JPWO2009142312A1

JPWO2009142312A1 - Microscope equipment

Info

Publication number: JPWO2009142312A1
Application number: JP2010513075A
Authority: JP
Inventors: 二星　俊明; 俊明二星
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2008-05-20
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2011-09-29
Also published as: WO2009142312A1

Abstract

対物レンズ１６と、レーザ光源３２，４２からのレーザ光束を前記対物レンズ１６を介して標本１２に照射する照明光学系５１と、前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブ６１と、前記蛍光キューブの前記光源側に挿脱可能な光学手段７０とを有し、前記光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行にする第１光学部材７２と、前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の位置に集光する第２光学部材７３とを有し、前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系内で移動可能である顕微鏡装置１。The objective lens 16, the illumination optical system 51 that irradiates the sample 12 with the laser beam from the laser light sources 32 and 42, the fluorescence detection optical system that detects the fluorescence from the sample, and the laser beam. A fluorescent cube 61 that guides the laser beam to the specimen, and optical means 70 that can be inserted into and removed from the light source side of the fluorescent cube. The optical means uses the principal ray of the laser beam as the optical axis of the illumination optical system. A first optical member 72 that is substantially parallel to the first optical member 72; and a second optical member 73 that condenses the laser beam at a predetermined position away from the optical axis of the pupil position of the objective lens. The microscope apparatus 1 in which the member and the second optical member are movable in the illumination optical system.

Description

本発明は、顕微鏡装置に関する。 The present invention relates to a microscope apparatus.

共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡は、生体細胞等の観察方法として広く使用されており、共にレーザ光源を使用する点で共通しており、共焦点顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡に使用できる顕微鏡が提案されている（例えば、特開２００５−１２１７９６号公報参照）。 Confocal microscopes and total reflection fluorescence microscopes are widely used as observation methods for living cells, etc., and both are common in that they use a laser light source, and a microscope that can be used for confocal microscopes and total reflection fluorescence microscopes is proposed. (See, for example, JP-A-2005-121796).

従来の顕微鏡では、共焦点顕微鏡から全反射顕微鏡への切り替え、或いは全反射顕微鏡において対物レンズを切替えた際に、対物レンズの瞳位置の全反射条件領域にレーザ光を集光させるための光学部材をその都度交換する必要があり、切替え交換作業が煩雑であるという問題がある。
上記課題を解決するため、本発明は、対物レンズと、レーザ光源からのレーザ光束を前記対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブと、前記蛍光キューブの前記レーザ光源側に挿脱可能な光学手段とを有し、前記光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行にする第１光学部材と、前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の位置に集光する第２光学部材とを有し、前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系内で移動可能であることを特徴とする顕微鏡装置を提供する。
本発明によれば、共焦点顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切換え可能であると共に、全反射照明時の対物レンズの切替えにも対応が容易な顕微鏡装置を提供することができる。In the conventional microscope, when switching from the confocal microscope to the total reflection microscope, or when switching the objective lens in the total reflection microscope, an optical member for condensing the laser beam on the total reflection condition region at the pupil position of the objective lens Need to be replaced each time, and there is a problem that switching and replacement work is complicated.
In order to solve the above problems, the present invention provides an objective lens, an illumination optical system that irradiates a specimen with a laser beam from a laser light source via the objective lens, and a fluorescence detection optical system that detects fluorescence from the specimen. A fluorescent cube that guides the laser beam to the specimen, and an optical unit that can be inserted into and removed from the laser light source side of the fluorescent cube, and the optical unit transmits a principal ray of the laser beam to the illumination optical system. A first optical member that is substantially parallel to the optical axis; and a second optical member that condenses the laser light beam at a predetermined position away from the optical axis of the pupil position of the objective lens. An optical member and the second optical member are movable in the illumination optical system, and provide a microscope apparatus.
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, while being able to switch from a confocal microscope to a total reflection fluorescence microscope, the microscope apparatus which can respond easily also to the switching of the objective lens at the time of total reflection illumination can be provided.

図１は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。
図２は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。
図３は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。
図４Ａは、実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作用における、共焦点走査照明状態または落射照明状態を説明する図。
図４Ｂは、実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作用における、全反射照明状態を説明する図。
図４Ｃは、実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作用における、楔プリズムの作用を説明する図。
図５Ａは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、移動量が「ｄ＋Δα」の場合の説明図。
図５Ｂは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、移動量が「ｄ」の場合の説明図。
図５Ｃは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、図５Ｂに対して結像位置変換手段を光軸方向に「Ｄ」移動した場合の説明図。FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a microscope apparatus according to an embodiment.
FIG. 2 shows an optical system of the microscope apparatus according to the embodiment.
FIG. 3 shows an optical system of the microscope apparatus when the optical system of the microscope apparatus according to the embodiment is switched to a total reflection microscope.
FIG. 4A is a diagram for explaining a confocal scanning illumination state or an epi-illumination state in the operation of the imaging position converting optical unit in the microscope apparatus according to the embodiment.
FIG. 4B is a diagram for explaining a total reflection illumination state in the operation of the imaging position converting optical unit in the microscope apparatus according to the embodiment.
FIG. 4C is a diagram for explaining the action of the wedge prism in the action of the imaging position converting optical unit in the microscope apparatus according to the embodiment.
FIG. 5A is an explanatory diagram when the movement amount is “d + Δα” in the operation of the imaging position conversion optical unit according to the embodiment.
FIG. 5B is an explanatory diagram when the movement amount is “d” in the operation of the imaging position conversion optical unit according to the embodiment.
FIG. 5C is an explanatory view when the imaging position converting means is moved “D” in the optical axis direction with respect to FIG. 5B in the operation of the imaging position converting optical means according to the embodiment.

以下、本発明の一実施の形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説明する。
図１は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。図２は実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。図３は全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。図４Ａ〜４Ｃは結像位置変換光学手段の作用を説明する図であり、図４Ａは共焦点走査照明状態または落射照明状態を、図４Ｂは全反射照明状態を、図４Ｃは楔プリズムの作用をそれぞれ説明する図である。図５Ａ〜５Ｃは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作を説明する図である。なお、図２、図３では、後述する透過照明光学系を省略している。
図１から図４Ａ〜４Ｃにおいて、顕微鏡装置１は、倒立型蛍光顕微鏡本体２（以後、単に顕微鏡と記す）と顕微鏡２に搭載されている各種装置を制御するパーソナルコンピュータ等からなる制御装置３（以後、ＰＣと記す）とから構成されている。
顕微鏡２は、ステージ１１に載置された標本１２を、透過照明光源１３からの光で透過照明光学系１４を介して照明し、標本１２を透過した光をリボルバ１５に搭載された対物レンズ１６で集光する。
対物レンズ１６で集光された光は、図２に示すように、結像光学系１７の結像レンズ１８とミラーＭ１を介して一次像面１７ａに結像される。一次像面１７ａに結像された標本１２の像は、リレーレンズ１７ｂ、ミラーＭ２、リレーレンズ１７ｃ、および接眼鏡筒１９のレンズ１９ａを介して二次像面１８ｂに結像され、不図示の接眼レンズを介して観察者に観察される。この際、図１に示す蛍光キューブホルダ２０中の蛍光キューブ２１は結像光学系１７の光路から外されている。また、プリズム２２は結像光学系１７の光路に交換可能に配置されており、標本１２の透過像を観察するときには光路から外されている。このように、顕微鏡装置１は透過型顕微鏡として使用することができる。
また、図２に示すように顕微鏡２には、共焦点走査観察系３１と落射照明系４１とが共通の照明光学系５１を介して配置されている。
以下、顕微鏡装置１を走査型顕微鏡（走査型蛍光顕微鏡、共焦点走査型顕微鏡）として使用する場合について図２を参照しつつ説明する。
走査型顕微鏡として使用する場合、共焦点走査観察系３１は、不図示のレーザ光源からのレーザ光を光ファイバ３２で導き、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光を光軸にほぼ平行なレーザ光にし、標本１２上で二次元に走査する二次元スキャナ３４に入射する。二次元スキャナ３４から射出されたレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像される。像面ＩＰ１を出射したレーザ光は、照明光学系５１の結像レンズ５２で光軸に略平行なレーザ光にされ光路に交換可能に配置された不図示のミラーに入射する。不図示のミラーは、蛍光キューブ２１、６１と切換え可能に構成されている。なお、共焦点走査観察系３１を使用する場合、後述する落射照明系４１で使用する照明光学系５１の光路に挿脱可能に配置されているダイクロイックミラー４４は、照明光学系５１の光路から外されている。
不図示のミラーに入射したレーザ光は、対物レンズ１６方向に反射され、対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。
一方、レーザ光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され、不図示のミラーで反射され照明光学系５１を逆行し二次元スキャナ３４に入射してデスキャンされ、ダイクロイックミラー３６で反射されて結像レンズ３７とピンホール３８を介してＰＭＴ等の受光素子３９に入射する。ＰＣ３は受光素子３９で受光された各点の強度を基に二次元画像に生成しモニター３ａ等で表示する。このように、顕微鏡装置１は共焦点走査型顕微鏡として使用することができる。
次に、顕微鏡装置１を落射蛍光顕微鏡として使用する場合について図２を参照しつつ説明する。
図２において、落射照明系４１の不図示の光源からの光は、光ファイバ４２で導かれ、コレクタレンズ４３で光ファイバ４２の端面から射出された光が、視野絞り４５位置に集光される。視野絞り４５を射出した光は、照明光学系５１に挿脱可能に配置されたダイクロイックミラー４４に入射して反射され、照明光学系５１の結像レンズ５２で集光され、光軸に略平行な光として光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ２１に入射する。なお、不図示の光源は、レーザ光源、高圧水銀ランプ、あるいはキセノンランプ等が使用可能である。蛍光キューブ２１は、波長選択フィルタ２１ａ、ダイクロイックミラー２１ｂ及びエミッションフィルタ２１ｃが内蔵されている。
蛍光キューブ２１に入射した光は、波長選択フィルタ２１ａとダイクロイックミラー２１ｂで所定の励起波長の光が選択され、対物レンズ１６方向に反射され、対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。
この光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され蛍光キューブ２１に入射し、蛍光キューブ２１のエミッションフィルタ２１ｃで所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ１８と結像光学系１７に挿脱可能に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。このようにして、顕微鏡装置１は落射蛍光顕微鏡として使用することができる。また、顕微鏡装置１では、撮像素子２３で撮像された蛍光画像と、受光素子３９で受光された信号から形成された共焦点画像をモニター３ａに重ねて表示させるなどして観察することが可能である。
次に、顕微鏡装置１を全反射顕微鏡として使用する場合について図３を参照しつつ説明する。
全反射顕微鏡として使用する際の照明は、上述の共焦点走査観察系３１のレーザ光を使用する。また、全反射照明を達成するための後述する結像位置変換光学手段７０を結像レンズ５２と蛍光キューブ６１との間の光路に挿入し全反射顕微鏡を達成している。
図３に示すように、共焦点走査観察系３１の不図示のレーザ光源からのレーザ光は、光ファイバ３２で導かれ、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光を光軸にほぼ平行なレーザ光にして二次元スキャナ３４に入射される。また、対物レンズ１６の瞳位置Ｐの光軸から離れた全反射条件領域にレーザ光を集光するために二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾斜が図１に示すＰＣ３の制御部により制御される。二次元スキャナ３４から射出された光軸シフト後のレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像され、照明光学系５１の結像レンズ５２を介して結像位置変換光学手段７０に入射する。結像位置変換光学手段７０は、光軸シフト後のレーザ光の光軸を照明光学系５１の光軸から距離ｄずらしたのち、対物レンズ１６の瞳位置Ｐに集光する光束に変換する。変換されたレーザ光はその後蛍光キューブ６１に入射する。
結像位置変換光学手段７０は、楔プリズム７２と凸レンズなどの集光レンズ７３から構成されている。そして図１に示す照明光学系５１の光路に挿脱可能に構成されている。なお、楔プリズム７２と集光レンズ７３は、光軸Ｉ１が図３及び図４Ｂに示すように、光軸シフト後レーザ光の光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」だけずらすことを可能にしている。この距離「ｄ」は、対物レンズ１６を介して被検物体を照明する場合の全反射条件となる瞳面上の位置に対応している。
このように結像位置変換光学手段７０に入射したレーザ光は、楔プリズム７２で光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸に対して主光線が距離「ｄ」だけずらされたレーザ光となり、集光レンズ７３で対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪帯状の全反射条件領域に集光される。この、全反射条件領域に集光されたレーザ光は、対物レンズ１６から標本１２と標本１２を支持するガラス基板との境界面で全反射される角度で標本１２に入射する。
全反射角で標本１２を支持する基板との境界面に入射したレーザ光は、境界面にエバネッセント波を発生し、標本１２の境界面近傍でこのエバネッセント波により励起された蛍光が発生する。なお、レーザ光の波長は、不図示のレーザ光源で選択されているため、このとき図２に示す波長選択フィルタ２１ａは不要である。
エバネッセント波で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され蛍光キューブ６１に入射し、蛍光キューブ６１のエミッションフィルタ２１ｃで所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ１８と結像光学系１７の光軸に挿脱可能に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され、撮像素子２３で蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。
このように、顕微鏡装置１は、照明光学系５１の光路中に結像位置変換光学手段７０を挿入し、レーザ光の光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」だけ二次元スキャナ３４と楔プリズム７２を介して略平行に移動させ、かつ結像レンズ７３で対物レンズ１６の瞳面Ｐの所定位置に結像させることによって全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。
図４Ａ〜４Ｃ、図５Ａ〜５Ｃを参照して、全反射照明への移行について詳説する。
図４Ａは、走査型顕微鏡あるいは落射蛍光顕微鏡として使用する場合の照明光の状態を示している。上記顕微鏡の場合、結像レンズ５２に入射した破線で示す（＋）最大画角光束）、実線で示す像中心光束、及び粗い破線で示す（−）最大画角光束のいずれの場合も、対物レンズ１６の瞳位置Ｐでは、集光されていない略平行光束である。
一方、図４Ｂに示す、全反射顕微鏡としての照明状態では、レーザ光の光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸から図４Ａ〜４Ｃの紙面では上方に距離「ｄ」シフトされている。また、結像レンズ５２から射出するレーザ光は、レーザ光の光軸Ｉ１が、図４Ｃに示すように照明光学系５１の光軸に対して角α傾斜して入射する。楔プリズム７２はこの傾斜角αをほぼゼロにして照明光学系５１の光軸とレーザ光の光軸Ｉ１とが距離「ｄ」だけ離れてほぼ平行になるように変換する。その後、レーザ光は集光レンズ７３で対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪帯状の全反射条件領域に集光される。この結果、全反射照明が可能となる。
図４Ｃに示すように、傾斜角αと楔プリズム７２の頂角δの関係は、α＝（ｎ−１）×δで示される。ここでｎは、楔プリズム７２を構成する媒質の屈折率である。
このように、対物レンズ１６の開口数（ＮＡ）に応じたレーザ光の光軸Ｉ１の傾斜角αに対応する頂角δを有する楔プリズム７２と、焦点距離ｆの集光レンズ７３を組み合わせた結像位置変換光学手段７０を照明光学系５１の結像レンズ５２と蛍光キューブ６１との間に挿入することで容易に全反射照明を達成することが可能になる。
また、実施の形態にかかる顕微鏡１では、照明光学系５１の光路に挿入される結像位置変換光学手段７０の楔プリズム７２と結像レンズ７３は、図５Ａ〜５Ｃに示すように照明光学系５１の光路中で移動可能に構成されている。なお、図５Ａ〜５Ｃでは、楔プリズム７２と結像レンズ７３とが一体的に、照明光学系５１の光軸に対して直交する方向、或いは照明光学系５１の光軸に沿った方向に移動する場合を示しているが、楔プリズム７２と結像レンズ７３を個別に移動するように構成することもできる。例えば、結像位置変換手段７０を照明光学系５１の光軸に対して直交する方向に移動後、結像レンズ７３のみを照明光学系５１の光軸に沿って移動するように構成することも可能である。このように構成することで、レーザ光の光軸をｄずらしたのちに対物レンズ１６の瞳位置Ｐの全反射領域に集光することが容易になる。
これにより、対物レンズ１６が交換されて、ＮＡと瞳位置Ｐが変わった場合でも、照明光学系５１内での楔プリズム７２と結像レンズ７３の位置を調整することで、対物レンズ１６に応じた全反射照明領域にレーザ光を集光することができる。
図５Ａ〜５Ｃを参照して、移動量「ｄ」と瞳位置が変化した場合の結像位置変換光学手段７０の作用について説明する。
図５Ａに示すように、移動量が「ｄ＋Δα」、瞳位置「Ｐ１」の対物レンズ１６から、図５Ｂ、図５Ｃに示す移動量が「ｄ」、瞳位置が「Ｐ」の対物レンズ１６に交換された場合について説明する。
まず、レーザ光の光軸Ｉ１の移動量を「ｄ＋Δα」から「ｄ」に、図１に示すＰＣ３の制御部を介して二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾きを制御すると共に、結像位置変換光学手段７０を照明光学系５１の光軸に直交する方向に移動して、楔プリズム７２から射出する光束の光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸に略平行になるようにする（図５Ｂ参照）。これで、光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸から「ｄ」の距離に設定される。
次に、結像位置変換光学部材７０を照明光学系５１の光軸に沿って移動量「Ｄ」（図５Ｂ参照）移動し対物レンズ１６の瞳位置「Ｐ」にレーザ光が集光するように結像レンズ７３を位置付けする（図５Ｃ参照）。以上の操作で、対物レンズ１６が変更された場合の、移動量「ｄ」と瞳位置「Ｐ」への集光調整が完了する。なお、結像位置変換光学手段７０の移動制御、或いは楔プリズム７２、結像レンズ７３それぞれの移動制御は、ＰＣ３の制御部を介して、不図示のそれぞれの駆動部を駆動するように構成することもできる。
以上述べたように、実施の形態にかかる顕微鏡装置１によれば、共焦点走査観察系３１の二次元スキャナ３４を所定の傾きに制御することでレーザ光を照明光学系５１の光軸からシフトさせた後、結像位置変換光学手段７０を照明光学系５１の光路中に挿入し、楔プリズム７２、結像レンズ７３の位置を調整することによって全反射蛍光観察を可能にすることができる。
また、対物レンズ１６が交換された場合でも、共焦点走査観察系３１の二次元スキャナ３４を所定の傾きに制御してレーザ光を照明光学系５１の光軸からシフトさせた後、結像位置変換光学手段７０の、楔プリズム７２、結像レンズ７３の位置を調整することによって全反射蛍光観察を可能にすることができる。
また、共焦点走査型観察、走査型蛍光観察、落射蛍光観察、透過観察等の顕微鏡としても使用可能な顕微鏡装置１を提供することができる。
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。Hereinafter, a microscope apparatus according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings.
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a microscope apparatus according to an embodiment. FIG. 2 shows an optical system of the microscope apparatus according to the embodiment. FIG. 3 shows the optical system of the microscope apparatus when switched to the total reflection microscope. 4A to 4C are diagrams for explaining the operation of the imaging position converting optical means. FIG. 4A shows the confocal scanning illumination state or the epi-illumination state, FIG. 4B shows the total reflection illumination state, and FIG. 4C shows the operation of the wedge prism. It is a figure explaining each. 5A to 5C are diagrams for explaining the operation of the imaging position converting optical unit according to the embodiment. In FIGS. 2 and 3, a transmission illumination optical system to be described later is omitted.
1 to 4A to 4C, a microscope apparatus 1 includes an inverted fluorescent microscope main body 2 (hereinafter simply referred to as a microscope) and a control device 3 (for example, a personal computer that controls various devices mounted on the microscope 2). Hereinafter, it is referred to as PC).
The microscope 2 illuminates the specimen 12 placed on the stage 11 with light from the transmission illumination light source 13 via the transmission illumination optical system 14, and the objective lens 16 mounted on the revolver 15 with the light transmitted through the specimen 12. To collect light.
As shown in FIG. 2, the light condensed by the objective lens 16 is imaged on the primary image surface 17a via the imaging lens 18 of the imaging optical system 17 and the mirror M1. The image of the specimen 12 formed on the primary image surface 17a is formed on the secondary image surface 18b via the relay lens 17b, the mirror M2, the relay lens 17c, and the lens 19a of the eyepiece tube 19, and is not shown. Observed by an observer through an eyepiece. At this time, the fluorescent cube 21 in the fluorescent cube holder 20 shown in FIG. 1 is removed from the optical path of the imaging optical system 17. Further, the prism 22 is disposed so as to be exchangeable in the optical path of the imaging optical system 17, and is removed from the optical path when a transmission image of the specimen 12 is observed. Thus, the microscope apparatus 1 can be used as a transmission microscope.
As shown in FIG. 2, the microscope 2 is provided with a confocal scanning observation system 31 and an epi-illumination system 41 through a common illumination optical system 51.
Hereinafter, the case where the microscope apparatus 1 is used as a scanning microscope (scanning fluorescence microscope, confocal scanning microscope) will be described with reference to FIG.
When used as a scanning microscope, the confocal scanning observation system 31 guides laser light from a laser light source (not shown) with an optical fiber 32, and the laser light emitted from the end face of the optical fiber 32 with the collector lens 33 is an optical axis. And is incident on a two-dimensional scanner 34 that scans the sample 12 two-dimensionally. The laser light emitted from the two-dimensional scanner 34 is imaged on the image plane IP1 by the pupil relay lens 35. The laser beam emitted from the image plane IP1 is converted into a laser beam substantially parallel to the optical axis by the imaging lens 52 of the illumination optical system 51 and is incident on a mirror (not shown) disposed so as to be exchangeable in the optical path. A mirror (not shown) is configured to be switchable with the fluorescent cubes 21 and 61. When the confocal scanning observation system 31 is used, the dichroic mirror 44 that is detachably arranged in the optical path of the illumination optical system 51 used in the epi-illumination system 41 to be described later is outside the optical path of the illumination optical system 51. Has been.
Laser light that has entered a mirror (not shown) is reflected in the direction of the objective lens 16, enters the objective lens 16, and is collected on the sample 12.
On the other hand, the fluorescence excited by the laser light and expressed in the specimen 12 is collected by the objective lens 16, reflected by a mirror (not shown), reversely travels through the illumination optical system 51, enters the two-dimensional scanner 34, and is descanned. The light is reflected by 36 and enters a light receiving element 39 such as a PMT through an imaging lens 37 and a pinhole 38. The PC 3 generates a two-dimensional image based on the intensity of each point received by the light receiving element 39 and displays it on the monitor 3a or the like. Thus, the microscope apparatus 1 can be used as a confocal scanning microscope.
Next, the case where the microscope apparatus 1 is used as an epifluorescence microscope will be described with reference to FIG.
In FIG. 2, light from a light source (not shown) of the epi-illumination system 41 is guided by the optical fiber 42, and light emitted from the end face of the optical fiber 42 by the collector lens 43 is condensed at the position of the field stop 45. . The light emitted from the field stop 45 is incident on and reflected by the dichroic mirror 44 that is detachably disposed in the illumination optical system 51, is collected by the imaging lens 52 of the illumination optical system 51, and is substantially parallel to the optical axis. Is incident on the fluorescent cube 21 that is replaceably disposed in the optical path. As the light source (not shown), a laser light source, a high-pressure mercury lamp, a xenon lamp, or the like can be used. The fluorescent cube 21 includes a wavelength selection filter 21a, a dichroic mirror 21b, and an emission filter 21c.
For light incident on the fluorescent cube 21, light having a predetermined excitation wavelength is selected by the wavelength selection filter 21a and the dichroic mirror 21b, reflected toward the objective lens 16, and incident on the objective lens 16 and condensed on the specimen 12. .
The fluorescence excited by the light and expressed in the specimen 12 is collected by the objective lens 16 and enters the fluorescent cube 21, and predetermined fluorescence is selectively transmitted through the emission filter 21 c of the fluorescent cube 21, and forms an image with the imaging lens 18. An image is formed on the image sensor 23 through the prism 22 that is detachably disposed in the optical system 17 and a fluorescent image is captured. The image picked up by the image pickup device 23 is subjected to image processing by the PC 3 shown in FIG. 1 and displayed on the monitor 3a. Thus, the microscope apparatus 1 can be used as an epifluorescence microscope. In the microscope apparatus 1, it is possible to observe the fluorescent image captured by the image sensor 23 and the confocal image formed from the signal received by the light receiving element 39 by superimposing them on the monitor 3 a. is there.
Next, the case where the microscope apparatus 1 is used as a total reflection microscope will be described with reference to FIG.
For the illumination when used as a total reflection microscope, the laser beam of the above-described confocal scanning observation system 31 is used. Further, an imaging position converting optical means 70 to be described later for achieving total reflection illumination is inserted into the optical path between the imaging lens 52 and the fluorescent cube 61 to achieve a total reflection microscope.
As shown in FIG. 3, laser light from a laser light source (not shown) of the confocal scanning observation system 31 is guided by an optical fiber 32, and the laser light emitted from the end face of the optical fiber 32 by the collector lens 33 is converted into an optical axis. Is incident on the two-dimensional scanner 34. Further, the tilt of the XY mirrors of the two-dimensional scanner 34 is controlled by the control unit of the PC 3 shown in FIG. 1 in order to focus the laser beam on the total reflection condition region away from the optical axis of the pupil position P of the objective lens 16. The The laser beam after the optical axis shift emitted from the two-dimensional scanner 34 is imaged on the image plane IP1 by the pupil relay lens 35, and is applied to the imaging position converting optical means 70 via the imaging lens 52 of the illumination optical system 51. Incident. The imaging position conversion optical means 70 shifts the optical axis of the laser beam after the optical axis shift by a distance d from the optical axis of the illumination optical system 51 and then converts it into a light beam that is condensed at the pupil position P of the objective lens 16. The converted laser light then enters the fluorescent cube 61.
The imaging position converting optical means 70 includes a wedge prism 72 and a condenser lens 73 such as a convex lens. And it is comprised so that insertion / removal to the optical path of the illumination optical system 51 shown in FIG. The wedge prism 72 and the condensing lens 73 have the optical axis I1 shifted from the optical axis of the illumination optical system 51 by a distance “d” as shown in FIGS. 3 and 4B. It is possible to shift. This distance “d” corresponds to a position on the pupil plane that is a total reflection condition when the object to be examined is illuminated via the objective lens 16.
The laser light incident on the imaging position converting optical means 70 in this way becomes laser light in which the principal ray is shifted by the distance “d” with respect to the optical axis of the illumination optical system 51 by the wedge prism 72. The light is condensed by the condensing lens 73 on the annular total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16. The laser beam condensed in the total reflection condition region is incident on the sample 12 at an angle that is totally reflected from the objective lens 16 at the boundary surface between the sample 12 and the glass substrate that supports the sample 12.
The laser light incident on the boundary surface with the substrate supporting the sample 12 at the total reflection angle generates an evanescent wave at the boundary surface, and fluorescence excited by the evanescent wave is generated near the boundary surface of the sample 12. Since the wavelength of the laser light is selected by a laser light source (not shown), the wavelength selection filter 21a shown in FIG. 2 is not necessary at this time.
The fluorescence excited by the evanescent wave and expressed in the specimen 12 is collected by the objective lens 16 and enters the fluorescent cube 61, and predetermined fluorescence is selectively transmitted by the emission filter 21 c of the fluorescent cube 61, and forms an image with the imaging lens 18. An image is formed on the image sensor 23 via a prism 22 that is detachably disposed on the optical axis of the optical system 17, and a fluorescence image is captured by the image sensor 23. The image picked up by the image pickup device 23 is subjected to image processing by the PC 3 shown in FIG. 1 and displayed on the monitor 3a.
In this way, the microscope apparatus 1 inserts the imaging position converting optical means 70 in the optical path of the illumination optical system 51 and two-dimensionally separates the optical axis I1 of the laser light from the optical axis of the illumination optical system 51 by a distance “d”. By moving the scanner 34 and the wedge prism 72 substantially in parallel, and forming an image at a predetermined position on the pupil plane P of the objective lens 16 with the imaging lens 73, it can be used as a total reflection fluorescent microscope.
The transition to total reflection illumination will be described in detail with reference to FIGS. 4A to 4C and FIGS. 5A to 5C.
FIG. 4A shows the state of illumination light when used as a scanning microscope or an epifluorescence microscope. In the case of the above-described microscope, the objective lens in any case of the (+) maximum field angle light beam indicated by a broken line incident on the imaging lens 52, the image center light beam indicated by a solid line, and the (−) maximum field angle light beam indicated by a rough broken line. At the pupil position P of the lens 16, it is a substantially parallel light beam that is not condensed.
On the other hand, in the illumination state as a total reflection microscope shown in FIG. 4B, the optical axis I1 of the laser light is shifted upward by a distance “d” from the optical axis of the illumination optical system 51 on the paper surface of FIGS. Further, the laser light emitted from the imaging lens 52 is incident with the optical axis I1 of the laser light inclined at an angle α with respect to the optical axis of the illumination optical system 51 as shown in FIG. 4C. The wedge prism 72 converts the optical axis of the illumination optical system 51 and the optical axis I1 of the laser beam so as to be substantially parallel to each other by a distance “d” with the inclination angle α being substantially zero. Thereafter, the laser beam is condensed by the condenser lens 73 onto the annular total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16. As a result, total reflection illumination is possible.
As shown in FIG. 4C, the relationship between the inclination angle α and the apex angle δ of the wedge prism 72 is expressed as α = (n−1) × δ. Here, n is the refractive index of the medium constituting the wedge prism 72.
As described above, the wedge prism 72 having the apex angle δ corresponding to the inclination angle α of the optical axis I1 of the laser beam corresponding to the numerical aperture (NA) of the objective lens 16 and the condenser lens 73 having the focal length f are combined. By inserting the imaging position converting optical means 70 between the imaging lens 52 of the illumination optical system 51 and the fluorescent cube 61, total reflection illumination can be easily achieved.
Further, in the microscope 1 according to the embodiment, the wedge prism 72 and the imaging lens 73 of the imaging position conversion optical means 70 inserted in the optical path of the illumination optical system 51 are provided in the illumination optical system as shown in FIGS. It is configured to be movable in 51 optical paths. 5A to 5C, the wedge prism 72 and the imaging lens 73 are integrally moved in a direction orthogonal to the optical axis of the illumination optical system 51 or in a direction along the optical axis of the illumination optical system 51. However, the wedge prism 72 and the imaging lens 73 may be moved individually. For example, after the imaging position converting means 70 is moved in a direction orthogonal to the optical axis of the illumination optical system 51, only the imaging lens 73 may be moved along the optical axis of the illumination optical system 51. Is possible. With this configuration, it is easy to focus the light on the total reflection region at the pupil position P of the objective lens 16 after the optical axis of the laser light is shifted by d.
Thereby, even when the objective lens 16 is exchanged and the NA and the pupil position P are changed, the positions of the wedge prism 72 and the imaging lens 73 in the illumination optical system 51 are adjusted, so that the objective lens 16 is adjusted. Further, the laser beam can be condensed on the total reflection illumination area.
With reference to FIGS. 5A to 5C, the operation of the imaging position converting optical means 70 when the movement amount “d” and the pupil position change will be described.
As shown in FIG. 5A, from the objective lens 16 with the movement amount “d + Δα” and the pupil position “P1” to the objective lens 16 with the movement amount “d” and the pupil position “P” shown in FIGS. 5B and 5C. The case where it is exchanged will be described.
First, the amount of movement of the optical axis I1 of the laser light is changed from “d + Δα” to “d”, and the tilt of the XY mirrors of the two-dimensional scanner 34 is controlled via the control unit of the PC 3 shown in FIG. The conversion optical means 70 is moved in a direction perpendicular to the optical axis of the illumination optical system 51 so that the optical axis I1 of the light beam emitted from the wedge prism 72 is substantially parallel to the optical axis of the illumination optical system 51 (FIG. 5B). Thus, the optical axis I1 is set to a distance “d” from the optical axis of the illumination optical system 51.
Next, the imaging position converting optical member 70 is moved along the optical axis of the illumination optical system 51 by the movement amount “D” (see FIG. 5B) so that the laser beam is focused on the pupil position “P” of the objective lens 16. The imaging lens 73 is positioned on (see FIG. 5C). With the above operation, the focusing adjustment to the movement amount “d” and the pupil position “P” when the objective lens 16 is changed is completed. The movement control of the imaging position converting optical means 70 or the movement control of each of the wedge prism 72 and the imaging lens 73 is configured to drive each driving unit (not shown) via the control unit of the PC 3. You can also.
As described above, according to the microscope apparatus 1 according to the embodiment, the laser beam is shifted from the optical axis of the illumination optical system 51 by controlling the two-dimensional scanner 34 of the confocal scanning observation system 31 to a predetermined inclination. Then, the imaging position conversion optical means 70 is inserted into the optical path of the illumination optical system 51, and the positions of the wedge prism 72 and the imaging lens 73 can be adjusted to enable total reflection fluorescence observation.
Even when the objective lens 16 is replaced, after the laser beam is shifted from the optical axis of the illumination optical system 51 by controlling the two-dimensional scanner 34 of the confocal scanning observation system 31 to a predetermined inclination, the imaging position By adjusting the positions of the wedge prism 72 and the imaging lens 73 of the conversion optical means 70, total reflection fluorescence observation can be made possible.
Further, it is possible to provide a microscope apparatus 1 that can be used as a microscope for confocal scanning observation, scanning fluorescence observation, epifluorescence observation, transmission observation, and the like.
The above-described embodiment is merely an example, and is not limited to the above-described configuration and shape, and can be appropriately modified and changed within the scope of the present invention.

Claims

An objective lens;
An illumination optical system for irradiating a specimen with a laser beam from a laser light source via the objective lens;
A fluorescence detection optical system for detecting fluorescence from the specimen;
A fluorescent cube for guiding the laser beam to the specimen;
Optical means that can be inserted into and removed from the laser light source side of the fluorescent cube;
The optical means includes a first optical member that makes the principal ray of the laser beam substantially parallel to the optical axis of the illumination optical system, and a predetermined distance apart from the optical axis at the pupil position of the objective lens. A second optical member that collects light at a position;
The microscope apparatus, wherein the first optical member and the second optical member are movable in the illumination optical system.

The microscope apparatus according to claim 1, wherein the first optical member and the second optical member are movable in a direction substantially orthogonal to the optical axis of the illumination optical system.

The microscope apparatus according to claim 1, wherein the first optical member and the second optical member are movable along an optical axis of the illumination optical system.

The microscope apparatus according to claim 1 or 2, wherein only the second optical member is movable along the optical axis of the illumination optical system.

The microscope apparatus according to claim 1, wherein the first optical member includes a wedge prism.

The microscope apparatus according to claim 1, wherein the second optical member includes an imaging lens.

2. The microscope apparatus according to claim 1, wherein the laser beam condensed at the predetermined position is emitted from the objective lens so that an incident angle with respect to the specimen is equal to or greater than a total reflection angle.

The microscope apparatus according to claim 1, wherein the illumination optical system further includes an epi-illumination optical system.