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JPWO2009044773A1 - レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマー、検出方法および検出キット - Google Patents

レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマー、検出方法および検出キット Download PDF

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Abstract

【課題】レジオネラ属菌を迅速、高感度、特異的に検出すること。【解決手段】レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを特異的かつ高効率に増幅するためのプライマーセットおよびそのプライマーセットによるレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ検出方法を提供する。【選択図】 図１

Description

本発明は、レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマーセット、検出方法および検出キットに関する。
レジオネラ属菌は、自然界の土壌と淡水などに広く分布しているグラム陰性桿菌である。レジオネラ属菌は約５０種に分類され、すべての菌種によってレジオネラ症が発症しうるとされている。近年、クーリングタワー、循環温泉水、２４時間風呂などの人工環境中でレジオネラ属菌が増殖し、発生したエアロゾルの吸入によるレジオネラ症への感染が問題となっている。
レジオネラ症は病状の進行が早く、早期に治療する必要があるが、レジオネラ症に対して他の細菌感染症の治療に使用されるペニシリン系、セフェム系抗生物質は効果がなく適切な治療のためには、早期にレジオネラ症と診断する必要がある。また、レジオネラ症予防の観点からも人工環境中のレジオネラ属菌の迅速な検査も必要とされている。しかし、従来のレジオネラ属菌検査方法は培養法であり、検査の結果を得るために５日間〜７日間と長い時間を要する（非特許文献１）。
この問題を解決するために免疫学的検査法、遺伝子検査法が試みられている。免疫学的検査法はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ特異的抗体を用いているため、検出できるのはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに限られ、他の菌種に対する感度が不十分である（非特許文献２）。
また、遺伝子検査法ではＪｏｎａｓ Ｄ．等によるレジオネラ属菌の１６ＳリボソームＤＮＡを標的としたＰＣＲ法が汎用されており、レジオネラ属菌を高感度に検出することができる（非特許文献３）。
他方、ＲＮＡを高感度に測定する方法としてＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられるが、この場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要で、このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることになる。このＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減の点で問題があった。
ＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を経時的に測定するＫｉｎｅｔｉｃ ＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されているが、この方法ではＰＣＲ工程および測定工程を少なくとも２０分で実施可能であるもののプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題があった。さらに、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。また、ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＤＮＡも増幅してしまうため、前述のようにＲＮＡを対象とする場合は、ＤＮａｓｅ処理等により試料中のＤＮＡを完全に除去する必要があり、このことが操作のいっそうの煩雑化をまねいていた。
これに対し、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２参照）、およびＴＭＡ法（特許文献３参照）などが報告されている。このＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定核酸配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
これらのＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼイション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、この煩雑さのために多数検体処理や自動化に不適であるばかりでなく、結果として再現性不良や増幅核酸の二次汚染をまねきやすいという課題がある。
これに対して、簡便にＲＮＡを増幅および測定する方法としては，Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特許文献４および非特許文献４参照）の方法があげられる。この方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分がその相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時かつ迅速・簡便に実施することが可能である。
特許第２６５０１５９号 特許第３１５２９２７号 特許第３２４１７１７号 特開２０００−１４４００号公報 厚生省生活衛生局企画課監修新版レジオネラ症防止指針、財団法人 ビル管理教育センター発行 感染症学雑誌 Ｖｏ．７１，Ｎｏ．７，ｐ６３４−６４３ Ｊｏｎａｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３３，１２４７−１２５２ Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，（２００３）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６ Ｓｔｅｖｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，（２００６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５０，１９１３−１９２０ Ｎａｏｋｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，１１２７０−１１２８１
約５０種のレジオネラ属菌を検出し、その他の非レジオネラ属菌を検出しないための核酸増幅標的としては、レジオネラ属菌種間で高度に保存されており、かつ非レジオネラ属菌とは顕著に異なる配列を有する標的核酸（標的遺伝子）が望ましいと考えた。
このような標的核酸（標的遺伝子）候補の一つとして、１６ＳリボゾームＲＮＡを考えたが、１６ＳリボゾームＲＮＡを標的としても、現実的にはレジオネラ属菌種間でも多くの多様性があり、またその多くが非レジオネラ属菌と高い相同性を示す配列であった。そのため、約５０種のレジオネラ属菌の１６ＳリボゾームＲＮＡを高効率かつ一様に増幅し、かつ非レジオネラ属菌の１６ＳリボゾームＲＮＡは増幅しないというプライマーセットの構築はきわめて困難であった。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを特異的かつ高効率に増幅するためのプライマーセットおよびそのプライマーセットを用いたレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ検出方法を提供することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを特異的に増幅するプライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法を構築するにいたった。
すなわち、本発明によれば、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、配列番号：１又は７で示される塩基配列の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーと、配列番号：４７又は４９で示される塩基配列の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むセンスプライマーを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセットが提供される。
また、本発明によれば、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、配列番号：４５又は４８で示される塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーと、配列番号：２又は８で示される塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むセンスプライマーを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセットが提供される。
これらのレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的プライマーセットを用いて各種の核酸増幅法を行うことにより、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡを特異的に高効率に増幅することができ、レジオネラ属菌の簡便かつ確実な検出が可能となる。
また、本発明によれば、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡを鋳型として、前述のプライマーセットにより核酸増幅を行い、増幅産物を得る工程と、その工程と同時か或いはそれに引き続いて、その増幅産物を、検出可能なシグナル生成手段で標識された、配列番号：６又は１１で示される塩基配列あるいはその塩基配列の相補配列の何れか一方と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含む核酸プローブで検出する工程と、を含むレジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡの検出方法が提供される。
この検出方法によれば、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的プライマーセットを用いた核酸増幅法と、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的標識核酸プローブによる検出とを組み合わせて行うことにより、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの増幅および検出を、密閉容器内で同時かつ迅速・簡便に実施することが可能となる。
また、本発明によれば、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡの検出キットであって、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡを鋳型として核酸増幅を行い、増幅産物を得るための、前述のプライマーセットと、その増幅産物を検出するための、検出可能なシグナル生成手段で標識された、配列番号：６又は１１で示される塩基配列あるいは該塩基配列の相補配列の何れか一方と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基のヌクレオチドを含む核酸プローブとを含む検出キットが提供される。
この検出キットを用いると、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的プライマーセットを用いた核酸増幅法と、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的標識核酸プローブによる検出とを組み合わせて行うことが可能となり、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの増幅および検出を、密閉容器内で同時かつ迅速・簡便に実施することが可能となる。
本発明により、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを迅速、高感度で検出することが可能となった。さらに、本発明においては、従来法に比べ、生菌に対する検出特異性が改善された。したがって、本発明によると、治療後の患者、洗浄後の環境水などでの偽陽性を軽減することも可能である。
実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。 本発明における代表的な塩基配列を説明するための図である。 本発明における代表的な塩基配列を説明するための図である。
発明の実施の形態
〔用語の説明〕
本実施形態における「レジオネラ属菌」とは、自然界の土壌と淡水などに広く分布しているグラム陰性桿菌である。レジオネラ属菌は約５０種に分類され、すべての菌種によってレジオネラ症が発症しうるとされている。本実施形態におけるレジオネラ属菌とは、出願時においての、生物学的分類（特に遺伝学的分類や分子生物学的分類）によるレジオネラ（Legionella）属の細菌のみならず、以前はレジオネラ属菌として分類されていたが、現在は他の属として分類されているレジオネラ属類縁菌（旧レジオネラ属菌）も含む。このようなレジオネラ属類縁菌としては、例えば、FluoribacterやTatlockiaなどが挙げられる。これらは依然、医療現場においては、レジオネラ症の原因菌（レジオネラ属菌）として重要な細菌であり、本発明はこれらの菌類もその対象として検出可能であり、したがって、これらも本実施形態における「レジオネラ属菌」に含める。
また、本実施形態における「リボゾームＲＮＡ」とは、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の各サブユニットをいう。リボソームＲＮＡには、沈降係数（Ｓ）の異なるリボゾームＲＮＡのサブユニットが存在するが、本発明のプライマーセットは、主に、１６Ｓサブユニットを構成するＲＮＡをその標的とする。
また、本実施形態における「ヌクレオチド」もしくは「核酸」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド（ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）及びポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本実施形態に係るヌクレオチドもしくは核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子等や放射性同位体で標識されたモノマー、あるいはこれらを含むオリゴマー又はポリマーを含む。
また、配列表（配列番号：３、９、１０、５０）に記載の塩基記号ｙはシトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）を表す。
また、本実施形態における「プライマー」とは、核酸増幅反応において、鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいう。核酸増幅反応において増幅を所望する鋳型を基に、その鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を行えるように、例えば、特異的なＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法等での生成物（鎖長あるいは配列において）を生成可能なように、好ましくはプライマー自身がその鋳型特異的な配列を含むように、設計される。また、一般的なプライマーは、これに限られないが、通常、１５塩基−１００塩基、好ましくは１５塩基−３５塩基の鎖長を有するように設計される。
プライマーの３’側の領域は鋳型鎖に対し相補的であることが好ましいが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどの機能的な配列を付加することも可能である。
また、後述するように、例えば核酸増幅法としてＩＣＡＮ法を用いる場合などにおいては、プライマーはＤＮＡだけでなくＲＮＡを含むか、あるいは必要に応じてＲＮＡのみで構成されていてもよい。特に本発明に好適なプライマーについては、後述する。ＰＣＲ法又はその他の協奏的核酸増幅反応においては、一般に、センスプライマー（第一のプライマー）とアンチセンスプライマー（第二のプライマー）とからなる一組、あるいはそれ以上のプライマーを含むプライマーセットが用いられる。
また、本実施形態において、「特異的にハイブリダイズする」とは、あるヌクレオチドに対し、別のヌクレオチドが水素結合等を介し、相補的に結合し、比較対照とすべきヌクレオチドには同条件では結合しない状態をいう。必ずしも、他の全てのヌクレオチドに対して特異的である必要は無く、使用目的に応じた特異性を有していればよい。例えば、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの検出においては、レジオネラ属菌以外の菌のリボゾームＲＮＡのヌクレオチドに対して結合しなければ、「特異的にハイブリダイズする」といってもよい。
ハイブリダイズの条件は、そのヌクレオチドの使用目的に応じて選択することができる。例えば、ＰＣＲ法に用いるプライマーとしてのヌクレオチドであれば、ＰＣＲ法でのアニーリング時の条件でハイブリダイズするように選択される。また、核酸プローブとして用いられる時には、そのハイブリダイゼイション条件下においてハイブリダイズするように選択される。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼイション条件でハイブリダイズするものが選択される。
また、本実施形態における「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼイション中にホルムアミド等の変性剤を含む条件、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるものや、その適宜改変したものが挙げられるが、これに限られない。また、ハイブリダイゼイション条件の温度については、用いる核酸増幅反応あるいはハイブリダイズ反応に応じて定めることができるが、例えば、４２℃、４３℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、６８℃、７０℃、７２℃である。
また、本実施形態において、「核酸増幅」法としては、標的の核酸を増幅させる方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよいが、プライマー及びプライマーセットを用いる方法として、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法あるいは他の核酸の協奏的核酸増幅方法が用いられる。特にＲＮＡを増幅する際には、逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それと同時或いはそれに引き続いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の核酸産物を増幅させるＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋｉｎｅｔｉｃ ＲＴ−ＰＣＲ法など）、ＲＴ−ＬＡＭＰ法あるいは他の核酸の協奏的ＲＮＡ増幅方法が用いられる。
更に、ＲＮＡ増幅法としては、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、上記のＬＡＭＰ法に加え、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２参照）、ＴＭＡ法（特許文献３参照）、３ＳＲ法等を用いることもできる。これらの方法の概略は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定核酸配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うというものである。
更に、他の核酸増幅法として、ＩＣＡＮ法（例えば特許第３４３３９２９号公報参照）を用いることもできる。これらの方法の概略は、標的となるＲＮＡに対して、逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それと同時或いはそれに引き続いて、ＲＮＡ−ＤＮＡからなるキメラプライマー、転写酵素により、ＲＮＡを含む２本鎖ＤＮＡを合成し、その２本鎖ＤＮＡにリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が切れ目を入れることで、標的ＲＮＡ由来の特定核酸配列を含むＤＮＡを生産する鎖置換連鎖反応を行うというものである。
また、本実施形態において、増幅産物の検出法としては、核酸を検出するための方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよい。例えば、増幅後の核酸を電気泳動して検出しても、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法を用いて検出してもよいが、多数検体処理、自動化、再現性や二次汚染等の点で有利な、以下に記す方法を用いてもよい。
簡便にＲＮＡを検出する方法として、これに限られないが、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを用いることができる（特許文献４および非特許文献４のプローブについての部分を参照のこと）。このようなプローブを用いた検出方法は、標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分がその相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、核酸増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、この方法により一定温度、一段階かつ密閉容器内で核酸増幅および検出（測定）を同時かつ迅速・簡便に実施することが可能となる。
増幅核酸の検出方法は、上記に限られず、例えば、ＬＡＭＰ法では、副産物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を指標に検出してもよく、増幅核酸を直接測定しない方法等であっても、それぞれの核酸増幅方法に適用可能な公知の増幅産物検出方法であれば、何れの方法でも用いることができる。
さらに、ＲＮＡ増幅およびその検出を簡便に行う方法として、例えば、特許文献４および非特許文献４に記載のＴＲＣ（Transcription Reverse-transcription Concerted reaction）法を用いることもできる。ＴＲＣ法は、逆転写反応と転写反応が協奏的に進むＴＲＣ反応と、インターカレーター性蛍光色素がリンカーを介してオリゴヌクレオチド鎖リン酸ジエステルのリン原子に結合した構造のＩＮＡＦ（Intercalation Activating Fluorescence probe）プローブとを組合せたＲＮＡ増幅のリアルタイム検出法である。ＴＲＣ反応では、例えば、４３℃の一定温度下で逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用して逆転写反応と転写反応のサイクルを形成し、指数関数的なＲＮＡの複写増幅が速やかに達成される。ＩＮＡＦプローブは増幅ＲＮＡと特異的に相補結合したときに蛍光増感を示すことから、ＴＲＣ反応の初期段階から共存させておけば、ＲＮＡの複写増幅をリアルタイムにモニターすることが可能となる。
これらの方法は、キットに添付された説明書や、通常用いられるプロトコールに従い、実施することができる。
また、本実施形態における「ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列」とは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するために必要なプロモーター配列のことをいい、例えば、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などの、各種核酸増幅法を行う際には、プライマーがＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有することが必要となる。このようなＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列としては、それぞれの核酸増幅法に用いるＲＮＡポリメラーゼが認識できるプロモーター配列であれば、どのようなプロモーターを用いてもよい。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の具体例としては、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、もしくはＴ３ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が用いられる。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は、好ましくは、プライマーの５’末端に付加される。
また、本実施形態において、「検出可能なシグナル生成手段で標識される」とは、生物学及び医学の分野で用いることのできる任意のシグナル生成手段で標識されていることをいう。このような検出可能なシグナル生成手段による標識としては、例えば、α−３３Ｐなどの放射性標識、蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識、有色化合物などによる色素標識、あるいはＨＲＰやＡＰなどの酵素標識が挙げられるが、好ましくは蛍光色素標識である。また、相補的二本鎖を形成することで標識の特性が変化するものがより好ましく、更に好ましくは、相補的二本鎖を形成することで蛍光特性の変化するインターカレーター性蛍光色素標識である。当業者であれば、各種標識試薬・キットの使用法又は常法に従い、これらの標識を行うことは容易に可能である。
また、本実施形態における「相同性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合は間隙を導入した上で、目的の塩基と同一である候補配列中の核酸塩基数のパーセントとして定義される。この際に、同一の塩基（チミンとウラシルも同一とみなす）を有するＤＮＡとＲＮＡとは結合特性が非常に近いため、同一の核酸塩基として定義される。相同性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の提供するｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ又はＡＬＩＧＮのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能であるが、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑにおいて標準的な初期パラメーターを用いて計算された値を用いることもできる。
なお、核酸増幅のためのプライマーやその他のプローブなどにおいては、ある塩基配列の代わりに、その塩基配列と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上あるいは９８％以上（１００％以下）の相同性を有する塩基配列、あるいは、その塩基配列に対し、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、又は数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いることもできる（相同性の定義の際と同様に、同一の塩基を有するＲＮＡとＤＮＡの置換は、ここでの置換・欠失・挿入には含まれない）。
また、本実施形態における「十分に相補的な配列」とは、核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度等の試薬組成および温度）において、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡおよびそれと完全に相同な核酸に対して、高効率にハイブリダイゼイション可能な配列をさす。また、本実施形態における「十分に相同な配列」とは、核酸増幅反応条件において、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡと完全に相補的な核酸に対して、高効率にハイブリダイゼイション可能な配列をさす。すなわち、本実施形態における「十分に相補的な配列」あるいは「十分に相同な配列」とは、核酸増幅反応においてハイブリダイゼイションの効率に影響を及ぼさない範囲内で、それぞれ完全に相補的あるいは完全に相同な配列である必要はない。
〔実施形態〕
以下、本発明の実施形態について、説明する。
本発明のある実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、配列番号：１（actgatacag gtgctgca）又は７（ctacctggcc taatactgac act）で示される塩基配列の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーと、配列番号：４７（tataaccaac agctagttga catcgtttac agcgtgg）又は４９（cactgaaagt gctttacaac cct）で示される塩基配列の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むセンスプライマーを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセットである。
また、本発明のある実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、配列番号：４５（tgcagcacct gtatcagt）又は４８（agtgtcagta ttaggccagg tag）で示される塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーと、配列番号：２（ccacgctgta aacgatgtca actagctgtt ggttata）又は８（agggttgtaa agcactttca gtg）で示される塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むセンスプライマーを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセットである。
上述の実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーが配列番号：１に対して十分に相補的な配列で少なくとも１５ヌクレオチドからなり、かつセンスプライマーが配列番号：２に対して十分に相同な配列で少なくとも１５ヌクレオチドからなるプライマーから構成されてなることを特徴とするプライマーセットであってもよい。
また、上述の実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーが配列番号：７に対して十分に相補的な配列で少なくとも１５ヌクレオチドからなり、かつセンスプライマーが配列番号：８に対して十分に相同な配列で少なくとも１５ヌクレオチドからなるプライマーから構成されてなることを特徴とするプライマーセットであってもよい。
すなわち、上述のプライマーセットに含まれるプライマーは、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ配列の一部に相同的あるいは相補的な塩基配列を持つ、つまり、配列番号：１および４７、あるいは、配列番号：７および４９をプライマー結合部位とするものであり、好ましくは、例えば、配列番号：１、４７、７、４９で示される塩基配列の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするもの、あるいは、配列番号：４５、２、４８、８で示される塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有するものである。
上述のプライマーセットを用いて核酸増幅をすることにより、レジオネラ菌属の迅速、高感度、特異的な検出が可能となった。さらに、生菌に対する特異性も従来法より向上した。したがって、本発明によって治療後の患者、洗浄後の環境水などでの偽陽性も軽減可能である。
また、このプライマーセットを用い、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的とした核酸増幅を行うことにより、培養法では５〜７日間かかるレジオネラ属菌検査が、数十分〜数時間と遥かに短縮される。
また、従来、レジオネラ属菌の検出に一般的に用いられてきた、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ特異的抗体による免疫学的手法では、検出できるのはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに限られ、他の菌種に対する感度が不十分であったのに対し、このプライマーセットを用いた方法では、広い範囲でのレジオネラ属菌の検出が可能である。
また、従来、分子生物学的手法として用いられてきた、レジオネラＤＮＡを標的とした検出では、標的であるＤＮＡが死菌の中でも比較的安定に存在していることから治療後の患者、洗浄後の環境水などで偽陽性となる可能性があった。それに対し、本発明では、死菌中で分解されやすいＲＮＡを標的にすることで、生菌を特異的に検査することが可能となった（非特許文献５）。特に、１６ＳリボゾームＲＮＡは、１６ＳリボゾームＤＮＡに比べ１菌中に含まれる量が１０００倍〜１００００倍であり、更に高感度な検出を行うことができる。
また、１６ＳリボゾームＲＮＡ（ＤＮＡ）を標的とした場合でも、現実的にはこのＲＮＡ（ＤＮＡ）もレジオネラ属菌種間での多様性に富み、また非レジオネラ属菌と高い相同性を示す配列が少なくない。しかし、本発明のプライマーセットのうち、さらに好適なものは、約５０種のレジオネラ属菌の１６ＳリボゾームＲＮＡを高効率かつ一様に増幅し、かつ非レジオネラ属菌の１６ＳリボゾームＲＮＡは増幅しないという特異性を有する。
ここで、上述のプライマーと配列番号：４５、２、４８、８で示される塩基配列との間の相同性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上あるいは９８％以上（１００％以下）であることが好ましい。あるいは、上記塩基配列に対し、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、又は数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を含むプライマーを用いてもよい（相同性の定義の際と同様に、同一の塩基を有するＲＮＡとＤＮＡの置換は、ここでの置換・欠失・挿入には含まれない）。また、上記の塩基配列内の連続する配列（あるいはその置換体）であると、更に好ましい。
それぞれのプライマーは、その目的に応じて、更に様々なものを付加して含んでもよいが、プライマーとしての有効性を考えると、その長さは少なくとも１５塩基以上、あるいは１８塩基以上、あるいは２０塩基以上である。長さの上限は、特に制限されるものではないが、プライマーが長すぎることによる核酸増幅反応の効率低下や各増幅反応に必要なプライマー長を考慮し、上限を、１００塩基以下、８０塩基以下、６０塩基以下、あるいは５０塩基以下としてもよい。
また、ＲＮＡを標的として核酸増幅する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法などが挙げられるが、その何れにおいても、本発明のプライマーセットを用いることができる。
また、本発明の更なる実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、配列番号：３（tgyagyayyt gtatyagt）又は９（agtgtyagta ttaggyyagg tag）で示される塩基配列内の、少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーと、前述のセンスプライマーを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセットである。配列番号：３又は９で示される塩基配列は、それぞれ配列番号：４５又は４８の配列内の、一部のシトシンがチミンに置換された塩基配列を示す。
上述の実施形態は、配列番号：１に対して十分に相補的な配列で少なくとも１５ヌクレオチドからなる上記のアンチセンスプライマーが、シトシンがチミンに置換された塩基を含む配列番号：３に記載の配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなることを特徴とするプライマーセットであってもよい。
また、上述の実施形態は、配列番号：７に対して十分に相補的な配列少なくとも１５ヌクレオチドからなる上記のアンチセンスプライマーが、シトシンがチミンに置換された塩基を含む配列番号：９に記載の配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなることを特徴とするプライマーセットであってもよい。
また、本発明の更なる実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、上述のセンスプライマーと、配列番号：５０（yyaygytgta aaygatgtya aytagytgtt ggttata）又は１０（agggttgtaa agyaytttya gtg）で示される塩基配列内の、少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むセンスプライマーとを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセットである。配列番号：５０又は１０で示される塩基配列は、それぞれ配列番号：２又は８の配列内の、一部のシトシンがチミンに置換された塩基配列を示す。
上述の実施形態は、配列番号：２に対して十分に相同な配列で少なくとも１５ヌクレオチドからなる上記センスプライマーが、シトシンがチミンに置換された塩基を含む配列番号：５０に記載の配列からなることを特徴とするプライマーセットであってもよい。
また、上述の実施形態は、配列番号：８に対して十分に相同な配列で少なくとも１５ヌクレオチドからなる上記センスプライマーが、シトシンがチミンに置換された塩基を含む配列番号：１０に記載の配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなることを特徴とするプライマーセットであってもよい。
核酸増幅において高い特異性を発揮するためには、標的ＲＮＡとプライマーに一つでもミスマッチがある場合に、そうでないものと比較して著しく効率が低下する系であることが有効である。すなわち、本発明では、レジオネラ属菌に対する特異性を向上させるための好ましい態様として、プライマー中の少なくとも一部のシトシンをチミンに置換した配列を使用することができる。
標的ＲＮＡ中のグアニン（Ｇ）とプライマー中のチミン（ｄＴ）は比較的安定な塩基対を形成することが報告されている（非特許文献６）。したがって、もともと標的ＲＮＡとミスマッチがないプライマーの場合（特異的アニールの場合）は、配列中の適当数のシトシンをチミンに置換してもハイブリダイゼイション効率は顕著に低下しないが、標的ＲＮＡと一つでもミスマッチがある場合（非特異的アニールの場合）はそれらのミスマッチ塩基の他の配列中にシトシンからチミンへの置換を導入することでハイブリダイゼイション効率は顕著に低下すると考えられる。
したがって、例えば上述のプライマーセットのように、プライマー配列中のシトシンをチミンに置換したプライマーセットを用いることで、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡに対するハイブリダイゼイション効率を維持しつつ、非レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡに対するハイブリダイゼイション効率を顕著に低下させることが可能となる。
また、本発明の更なる実施形態は、アンチセンスプライマーが配列番号：４（tagcatctgt atcagt）で示される塩基配列のヌクレオチドを含む、前述のプライマーセットである。配列番号：４で示される塩基配列は、配列番号：３で示される塩基配列の中の、特に有効な配列の一つである。
上述の実施形態は、配列番号：３に記載の配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなる上記アンチセンスプライマーが配列番号：４に記載の配列からなることを特徴とするプライマーセットであってもよい。
これらの、特定の配列をプライマー配列として有するプライマーセットを用いることで、より確実かつ特異的な核酸増幅、そしてレジオネラ属菌の検出を行うことができる。
また、本発明のある実施形態は、アンチセンスプライマーおよびセンスプライマーの少なくとも一方が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、ステム・ループ構造を構成する配列、又は制限酵素部位などの特定の機能を担う配列を付加してなることを特徴とする、前述のプライマーセットである。
プライマーがプロモーター配列を含むことで、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などの核酸増幅法を用いることが可能となる。
従来の通常のＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。これに対し、上記の核酸増幅法は、増幅反応は等温で連続的に進行し、増幅効率も高く、特別な機器も必要なく、鋳型がＲＮＡであってもＤＮＡと同様にワンステップで増幅可能である、などの利点を有し、診断などに使用する上において、極めて有効である。
センスプライマーにプロモーター配列が付加される場合、標的ＲＮＡは、特定核酸配列の５’末端で切断される必要がある。特定核酸配列とは、標的ＲＮＡ上におけるセンスプライマーとの相同領域の５’末端から、アンチセンスプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列をいう。このように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定核酸配列内の５’末端部分に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドＤＮＡ（切断用オリゴヌクレオチド）を添加し、結果として形成されたＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性により切断する方法が好ましい。この切断用オリゴヌクレオチドは、その３’末端側からの伸長反応をおさえるために、３’末端水酸基が化学的に修飾されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが望ましい。
本発明のプライマーセットを用いる核酸増幅は、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡを鋳型として、上述のアンチセンスプライマーによりｃＤＮＡを合成し、それと同時か或いはそれに引き続いて、上述のプライマーセットと適当なＤＮＡポリメラーゼ活性および／あるいはＲＮＡポリメラーゼ活性により連鎖的に実行される核酸増幅法によってなされる。
以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は公知の核酸検出方法で検出することが可能であり、さらには、検出可能なシグナル生成手段で標識された核酸プローブにより特異的に検出することも可能である。
また、ステム・ループ構造あるいは制限酵素部位などの、様々な特定の機能を担う配列をこれらのプライマーに付加させる・含ませることも可能である。これらの特定の機能を担う配列については、遺伝子工学の分野で用いられる任意の機能配列、特に、核酸の加工・増幅・検出に用いられる、特定の機能を担う様々な配列を用いることができ、それらは当該分野で通常用いられる方法に従い設計することができる。
また、本発明のある実施形態は、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡを鋳型として、前述のプライマーセットにより核酸増幅を行い、増幅産物を得る工程と、その工程と同時か或いはそれに引き続いて、前記増幅産物を、検出可能なシグナル生成手段で標識された、配列番号：６（cactgtatgt caagggtagg t）又は１１（acctacgcac cctttacg）で示される塩基配列あるいはその塩基配列の相補配列の何れか一方と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基のヌクレオチドを含む核酸プローブで検出する工程と、を含むレジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡの検出方法である。
この検出方法によれば、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的プライマーセットを用いた核酸増幅法と、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的標識核酸プローブによる検出とを組み合わせて行うことにより、分離分析を必要とせず、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの増幅および検出を、一定温度、一段階および密閉容器内で同時かつ迅速・簡便に実施することが可能となる。
また、上記の検出方法は、核酸増幅を行い、増幅産物を得る工程が（１）レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの特定塩基配列の５’末端から下流の少なくとも一部に相同な第一のプライマー、およびその特定塩基配列の３’末端から上流の少なくとも一部に相補的な第二のプライマー（第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）により、プロモーター配列とそのプロモーター配列下流に前述の特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、（２）その２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）そのＲＮＡ転写産物が引き続きＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にそのＲＮＡ転写産物が増幅する工程、からなることを特徴とするレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの検出方法であってもよい。
また、本発明のある実施形態は、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡの検出キットであって、レジオネラ属菌のリボゾームＲＮＡを鋳型として核酸増幅を行い、増幅産物を得るための、前述のプライマーセットと、その増幅産物を検出するための、検出可能なシグナル生成手段で標識された、配列番号：６又は１１で示される塩基配列あるいは該塩基配列の相補配列の何れか一方と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基のヌクレオチドを含む核酸プローブとを含む検出キットである。
この検出キットを用いると、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的プライマーセットを用いた核酸増幅法と、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ特異的標識核酸プローブによる検出とを組み合わせて行うことが可能となり、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの増幅および検出を、一定温度、一段階および密閉容器内で同時かつ迅速・簡便に実施することが可能となる。
また、上記の検出キットは、前述の検出方法を実施するための検出キットであって、少なくともＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、をさらに含むことを特徴とする検出キットであってもよい。
本実施形態において用いられる、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチド配列は、核酸増幅産物中の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るものであればよいが、配列番号：６又は１１で示される塩基配列あるいはその塩基配列の相補配列の何れか一方と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基のヌクレオチドであることが好ましい。更に好ましくは、相同性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上あるいは９８％以上（１００％以下）である。あるいは、上記塩基配列に対し、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、又は数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を含むヌクレオチドであってもよい。更に好ましくは、連続した配列である。また、そのオリゴヌクレオチドの３’末端からの伸長反応を抑えるために、３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグリコール酸付加）されていることが好ましい。
また、核酸増幅する方法としてＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などを用いる場合、従来用いられてきた、ＲＴ−ＰＣＲ法に比べ、更なる利点を有する。ＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要で、このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることになっていた。また、これらの工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減の点でも問題があった。
また、ＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を経時的に測定するＫｉｎｅｔｉｃ ＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されているが、該方法ではＰＣＲ工程および測定工程を少なくとも２０分で実施可能であるもののプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題があった。さらに、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。また、ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＤＮＡも増幅してしまうため、前述のようにＲＮＡを対象とする場合は、ＤＮａｓｅ処理等により試料中のＤＮＡを完全に除去する必要があり、このことが操作のいっそうの煩雑化をまねいていた。
これらの問題点に対し、例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＩＣＡＮ法などを用いる場合、一段階のより簡便な工程で、かつ短時間で測定を行うことができ、多数検体処理や検査コストの低減の点でも有利である。
更に、好ましい実施形態として、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献４）があげられる。ＴＲＣ法を用いることにより、増幅から検出までもが、一定温度、一段階かつ密閉容器内で迅速・簡便に実施することが可能となる。
また、本発明のある実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的とし、配列番号：４に記載の配列からなるアンチセンスプライマーとＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成を行う工程、生成されたＲＮＡ・ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨ活性によりＲＮＡ部分を分解・解離させ、そのｃＤＮＡを鋳型として配列番号：５に記載の配列からなるセンスプライマーとＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによって２本鎖ＤＮＡを生成する工程、ここで使用したアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーからなるプライマーセットの一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有し、生成された２本鎖ＤＮＡはその５’末端に機能的プロモーターを有する、その２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生産する工程、そのＲＮＡ転写産物がそのｃＤＮＡ合成の鋳型となり各工程が連鎖的に繰り返される核酸増幅工程において、その核酸増幅がインターカレーター性蛍光色素で標識された配列番号：６に記載の配列かあるいはその相補配列からなる核酸プローブ存在下で実施され、反応液の蛍光強度変化を測定することによってレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを検出する方法である。
また、本発明のある実施形態は、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的とし、配列番号：３１（catcgtttac agcgtgg）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドＤＮＡとＲＮａｓｅＨ活性によりレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡ上の特定核酸配列の５’末端でリボゾームＲＮＡを切断する工程、配列番号：４に記載の配列からなるアンチセンスプライマーとＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成を行う工程、生成されたＲＮＡ・ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨ活性によりＲＮＡ部分を分解・解離させ、そのｃＤＮＡを鋳型として、その５’末端にプロモーター配列が付加された配列番号：５に記載の配列からなるセンスプライマーとＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによって２本鎖ＤＮＡを生成する工程、その２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生産する工程、そのＲＮＡ転写産物がそのｃＤＮＡ合成の鋳型となり各工程が連鎖的に繰り返される核酸増幅工程において、その核酸増幅がインターカレーター性蛍光色素で標識された配列番号：６に記載の配列からなる核酸プローブ存在下で実施され、反応液の蛍光強度変化を測定することによってレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを検出する方法である。
以上の実施形態の全てにおいて、ＲＮａｓｅＨ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（転写酵素）活性を担う酵素は特に限定されないが、これら全ての活性を保持する逆転写酵素を使用することが好ましい。逆転写酵素は分子生物学実験等に使用可能な公知の任意の逆転写酵素を用いることができるが、特に、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素等、およびそれらの誘導体が好適に使用される。
また、ＲＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、バクテリオファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ等、およびその誘導体が好適に使用される。
また、ＬＡＭＰ法などにこのプライマーセットを用いる場合、リボゾームＲＮＡ上で、この配列の外を標的とするプライマーを更に含む、４対のプライマーからなるプライマーセットとすることもできる。このように、それぞれの核酸増幅法の必要性に応じて、更に付加的なプライマーを有してもよく、そのような付加的なプライマーの数や配列等は、それぞれの核酸増幅法に応じて、常法に従い容易に設計することができる。
なお、上記の実施形態により説明されるプライマーセットおよび検出方法は、本願発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本願発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
種々の設計的変更としては、例えば、本実施例に基づき、センスプライマーに好適な塩基配列として、上述の実施形態の配列番号：２の代わりに、配列番号：１２（ccacgctgta aacgatgtca a）、１３（aaacgatgtc aattagctgt t）、１４（aaacgatgtc aactagctgt t）、１５（taaacgatgt caattagctg ttg）、１６（tgtaaacgat gtcaattagc tgttg）、１７（gctgtaaacg atgtcaatta gctgttg）、１８（gtcaactagc tgttggttat a）、５１（caactagctg ttggttatat ga）、５２（aaacgatgtc aactagctgt tggttatatg a）、５３（aaacgatgtc aactagctgt tggtta）、５４（aaacgatgtc aactagctgt tggttata）の何れかを用いてもよく、アンチセンスプライマーに好適な塩基配列として、上述の実施形態の配列番号：４５の代わりに、１９（cagcacctgt atcagt）、２０（tagtatttgt attagt）、２１（tagtatttgt atcagt）、２２（tagtatctgt attagt）、２３（tagtacctgt attagt）、２４（tagcacttgt attagt）、２５（cagtacttgt attagt）、２６（tagtatctgt atcagt）、２７（tagtacctgt atcagt）、２８（tagcacttgt atcagt）、２９（cagtacttgt atcagt）の何れかから、適するものを用いてもよい。この場合、インターカレーター性蛍光色素標識蛍光プローブのための塩基配列として、配列番号：６の代わりに、配列番号：４４（ctgtatgtca agggta）を用いてもよい。また、切断用オリゴヌクレオチドのための塩基配列として、配列番号：３０（cgtggactac cagggtat）、３１（catcgtttac agcgtgg）、３２（gtttacagcg tggacta）、３３（ttacagcgtg gactacc）、３４（tacagcgtgg actacca）、３５（ttgacatcgt ttacagc）、５５（agctagttga catcgtttac ag）の何れかから適するものを用いてもよい。
あるいは、センスプライマーに好適な塩基配列として、上述の実施形態の配列番号：８の代わりに、配列番号：３６（gttgtaaagc actttcagtg）又は３７（gttgtaaagc attttcagtg）を用いてもよく、アンチセンスプライマーに好適な塩基配列として、上述の実施形態の配列番号：４８の代わりに、配列番号：３８（gtattaggcc aggtag）、３９（agtattaggc caggta）、４０（agtattaggt taggta）、４１（gtcagtatta ggccaggta）、４２（agtgtcagta ttaggccagg ta）の何れかから、適するものを用いてもよい。また、切断用オリゴヌクレオチドのための塩基配列として、４３（acaaccctca ggcctt）を用いてもよい。
これらの変形例も、本願発明の技術的範囲に含まれる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。
〔実施例１〕
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡは、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ・プロモータ下流にＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボソームＤＮＡ（塩基番号１〜１３９７を含む、塩基番号はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１２２８８５に従った）を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型としてインビトロ転写を実施し、引き続いてＤＮａｓｅＩ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後ＲＮＡを精製して調製した。このＲＮＡについて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。以下の実施例では、本発明の測定対象であるレジオネラ属菌１６ＳリボゾームＲＮＡの標準試料として、このＲＮＡを用いた。
〔実施例２〕
以下の手順で、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。はじめに、Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７）により、配列番号：６に記載の配列の５’末端から３番目のＣと４番目のＴの間、配列番号：１１に記載の配列の５’末端から８番目のＣと９番目のＡの間、配列番号：４４に記載の配列の５’末端から９番目のＣと１０番目のＡの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
〔実施例３〕
本願発明の方法において、種々の組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、レジオネラ属菌１６ＳリボゾームＲＮＡの測定を行った。
（１）実施例１で調製したＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡ（塩基番号１〜１３９７を含む）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて１０６、１０３、１０２あるいは５０コピー／５μｌとなるよう希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ；
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号は表１に記載）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号は表１に記載）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号は表１に記載）：実施例２において調製されたものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号は表１に記載）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）前述の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１に示した。
表１に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合、１０６、１０３、１０２あるいは５０コピー／テストのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが３０分以内に検出された。
すなわち、第一のプライマーとして配列番号：５および１２〜１８より選ばれた配列と、第二のプライマーとして配列番号：４および１９〜２９および４５より選ばれた配列と、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとして配列番号：６および４４より選ばれた配列と、切断用オリゴヌクレオチドとして配列番号：３０〜３５より選ばれた配列とからなる組み合わせ、あるいは、第一のプライマーとして配列番号：８および３６および３７より選ばれた配列と、第二のプライマーとして配列番号：３８〜４２より選ばれた配列と、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとして配列番号：１１に示された配列と、切断用オリゴヌクレオチドとして配列番号：４３に示された配列とからなる組み合わせを用いた場合、いずれもＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが迅速に検出可能であった。
ここで、配列番号：５および１２〜１８のそれぞれは配列番号：５０の部分配列、配列番号：４、１９〜２９および４５のそれぞれは配列番号：３の部分配列、配列番号：３６および３７のそれぞれは配列番号：１０の部分配列、配列番号：３８〜４２のそれぞれは配列番号：９の部分配列である。
よって、配列番号：３の少なくとも１５ヌクレオチドを有する第二のプライマーおよび配列番号：５０の少なくとも１５ヌクレオチドを有する第一のプライマーからなるプライマーセット、および配列番号：９の少なくとも１５ヌクレオチドを有する第二のプライマーおよび配列番号：１０の少なくとも１５ヌクレオチドを有する第一のプライマーからなるプライマーセットによりレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを迅速・高感度に検出できることが示された。
以上から、本発明の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブを用いたＲＮＡ増幅・測定法により、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが迅速に検出可能であることが示された。
Figure 2009044773
Figure 2009044773
Figure 2009044773
Figure 2009044773
また、表１以外についても、上表の組み合わせのオリゴヌクレオチドを用い、５０、１０２、１０３、１０６コピー／テストのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡをサンプルとしてＲＮＡ増幅・蛍光測定を実施した。蛍光強度比１．２を超えたものを（＋）と判定し、そのときの時間を検出時間とした。
〔実施例４〕
〔実検体（レジオネラ属菌）〕
（１）表５に示したレジオネラ属７菌種７株をＢＣＹＥα寒天培地で培養した。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、約１００ｃｆｕ／５０μｌになるように希釈し、ＲＮＡを抽出した。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに前記抽出ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ；
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号：５）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号は表５に記載）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号：６）：実施例２において調製したものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号：３１）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、３０分以内に反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、結果を表５に示した。
表５のプライマーセットでレジオネラ属7菌種７株はすべて検出が可能であった。
Figure 2009044773
〔実施例５〕
〔特異性評価（ＣＴ置換の有効性）〕
（１）表６に示した非レジオネラ属９菌種９株（Bacillus cereus, Haemophilus influenzae, Stphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus agalactiaeおよびShigella boydii）を寒天培地で培養した。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、約１０８〜１０９ｃｆｕ／５０μｌになるように希釈し、ＲＮＡを抽出した。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに前記抽出ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ；
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号：５）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号は表６に記載）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号：６）：実施例２において調製されたものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号：３１）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が３０分以内に１．２を超えた場合を（＋）判定とした結果を表６に示した。
Figure 2009044773
上表のプライマーセットにおいてシトシンをチミンに置換することで非レジオネラ属菌の検出を抑制することができた。また、第一プライマーとして配列番号：５のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号：４のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることで、レジオネラ属菌に対しての感度を保ちつつ、非レジオネラ属菌に対する特異性を上げることが可能となった。
〔実施例６〕
〔生菌特異性（塩素添加の実験）〕
（１）Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａをＢＣＹＥα寒天培地で培養した。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、約１０５ｃｆｕ／５０μｌになるように希釈した。そこに残存塩素濃度が２ｍｇ／ｌになるように次亜塩素酸を添加し、添加開始からの経過時間における生菌数および１６ＳリボゾームＲＮＡの検出を行った。生菌数はＢＣＹＥα寒天培地で培養し確認した。また、１６ＳリボゾームＲＮＡの検出のため、ＲＮＡを抽出した。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記抽出ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号：５）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号：４）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号：６）：実施例２において調製されたものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号：３１）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とした結果を表７に示した。
（５）比較として１６ＳリボゾームＤＮＡの検出をＤＮＡ増幅キット（栄研化学社製）を用いて行った。その結果を表７に示した。次亜塩素酸によって殺菌したときの生菌・死菌に対する特異性を１６ＳリボゾームＲＮＡと１６ＳリボゾームＤＮＡの検出で比較した。
１６ＳリボゾームＲＮＡは菌が死滅すると検出できなくなったが、１６ＳリボゾームＤＮＡは菌が死滅してから４３時間後でも陽性と判定された。以上の結果より１６ＳリボゾームＲＮＡを標的とすることで１６ＳリボゾームＤＮＡを標的した場合と比較して生菌の特異的な検出が可能であった。
Figure 2009044773
〔実施例７〕
本願発明の方法において、種々の組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、レジオネラ属菌１６ＳリボゾームＲＮＡの測定を行った。
（１）実施例１で調製したＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡ（塩基番号１〜１３９７を含む）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて１０３コピー／５μｌとなるよう希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ；
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号は表８に記載）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号は表８に記載）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号は表８に記載）：実施例２において調製されたものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号は表８に記載）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）前述の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表８に示した。
表８に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合、１０2コピー／テストのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが３０分以内に検出された。
すなわち、第一のプライマーとして配列番号：５１〜５４より選ばれた配列と、第二のプライマーとして配列番号：４および４５より選ばれた配列と、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとして配列番号：６と、切断用オリゴヌクレオチドとして配列番号：３１および５５より選ばれた配列とからなる組み合わせを用いた場合、いずれもＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが迅速に検出可能であった。
ここで、配列番号：５１〜５４のそれぞれは配列番号：２の部分配列、配列番号：４および４５のそれぞれは配列番号：３の部分配列である。
よって、配列番号：３の少なくとも１５ヌクレオチドを有する第二のプライマーおよび配列番号：２の少なくとも１５ヌクレオチドを有する第一のプライマーからなるプライマーセットによりレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを迅速・高感度に検出できることが示された。
以上から、本発明の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブを用いたＲＮＡ増幅・測定法により、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが迅速に検出可能であることが示された。
Figure 2009044773
〔実施例８〕
〔検出感度〕
本願発明の方法において、表９に示す組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、レジオネラ属菌１６ＳリボゾームＲＮＡの検出感度を測定した。
（１）実施例１で調製したＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡ（塩基番号１〜１３９７を含む）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて１０３、１０２、５０、あるいは３０コピー／５μｌとなるよう希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ；
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号は表９に記載）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号は表９に記載）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号は表９に記載）：実施例２において調製されたものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号は表９に記載）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）前述の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が２０分以内に１．２を超えた場合を（＋）判定とした結果を表９に示した。
表９に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合、１０３コピー／テストのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが２０分以内に検出された。
さらに、第一のプライマーとして配列番号：５１に示された配列と、第二のプライマーとして配列番号：４５に示された配列と、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとして配列番号：６に示された配列と、切断用オリゴヌクレオチドとして配列番号：５５に示された配列からなる組み合わせでは３０コピー／テストのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが２０分以内に検出された。
以上から、本発明の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブを用いたＲＮＡ増幅・測定法により、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １６ＳリボゾームＲＮＡが低コピー数の場合においても迅速に検出可能であることが示された。
Figure 2009044773
〔実施例９〕
〔実検体（レジオネラ属菌）〕
（１）表１０に示したレジオネラ属７菌種７株をＢＣＹＥα寒天培地で培養した。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、約１００ｃｆｕ／５０μｌになるように希釈し、ＲＮＡを抽出した。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに前記抽出ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ；
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号：５１）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号：４５）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号：６）：実施例２において調製したものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号：５５）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、３０分以内に反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、結果を表１０に示した。
表１０のプライマーセットでレジオネラ属７菌種７株はすべて検出が可能であった。
Figure 2009044773
〔実施例１０〕
〔特異性評価〕
（１）表１１に示した非レジオネラ属９菌種９株（Bacillus cereus、Haemophilus influenzae、Stphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniae、Enterococcus faecalis、Pseudomonas aeruginosa、Streptococcus pyrogenes、Streptococcus agalactiaeおよびShigella boydii）を寒天培地で培養した。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、約１０７ｃｆｕ／５０μｌになるように希釈し、ＲＮＡを抽出した。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに前記抽出ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）；
１８ｍＭ 塩化マグネシウム；
１００ｍＭ 塩化カリウム；
１ｍＭ ＤＴＴ；
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．６ｍＭ ＩＴＰ；
１μＭ 第一のプライマー（配列番号：５１）：配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモータ配列（配列番号：４６）が付加されたものである；
１μＭ 第二のプライマー（配列番号：４５）；
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号：６）：実施例２において調製したものである；
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号：５５）：３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾されている；
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）；
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
〔酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度〕
２％ ソルビトール；
６.４Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）；
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）；
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が３０分以内に１．２を超えた場合を（＋）判定とした結果を表１１に示した。
Figure 2009044773
上表のプライマーセットにおいて、第一プライマーとして配列番号：５１のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号：４５のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることで、レジオネラ属菌に対しての感度を保ちつつ、非レジオネラ属菌に対する特異性を上げることが可能となった。
上記実施例１〜１０の実験から、本願発明のプライマー及びプライマーセット等を用いることで、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを、生菌に対する高い検出特異性をもって、迅速、高感度で検出できることが確認された。
本発明はレジオネラ属菌の検査を必要とする医学、薬学、微生物学、および、浴場の水質管理、プールの水質管理、環境水の水質管理、建物等の冷却水の水質管理等をはじめとする公衆衛生の分野において有用である。

Claims (11)

  1. レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、配列番号：１又は７で示される塩基配列の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーと、配列番号：４７又は４９で示される塩基配列の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むセンスプライマーを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセット。
  2. レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを標的として、核酸増幅するためのプライマーセットであって、配列番号：４５又は４８で示される塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーと、配列番号：２又は８で示される塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含むセンスプライマーを含んでなる、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを増幅可能なプライマーセット。
  3. 前記アンチセンスプライマーが、配列番号：３又は９で示される塩基配列内の、少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
  4. 前記アンチセンスプライマーが配列番号：４で示される塩基配列のヌクレオチドを含む、請求項３に記載のプライマーセット。
  5. 前記センスプライマーが、配列番号：５０又は１０で示される塩基配列内の、少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
  6. 前記センスプライマーが、配列番号：５で示される塩基配列内の、少なくとも１５塩基以上のヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
  7. 前記アンチセンスプライマーおよび前記センスプライマーの少なくとも一方が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、ステム・ループ構造を構成する配列、又は制限酵素部位などの特定の機能を担う配列を付加してなることを特徴とする、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
  8. レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを鋳型として、
    請求項１又は２に記載のプライマーセットにより、核酸増幅を行い、増幅産物を得る工程と、
    前記工程と同時か或いはそれに引き続いて、前記増幅産物を、検出可能なシグナル生成手段で標識された、配列番号：６又は１１で示される塩基配列あるいは該塩基配列の相補配列の何れか一方と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基のヌクレオチドを含む核酸プローブで検出する工程と、
    を含むレジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの検出方法。
  9. レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの検出キットであって、
    レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡを鋳型として核酸増幅を行い、増幅産物を得るための、請求項１又は２に記載のプライマーセットと、
    前記増幅産物を検出するための、検出可能なシグナル生成手段で標識された、配列番号：６又は１１で示される塩基配列あるいは該塩基配列の相補配列の何れか一方と８０％以上の相同性を有する少なくとも１５塩基のヌクレオチドを含む核酸プローブと、
    を含む検出キット。
  10. 核酸増幅を行い、増幅産物を得る工程が
    （１）レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの特定塩基配列の５’末端から下流の少なくとも一部に相同な第一のプライマー、および前記特定塩基配列の３’末端から上流の少なくとも一部に相補的な第二のプライマー（前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）により、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
    （２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成する工程、
    （３）該ＲＮＡ転写産物が引き続きＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物が増幅する工程、
    からなることを特徴とする請求項８に記載の、レジオネラ属菌リボゾームＲＮＡの検出方法。
  11. 請求項１０の検出方法を実施するための検出キットであって、
    少なくともＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、
    をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の検出キット。
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