JPWO2005063782A1 - アスパラギン結合型糖タンパク質コア糖鎖構造の合成 - Google Patents
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Abstract
アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖部分を化学的に合成する。非常に安価なマンノースβ−１，４−結合を有する天然多糖を出発原料として利用し、マンノースのβ1→４グリコシド結合を形成させる。
Description
本発明は糖鎖化学合成の分野に属し、詳細には糖タンパク質糖鎖を簡便に化学合成するための方法およびそのための中間体に関する。
糖タンパク質は、糖鎖と呼ばれるオリゴ糖部分を有するタンパク質である。
近年、糖タンパク質が生体内で細胞接着や情報伝達などの生命現象に深く関わっていることが明らかにされつつあり、様々な生命現象を引き起こす糖鎖の構造が徐々にわかってきている。しかし、生体内で糖鎖が機能する上で発現する量は微量であり、糖鎖の化学的、物理的性質を解明するほどの量を純粋に得ることは非常に難しい。
糖タンパク質のひとつであるアスパラギン結合型糖タンパク質は人の血清中や卵白アルブミンなどに幅広く存在する。このアスパラギン結合型糖鎖は、糖鎖構造の分岐および構成糖の特徴から高マンノース型、複合型および混合型に分類される。これらの型はすべて、マンノース３分子、Ｎ−アセチルグルコサミン２分子からなる共通する５糖のコア糖鎖構造を糖鎖の還元末端側にもっている：
そのため、上記式で示されるコア糖鎖構造を化学的に合成することがアスパラギン結合型糖鎖の機能を調べる上で研究の基礎となる。
近年、糖タンパク質が生体内で細胞接着や情報伝達などの生命現象に深く関わっていることが明らかにされつつあり、様々な生命現象を引き起こす糖鎖の構造が徐々にわかってきている。しかし、生体内で糖鎖が機能する上で発現する量は微量であり、糖鎖の化学的、物理的性質を解明するほどの量を純粋に得ることは非常に難しい。
糖タンパク質のひとつであるアスパラギン結合型糖タンパク質は人の血清中や卵白アルブミンなどに幅広く存在する。このアスパラギン結合型糖鎖は、糖鎖構造の分岐および構成糖の特徴から高マンノース型、複合型および混合型に分類される。これらの型はすべて、マンノース３分子、Ｎ−アセチルグルコサミン２分子からなる共通する５糖のコア糖鎖構造を糖鎖の還元末端側にもっている：
しかし、このアスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造を化学的に合成するための効率的な手法は未だ存在していない。その理由としては、コア糖鎖構造には化学的に合成する上で非常に困難な部分を含んでいることが挙げられる。
コア糖鎖構造の化学的合成において、マンノースβグリコシド結合構造、すなわちβ-マンノグリコシド結合（Manβ1→４GlcNAc）を化学的に形成させることは非常に困難である。マンノースの2位の水酸基がアキシアル型に結合しているため、隣接基効果を利用できないこと、またβ-マンノグリコシド結合は、糖特有のアノマー効果に対して電気的に不安定な構造をとることなどが、その理由である。非特許文献１にはβ-マンノグリコシド結合構造の化学的合成法が記載されているが、それは非常に複雑な工程を含み、時間およびコストを必要とする。
さらに、β-マンノグリコシド結合（Manβ1→４GlcNAc）の形成が困難である理由としては、グリコシル化反応時にアクセプターとなるN-アセチルグルコサミンの反応溶媒への溶解性が低いこと、また4位の水酸基の反応性が他の水酸基に比べて低いことが挙げられる(水酸基の反応性：1位≫6位≫2位＞3位＞4位)。
また、アスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造を化学的に合成する際には、GlcNAcβ1→４GlcNAc構造の合成についても問題がある。
このようにアスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造を化学的に合成するには、特に還元末端の3糖(Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc)の合成が、大きな問題として残っている。より効率的に、このコア糖鎖構造を合成するためには、特にβ-マンノグリコシド結合を効率的に合成するという問題を解決しなければならない。
コア糖鎖構造の化学的合成において、マンノースβグリコシド結合構造、すなわちβ-マンノグリコシド結合（Manβ1→４GlcNAc）を化学的に形成させることは非常に困難である。マンノースの2位の水酸基がアキシアル型に結合しているため、隣接基効果を利用できないこと、またβ-マンノグリコシド結合は、糖特有のアノマー効果に対して電気的に不安定な構造をとることなどが、その理由である。非特許文献１にはβ-マンノグリコシド結合構造の化学的合成法が記載されているが、それは非常に複雑な工程を含み、時間およびコストを必要とする。
さらに、β-マンノグリコシド結合（Manβ1→４GlcNAc）の形成が困難である理由としては、グリコシル化反応時にアクセプターとなるN-アセチルグルコサミンの反応溶媒への溶解性が低いこと、また4位の水酸基の反応性が他の水酸基に比べて低いことが挙げられる(水酸基の反応性：1位≫6位≫2位＞3位＞4位)。
また、アスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造を化学的に合成する際には、GlcNAcβ1→４GlcNAc構造の合成についても問題がある。
このようにアスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造を化学的に合成するには、特に還元末端の3糖(Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc)の合成が、大きな問題として残っている。より効率的に、このコア糖鎖構造を合成するためには、特にβ-マンノグリコシド結合を効率的に合成するという問題を解決しなければならない。
Kunz, H. and Gunther, W. (1988) Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1086-1087
そこで、本発明者らはマンノース残基がβ1→4結合で連なった構造を有する天然多糖、特にマンノースβ−１，４−結合を有するガラクトマンナン、グアガムおよびマンナンに着目した。すなわち、本発明ではコア糖鎖構造の合成において最大の難関となるβ-マンノグリコシド結合の形成を、天然多糖の構造中に含まれるManβ1→4Manの2糖を利用して行うという新合成手法を用いることにより克服し、コア糖鎖構造の効率的合成法を確立することを目的とする。
すなわち、本発明は、アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)を製造する方法において、
（１）マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類、好ましくはマンノースβ−１，４−結合を有するガラクトマンナン、グアガムおよびマンナン、さらに好ましくは、式(Ｖ)：
(式中、ｎは５０以上の整数)
で示されるガラクトマンナン誘導体、または、式（ＶＩ）：
（式中、ｎは５０以上の整数）
で示されるマンナン誘導体、を加水分解し、次いで得られた化合物の水酸基を保護することにより、式(Ｉ)：
(式中、Ｐ１は水酸基の保護基であり、波線はＯＰ１基がアキシアル配置もしくはエカトリアル配置、または両配置が混在していることを示す)
で示されるマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する工程；
（１）マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類、好ましくはマンノースβ−１，４−結合を有するガラクトマンナン、グアガムおよびマンナン、さらに好ましくは、式(Ｖ)：
で示されるガラクトマンナン誘導体、または、式（ＶＩ）：
で示されるマンナン誘導体、を加水分解し、次いで得られた化合物の水酸基を保護することにより、式(Ｉ)：
で示されるマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する工程；
（２）得られたマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物をハロゲン化し、次いで還元することにより、マンノース２糖化合物における還元末端側のマンノースがグリカールに変換したグリカール化合物とし、次に、
（３）得られたグリカール化合物をアジドナイトレーション反応に付し、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに位置する式（ＩＩ）：
(式中、Ｐ１は前記と同意義であり、波線はニトロ基がアキシアル配置もしくはエカトリアル配置、または両配置が混在していることを示す)
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する各工程；
（３）得られたグリカール化合物をアジドナイトレーション反応に付し、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに位置する式（ＩＩ）：
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する各工程；
（４）得られたアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物のニトロ基を脱離基に置換し、好ましくは
（４−１）得られたアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物のニトロ基を−ＯＰ１０基（式中、Ｐ１０は水酸基の保護基）に置換し、Ｐ１０を脱保護した後、トリハロアセトニトリルを反応させ、トリハロアセトイミデート体とするか、または（４−２）得られたアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物のニトロ基を脱離基で置換し、次いで
（５）得られた脱離基導入体に式：
（式中、Ｐ２は水酸基の保護基、Ｐ３はアミノ保護基、Ｐ１１は水酸基の保護基である）
で示されるアミノ保護グルコピラノシドを反応させ、式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ１１は前記と同意義）
で示される３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物を製造する各工程：
（４−１）得られたアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物のニトロ基を−ＯＰ１０基（式中、Ｐ１０は水酸基の保護基）に置換し、Ｐ１０を脱保護した後、トリハロアセトニトリルを反応させ、トリハロアセトイミデート体とするか、または（４−２）得られたアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物のニトロ基を脱離基で置換し、次いで
（５）得られた脱離基導入体に式：
で示されるアミノ保護グルコピラノシドを反応させ、式（ＩＩＩ）：
で示される３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物を製造する各工程：
（６）得られた３糖化合物の還元末端に保護アスパラギンを結合させ、式（ＩＶ）：
（式中、Ｐ１およびＰ２は前記と同意義、Ｐ４およびＰ６は各々独立してアミノ保護基、Ｐ５はカルボキシ保護基である）
で示されるアスパラギン結合型３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)化合物を製造する工程：
を含む方法、およびそれぞれの工程にかかる方法、ならびに：
で示されるアスパラギン結合型３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)化合物を製造する工程：
を含む方法、およびそれぞれの工程にかかる方法、ならびに：
本発明の方法に有用な合成中間体である式（ＩＩ）：
(式中、Ｐ１は水酸基の保護基であり、波線はニトロ基がアキシアル配置もしくはエカトリアル配置、または両配置が混在していることを示す)
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物、および
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物、および
式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｐ１、Ｐ２およびＰ１１は水酸基の保護基、Ｐ３はアミノ保護基である）
で示される３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物：に関する。
で示される３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物：に関する。
本発明は、アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)部分を簡便に合成できるので、様々な生命現象を引き起こすアスパラギン結合型糖タンパク質の機能および構造特性を解明するのに有用である。
本発明のコア糖鎖構造の新合成手法の概略を示すと次のとおりになる：
（式中、波線はＯＰ１基またはニトロ基が独立してアキシアル配置もしくはエカトリアル配置、または両配置が混在していることを示す）
まず、マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類を酸加水分解後、アセチル化を行い2糖である化合物(Ｉ)Manβ1→4Manを得る。次に、これを化学的手法により還元末端側のマンノースをグリカールヘ変換し、アジドナイトレーション反応を行い、化合物(ＩＩ)に変換する。この還元末端側の2位にアジド基がエカトリアルに位置する化合物(ＩＩ)は、コア糖鎖構造のManβ1→4GlcNAc部分へと変換できる有用な鍵中間体である。
このように、ガラクトマンナン、グアガムおよびマンナン誘導体から得られる化合物(Ｉ)から、コア糖鎖構造の中でも最も合成困難であるManβ1→4GlcNAc構造へ変換可能である中間体(ＩＩ)が安価かつ大量かつ簡単に合成できる。さらに、この中間体(ＩＩ)をグリコシルドナーとして利用することにより、コア糖鎖構造の還元末端の3糖(Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc)に容易に変換できる3糖構造の化合物(ＩＩＩ)を合成する事ができる。
このようにして、非常に安価な天然多糖を利用することにより、コア構造の還元末端の3糖の合成を簡略化することに成功した。
このように、ガラクトマンナン、グアガムおよびマンナン誘導体から得られる化合物(Ｉ)から、コア糖鎖構造の中でも最も合成困難であるManβ1→4GlcNAc構造へ変換可能である中間体(ＩＩ)が安価かつ大量かつ簡単に合成できる。さらに、この中間体(ＩＩ)をグリコシルドナーとして利用することにより、コア糖鎖構造の還元末端の3糖(Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc)に容易に変換できる3糖構造の化合物(ＩＩＩ)を合成する事ができる。
このようにして、非常に安価な天然多糖を利用することにより、コア構造の還元末端の3糖の合成を簡略化することに成功した。
次に本発明方法の各工程について詳細に説明する。
工程（１）：
工程１はマンノースβ−１，４−結合を有する多糖類からマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物（Ｉ）を製造する。まず、マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類を加水分解し、次いで水酸基を保護し、そして目的の２糖を分離する。
出発原料であるマンノースβ−１，４−結合を有する多糖類としては、好ましくはマンノースβ−１，４−結合を有するガラクトマンナン、グアガムおよびマンナンを使用し、さらに好ましくはさらに好ましくは、式(Ｖ)：
(式中、ｎは５０以上の整数)
で示されるガラクトマンナン誘導体、または、式（ＶＩ）：
（式中、ｎは５０以上の整数）
で示されるマンナン誘導体を使用する。
工程（１）：
工程１はマンノースβ−１，４−結合を有する多糖類からマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物（Ｉ）を製造する。まず、マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類を加水分解し、次いで水酸基を保護し、そして目的の２糖を分離する。
出発原料であるマンノースβ−１，４−結合を有する多糖類としては、好ましくはマンノースβ−１，４−結合を有するガラクトマンナン、グアガムおよびマンナンを使用し、さらに好ましくはさらに好ましくは、式(Ｖ)：
で示されるガラクトマンナン誘導体、または、式（ＶＩ）：
で示されるマンナン誘導体を使用する。
ガラクトマンナン（galactomannnan）誘導体（ガラクトマンノグリカン（galactomannoglycan）とも呼ばれる）は、マメ科植物の種子をはじめとし、アルファルファやクローバーの実などに広く存在する。グアール（guar, Cyamopsis tetragonolobus）やイナゴマメ（carobまたはlocust bean, Ceratonia siliqua）の実のガラクトマンナンは植物ガム製品として市販されている。
グアー種子から取れる「グアガム」は、マンノースがβ1→4結合で連なった直鎖状の糖鎖にマンノース1残基毎にガラクトースがα1→６結合で分岐している天然多糖である。この物質の用途はほとんどが食品添加物であり、様々な缶詰製品の増粘剤として、食品の品質保持(型崩れ防止)や味の緩和剤として用いられており、簡単に入手可能かつ非常に安価である。
マンナン（mannan）誘導体は、Ｄ−マンノースから構成される多糖の総称である。ゾウゲヤシの種子胚乳、ラン科植物の球根などに含まれる植物マンナンはＤ−マンノース残基がβ１→４結合で連なった直鎖構造を有し、水に難溶である。
これらは詳細には、「地域生物資源活用大辞典」 藤巻宏編 (1998) 農山漁村文化協会、Y. C. Lee, et al. (1977) Analytical Biochem., 79, 329-337 およびShiryo Yaga, et al. (1995) Mokuzai Gakkaishi, vol41, No 4, 440-443に記載されている。
マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類の加水分解は通常、酸加水分解を行う。それには、通常、硫酸、好ましくは１０−２０％硫酸、トリフルオロ酢酸、硫酸−酢酸溶液を用い、反応温度は５０−７０℃が好ましい。
加水分解物中、70％エタノール可溶ガラクトマンナンを分離することにより、重合度「９」以上のものを除く。一般に、重合度が高くなれば、不溶画分に残る。
グアー種子から取れる「グアガム」は、マンノースがβ1→4結合で連なった直鎖状の糖鎖にマンノース1残基毎にガラクトースがα1→６結合で分岐している天然多糖である。この物質の用途はほとんどが食品添加物であり、様々な缶詰製品の増粘剤として、食品の品質保持(型崩れ防止)や味の緩和剤として用いられており、簡単に入手可能かつ非常に安価である。
マンナン（mannan）誘導体は、Ｄ−マンノースから構成される多糖の総称である。ゾウゲヤシの種子胚乳、ラン科植物の球根などに含まれる植物マンナンはＤ−マンノース残基がβ１→４結合で連なった直鎖構造を有し、水に難溶である。
これらは詳細には、「地域生物資源活用大辞典」 藤巻宏編 (1998) 農山漁村文化協会、Y. C. Lee, et al. (1977) Analytical Biochem., 79, 329-337 およびShiryo Yaga, et al. (1995) Mokuzai Gakkaishi, vol41, No 4, 440-443に記載されている。
マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類の加水分解は通常、酸加水分解を行う。それには、通常、硫酸、好ましくは１０−２０％硫酸、トリフルオロ酢酸、硫酸−酢酸溶液を用い、反応温度は５０−７０℃が好ましい。
加水分解物中、70％エタノール可溶ガラクトマンナンを分離することにより、重合度「９」以上のものを除く。一般に、重合度が高くなれば、不溶画分に残る。
水酸基の保護には通常、糖質化学の分野で利用されるアセチル基、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、ベンゾイル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基などである。
２糖の分離は通常、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、および／または高速液体クロマトグラフィーにより行う。
工程２：
工程２はマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物（Ｉ）からグリカール化合物を製造する。まず、２糖化合物の還元末端側マンノースの１位をハロゲン化し、還元することによりグリカール化合物を製造する。
ハロゲン化は通常、ハロゲン化水素、酸ハロゲン化物等を用い、室温程度にて行う。還元は亜鉛等の金属を用いて行うが、高温は避ける。
工程２はマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物（Ｉ）からグリカール化合物を製造する。まず、２糖化合物の還元末端側マンノースの１位をハロゲン化し、還元することによりグリカール化合物を製造する。
ハロゲン化は通常、ハロゲン化水素、酸ハロゲン化物等を用い、室温程度にて行う。還元は亜鉛等の金属を用いて行うが、高温は避ける。
工程３：
工程３はグリカール化合物をアジドナイトレーション反応に付し、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに位置するアジ化２糖化合物（ＩＩ）を製造する。
アジドナイトレーション反応は、アジド化とニトロ化とを同時に反応させて行う。この反応により、エカトリアルとアキシアルの混合物が生成されるので、それを分離精製することにより、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに配置された化合物を得る。
工程３はグリカール化合物をアジドナイトレーション反応に付し、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに位置するアジ化２糖化合物（ＩＩ）を製造する。
アジドナイトレーション反応は、アジド化とニトロ化とを同時に反応させて行う。この反応により、エカトリアルとアキシアルの混合物が生成されるので、それを分離精製することにより、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに配置された化合物を得る。
工程４：
工程４はアジ化２糖化合物のニトロ基を脱離基に置換する工程である。ここで使用する脱離基は、フッ素、臭素、塩素、トリクロロアセトイミデート、4-ペンテニル、アルキルチオ（硫黄）、アリールチオなどが一般的である。
好ましくは、アジ化２糖化合物のニトロ基を−ＯＰ１０基（Ｐ１０は水酸基の保護基）に置換し、Ｐ１０を脱保護した後、トリハロアセトニトリルを反応させ、トリハロアセトイミデート体とする。またはロゲン化水素を反応させてハロゲン体を得る。あるいは、−ＯＰ１０体またはＰ１０脱保護体は、ペンテニル体、アセチルチオ体、アリールチオ体などの脱離基導入体へと常法により変換してもよい。
工程４はアジ化２糖化合物のニトロ基を脱離基に置換する工程である。ここで使用する脱離基は、フッ素、臭素、塩素、トリクロロアセトイミデート、4-ペンテニル、アルキルチオ（硫黄）、アリールチオなどが一般的である。
好ましくは、アジ化２糖化合物のニトロ基を−ＯＰ１０基（Ｐ１０は水酸基の保護基）に置換し、Ｐ１０を脱保護した後、トリハロアセトニトリルを反応させ、トリハロアセトイミデート体とする。またはロゲン化水素を反応させてハロゲン体を得る。あるいは、−ＯＰ１０体またはＰ１０脱保護体は、ペンテニル体、アセチルチオ体、アリールチオ体などの脱離基導入体へと常法により変換してもよい。
工程５：
工程５は得られた脱離基導入体にアミノ保護グルコピラノシドを反応させ、３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物を製造する。
アミノ保護グルコピラノシドは次のスキームに従って製造できる。
工程５は得られた脱離基導入体にアミノ保護グルコピラノシドを反応させ、３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物を製造する。
アミノ保護グルコピラノシドは次のスキームに従って製造できる。
アミノ保護基：Ｐ３としては通常、フタルイミド基、tert−ブチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基などを利用する。
次いで、これを得られた脱離基導入体と酸性（ルイス酸性）条件下、反応させる。
次いで、これを得られた脱離基導入体と酸性（ルイス酸性）条件下、反応させる。
工程６：
工程６は、得られた３糖化合物にアスパラギンを結合させる。アスパラギンの結合は例えば、以下に示すスキームに従って行うことができる。
工程６は、得られた３糖化合物にアスパラギンを結合させる。アスパラギンの結合は例えば、以下に示すスキームに従って行うことができる。
上記のようにして合成した３糖を、目的タンパク質のアスパラギン残基に導入し、さらに新たな糖を付加させてその糖鎖を伸長させることができる。さらにあらかじめ３糖に対して糖鎖を伸長させた後にタンパク質に導入することもできる。
あるいは、得られたアスパラギン結合型３糖のアスパラギンに、通常のペプチド合成化学を応用すれば、タンパク質を伸張させることができる。また、非還元末端のマンノースに通常の糖質化学を応用すれば、糖鎖を伸張させることができる。
あるいは、得られたアスパラギン結合型３糖のアスパラギンに、通常のペプチド合成化学を応用すれば、タンパク質を伸張させることができる。また、非還元末端のマンノースに通常の糖質化学を応用すれば、糖鎖を伸張させることができる。
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例にて使用している試薬の入手先は次のとおりである。
・三晶株式会社(食品資材部)
グアガム(Guargum)MEYPROGAT 120S
・関東化学株式会社
亜鉛粉末(Zinc Powder)
硫酸銅５水和物(Copper(II)Sulfate Pentahydrate (結晶粉末)
セリウム(IV)ジアンモニウム ニトレート(Diammonium Cerium(IV) Nitrate)
実施例にて使用している試薬の入手先は次のとおりである。
・三晶株式会社(食品資材部)
グアガム(Guargum)MEYPROGAT 120S
・関東化学株式会社
亜鉛粉末(Zinc Powder)
硫酸銅５水和物(Copper(II)Sulfate Pentahydrate (結晶粉末)
セリウム(IV)ジアンモニウム ニトレート(Diammonium Cerium(IV) Nitrate)
・和光純薬工業株式会社
酢酸ナトリウム(Sodium Acetate)
無水酢酸(Acetic Anhydride)
トリフルオロ酢酸(Trifluoroacetic Acid)
アジ化ナトリウム(Sodium Azide)
1,8-ジアザビシクロ[5, 4, 0]ウンデカ-7-エン(DBU、1,8-Diazabicyclo[5, 4, 0]undec-7-ene)
トリクロロアセトニトリル(CCl3CN、Trichloroacetonitrile)
ホウ素トリフルオリド ジエチルエーテルコンプレックス(BF3OEt2、Boron Trifluoride Diethyl Ether Complex)
酢酸(Acetic Acid、有機合成用)
ピリジン(Pyridine、有機合成用)
テトラヒドロフラン(THF、Tetrahydrofuran、有機合成用)
ジクロロメタン(CH2Cl2、Dichloromethane、有機合成用)
アセトニトリル(Acetonitrile、有機合成用)
酢酸エチル
クロロホルム
トルエン
無水MgSO4
トリエチルアミン
酢酸ナトリウム(Sodium Acetate)
無水酢酸(Acetic Anhydride)
トリフルオロ酢酸(Trifluoroacetic Acid)
アジ化ナトリウム(Sodium Azide)
1,8-ジアザビシクロ[5, 4, 0]ウンデカ-7-エン(DBU、1,8-Diazabicyclo[5, 4, 0]undec-7-ene)
トリクロロアセトニトリル(CCl3CN、Trichloroacetonitrile)
ホウ素トリフルオリド ジエチルエーテルコンプレックス(BF3OEt2、Boron Trifluoride Diethyl Ether Complex)
酢酸(Acetic Acid、有機合成用)
ピリジン(Pyridine、有機合成用)
テトラヒドロフラン(THF、Tetrahydrofuran、有機合成用)
ジクロロメタン(CH2Cl2、Dichloromethane、有機合成用)
アセトニトリル(Acetonitrile、有機合成用)
酢酸エチル
クロロホルム
トルエン
無水MgSO4
トリエチルアミン
・東京化成株式会社(食品資材部)
臭化水素（30％ HBr-AcOH, 30% Hydrogen Bromide in Acetic Acid)
臭化水素（30％ HBr-AcOH, 30% Hydrogen Bromide in Acetic Acid)
・ナカライテスク株式会社
ベンジルアミン(Benzylamine)
ベンジルアミン(Benzylamine)
・日本アルコール販売株式会社
99% エタノール
99% エタノール
実施例１
１．グアガムの加水分解およびManβ1→4Manの単離
合成スキーム (1)
１．グアガムの加水分解およびManβ1→4Manの単離
合成スキーム (1)
１．１．グアガムの加水分解(少量スケール)
(A) グアガムをトリフルオロ酢酸(TFA)で酸加水分解し、70％エタノール可溶ガラクトマンナン(Galactomannan)を得る。
グアガム(1)2.0gを１N TFA 16.6mlに溶解させ、オイルバス中で110℃に加熱しながら、90分間スターラーを用いて撹拌した。反応溶液を、40mＬの99％エタノールに加え、室温で静置すると、白い粉末が沈殿してくるのでブフナー漏斗を用いてろ過を行い、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をトルエンで数回共沸させ、70％エタノール可溶のガラクトマンナン(2) 2.26gと、70％エタノール不溶物のガラクトマンナン(3) 73mgを得た。
この70%エタノール可溶のガラクトマンナン(2)をMALDI-TOFMSにより測定したところ重合度1から8まで分解されていることを確認した。
(A) グアガムをトリフルオロ酢酸(TFA)で酸加水分解し、70％エタノール可溶ガラクトマンナン(Galactomannan)を得る。
グアガム(1)2.0gを１N TFA 16.6mlに溶解させ、オイルバス中で110℃に加熱しながら、90分間スターラーを用いて撹拌した。反応溶液を、40mＬの99％エタノールに加え、室温で静置すると、白い粉末が沈殿してくるのでブフナー漏斗を用いてろ過を行い、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をトルエンで数回共沸させ、70％エタノール可溶のガラクトマンナン(2) 2.26gと、70％エタノール不溶物のガラクトマンナン(3) 73mgを得た。
この70%エタノール可溶のガラクトマンナン(2)をMALDI-TOFMSにより測定したところ重合度1から8まで分解されていることを確認した。
(B) 70％エタノール可溶のガラクトマンナンをアセチル化し、O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-1,2,3,6-テトラ-O-アセチル-α-and β-D-マンノピラノシド(4)を得る。
得られた70％エタノール可溶のガラクトマンナン (2)2.26gをピリジン23mlに溶解させ、氷冷中で無水酢酸 23mｌを加え、10℃で22時間撹拌させた。反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄をした後、無水MgSO4を用いて乾燥させた。セライト濾過を用いてMgSO4を取り除き、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル = 2:1)を用いて分離精製し、目的物(4)を450mg得た。
試料α:β = 2:1 混合物; [α]D-0.5 (c 0.012, クロロホルム); 1H NMR δ(CDCl3) 1.99〜2.19 (all s, 24H, 8COCH3), 3.64 (m, 1H, H-5'), 3.77 (m, 1/3H, H-5β),3.95〜4.13 (m, 2＋2/3H, H-5α, H-4β, H-4α and H-6'b), 4.23〜4.37 (m, 3H, H-6bβ, H-6aα, H-6bα, H-6a' and H-6aβ) , 4.72 (d, 1/3H, Jβ 1',2'＝1.1Hz, H-1β'), 4.75 (d, 2/3H, Jα 1', 2'=1.1 Hz, H-1α'), 5.04 (m, 1H, H-3'), 5.17〜5.25 (m, 2H, H-4', H-2α and H-3β), 5.39〜5.45 (m, 2H, H-2', H-2β and H-3α), 5.81 (d, 1/3H, Jβ 1, 2 =1.1 Hz, H-1β), 6.03 (d, 2/3H, Jα 1, 2 =2.0 Hz, H-1α).
理論値(C28H38O19として):C, 49.56; H, 5.64; 実測値:C, 49.34; H, 5.67
HR-FAB MS[M+Na]+計算値(C28H38O19Naとして)701.191, 実測値 709.190
t.l.c ; Rf = 0.30 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
得られた70％エタノール可溶のガラクトマンナン (2)2.26gをピリジン23mlに溶解させ、氷冷中で無水酢酸 23mｌを加え、10℃で22時間撹拌させた。反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄をした後、無水MgSO4を用いて乾燥させた。セライト濾過を用いてMgSO4を取り除き、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル = 2:1)を用いて分離精製し、目的物(4)を450mg得た。
試料α:β = 2:1 混合物; [α]D-0.5 (c 0.012, クロロホルム); 1H NMR δ(CDCl3) 1.99〜2.19 (all s, 24H, 8COCH3), 3.64 (m, 1H, H-5'), 3.77 (m, 1/3H, H-5β),3.95〜4.13 (m, 2＋2/3H, H-5α, H-4β, H-4α and H-6'b), 4.23〜4.37 (m, 3H, H-6bβ, H-6aα, H-6bα, H-6a' and H-6aβ) , 4.72 (d, 1/3H, Jβ 1',2'＝1.1Hz, H-1β'), 4.75 (d, 2/3H, Jα 1', 2'=1.1 Hz, H-1α'), 5.04 (m, 1H, H-3'), 5.17〜5.25 (m, 2H, H-4', H-2α and H-3β), 5.39〜5.45 (m, 2H, H-2', H-2β and H-3α), 5.81 (d, 1/3H, Jβ 1, 2 =1.1 Hz, H-1β), 6.03 (d, 2/3H, Jα 1, 2 =2.0 Hz, H-1α).
理論値(C28H38O19として):C, 49.56; H, 5.64; 実測値:C, 49.34; H, 5.67
HR-FAB MS[M+Na]+計算値(C28H38O19Naとして)701.191, 実測値 709.190
t.l.c ; Rf = 0.30 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
１．２．グアガムの加水分解(大量スケール)
(A)' グアガムをTFAで酸加水分解し、70％エタノール可溶のガラクトマンナンを得る。
グアガム(1) 200gを１N トリフルオロ酢酸(TFA) 1660mlに溶解させ、オイルバス中で110℃に加熱しながら、35分間メカニカルスターラーを用いて撹拌した。グアガムが懸濁したところで、15分間超音波破砕を行い、110℃下で、メカニカルスターラーを用いて80分間撹拌した。反応溶液を、氷水で冷却した後、4Ｌの99％エタノールに加えた。室温で静置すると、白い粉末が沈殿してくるのでブフナー漏斗を用いてろ過を行い、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をトルエンで数回共沸させ、70％エタノール可溶のガラクトマンナン(2) 200.3gと、70％エタノール不溶物のガラクトマンナン(3) 9.9gを得た。
この70%エタノール可溶物のガラクトマンナン(2)をMALDI-TOFMSにより測定したところ重合度1から8まで分解されていることを確認した。
(A)' グアガムをTFAで酸加水分解し、70％エタノール可溶のガラクトマンナンを得る。
グアガム(1) 200gを１N トリフルオロ酢酸(TFA) 1660mlに溶解させ、オイルバス中で110℃に加熱しながら、35分間メカニカルスターラーを用いて撹拌した。グアガムが懸濁したところで、15分間超音波破砕を行い、110℃下で、メカニカルスターラーを用いて80分間撹拌した。反応溶液を、氷水で冷却した後、4Ｌの99％エタノールに加えた。室温で静置すると、白い粉末が沈殿してくるのでブフナー漏斗を用いてろ過を行い、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をトルエンで数回共沸させ、70％エタノール可溶のガラクトマンナン(2) 200.3gと、70％エタノール不溶物のガラクトマンナン(3) 9.9gを得た。
この70%エタノール可溶物のガラクトマンナン(2)をMALDI-TOFMSにより測定したところ重合度1から8まで分解されていることを確認した。
(B)' 70％エタノール可溶のガラクトマンナンをアセチル化し、O-(2,3,4,6,-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-1,2,3,6,-テトラ-O-アセチル-α-andβ-D-マンノピラノシド(4)を得る。
得られた70％エタノール可溶のガラクトマンナン (2)200.3gをピリジン2100mLに溶解させ、氷冷中で無水酢酸 2100mｌを加え、10℃で22時間撹拌させた。反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄をした後、無水MgSO4を用いて乾燥させた。セライト濾過を用いてMgSO4を取り除き、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル = 1:2)を用いて部分精製し、さらに中圧クロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル = 2:1)を用いて分離精製し、目的物(4)25.2gを得た。
得られた70％エタノール可溶のガラクトマンナン (2)200.3gをピリジン2100mLに溶解させ、氷冷中で無水酢酸 2100mｌを加え、10℃で22時間撹拌させた。反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄をした後、無水MgSO4を用いて乾燥させた。セライト濾過を用いてMgSO4を取り除き、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル = 1:2)を用いて部分精製し、さらに中圧クロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル = 2:1)を用いて分離精製し、目的物(4)25.2gを得た。
２． O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→４)-1,3,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシド(8)の合成
合成スキーム (2)
合成スキーム (2)
(C) O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-マンノピラノシル ブロミド (5)の合成
化合物(4)2.20gを酢酸 19mlに溶解させ、氷冷中で30％ HBr-AcOHを4.6ml加え遮光しながら室温で150分間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄した後に、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮し、目的物(5)を含む反応混合物を2.21g得た。
t.l.c.; Rf = 0.35 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
化合物(4)2.20gを酢酸 19mlに溶解させ、氷冷中で30％ HBr-AcOHを4.6ml加え遮光しながら室温で150分間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄した後に、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮し、目的物(5)を含む反応混合物を2.21g得た。
t.l.c.; Rf = 0.35 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
(D)O-(2,3,4,6-テトラ-0-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-,3,6-ジ-O-アセチル-D-グリコール(6)の合成
氷冷中で、酢酸 3.8ml、水 7.6ｍｌ、酢酸ナトリウム 2.06ｇ、硫酸銅５水和物 0.20g、亜鉛 1.65ｇの順番で３つ口フラスコに、メカニカルスターラーを用いて撹拌しながら加えた。次に、化合物(5)を含む反応混合物を酢酸 7.6mlに溶かし、氷冷中で反応溶液に加え、室温で遮光しながら4時間撹拌させた。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液をセライトろ過を用いて亜鉛を取り除き、ろ液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄した後に無水MgSO4で乾燥した。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝ 2:1)を用いて分離精製し、目的物(6)を0.64g得た。
化合物(4)からの収率： 36%・
氷冷中で、酢酸 3.8ml、水 7.6ｍｌ、酢酸ナトリウム 2.06ｇ、硫酸銅５水和物 0.20g、亜鉛 1.65ｇの順番で３つ口フラスコに、メカニカルスターラーを用いて撹拌しながら加えた。次に、化合物(5)を含む反応混合物を酢酸 7.6mlに溶かし、氷冷中で反応溶液に加え、室温で遮光しながら4時間撹拌させた。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液をセライトろ過を用いて亜鉛を取り除き、ろ液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄した後に無水MgSO4で乾燥した。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝ 2:1)を用いて分離精製し、目的物(6)を0.64g得た。
化合物(4)からの収率： 36%・
1H NMR δ(CDCl3) .200, 2.05, 2.08, 2.10, 2.12 and 2.17(all s, 18H, 6COCH3), 3.66(ddd, 1H, J4', 5'=9.8Hz, J5',6a' = 5.8Hz, J5',6 b' =12.2Hz, H-5'), 4.05(dd, 1H, J3, 4=6.0Hz, J4, 5=8.1Hz, H-4), 4.12(dd, 1H, J5',6b'=2.6Hz, J6a', 6b'=12.2Hz, H-6b'), 4.13-4.17(m, 1H, H-5), 4.23(dd, 1H, J5,6b =5.3Hz, J6a,6b =12.2Hz, H-6b), 4.30(dd, 1H, J5',6a'=5.8Hz, J6a',6b' =12.2Hz, H-6a'), 4.42(dd, 1H, J5,6a =2.9Hz, J6a,6b =12.2Hz, H-6a), 4.79(dd,1H,J1, 2=6.1Hz, J2,3 =3.1Hz, H-2), 4.86 (d, 1H, J1',2' =1.1Hz, H-1'), 5.05 (dd,1H, J2', 3'=3.4Hz, J3',4' =10.1Hz, H-3'), 5.22 (t, 1H, J4',5' =9.8Hz,H-4'), 5.45 (dd, 1H, J1',2' =1.1Hz J2',3' = 3.4Hz, H-2'), 5.51 (m, 1H, H-3), 6.40 (dd, 1H, J1,2 =6.1 Hz, Jduble bond cis= 1.2Hz,H-1)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-21.0(m, 6COCH3), 61.8(C-6), 62.5(C-6'), 65.9(C-4'), 68.5(C-3 and C-2'), 70.8(C-3'), 72.6(C-5'), 74.0(C-4), 74.4(C-5), 97.9(C-1'), 99.0(C-2), 145.6(C-1), 169.5-170.6(m, 6COCH3)
t.l.c.; Rf = 0.40 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-21.0(m, 6COCH3), 61.8(C-6), 62.5(C-6'), 65.9(C-4'), 68.5(C-3 and C-2'), 70.8(C-3'), 72.6(C-5'), 74.0(C-4), 74.4(C-5), 97.9(C-1'), 99.0(C-2), 145.6(C-1), 169.5-170.6(m, 6COCH3)
t.l.c.; Rf = 0.40 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
(E)O-(2,3,4,6-テトラ-0-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→４)-3,6-di-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ α-andβ-D-グルコピラノシル ニトレート (7)の合成
化合物(6) 510mgを脱水アセトニトリル 5.4mｌに溶かし、−20℃に冷やし、スターラーで撹拌した。この溶液に、アジ化ナトリウム(NaN3)89mgを加え、さらに、セリウム(IV)ジアンモニウム ニトレート 1.50gを15分毎に4回に分けて加えた。反応溶液をヘリウム雰囲気下、−20℃で18時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮し,目的物(7)を含む残渣460mgを得た。
t.l.c.; Rf = 0.5 0 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
化合物(6) 510mgを脱水アセトニトリル 5.4mｌに溶かし、−20℃に冷やし、スターラーで撹拌した。この溶液に、アジ化ナトリウム(NaN3)89mgを加え、さらに、セリウム(IV)ジアンモニウム ニトレート 1.50gを15分毎に4回に分けて加えた。反応溶液をヘリウム雰囲気下、−20℃で18時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮し,目的物(7)を含む残渣460mgを得た。
t.l.c.; Rf = 0.5 0 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
(F)O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→４)-1,3,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシド(8)の合成
化合物(7)を含む反応混合物の残渣 460mgを酢酸 2.0mlに溶かし、酢酸ナトリウム 170mgを加え、80℃のオイルバス中で75分間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝３：２)を用いて分離精製し、目的物(8)とO-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→４)-1, 3,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-α-D-マンノピラノシド(9)を含む残渣360mｇ得た。この混合物を少量のエタノールに熱しながら溶かし、氷水で冷やしながら結晶化させた。これにより、目的物(8)を 201mmg得た。
t.l.c.; Rf = 0.39 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
化合物(6)からの収率： 33%。
化合物(7)を含む反応混合物の残渣 460mgを酢酸 2.0mlに溶かし、酢酸ナトリウム 170mgを加え、80℃のオイルバス中で75分間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、NaHCO3水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝３：２)を用いて分離精製し、目的物(8)とO-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→４)-1, 3,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-α-D-マンノピラノシド(9)を含む残渣360mｇ得た。この混合物を少量のエタノールに熱しながら溶かし、氷水で冷やしながら結晶化させた。これにより、目的物(8)を 201mmg得た。
t.l.c.; Rf = 0.39 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
化合物(6)からの収率： 33%。
1H NMR δ(CDCl3) 1.99, 2.05, 2.10, 2.12, 2.17 and 2.20 (all s, 21H, 7COCH3), 3.51 (dd, 1H, J1, 2=3.8Hz J2,3 = 10.5Hz, H-2), 3.61 (ddd, 1H, J4',5' =9.9Hz, J5',6a' =5.0Hz, J5',6b'= 2.8Hz, H-5'), 3.83 (t, 1H, J4,5 =10.2Hz, H-4), 3.99 (m, 1H, H-5), 4.12 (dd, 1H, J5',6b'= 2.8Hz J6a',6b' = 12.3Hz, H-6b'), 4.24 (dd, 1H, J5,6b= 3.7Hz J6a,6b = 12.5Hz, H-6b), 4.30(dd, 1H, J5, 6a=2.8Hz, J6a, 6b=12.5Hz, H-6a) 4.38(dd, 1H, J5, 6a=2.8Hz, J6a, 6b= 12.5Hz, H-6a), 4.66 (d, 1H, J1',2 '= 0.6Hz, H-1'), 5.03 (dd, 1H, J2', 3'=3.2Hz, J3',4' = 9.9Hz, H-3'), 5.23 (t, 1H, J 4',5' = 9.9Hz, H-4'), 5.42 (dd, 1H, J1'2'=0.6Hz, J2',3' = 3.2Hz, H-2'), 5.43 (dd, 1H, J2, 3=10.5Hz, J3,4 = 9.3Hz, H-3), 6.24 (d, 1H, J1,2 = 3.8Hz, H-1)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-20.9(m, 6COCH3), 60.3(C-2), 61.9(C-6), 62.2(C-6'), 65.8(C-4'), 68.1(C-2'), 69.7(C-3), 70.4(C-5), 70.7(C-3'), 72.5(C-5'), 74.0(C-4), 89.9(C-1), 97.5(C-1'), 168.6-170.4(m, 6COCH3)
理論値(C26H35O17として): C, 47.20; H, 5.33; N, 6.35；実測値: C, 46.90; H, 5.32; N, 6.39.
HR-FAB MS[M+H]+計算値(C26H36N3O17として)662.205, 実測値 662.202
mp+183.5-184.0℃(エタノールから),
t.l.c.; Rf = 0.39 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-20.9(m, 6COCH3), 60.3(C-2), 61.9(C-6), 62.2(C-6'), 65.8(C-4'), 68.1(C-2'), 69.7(C-3), 70.4(C-5), 70.7(C-3'), 72.5(C-5'), 74.0(C-4), 89.9(C-1), 97.5(C-1'), 168.6-170.4(m, 6COCH3)
理論値(C26H35O17として): C, 47.20; H, 5.33; N, 6.35；実測値: C, 46.90; H, 5.32; N, 6.39.
HR-FAB MS[M+H]+計算値(C26H36N3O17として)662.205, 実測値 662.202
mp+183.5-184.0℃(エタノールから),
t.l.c.; Rf = 0.39 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
３． アリル O-(2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-O-(3, 6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル)-(1→4)-3, 6-ジ-O-ベンジル2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシド(13)の合成
合成スキーム (3)
合成スキーム (3)
(G) O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→４)-3,6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-グルコピラノース (10)の合成
化合物(8)300mgをTHF 3.0mlに溶解させ、氷冷中でベンジルアミン 89μlを加え、室温で48時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、1N.HCl水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル＝3:2)を用いて分離精製し、目的物(10)を257mｇ得た。
化合物(8)からの収率： 92%。
HR-FAB MS[M+H]+計算値(C24H34N3O16として)620.194；実測値 620.192。
t.l.c ; Rf = 0.26 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
化合物(8)300mgをTHF 3.0mlに溶解させ、氷冷中でベンジルアミン 89μlを加え、室温で48時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、1N.HCl水溶液、NaCl水溶液の順で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた。セライトろ過を用いてMgSO4を取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル＝3:2)を用いて分離精製し、目的物(10)を257mｇ得た。
化合物(8)からの収率： 92%。
HR-FAB MS[M+H]+計算値(C24H34N3O16として)620.194；実測値 620.192。
t.l.c ; Rf = 0.26 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
(H) O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→４)-3,6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシル トリクロロアセトイミデート(11)の合成
化合物(10)85mgをCH2Cl2 550μlとCCl3CN 275μlに溶解させ、氷冷中でDBU 10.2μlを加え、室温で2時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝2:1)を用いて分離精製し、目的物(11)を80mｇ得た。
化合物(10)からの収率：76%。
化合物(10)85mgをCH2Cl2 550μlとCCl3CN 275μlに溶解させ、氷冷中でDBU 10.2μlを加え、室温で2時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝2:1)を用いて分離精製し、目的物(11)を80mｇ得た。
化合物(10)からの収率：76%。
1H NMR δ(CDCl3) 1.97, 2.02, 2.07, 2.08, 2.16 and 2.17(all s, 18H, 6COCH3), 3.56-3.60(m, 1H, H-5'), 3.60(dd, 1H, J1, 2=3.4Hz, J2, 3=10.5Hz, H-2), 3.88(t, 1H, J4, 5=9.8Hz, H-4), 4.09(dd, 1H, J5', 6b'=2.7Hz, J6a', 6b'=12.5Hz, H-6b'), 4.09-4.14(m, 1H, H-5), 4.21(dd, 1H, J5, 6b=3.9Hz, J6a, 6b=12.5Hz, H-6b), 4.33(dd, 1H, J5, 6a=2.2Hz, J6a, 6b=12.5Hz, H-6a), 4.33(dd, 1H, J5', 6a'=4.9Hz, J6a', 6b'=12.5Hz, H-6a'), 4.69(s, 1H, H-1'), 5.01(dd, 1H, J2', 3'=3.4Hz, J3', 4'=10.0Hz, H-3'), 5.20(t, 1H, J4', 5'=9.8Hz, H-4'), 5.38(d, 1H, J2', 3'=3.4Hz, H-2'), 5.51(dd, 1H, J2, 3=10.5Hz, J3, 4=9.5Hz, H-3), 6.41(d, 1H, J1, 2=3.4Hz, H-1), 8.79(s, 1H, NH)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-20.7(m, 6COCH3), 60.8(C-2), 61.9(C-6), 62.3(C-6'), 65.8(C-4'), 68.2(C-2'), 69.3(C-3), 70.7(C-5 and C-3'), 72.6(C-5'), 74.1(C-4), 90.5(C(NH)CCl3), 94.1(C-1), 97.3(C-1'), 160.6(C(NH)CCl3), 169.5-170.4(m, 6COCH3)
t.l.c ; Rf = 0.37 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-20.7(m, 6COCH3), 60.8(C-2), 61.9(C-6), 62.3(C-6'), 65.8(C-4'), 68.2(C-2'), 69.3(C-3), 70.7(C-5 and C-3'), 72.6(C-5'), 74.1(C-4), 90.5(C(NH)CCl3), 94.1(C-1), 97.3(C-1'), 160.6(C(NH)CCl3), 169.5-170.4(m, 6COCH3)
t.l.c ; Rf = 0.37 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
(I) アリル O-(2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-O-(3, 6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル)-(1→4)-3, 6-ジ-O-ベンジル2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシド(13)の合成
化合物(11)47mgとアリル-O-3, 6-O-ジ-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシド(12)45mgをCH2Cl2 700μlに溶解させ、MS4Å（モレキュラーシーブス）を70mg加え、窒素雰囲気下、-20℃で30分撹拌した。
次に、BF3OEt2を2.3μl加え、窒素雰囲気下、-20℃で24時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、トリエチルアミン(TEA)を加え中和した後、セライトろ過を用いてMS4Åを取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝5:2)を用いて部分精製し、目的物(13)とアリル O-(2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-O-(3, 6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシル)-(1→4)-3, 6-ジ-O-ベンジル2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシドを含む残渣32mgを得た(α;β=1:2)。さらにHPLC(溶出液；ヘキサン/エタノール＝12:1)を用いて分離精製し、目的物(13)を21mg得た。
化合物(11)からの収率： 31%。
化合物(11)47mgとアリル-O-3, 6-O-ジ-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシド(12)45mgをCH2Cl2 700μlに溶解させ、MS4Å（モレキュラーシーブス）を70mg加え、窒素雰囲気下、-20℃で30分撹拌した。
次に、BF3OEt2を2.3μl加え、窒素雰囲気下、-20℃で24時間撹拌した。反応終結をTLCで確認した後、トリエチルアミン(TEA)を加え中和した後、セライトろ過を用いてMS4Åを取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(溶出液；トルエン/酢酸エチル ＝5:2)を用いて部分精製し、目的物(13)とアリル O-(2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチル-β-D-マンノピラノシル)-(1→4)-O-(3, 6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシル)-(1→4)-3, 6-ジ-O-ベンジル2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシドを含む残渣32mgを得た(α;β=1:2)。さらにHPLC(溶出液；ヘキサン/エタノール＝12:1)を用いて分離精製し、目的物(13)を21mg得た。
化合物(11)からの収率： 31%。
1H NMR δ(CDCl3) 1.90, 1.92, 1.96, 2.00, 2.07, 2.15(all s, 18H, 6COCH3), 3.08(m, 1H, H-5'), 3.27(dd, 1H, J1', 2'=8.1Hz, J2', 3'=10.2Hz, H-2'), 3.46(ddd, 1H, J4", 5"=9.9Hz, J5", 6a"=4.8Hz, J5", 6b"=2.6Hz, H-5"), 3.51-3.56(m, 1H, H-5), 3.56(t, 1H, J4', 5'=9.8Hz, H-4'), 3.76(dd, 1H, J5, 6b=1.4Hz, J6a, 6b=10.9Hz, H-6b), 3.87(dd, 1H, J5, 6a=2.9Hz, J6a, 6b=10.9Hz, H-6a), 3.91(dd, 1H, J=6.3Hz, J=13.0Hz, CHH'CH=CH2), 3.98-4.20(m, 7H, H-6b", H-6b', H-4, H-2, H-6a', H-3, CHH'CH=CH2), 4.27(dd, 1H, J5", 6a"=4.8Hz, J6a", 6b"=12.3Hz, H-6a"), 4.27 and 4.66(ABq, 2H, J=12.5Hz, PhCH2), 4.30(d, 1H, J1', 2'=8.1Hz, H-1'), 4.42 and 4.73(ABq, 2H, J=12.0Hz, PhCH2), 4.45(s, 1H, H-1"), 4.76(dd, 1H, J2', 3'=3.4Hz, J3', 4'=9.9Hz, H-3'), 4.92(dd, 1H, J2", 3"=3.4Hz, J3", 4"=9.9Hz, H-3"), 4.93(dd, 1H, J=1.5Hz, Jtrans=10.4Hz, CH=CHtransH), 4.93(dd, 1H, J=1.5Hz, Jcis=17.2Hz, CH=CHHcis), 5.06(d, 1H, J1,2=8.4Hz, H-1), 5.14(t, 1H, J4", 5"=9.9Hz, H-4"), 5.30(d, 1H, J2", 3"=3.4Hz, H-2"), 5.60(m, 1H, CH=CH2), 6.70-7.58(m, 14H, Ar-H)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-20.6(m, 6COCH3), 55.5(C-2), 62.2(C-6' and C-6"), 64.5(C-2'), 65.9(C-4"), 67.8(C-6), 68.1(C-2"), 69.7(CH2CH=CH2), 70.7(C-3"), 71.9(C-3'), 72.0(C-5'), 72.5(C-5"), 73.5 and 74.3(2PhCH2), 74.6(C'-4 and C-5), 78.2(C-4), 97.3(C-1 and C-1"), 100.8(C-1'), 117.3(CH2CH=CH2), 127.0-133.7(m, 18Ar-C), 137.9(CH2CH=CH2), 169.6-170.4(m, 8C=O)
HR-FAB MS[M+Na]+計算値(C55H62N4O22Naとして).1153.375, 実測値 1153.374
t.l.c ; Rf = 0.53 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
13C NMR δ(CDCl3) 20.5-20.6(m, 6COCH3), 55.5(C-2), 62.2(C-6' and C-6"), 64.5(C-2'), 65.9(C-4"), 67.8(C-6), 68.1(C-2"), 69.7(CH2CH=CH2), 70.7(C-3"), 71.9(C-3'), 72.0(C-5'), 72.5(C-5"), 73.5 and 74.3(2PhCH2), 74.6(C'-4 and C-5), 78.2(C-4), 97.3(C-1 and C-1"), 100.8(C-1'), 117.3(CH2CH=CH2), 127.0-133.7(m, 18Ar-C), 137.9(CH2CH=CH2), 169.6-170.4(m, 8C=O)
HR-FAB MS[M+Na]+計算値(C55H62N4O22Naとして).1153.375, 実測値 1153.374
t.l.c ; Rf = 0.53 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
(J) (グリコシル アクセプターデータ) アリル-O-3, 6-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシド(12)
アミノ保護グルコピラノシド(12)を、次の合成スキームに従って製造した。
1H NMR δ(CDCl3) 3.63(m, 1H, H-5), 3.76-3.85(m, 3H, H-4, H-6a and H-6b), 3.97(dd, 1H, J=13.1Hz, J=6.1Hz, CHH'CH=CH2), 4.15-4.26(m, 3H, H-2, H-3 and CHH'CH=CH2), 4.52 and 4.73(ABq, 2H, J=12.2Hz, PhCH2), 4.58 and 4.64(ABq, 2H, J=11.9Hz, PhCH2), 4.99(dd, 1H, J=1.3Hz, Jtrans=10.3Hz, CH=CHcisHtrans), 5.07(dd, 1H, J=1.3Hz, Jcis=17.2Hz, CH=CHcisHtrans), 5.17(d, 1H, J1, 2=8.1Hz, H-1), 5.61-5.70(m, 1H, CH=CH2), 6.93-7.67(m, 14H, Ar-H)
13C NMR δ(CDCl3) 55.3(C-2), 69.7(C-C=C), 70.7(C-6), 73.5(C-5), 73.8 and 74.3(Ph-C), 74.5(C-4), 78.7(C-3), 97.4(C-1), 117.3(C-C=C), 127.4-128.5(m, Ar-C), 133.6(C-C=C), 137.6 and 138.2(C=O)
HR-FAB MS[M+H]+計算値(C31H32NO7として)530.218, 実測値 530.215
t.l.c ; Rf = 0.72 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
アミノ保護グルコピラノシド(12)を、次の合成スキームに従って製造した。
13C NMR δ(CDCl3) 55.3(C-2), 69.7(C-C=C), 70.7(C-6), 73.5(C-5), 73.8 and 74.3(Ph-C), 74.5(C-4), 78.7(C-3), 97.4(C-1), 117.3(C-C=C), 127.4-128.5(m, Ar-C), 133.6(C-C=C), 137.6 and 138.2(C=O)
HR-FAB MS[M+H]+計算値(C31H32NO7として)530.218, 実測値 530.215
t.l.c ; Rf = 0.72 (トルエン/酢酸エチル = 1:1)
糖鎖において糖を新たに付加して伸張させる場合、糖転移酵素を利用すれば簡便であるため、糖鎖の自動合成は通常、付加する糖とその糖を付加するための糖転移酵素が使用される。しかし、アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)部分を作るための糖転移酵素は存在していない。従ってその合成は化学合成法に頼らざるを得ない。
本発明は、非常に安価な天然多糖であるマンノースβ−１，４−結合を有するガラクトマンナン、グアガムおよび／またはマンナン誘導体を利用することによる、コア構造の還元末端３糖の簡便な合成方法である。
本発明は、非常に安価な天然多糖であるマンノースβ−１，４−結合を有するガラクトマンナン、グアガムおよび／またはマンナン誘導体を利用することによる、コア構造の還元末端３糖の簡便な合成方法である。
Claims (10)
- （１）マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類を加水分解し、次いで得られた化合物の水酸基を保護することにより、式(Ｉ)：
で示されるマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する工程を含む、アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)を製造する方法。 - アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)を製造する請求項１記載の方法において、さらに、
（２）得られたマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物をハロゲン化し、次いで還元することにより、マンノース２糖化合物における還元末端側のマンノースがグリカールに変換したグリカール化合物とし、次に、
（３）得られたグリカール化合物をアジドナイトレーション反応に付し、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに位置する式（ＩＩ）：
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する、各工程を含む方法。 - アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)を製造する請求項２記載の方法において、さらに、
（４）得られたアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物のニトロ基を脱離基に置換し、次いで
（５）得られた脱離基導入体に式：
で示されるアミノ保護グルコピラノシドを反応させ、式（ＩＩＩ）：
で示される３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物を製造する、各工程を含む方法。 - アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)を製造する請求項３記載の方法において、さらに、
（６）得られた３糖化合物の還元末端に保護アスパラギンを結合させ、式（ＩＶ）：
で示されるアスパラギン結合型３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)化合物を製造する方法。 - マンノースβ−１，４−結合を有する多糖類を加水分解し、次いで得られた化合物の水酸基を保護することにより、式(Ｉ)：
で示されるマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する方法。 - 式(Ｉ)：
で示されるマンノース２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物をハロゲン化し、次いで還元することにより、マンノース２糖化合物における還元末端側のマンノースがグリカールに変換したグリカール化合物とし、次に、
得られたグリカール化合物をアジドナイトレーション反応に付し、還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに位置する式（ＩＩ）：
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物を製造する方法。 - 還元末端側のマンノースの２位にアジド基がエカトリアルに位置する式（ＩＩ）：
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物のニトロ基を脱離基に置換し、次いで
得られた脱離基導入体に式：
で示されるアミノ保護グルコピラノシドを反応させ、式（ＩＩＩ）：
で示される３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物を製造する方法。 - 式（ＩＩＩ）：
で示される３糖化合物の還元末端に保護アスパラギンを結合させ、式（ＩＶ）：
で示されるアスパラギン結合型３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)化合物を製造する方法。 - 式（ＩＩ）：
で示されるアジ化２糖（ManP1β1→4ManP1型）化合物。 - 式（ＩＩＩ）：
で示される３糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)化合物。
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