標的遺伝子の発現の抑制を肯定できるとき、供給したｓｉＲＮＡが由来するセンスコードＤＮＡが細胞の標的遺伝子、すなわち、ｓｉＲＮＡの実際の標的であるｍＲＮＡ上の標的配列又はその候補として選択できる。また、ｓｉＲＮＡライブラリを用いることで標的遺伝子につき網羅的に発現抑制効果の高い標的配列をスクリーニングできる。
本発明のスクリーニング方法においては、標的遺伝子の発現を測定する方法は、特に限定されないで公知の方法を採用できる。例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーションやウェスタンブロットハイブリダイゼーション等により可能である。
網羅的な標的配列のスクリーニングには、in vitro転写反応によるｓｉＲＮＡの供給と細胞内での発現によるｓｉＲＮＡの供給の双方を実施することが好ましい。こうした２種類の標的配列スクリーニングにより、より好ましい標的配列を取得できる。In vitro転写反応と細胞内での発現によるｓｉＲＮＡの供給実験はどのように組み合わせてもよい。一次スクリーニングでin vitro転写反応を利用し、二次スクリーニングでin vitro転写反応を利用してもよい。一次スクリーニングを、細胞レベルでのスクリーニングとして、in vitro及びin vivoで双方又はいずれかの転写反応を利用するものとし、二次スクリーニングを動物レベルでのスクリーニングとして、in vitro及びin vivoの双方又はいずれかの転写反応を利用するものとしてもよい。
（疾患の予防又は治療に有用なｓｉＲＮＡのスクリーニング方法）
本発明の疾患の予防又は治療に有用なｓｉＲＮＡのスクリーニング方法は、前記疾患に関連する１種又は２種以上の標的遺伝子について、本発明のｓｉＲＮＡライブラリを準備する工程と、前記準備したｓｉＲＮＡライブラリの前記ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び／又は細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記センスコードＤＮＡ及び前記アンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡを供給する工程と、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を測定する工程と、を備えることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、疾患関連遺伝子の発現を効果的に抑制できる標的配列を効率的にかつ網羅的にスクリーニングできる。すなわち、ＲＮＡｉ医薬として有用なｓｉＲＮＡをスクリーニングできる。ｓｉＲＮＡを供給する細胞は、疾患モデル細胞、モデル動物や罹患個体（患者）から採取した細胞等に由来する細胞や組織であってもよい。疾患の予防又は治療に有用な表現型を発現するように人工的に構築された細胞あってもよい。
（疾患の予防又は治療に有用な創薬標的遺伝子のスクリーニング方法）
本発明の疾患の予防又は治療に有用な創薬標的遺伝子のスクリーニング方法は、前記疾患に関連する可能性のある標的遺伝子について、本発明のｓｉＲＮＡライブラリを準備する工程と、前記準備したｓｉＲＮＡライブラリの前記ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び／又は細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記センスコードＤＮＡ及び前記アンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡを供給する工程と、前記細胞における前記ｓｉＲＮＡの供給前後の変化を測定する工程と、を備えることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、ｓｉＲＮＡ供給前後の変化を測定することで、疾患に関連する標的遺伝子、ひいては標的遺伝子をスクリーニングできる。すなわち、ｓｉＲＮＡを導入することで、細胞の表現型に変化がある場合、その標的とするＤＮＡが疾患の発症、進行、治療及び予後等に関連する可能性があり、創薬標的となる可能性があるからである。本発明によれば、網羅的なスクリーニングが可能であるため、創薬標的を効率的にスクリーニングできる。
ｓｉＲＮＡを供給する細胞は、疾患モデル細胞、モデル動物や罹患個体（患者）から採取した細胞や組織に由来する細胞や組織であってもよい。また、疾患の予防又は治療に有用な表現型を発現するように人工的に構築された細胞であってもよい。
本発明によれば、ｓｉＲＮＡに限らず、本発明のＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、標的遺伝子を発現している細胞内にＲＮＡを供給する工程を備えて、前記標的遺伝子の発現調節する方法も実施が可能である。ｎｃＲＮＡは、遺伝子発現の抑制を含む、各種の遺伝子発現調節に寄与していると考えられるからである。また、同様にして動物細胞内にＲＮＡを供給して、ＲＮＡを供給した細胞とＲＮＡを供給していない細胞とを対比してＲＮＡの機能を評価する、ＲＮＡの機能解析方法も実施が可能である。機能解析のための手法は特に限定しない。ｍＲＮＡやタンパク質の発現解析であってもよいし、細胞の特定の機能のアッセイであってもよい。
以下、本発明を具体例を挙げて説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
（ハイブリッドプロモーターを備えるプラスミドの構築）
１．ハイブリッドプロモーターの配列
本発明のハイブリッドプロモーターであるｉｒｅｃｏＵ６プロモーターは、ｓｉＲＮＡの細胞内転写に広く用いられるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存プロモーターであるマウスＵ６プロモーター（以下Ｕ６プロモーター）の一部を、試験管内ＲＮＡ転写反応に広く使われるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ依存プロモーター（以下Ｔ７プロモーター）で置換して作製した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの挿入位置もしくは方向としては様々な形態が考え得るが、（１）どちらのプロモーターを機能させた場合も同じ転写産物が期待される、（２）転写されるｓｉＲＮＡに余分な配列が付加されるのは望ましくない、という２つの理由から、Ｕ６プロモーターの転写開始点（＋１）に、Ｔ７プロモーターの転写開始点（＋１）が揃うようにＴ７プロモーター配列を挿入した（図１）。
また、図１に示すように、ｉｒｅｃｏＵ６プロモーター下流にはｓｉＲＮＡをコードする配列にＲＮＡポリメラーゼIIIの転写終結配列（ＴＴＴＴＴＴ）を付加するとともに、「ラン・オフ」のために、この転写終結配列にＡＡＡを続けることでＤｒａＩ認識配列（ＴＴＴＡＡＡ）を作り、in vitro転写反応前にＤｒａＩで処理しておくことで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写がこの位置で正確に止まるようにデザインした。
２．プラスミドベクターの構築
プラスミドの構築は標準的な分子生物学技術を用いて行った。プラスミドベクターとして、図３に示すレトロウイルスベクターｐＮＡＭＡ−ｉｒｅｃｏＵ６及び図４に示すレンチウイルスベクタープラスミドｐＮＡＭＡｈ−ｉｒｅｃｏＵ６を構築した。これらの各プラスミドベクターの構築方法を図５及び図６にそれぞれ示す。なお、各段階で使用した制限酵素は、以下の略号で図示するとともに、制限酵素部位をロリポップで示した（B:BamHI、P:PstI、D:DraI、G:BglII、N:NotI、H:HindIII、K:KpnI、S:SpeI、A:AvrII、M:NgoMIV、Z:XbaI、O:XhoI）。使用したプライマー及びオリゴヌクレオチド（on_01〜12）を表２に示す。
３．レトロウイルスベクター
まず、図５に示すように、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ）由来のマウスＵ６プロモーター配列と終結配列を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をベースとしたプラスミドpBsk-U63-LTRプラスミド（Nature Genet.36, 190-196, 2004）を鋳型にＰＣＲ（プライマー：ｏｎ＿０１、ｏｎ＿０２）を行い、増幅産物をBamHIで処理し、自己環状化することで、Ｕ６プロモーターの先端部分にT7プロモーター配列が組み込まれた中間体１を得た。
次いで、この中間体をBamHIとPstIで切断し、オリゴヌクレオチド（on_03、on_04）をリンカーライゲーションすることで中間体２を得た。この操作によりsiRNAの転写終結配列直後にDraI認識配列が組み込まれた。一方、pIRES-puro2（Clontech）を鋳型にPCR（プライマー：on_05、on_06）で増幅したピューロマイシンNアセチルトランスフェラーゼコード（PAC）配列を含む断片をBglIIとNotIで処理し、pda5LTR-DsRed2（Nature Genet. 36: 190-196, 2004）のBamHI-NotI間に挿入することで中間体3を得た。さらに、中間体２からNotIとHindIIIで抜き出したLTR とirecoU6配列を含む断片を、中間体３のNotI-HindIII間に挿入し、pNAMA-irecoU6を得た。
４．レンチウイルスベクタープラスミド
図６に示すように、pLKO.1（addgene）をAvrIIとNgoMIVで切断し、オリゴヌクレオチド（on_07、on_08）をリンカーライゲーションし、中間体４を得た。この操作によってpLKO.1に存在するよりT7プロモーター配列（黒ボックス）が除去された。次いで、pLKO.1をKpnIとAvrIIで切断し3'LTRを抜き出し、pBluescriptSK(-)のKpnI-SpeI間に挿入し、中間体５を得た。この中間体５を鋳型にPCR（プライマー：on_09、on_10）し、増幅産物をNheIで処理した後、自己環状化することで中間体６を得た。この操作によってSIN3’LTRよりBbsI認識配列が除去された。次いで、中間体６からKpnIとXbaIで抜き出した3'LTRを含む断片を中間体４のKpnI-XbaI間に挿入し中間体７を得た。この中間体７を鋳型にPCR（プライマー：on_11、on_12）し、増幅産物をBbsIで処理した後、XhoIで切断した中間体７に挿入し、中間体８を得た。この操作により、pLKO.1に組み込まれていたU6プロモーターが除去された。さらに、既に構築したpNAMA-irecoU6からよりNheI切断で抜き出したirecoU6配列を含む断片を、AvrII で切断した中間体８に挿入し、pNAMAh-irecoU6を得た。
（ＲＮＡポリメラーゼIII依存性プロモーター活性の確認）
本実施例では、Ｕ６プロモーターの改変が本来の転写活性に影響を及ぼしていないか調べるため、ＧＦＰを用いたモデル実験（細胞内での発現）を行った。実験には、ＧＦＰを標的とする強弱の異なる３種類のｓｉＲＮＡコード配列をステムループ型の形態で用いた。センスコードＤＮＡ、ループ配列及びアンチセンスコードＤＮＡを含むステムループ型コンストラクト用ＤＮＡ鎖の配列を表３に示す。
（siRNAのコード配列の挿入）
実施例１で構築したプラスミド（pNAMA-irecoU6レトロウイルスベクタープラスミド）へのsiRNAコード配列の挿入はオリゴヌクレオチドのリンカーライゲーションによって行った。また、対照としてＵ６プロモーターを保持するpNAMA-U6プラスミド（（Nature Genet. 36, 190-196, 2004）を用いた。
実施例１で構築した上記プラスミドにおいては、全て同じ操作でリンカーライゲーションができるように設計してある。すなわち、図７に各ベクターに共通であるＴ７プロモーター配列及びその直下の配列を示す。図７に示すように、挿入すべきsiRNAコード配列をループ配列で上流側と下流側との半分に分けたオリゴヌクレオチドを準備する。図7で（N.........N）で示した部分がsiRNAコード配列の上流側配列及び下流側配列のそれぞれに対応する。それぞれ相補的な５’リン酸化オリゴヌクレオチド(上流側：A及びa、下流側：B及びb）をアニーリングさせた後、BbsIで切断したベクタープラスミドとともにライゲーション反応を行うことにより、siRNAコード配列をプラスミドに挿入した。
（細胞培養）
２９３Ｔ細胞は１０％非働化仔ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク）において培養した。
（トランスフェクション）
トランスフェクションは全て９６ウェルフォーマットで行った。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドのトランスフェクションは、１ウェル当たりｓｉＲＮＡ発現プラスミド２００ｎｇをＧＦＰ発現プラスミド１００ｎｇと共にリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションした。なお、ＧＦＰ発現プラスミドとしては、pMX-d2EGPを用いた。このプラスミドは、pMX（東京大学北村俊夫博士より供与）のBamHI-NotI間にpd2EGFP-1（クロンテック）よりBamHIとNotIで切り出したd2EGFPのコード配列を含む断片を挿入することで作製した。
トランスフェクション後、２日間維持した後、ＧＦＰの発現量を解析した。ＧＦＰ発現量の解析は、ＧＥＮｉｏｓ（Ｔｅｃａｎ）で測定した蛍光強度を元に、相対減少度をＲＮＡｉ効果として評価した。例えば、相対減少度が２であるとき、ＧＦＰの蛍光強度が５０％減少していることを示し、同１０であるとき９０％減少していることを表す。結果を図８に示す。
図８に示すように、ｉｒｅｃｏＵ６プロモーターを用いた細胞内での発現により発現させたｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ効果（ＧＦＰの蛍光強度の相対減少度）は、改変前プロモーターによる制御下においてよりもむしろ若干増強されており、ＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーターとしての機能は十分に保持されていることが示された。
（ｉｒｅｃｏＵ６プロモーターを用いたin vitro転写反応によるｓｉＲＮＡの合成）
本実施例では、ｉｒｅｃｏＵ６プロモーターを有するプラスミドがin vitro転写反応の鋳型として機能するかを調べた。実施例１で構築したpNAMA-irecoU6レトロウイルスベクタープラスミドを、ＤｒａＩで切断した後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写反応を行った。なお、転写反応に必要な試薬は、ＣＵＧＡ７ in vitro Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ニッポンジーン株式会社）から適宜用い、添付プロトコルに従ってｓｈＲＮＡを作製・精製した。
簡単に説明すると、ＤｒａＩで消化したプラスミド１．５ｐｍｏｌ当たり２ｕＬのＣＵＧＡ ７ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを含む反応液を３７℃２時間インキュベーションした後、４ｕＬのＤＮａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ を加えてさらに３０分インキュベーションした。ｓｉＲＮＡの脱リン酸化は、１μｇあたり１０ｕのＳＡＰ（ＴａＫａＲａ）で３７℃１時間インキュベーションして行った。転写されたＲＮＡをポリアクリルアミド電気泳動で解析した。結果を図９に示す。
図９に示すように、約２５ｂｐ付近に単一のバンドが見られ、高い純度で目的のｓｉＲＮＡが転写されていることが示された。一般に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの効率の良い転写には転写開始点にグアニン塩基が３つ必要と言われている。ｉｒｅｃｏＵ６プロモーターの転写開始点は１つのグアニン塩基しかないが、Ｔ７プロモーターは十分に機能していることわかった。
本実施例では、pNAMA-irecoU6レトロウイルスベクタープラスミドからin vitro転写によって合成した３種のｓｉＲＮＡの機能をＧＦＰを用いたモデル実験で調べた。in vitro転写反応で合成したＲＮＡの５’末端に付加されているトリリン酸基は細胞に毒性を示すことが報告されているため（Nature Biotechnology 22, 321-325, 2004）、細胞内に導入する前に脱リン酸化処理を施した。これらのｓｉＲＮＡをＧＦＰ発現プラスミドと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、２日間維持した。なお、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、ｓｉＲＮＡを終濃度５０ｎＭ、１０ｎＭ、２ｎＭ、になるように、１ウェル当たり１６０ｎｇのＧＦＰ発現プラスミドと共にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後、２日間維持した後、ＧＦＰの発現量を解析した。ＧＦＰ発現量の解析は、実施例２と同様にして行った。結果を図１０に示す。
図１０に示すように、用いたいずれのｓｉＲＮＡにも、濃度依存的な発現抑制が観察された。また、３つの配列の特性は、図８に示すプラスミドトランスフェクションの効果と同様の傾向であった。これらの結果から、in vitro転写反応で合成したＲＮＡがｓｉＲＮＡとして機能することが確認された。
（レトロウイルスベクターを用いたiｒｅｃｏＵ６プロモーターの細胞導入）
本実施例では、ｉｒｅｃｏＵ６プロモーターをレトロウイルスベクターによって細胞に導入した場合のＲＮＡｉ効果について調べた。対象として、改変前のＵ６プロモーターを有するレトロウイルスベクターpNAMA-U6も用いた。実施例１で構築したpNAMA-irecoU6レトロウイルスベクタープラスミドに、実施例２で説明したリンカーライゲーションにより、表３に示すＧＦＰを標的とする３種類のｓｉＲＮＡコード配列をｉｒｅｃｏプロモーターの直下に挿入した。これらのプラスミドからレトロウイルスを調製し、安定的ＧＦＰ発現ＪｕｒｋａｔＴ細胞に感染させた。なお、レトロウイルスの調製及び細胞培養は以下のように行った。
（レトロウイルイルスの調製）
レトロウイルスは、３５ｍｍディッシュに播種したＧＰ２９３細胞に、レトロウイルスベクタープラスミド４μｇをｐＶＳＶＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）０．４μｇと共にリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションし、２日後にウイルス粒子を含む培養液を回収した。
（細胞培養）
ＪｕｒｋａｔＴ細胞は１０％非働化仔ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク）において培養した。薬剤選択を行う場合は上記培地に０．４ｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）を加えた。また、ＧＰ２９３細胞は１０％非働化仔ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク）において培養した。
ウイルス粒子をＪｕｒｋａｔＴ細胞に感染させた後、３日維持した後、フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、ウイルスを用いた実験では、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）で測定したＧＦＰの蛍光強度をＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）で解析し、ウイルス非感染細胞に対する相対減少度をＲＮＡｉ効果として評価した。なお、相対減少度２はＧＦＰの蛍光強度が５０％減少していることを表し、同１０ならば９０％減少していることを表す。結果を図１１に示す。
図１１（ａ）に示すように、いずれの配列であっても、ＧＦＰの発現レベルが低下していた。さらに、再度、ｉｒｅｃｏＵ６プロモーターとＵ６プロモーターとの比較を行ために、ウイルス１コピーのＲＮＡｉ効果を調べるため、限界希釈したウイルスを感染させた細胞をＰｕｒｏｍｙｃｉｎにより薬剤選択を行った後、ＧＦＰの発現量を測定した。結果は、図１１（ｂ）に示すように、１コピーでも十分なＲＮＡｉ効果が確認された。
（レンチウイルスベクターを用いたｉｒｅｃｏＵ６プロモーターの細胞導入）
レトロウイルスベクターは遺伝子導入幅広く用いられるが、非分裂細胞への感染効率が低いことからその利用範囲は限られていた。近年、細胞の増殖に関わらず効率良い感染が可能なレンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターに代わって使われ出している。本発明者は、実施例１でｉｒｅｃｏＵ６プロモーター有するレンチウイルスベクタープラスミドを構築した。このウイルスベクターのノックダウン効果を調べるため、実施例２と同様にして、実施例１で構築したｐＮＡＭＡｈ−ｉｒｅｃｏＵ６レンチウイルスベクタープラスミドのｉｒｅｃｏプロモーターの直下に、表３に示すＧＦＰを標的とする３種類のｓｉＲＮＡコード配列を挿入した。これらのプラスミドからレンチウイルスを調製し、安定的ＧＦＰ発現ＪｕｒｋａｔＴ細胞に感染させた。なお、レンチウイルスの調製及び細胞培養は以下のように行った。
（ウイルス粒子の調製）
レンチウイルスは、３５ｍｍディッシュに播種した２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスベクタープラスミド２ｕｇをｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅ）１．８ｕｇ及びｐＭＤ２．Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅ）０．２ｕｇと共にリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションし、２日後にウイルス粒子を含む培養液を回収した。
（細胞培養）
ＪｕｒｋａｔＴ細胞は１０％非働化仔ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク）において培養した。薬剤選択を行う場合は上記培地に０．４ｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）を加えた。また、２９３Ｔ細胞は１０％非働化仔ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク）において培養した。
安定的ＧＦＰ発現ＪｕｒｋａｔＴ細胞に感染させて３日維持した後、フローサイトメーターを用いてＧＦＰの蛍光強度を測定した。蛍光強度は、実施例５と同様にして測定した。結果を図１２に示す。
図１２に示すように、いずれもＤＮＡでも効率よくＲＮＡｉを誘導できることが確認された。レトロウイルスと比較すると、約１０分の１のウイルス量で同程度のＲＮＡｉ効果が得られた。
配列番号１：Ｕ６プロモーター及びＴ７プロモーターとして作動するハイブリッドプロモーター
配列番号２〜１１：プライマー
配列番号１２〜１３：ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ

Claims (15)

  1. 動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１のプロモーター活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有し、前記第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有するハイブリッドプロモーター、を備える、ＤＮＡコンストラクト。
  2. 前記第１のプロモーター活性配列は、Ｕ６プロモーター活性を有する配列及びＨ１プロモーター活性を有する配列のいずれかである、請求項１に記載のコンストラクト。
  3. 前記第１のプロモーター活性配列は、Ｕ６プロモーター活性を有する配列である、請求項２に記載のコンストラクト。
  4. 前記第２のプロモーター活性配列は、Ｔ７プロモーター活性を有する配列、Ｔ３プロモーター活性を有する配列及びＳＰ６プロモーター活性を有する配列からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のコンストラクト。
  5. 前記第２のプロモーター活性配列は、Ｔ７プロモーター活性を有する配列である、請求項４に記載のコンストラクト。
  6. 前記ハイブリッドプロモーターは、前記第１のプロモーター活性配列のＴＡＴＡボックス配列より３’側に前記第２のプロモーター活性配列の置換、挿入及び付加のいずれかがなされた塩基配列を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のコンストラクト。
  7. 前記ハイブリッドプロモーターは、前記第１のプロモーター活性配列がＵ６プロモーター活性を有する配列であり、前記第２のプロモーター活性配列がＴ７プロモーター活性を有する配列である、請求項１に記載のコンストラクト。
  8. 前記第１のプロモーター活性配列のＴＡＴＡボックス配列より３’側に前記第２のプロモーター活性を有する配列が置換、挿入又は付加されている、請求項７に記載のコンストラクト。
  9. 前記ハイブリッドプロモーターは、以下のいずれかの配列：
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列
    （ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、付加及び挿入のいずれかを有する塩基配列
    からなる、請求項８に記載のコンストラクト。
  10. プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項１〜９のいずれかに記載のコンストラクト。
  11. さらに、前記ハイブリッドプロモーターの制御下で転写可能に連結される、標的遺伝子のいずれかの領域のセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡを備え、ｓｉＲＮＡの作製用である、請求項１〜１０のいずれかに記載にコンストラクト。
  12. 動物細胞内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIである第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第１の活性配列に対して、試験管内で作動するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を有する第２のプロモーター活性配列の置換、挿入又は付加がなされた塩基配列を有し、前記第１のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性と、前記第２のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性とを有する、ハイブリッドプロモーター。
  13. 以下のいずれかの配列：
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列
    （ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、付加及び挿入のいずれかを有する塩基配列
    を有する、請求項１２記載のハイブリッドプロモーター。
  14. ＲＮＡの作製方法であって、
    請求項１０又は１１に記載のＤＮＡコンストラクトを用いてin vitro転写反応又は細胞内での発現によりＲＮＡを作製する、方法。
  15. 細胞にｓｉＲＮＡを供給して標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
    請求項１〜１０のいずれかに記載のＲＮＡ作製用ＤＮＡコンストラクトを用いたin vitro転写反応及び細胞内での発現のいずれか又は双方を介して、前記標的遺伝子を発現している細胞内に前記標的遺伝子のいずれかの領域のセンスコードＤＮＡ及びアンチセンスコードＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡを供給する工程を備える、方法。
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