JPWO2014003053A1 - 膵臓がんの検出方法及び検出用キット - Google Patents
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Abstract
本発明は、簡便で感度及び特異度の高い膵臓がんまたは膵臓がんのリスクの検出方法を提供することを課題とする。本発明は、被検者に由来する試料中における、以下の(i)及び(ii)から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを測定する工程を含む、膵臓がんの検出方法を提供する：(i) 配列番号：１〜１２０のいずれかで表される配列を有するｍｉＲＮＡ；及び(ii) (i)のいずれかのｍｉＲＮＡと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするｍｉＲＮＡであって、１７〜３０塩基長であるｍｉＲＮＡ。
Description
本発明は、膵臓がん特異的なマイクロRNAを測定することを特徴とする膵臓がんの検出方法等に関する。
マイクロRNA（以下、「miRNA」と表す場合もある。）は、約22塩基で構成される細胞内のsmall non-coding RNAの一つであり、個体の発生や細胞分化の制御に必須の因子である。miRNAの機能異常は多くのヒト疾患で認められる。特に、がんにおけるmiRNAの発現異常はほとんどのがん種で認められ、miRNAの機能異常と発がんが強く連携していることが考えられる。近年、miRNAが細胞内膜小胞であるエクソソームに包埋された形で細胞外へと放出（分泌）されていることが明らかとなってきた。miRNAの研究は、がん発生の分子機構の解明に加えて、治療薬や診断薬への応用展開が期待されている。
本発明者らは、これまでに大腸がんの検査マーカーとなりうる大腸がん特異的なmiRNAを見出している（特許文献１）。
本発明者らは、これまでに大腸がんの検査マーカーとなりうる大腸がん特異的なmiRNAを見出している（特許文献１）。
早期発見できる方法が求められている疾患に膵臓がんがある。従来、膵臓がんの検査としては、各種の画像診断や、腫瘍マーカーを検出する血液検査などが用いられているが、画像診断は大規模な設備と高額な装置を必要とし、広く普及しているとはいえない。また、これまでに用いられている腫瘍マーカーは、感度及び特異度が十分とはいえず、いずれもある程度がんが進行しないと増加しないものが多いので早期発見には適していない。
膵臓がんは、初期症状がほとんどないため早期発見が困難であり、進行が早く予後も悪い難治性がんである。膵臓がんはステージが低いほど治癒の可能性は高くなるので、膵臓がんによる死亡率を低下させるために早期発見は非常に重要である。
膵臓がんは、初期症状がほとんどないため早期発見が困難であり、進行が早く予後も悪い難治性がんである。膵臓がんはステージが低いほど治癒の可能性は高くなるので、膵臓がんによる死亡率を低下させるために早期発見は非常に重要である。
本発明は、簡便で感度及び特異度の高い膵臓がんまたは膵臓がんのリスクの検出方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、膵臓がん細胞株から分泌されているエクソソームmiRNAのプロファイルを作成し、膵臓がんに特異的なmiRNAを同定した。また、臨床血液検体を用いて、当該プロファイルが、大腸がんのプロファイルと大きく異なることを確認した。さらに、細胞株で同定されたmiRNAのいくつかが、膵臓がん患者の血液試料から有意に高値で検出されることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、
〔１〕被検者の膵臓がんを検出する方法であって、被検者に由来する試料中における以下の(i)及び(ii)から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを測定する工程を含む、検出方法：
(i) 配列番号：１〜１２０のいずれかで表される配列を有するｍｉＲＮＡ；及び
(ii) (i)のいずれかのｍｉＲＮＡと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするｍｉＲＮＡであって、１７〜３０塩基長であるｍｉＲＮＡ；
〔２〕前記(i)から選択されるｍｉＲＮＡが、配列番号：１〜３、５、７、１２、１３、１９〜２１、２６、２７、３０、３２、３５、３６、４２、５０、６２〜６４、７０〜７３、７８、８０、８１、８２、及び８５〜１２０のいずれかで表される配列を有する、上記〔１〕に記載の検出方法；
〔３〕前記ｍｉＲＮＡの濃度の測定値が健常人の対応する測定値と比較して統計学的に有意に高いとき、前記被検者が膵臓がんに罹患していると決定する、上記〔１〕又は〔２〕のいずれかに記載の検出方法。
〔４〕前記被検者に由来する試料は、被検者から採取された血漿からエクソソーム画分を濃縮する工程と、前記エクソソーム画分からｍｉＲＮＡを抽出する工程と、を含む方法によって調製される、上記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の検出方法；
〔５〕上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の検出方法を行うためのキットであって、
前記(i)及び(ii)から選択されるｍｉＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが固定された固相担体を含む、キット；
〔６〕上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の検出方法を行うためのキットであって、
前記(i)及び(ii)から選択されるｍｉＲＮＡまたはこれに相補的な核酸をＰＣＲ法で増幅するのに必要なプライマーセットを含む、キット；
〔７〕被検者の大腸がんを検出する方法であって、被検者に由来する試料中における配列番号：４７で表されるｍｉＲＮＡを測定する工程を含む、方法；
〔８〕前記被検者に由来する試料は、被検者から採取された血清からエクソソーム画分を濃縮する工程と、前記エクソソーム画分からｍｉＲＮＡを抽出する工程と、を含む方法によって調製される、上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕上記〔７〕または〔８〕に記載の検出方法を行うためのキットであって、
配列番号：４７で表されるｍｉＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが固定された固相担体を含む、キット；及び
〔１０〕上記〔７〕または〔８〕に記載の検出方法を行うためのキットであって、
配列番号：４７で表されるｍｉＲＮＡまたはこれに相補的な核酸をＰＣＲ法で増幅するのに必要なプライマーセットを含む、キット；
に関する。
即ち本発明は、
〔１〕被検者の膵臓がんを検出する方法であって、被検者に由来する試料中における以下の(i)及び(ii)から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを測定する工程を含む、検出方法：
(i) 配列番号：１〜１２０のいずれかで表される配列を有するｍｉＲＮＡ；及び
(ii) (i)のいずれかのｍｉＲＮＡと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするｍｉＲＮＡであって、１７〜３０塩基長であるｍｉＲＮＡ；
〔２〕前記(i)から選択されるｍｉＲＮＡが、配列番号：１〜３、５、７、１２、１３、１９〜２１、２６、２７、３０、３２、３５、３６、４２、５０、６２〜６４、７０〜７３、７８、８０、８１、８２、及び８５〜１２０のいずれかで表される配列を有する、上記〔１〕に記載の検出方法；
〔３〕前記ｍｉＲＮＡの濃度の測定値が健常人の対応する測定値と比較して統計学的に有意に高いとき、前記被検者が膵臓がんに罹患していると決定する、上記〔１〕又は〔２〕のいずれかに記載の検出方法。
〔４〕前記被検者に由来する試料は、被検者から採取された血漿からエクソソーム画分を濃縮する工程と、前記エクソソーム画分からｍｉＲＮＡを抽出する工程と、を含む方法によって調製される、上記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の検出方法；
〔５〕上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の検出方法を行うためのキットであって、
前記(i)及び(ii)から選択されるｍｉＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが固定された固相担体を含む、キット；
〔６〕上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の検出方法を行うためのキットであって、
前記(i)及び(ii)から選択されるｍｉＲＮＡまたはこれに相補的な核酸をＰＣＲ法で増幅するのに必要なプライマーセットを含む、キット；
〔７〕被検者の大腸がんを検出する方法であって、被検者に由来する試料中における配列番号：４７で表されるｍｉＲＮＡを測定する工程を含む、方法；
〔８〕前記被検者に由来する試料は、被検者から採取された血清からエクソソーム画分を濃縮する工程と、前記エクソソーム画分からｍｉＲＮＡを抽出する工程と、を含む方法によって調製される、上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕上記〔７〕または〔８〕に記載の検出方法を行うためのキットであって、
配列番号：４７で表されるｍｉＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが固定された固相担体を含む、キット；及び
〔１０〕上記〔７〕または〔８〕に記載の検出方法を行うためのキットであって、
配列番号：４７で表されるｍｉＲＮＡまたはこれに相補的な核酸をＰＣＲ法で増幅するのに必要なプライマーセットを含む、キット；
に関する。
本発明の検出方法によれば、被検者の試料中における所定のmiRNAを測定するという簡便な方法により、感度及び特異度の高い膵臓がん又は膵臓がんのリスクの検出を行うことができる。
（膵臓がんの検出方法）
本発明に係る膵臓がんの検出方法の一態様は、以下の(i)及び(ii)から選択される少なくとも1つのmiRNAを測定する工程を含む。
(i) 配列番号：１〜１２０のいずれかで表される配列を有するmiRNA；及び
(ii) (i)のいずれかのmiRNAと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするmiRNAであって、17〜30塩基長であるmiRNA。
本発明に係る膵臓がんの検出方法の一態様は、以下の(i)及び(ii)から選択される少なくとも1つのmiRNAを測定する工程を含む。
(i) 配列番号：１〜１２０のいずれかで表される配列を有するmiRNA；及び
(ii) (i)のいずれかのmiRNAと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするmiRNAであって、17〜30塩基長であるmiRNA。
上記(i)に記載された「配列番号：１〜１２０のいずれかで表される配列を有するmiRNA」は、後述する実施例で示されるとおり、6種類の膵臓がん細胞株が共通して分泌していたmiRNA、又は、膵臓がん患者由来の血漿検体において、コントロールの健常人と比べて有意に高い値で検出されたmiRNAである。
このうち、以下の65種類のmiRNAは、膵臓がん患者由来の血漿検体において、コントロールの健常人と比べて有意に高い値で検出された。
このうち、以下の65種類のmiRNAは、膵臓がん患者由来の血漿検体において、コントロールの健常人と比べて有意に高い値で検出された。
上記(ii)に記載された「(i)のいずれかのmiRNAと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするmiRNAであって、17〜30塩基長であるmiRNA」とは、(i)のmiRNAと配列同一性が高い変異体を意味する。ここで、配列同一性が高いとは、核酸レベルで８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上であることを意味している。
(ii)のmiRNAとしては、例えば、(i)のmiRNAのいずれかの配列において、1個または2個の塩基が欠失、付加または置換したものを含む。欠失、付加または置換される部位は、(i)のmiRNAの5’末端または3’末端でもよいし、末端以外の部分であってもよい。(ii)のmiRNAは、例えば17〜25塩基長のものでもよく、対応する(i)のmiRNAと同じ塩基長であることも好ましい。
(ii)のmiRNAとしては、例えば、(i)のmiRNAのいずれかの配列において、1個または2個の塩基が欠失、付加または置換したものを含む。欠失、付加または置換される部位は、(i)のmiRNAの5’末端または3’末端でもよいし、末端以外の部分であってもよい。(ii)のmiRNAは、例えば17〜25塩基長のものでもよく、対応する(i)のmiRNAと同じ塩基長であることも好ましい。
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、例えば、5%Denhardt's Solution（0.1%Ficoll（Pharmacia社）、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%ウシ血清アルブミンを含む）と、0.5%SDSと100μg/mlサケ精子DNAを含む、6×SSC溶液（1×SSCは0.15M NaCl、15mM クエン酸ナトリウム）中において65℃で洗浄する条件をいう。ストリンジェンシーは塩濃度（イオン強度）、温度等によって制御することができる。ストリンジェンシーがより高い条件、即ち塩濃度がより低く、温度がより高い条件では、洗浄により非特異的なハイブリダイゼーションによるバックグラウンドが除去され、特異的にハイブリダイズした核酸のみが残る。当業者であれば、温度や塩濃度を調整することによって、ストリンジェントな条件を適宜選択することができる。
本発明に係る膵臓がんの検出方法では、上記(i)及び(ii)から選択される少なくとも1つのmiRNAを測定すればよい。すなわち、膵臓がんまたは膵臓がんのリスクの判定は、ある1つのmiRNAを測定して行ってもよいし、2つ以上のmiRNAを測定して行ってもよい。
2つ以上のmiRNAを組み合わせる場合、組み合わせる個数はいくつでもよい。例えば、表１に示される65種のmiRNAの中から2つ以上を選択して組み合わせることも好ましい。
2つ以上のmiRNAを組み合わせる場合、組み合わせる個数はいくつでもよい。例えば、表１に示される65種のmiRNAの中から2つ以上を選択して組み合わせることも好ましい。
本明細書において「miRNAを測定する工程」は、試料中のmiRNAの濃度を正確に測定する工程であってもよいし、試料中の濃度が健常人のレベルよりも有意に高いことが確認できる限り、正確に濃度を測定しない工程であってもよく、単にmiRNAが試料中に含まれるか否かを検出するのみの工程であってもよい。
特に、健常人の試料からはほとんど検出されないmiRNAについては、miRNAを測定する工程として、被検者の試料中にこれらのmiRNAが存在するか否かの確認を行うだけでもよい。
また、miRNAを測定する工程では、各miRNAの濃度をそれぞれ求めてもよいし、試料中に含まれる複数のmiRNAの発現プロファイル（発現パターン）と、健常人における当該miRNAの発現プロファイルとを全体として比較し、その類似性を評価することによって行ってもよい。
特に、健常人の試料からはほとんど検出されないmiRNAについては、miRNAを測定する工程として、被検者の試料中にこれらのmiRNAが存在するか否かの確認を行うだけでもよい。
また、miRNAを測定する工程では、各miRNAの濃度をそれぞれ求めてもよいし、試料中に含まれる複数のmiRNAの発現プロファイル（発現パターン）と、健常人における当該miRNAの発現プロファイルとを全体として比較し、その類似性を評価することによって行ってもよい。
miRNAを測定する方法は特に限定されず、試料中から特定の配列のRNAを検出・測定できるあらゆる方法を用いることができる。かかる方法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、RNaseプロテクションアッセイ法、RT-PCR法やリアルタイムPCR法などの定量PCR法、DNAマイクロアレイを用いた方法などが挙げられる。
ノーザンハイブリダイゼーション法は、抽出したmiRNAをアガロース電気泳動などの電気泳動によってゲル上に展開し、ニトロセルロース膜やナイロン膜などのメンブレンに転写した後、上記(i)及び(ii)から選択されたmiRNA（標的miRNA）とハイブリダイズするプローブを用いて標的miRNAを検出する方法である。プローブの標識には、32Pなどの放射性同位元素、ジゴキシゲニン（DIG）と抗体などを用いることができる。
RNaseプロテクションアッセイ法は、放射性同位元素やDIGなどで標識したRNAプローブと標的miRNAをハイブリダイズさせた後、一本鎖に特異的なRNaseを用いて標的miRNAとハイブリダイズしなかったプローブの領域を消化した後、ハイブリダイゼーションによって保護されたプローブ部分を電気泳動などで検出する方法である。
RT-PCR法は、試料中のmiRNAから逆転写酵素でcDNAを得て、このcDNAを鋳型にして適当なプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を電気泳動などで定量して、試料中のRNA量を求める方法である。
リアルタイムPCR法は、PCR増幅産物を蛍光で検出する方法である。SYBR Greenに代表される二本鎖核酸に特異的に挿入する蛍光標識を用いるインターカレート法と、TaqManプローブに代表される蛍光標識した配列特異的なプローブを用いる方法がある。リアルタイムPCR法を用いる場合も、試料中のmiRNAから逆転写酵素でcDNAを得て、これを鋳型とすることができる。
DNAマイクロアレイを用いた方法は、標的miRNAの全部または一部とハイブリダイズするDNAプローブを固相担体に固定して試料と接触させ、プローブにハイブリダイズした標的miRNAを検出する方法である。試料中のmiRNAの発現プロファイルを網羅的に測定するのに適している。固相担体に固定されたプローブに、miRNAの一部がハイブリダイズするように設計し、miRNAの残りの部分が標識された第二のDNAプローブとハイブリダイズするようにして標的miRNAを検出することもできる。
本発明に係る検出方法の一態様では、被検者に由来する試料としては特に限定されないが、血液試料、特に血清または血漿とすることが好ましい。
また、上述したmiRNAを測定する工程を行う前に、血清または血漿からエクソソーム画分を濃縮する工程を行ってもよい。濃縮する方法は、超遠心法に限られず、膜で調製する方法、抗体で調製する方法、エクソソームを特異的に濃縮する試薬による方法により行ってもよい。さらに、エクソソーム画分からmiRNAを抽出する工程を行ってもよい。これらの工程は、当業者が常法にしたがって行うことができる。
また、上述したmiRNAを測定する工程を行う前に、血清または血漿からエクソソーム画分を濃縮する工程を行ってもよい。濃縮する方法は、超遠心法に限られず、膜で調製する方法、抗体で調製する方法、エクソソームを特異的に濃縮する試薬による方法により行ってもよい。さらに、エクソソーム画分からmiRNAを抽出する工程を行ってもよい。これらの工程は、当業者が常法にしたがって行うことができる。
本明細書において「膵臓がん」は通常の意味で用いられ、病理学的な分類、形態、深達度、進行で示される病期等によらず、あらゆる状態の膵臓がんを含む。
本明細書において「検出」は、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べることを意味し、本発明の検出方法は、例えば検査会社等で実施され得る。
また、本発明において、「検出」は、膵臓がんに罹患しているか否かを確認することに加え、膵臓がんに罹患しやすいかどうかのリスクを調べること、症状が現れない段階で膵臓がんの可能性をスクリーニングすること、膵臓がんに罹患していることが明らかになった後で、その進行度、予後、治療効果、再発の可能性などの癌の趨勢を調べることのいずれも含んでいる。
また、本発明において、「検出」は、膵臓がんに罹患しているか否かを確認することに加え、膵臓がんに罹患しやすいかどうかのリスクを調べること、症状が現れない段階で膵臓がんの可能性をスクリーニングすること、膵臓がんに罹患していることが明らかになった後で、その進行度、予後、治療効果、再発の可能性などの癌の趨勢を調べることのいずれも含んでいる。
また、本発明に係る検出方法は、従来膵臓がんの検査に用いられている腫瘍マーカーによる検査方法や画像診断などと組み合わせてもよい。
本明細書において「統計学的に有意」は、例えば、得られた値の危険率（有意水準）が０．０５、０．０１又は０．００１より小さい場合が挙げられる。それゆえ、測定値について「統計学的に有意に高い」とは、被検者と健常人のそれぞれから得られたｍｉＲＮＡの量的差異を統計学的に処理したときに両者間に有意差があり、かつ被検者の前記ｍｉＲＮＡの量が健常人のそれと比較して相対的に高いことをいう。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
（検出用キット）
本発明は、上述した本発明に係る検出方法を行うためのキットも包含する。
本発明に係る検出用キットの一態様は、上記(i)及び(ii)から選択されるmiRNAとハイブリダイズするDNAが固定された固相担体を含む。ここで固相担体は、DNAを固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられる。DNAは、これらの固相担体に公知の方法で固定することが可能である。
キットは、例えば、各種反応・検出用試薬、緩衝液、取扱説明書等をさらに備えていてもよい。
本発明は、上述した本発明に係る検出方法を行うためのキットも包含する。
本発明に係る検出用キットの一態様は、上記(i)及び(ii)から選択されるmiRNAとハイブリダイズするDNAが固定された固相担体を含む。ここで固相担体は、DNAを固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられる。DNAは、これらの固相担体に公知の方法で固定することが可能である。
キットは、例えば、各種反応・検出用試薬、緩衝液、取扱説明書等をさらに備えていてもよい。
本発明に係る検出用キットの一態様は、上記(i)及び(ii)から選択されるmiRNAまたはこれに相補的な核酸をPCR法で増幅するのに必要なプライマーセットを含む。上述のとおり試料中の標的miRNAの量をPCR法で測定する方法では、まず逆転写酵素でcDNAを作製することが一般的である。したがって、本発明に係る検出用キットは、標的miRNAまたはこれに相補的なDNAを増幅することができるプライマーセットを備えていてもよい。かかるプライマーセットは、標的miRNAの配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。
このようなキットは、例えば、逆転写酵素、各種反応・検出試薬、緩衝液、取扱説明書等をさらに備えていてもよい。
このようなキットは、例えば、逆転写酵素、各種反応・検出試薬、緩衝液、取扱説明書等をさらに備えていてもよい。
（膵臓がんの診断方法）
なお、本発明は、被検者に由来する血液試料中における、上記(i)及び(ii)から選択される少なくとも1つのmiRNAを測定する工程を含む、膵臓がんの診断方法も含む。
ここで「診断」は、医療行為者が、検出結果等に基づいて、被検者が特定の疾患に罹患しているかどうか判断することを意味する。
本発明に係る膵臓がんの診断方法について用いられる用語のうち、前述の本発明に係る検出方法で用いられた用語はそれと同義であり、ここでは説明を省略する。
なお、本発明は、被検者に由来する血液試料中における、上記(i)及び(ii)から選択される少なくとも1つのmiRNAを測定する工程を含む、膵臓がんの診断方法も含む。
ここで「診断」は、医療行為者が、検出結果等に基づいて、被検者が特定の疾患に罹患しているかどうか判断することを意味する。
本発明に係る膵臓がんの診断方法について用いられる用語のうち、前述の本発明に係る検出方法で用いられた用語はそれと同義であり、ここでは説明を省略する。
（大腸がんの検出方法）
本出願は、被検者に由来する血液試料中における配列番号：４７で表される配列を有するmiRNA、または当該miRNAと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするmiRNAであって、17〜30塩基長であるmiRNAを測定する工程を含む大腸がんの検出方法も包む。配列番号：４７で表されるmiRNAは、hsa-miR-23a-3pと称される。
大腸がんの検出方法について用いられる用語のうち、上述した膵臓がんの検出方法でも用いられたものはそれと同義である。
試料としては、血液試料、例えば血清または血漿が好ましい。
本出願は、被検者に由来する血液試料中における配列番号：４７で表される配列を有するmiRNA、または当該miRNAと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするmiRNAであって、17〜30塩基長であるmiRNAを測定する工程を含む大腸がんの検出方法も包む。配列番号：４７で表されるmiRNAは、hsa-miR-23a-3pと称される。
大腸がんの検出方法について用いられる用語のうち、上述した膵臓がんの検出方法でも用いられたものはそれと同義である。
試料としては、血液試料、例えば血清または血漿が好ましい。
後述する実施例に示すとおり、このmiRNAは、健常者の試料にはほとんど含まれないが、大腸がん患者ではステージが低い場合も高濃度に含まれていることが多い。また、大腸がんの術前に比較して、術後では濃度が有意に低下するので、術後の経過観察にも有用である。
hsa-miR-23a-3pは単独でも有用な大腸がんマーカーとして用いることができるし、例えば、特許文献１に開示されたmiRNAの少なくとも1つと組み合わせて用いてもよい。
hsa-miR-23a-3pは単独でも有用な大腸がんマーカーとして用いることができるし、例えば、特許文献１に開示されたmiRNAの少なくとも1つと組み合わせて用いてもよい。
本発明は、配列番号：４７で表される配列を有するmiRNAとハイブリダイズするDNAが固定された固相担体を含む、大腸がん検出用キットも含む。ここで固相担体は、DNAを固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられる。DNAは、これらの固相担体に公知の方法で固定することが可能である。キットは、例えば、各種反応・検出用試薬、緩衝液、取扱説明書等をさらに備えていてもよい。
本発明は、配列番号：４７で表される配列を有するmiRNAまたはこれに相補的な核酸をPCR法で増幅するのに必要なプライマーセットを含む大腸がん検出用キットも含む。かかるプライマーセットは、標的miRNAの配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。このようなキットは、例えば、逆転写酵素、各種反応・検出試薬、緩衝液、取扱説明書等をさらに備えていてもよい。
本発明は、被検者に由来する試料中における、配列番号：４７で表される配列を有するmiRNA、または当該miRNAと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするmiRNAを測定する工程を含む、大腸がんの診断方法も含む。
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に組み込まれる。
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
１．エクソソーム単離とエクソソームmiRNAのプロファイルの作製
100mmシャーレで10％FBSを含む培地で培養し、新しい培地に交換してから48時間後の6種類の膵臓がん細胞株（BxPC3, CAPAN1, HPAFII, Hs766T, PANC1, PSN1）及び2種類の不死化膵管上皮細胞株（HPDE4, HPDE6）の培養上清から、段階的に超遠心法（16,500 x g for 20 min、120,000 x g for 70 min）によって、エクソソーム画分を濃縮し、RNAをカラム調整し、マイクロアレイ解析の鋳型とした。16,500 x g で20 分間遠心した後、0.2 μmのナイロンメンブランで濾過したものを次の遠心の試料とした。
エクソソームmiRNAのプロファイルは、アジレント社のmiRNAマイクロアレイを用いて使用説明書に従って行い、GeneSpring Xでデータ解析を行った。
100mmシャーレで10％FBSを含む培地で培養し、新しい培地に交換してから48時間後の6種類の膵臓がん細胞株（BxPC3, CAPAN1, HPAFII, Hs766T, PANC1, PSN1）及び2種類の不死化膵管上皮細胞株（HPDE4, HPDE6）の培養上清から、段階的に超遠心法（16,500 x g for 20 min、120,000 x g for 70 min）によって、エクソソーム画分を濃縮し、RNAをカラム調整し、マイクロアレイ解析の鋳型とした。16,500 x g で20 分間遠心した後、0.2 μmのナイロンメンブランで濾過したものを次の遠心の試料とした。
エクソソームmiRNAのプロファイルは、アジレント社のmiRNAマイクロアレイを用いて使用説明書に従って行い、GeneSpring Xでデータ解析を行った。
図１に示されるように、超遠心法により濃縮したエクソソーム画分には、約20〜30塩基長の短いRNAが濃縮されていた。
このRNAサンプルを用いて、マイクロアレイ解析を行った結果を図２に示す。
図２に示されるように、膵臓がん細胞が分泌するエクソソームmiRNAのプロファイルは、内在性のmiRNAの発現プロファイルと大きく異なることから、膵臓がん細胞が分泌するmiRNAには選択性があることが分かった。
また、興味深いことに内在性の発現プロファイルでは、がん細胞株と不死化細胞（図中、下線部分）を区別することはできないが（左パネル）、エクソソームmiRNAのプロファイルでは、両者を区別できることがわかった。
この結果は、エクソソームmiRNAのプロファイルの変化は、細胞の悪性転換（がん化）によって誘導される可能性を示唆するものである。
このRNAサンプルを用いて、マイクロアレイ解析を行った結果を図２に示す。
図２に示されるように、膵臓がん細胞が分泌するエクソソームmiRNAのプロファイルは、内在性のmiRNAの発現プロファイルと大きく異なることから、膵臓がん細胞が分泌するmiRNAには選択性があることが分かった。
また、興味深いことに内在性の発現プロファイルでは、がん細胞株と不死化細胞（図中、下線部分）を区別することはできないが（左パネル）、エクソソームmiRNAのプロファイルでは、両者を区別できることがわかった。
この結果は、エクソソームmiRNAのプロファイルの変化は、細胞の悪性転換（がん化）によって誘導される可能性を示唆するものである。
続いて、6種類の膵臓がん細胞株が共通して分泌するmiRNAを選別した。マイクロアレイのデータは、細胞数、miR-923（リボソームRNA）、総RNA量のそれぞれで標準化した。下表に示されるとおり、膵臓がん細胞株で発現しているmiRNAが85種類同定された。
２．膵臓がん患者血漿を用いたエクソソームmiRNAの測定（１）
次に、膵臓がん患者由来の血漿検体(n=12)を用いて、エクソソームmiRNAのプロファイリングを行い、膵臓がんに特異的であるmiRNAの候補の検出が臨床の検体でも可能であるか検討を加えた。
まず、各膵臓がん患者の血漿検体（0.75〜1 mL）をPBSで10倍に希釈した後、超遠心法によりエクソソーム画分を濃縮した。
具体的には健常人(healthy control)１０名及び化学療法前の膵臓がん患者(pancreas cancer)１２名の血漿検体のアレイデータをシグナル強度として算出し、血漿量（plasma volume）で補正後に、算出したものを規格化したシグナル強度(normalized signal intensity (AU))とした。
解析には、検出された全miRNAのシグナル強度の総和を100％とし、各miRNAのシグナル値を％として示した値を用いてT検定を行い、p値が0.05以下のものを膵がん患者血漿特異的miRNAとして選別した。結果を下表に示す。また、測定の代表例を図３及び４に示す。
次に、膵臓がん患者由来の血漿検体(n=12)を用いて、エクソソームmiRNAのプロファイリングを行い、膵臓がんに特異的であるmiRNAの候補の検出が臨床の検体でも可能であるか検討を加えた。
まず、各膵臓がん患者の血漿検体（0.75〜1 mL）をPBSで10倍に希釈した後、超遠心法によりエクソソーム画分を濃縮した。
具体的には健常人(healthy control)１０名及び化学療法前の膵臓がん患者(pancreas cancer)１２名の血漿検体のアレイデータをシグナル強度として算出し、血漿量（plasma volume）で補正後に、算出したものを規格化したシグナル強度(normalized signal intensity (AU))とした。
解析には、検出された全miRNAのシグナル強度の総和を100％とし、各miRNAのシグナル値を％として示した値を用いてT検定を行い、p値が0.05以下のものを膵がん患者血漿特異的miRNAとして選別した。結果を下表に示す。また、測定の代表例を図３及び４に示す。
３．膵臓がん患者血漿を用いたエクソソームmiRNAの測定（２）
また、別の膵臓がん患者由来の血漿検体(n=12)を用いて、「２．膵臓がん患者血漿を用いたエクソソームmiRNAの測定（１）」と同様の測定を行った。
具体的には健常人(healthy control)１３名及び化学療法前の膵臓がん患者(pancreas cancer)１２名の血漿検体のアレイデータをシグナル強度として算出し、血漿量（plasma volume）で補正後に、算出したものを規格化したシグナル強度(normalized signal intensity (AU))とした。健常人と膵臓がん症例群について検定（Student’s t-test）を行い、平均値が膵臓がん群で高く、p値が0.05以下のものを健常人に対して有意に高いと判定した。
さらに血漿からエクソソームmiRNAのプロファイルをマイクロアレイで作成し、健常人及び大腸がん患者の血漿の解析データと比較検討した。
エクソソーム画分の濃縮、マイクロアレイによるプロファイリングやその後のデータ解析は、上記１．と同様の方法で行った。
また、別の膵臓がん患者由来の血漿検体(n=12)を用いて、「２．膵臓がん患者血漿を用いたエクソソームmiRNAの測定（１）」と同様の測定を行った。
具体的には健常人(healthy control)１３名及び化学療法前の膵臓がん患者(pancreas cancer)１２名の血漿検体のアレイデータをシグナル強度として算出し、血漿量（plasma volume）で補正後に、算出したものを規格化したシグナル強度(normalized signal intensity (AU))とした。健常人と膵臓がん症例群について検定（Student’s t-test）を行い、平均値が膵臓がん群で高く、p値が0.05以下のものを健常人に対して有意に高いと判定した。
さらに血漿からエクソソームmiRNAのプロファイルをマイクロアレイで作成し、健常人及び大腸がん患者の血漿の解析データと比較検討した。
エクソソーム画分の濃縮、マイクロアレイによるプロファイリングやその後のデータ解析は、上記１．と同様の方法で行った。
上記「２．膵臓がん患者血漿を用いたエクソソームのプロファイルの作製（１）」で検出されたmiRNAに加え、表６に示す9類のmiRNAは、健常人（n=13）と比べて有意に高い値（p<0.05）で検出されることが判明した。
さらに、図５に示されるように、血漿からのエクソソームmiRNAのプロファイルは、大腸がんと膵臓がん患者では大きく異なっており、がん種によって特異的である可能性が強く示唆された。
さらに、図５に示されるように、血漿からのエクソソームmiRNAのプロファイルは、大腸がんと膵臓がん患者では大きく異なっており、がん種によって特異的である可能性が強く示唆された。
４．大腸がんマーカーの同定
健常人血清検体(n=11)及びTNMステージ別大腸がん患者血清検体（Stages I(n=20)、II(n=20)、IIIa(n=20)、IIIb(n=16)、IV(n=12)）を用いて、エクソソームmiRNAのプロファイリングを行い、大腸がん特異的miRNAを選別した。
まず、血清検体（1 mL）をPBSで10倍に希釈した後、超遠心法によりエクソソーム画分を濃縮し、RNAを調整し、マイクロアレイ解析の鋳型とした。
血清からエクソソームmiRNAのプロファイルをマイクロアレイで作成し、健常人及び大腸がん患者血清の解析データを比較検討した。
エクソソーム画分の濃縮、マイクロアレイによるプロファイリングやその後のデータ解析は、上記１．と同様の方法で行った。
結果を図６に示す。図示されるように、miR-23a-3pについて、どのTNMステージにおいても、コントロールである健常人（n=11）と比べて有意に高い値で検出されることが判明した。また、miR-23a-3pは、健常人の血清からはほとんど検出されなかった。
健常人血清検体(n=11)及びTNMステージ別大腸がん患者血清検体（Stages I(n=20)、II(n=20)、IIIa(n=20)、IIIb(n=16)、IV(n=12)）を用いて、エクソソームmiRNAのプロファイリングを行い、大腸がん特異的miRNAを選別した。
まず、血清検体（1 mL）をPBSで10倍に希釈した後、超遠心法によりエクソソーム画分を濃縮し、RNAを調整し、マイクロアレイ解析の鋳型とした。
血清からエクソソームmiRNAのプロファイルをマイクロアレイで作成し、健常人及び大腸がん患者血清の解析データを比較検討した。
エクソソーム画分の濃縮、マイクロアレイによるプロファイリングやその後のデータ解析は、上記１．と同様の方法で行った。
結果を図６に示す。図示されるように、miR-23a-3pについて、どのTNMステージにおいても、コントロールである健常人（n=11）と比べて有意に高い値で検出されることが判明した。また、miR-23a-3pは、健常人の血清からはほとんど検出されなかった。
５．術前、術後の濃度の測定
大腸がん患者同一人物のがん摘出手術の術前術後の血清検体（Stages I(n=6)、II(n=5)、IIIa(n=5)、IIIb(n=5)、IV(n=3)）を用いて、miR-23a-3pが術後に減少するか検討した。
血清からエクソソームmiRNAのプロファイルをマイクロアレイで作成し、術前術後の大腸がん患者血清の解析データを比較検討した。
エクソソーム画分の濃縮、マイクロアレイによるプロファイリングやその後のデータ解析は、上記１．と同様の方法で行った。
結果を図７に示す。図示されるように、術前に比べて術後では、miR-23a-3pは有意に低い値で検出されることが判明した。また、どのTNMステージにおいても術後に減少した。
大腸がん患者同一人物のがん摘出手術の術前術後の血清検体（Stages I(n=6)、II(n=5)、IIIa(n=5)、IIIb(n=5)、IV(n=3)）を用いて、miR-23a-3pが術後に減少するか検討した。
血清からエクソソームmiRNAのプロファイルをマイクロアレイで作成し、術前術後の大腸がん患者血清の解析データを比較検討した。
エクソソーム画分の濃縮、マイクロアレイによるプロファイリングやその後のデータ解析は、上記１．と同様の方法で行った。
結果を図７に示す。図示されるように、術前に比べて術後では、miR-23a-3pは有意に低い値で検出されることが判明した。また、どのTNMステージにおいても術後に減少した。
配列番号：１〜１２０は、ｍｉＲＮＡの配列を示す。
Claims (5)
- 被検者の膵臓がんを検出する方法であって、
被検者に由来する試料中における以下の(i)及び(ii)から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを測定する工程を含む、検出方法：
(i) 配列番号：１〜１２０のいずれかで表される配列を有するｍｉＲＮＡ；及び
(ii) (i)のいずれかのｍｉＲＮＡと相補的な配列の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするｍｉＲＮＡであって、１７〜３０塩基長であるｍｉＲＮＡ。 - 前記(i)から選択されるｍｉＲＮＡが、配列番号：１〜３、５、７、１２、１３、１９〜２１、２６、２７、３０、３２、３５、３６、４２、５０、６２〜６４、７０〜７３、７８、８０、８１、８２、及び８５〜１２０のいずれかで表される配列を有する、請求項１に記載の検出方法。
- 前記被検者に由来する試料は、
被検者から採取された血漿からエクソソーム画分を濃縮する工程と、前記エクソソーム画分からｍｉＲＮＡを抽出する工程と、を含む方法によって調製される、請求項１または２に記載の検出方法。 - 請求項１から３のいずれか１項に記載の検出方法を行うためのキットであって、
前記(i)及び(ii)から選択されるｍｉＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが固定された固相担体を含む、キット。 - 請求項１から３のいずれか１項に記載の検出方法を行うためのキットであって、
前記(i)及び(ii)から選択されるｍｉＲＮＡまたはこれに相補的な核酸をＰＣＲ法で増幅するのに必要なプライマーセットを含む、キット。
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