JPWO2005061707A1 - 癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法 - Google Patents
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Abstract
２以上のヒト癌細胞株についてＥｇ５阻害剤に対する感受性と少なくとも１以上のヒト遺伝子の発現量とを測定し、その発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関のある遺伝子を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子として同定する方法。同定されたＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子の中から１以上の遺伝子を選択し、癌細胞における、選択した遺伝子の発現量を測定し、その発現量に応じた点数を割り当てることにより、その癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法。
Description
本発明は、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法、癌患者のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法、および癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングする方法に関する。
種々の抗癌剤による癌化学療法は、癌の治療において最も重要な方法の一つである。抗癌剤によって有効な治療を行うためには、患者における抗癌剤に対する感受性を予測し、適切な薬剤を選抜することが重要である。抗癌剤に対する感受性を決定している遺伝子を見出すことは、感受性予測のための一つの方法である。今までに多くの遺伝子が複数の抗癌剤に対する感受性の決定因子として報告されてきた。例えば、薬剤トランスポーターであるＭＤＲ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，５０６−５１４，１９９０）およびＭＲＰ２（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７，３５３７−３５４７，１９９７；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，４１２４−４１２９，１９９６）、薬物代謝酵素であるチトクロームＰ４５０（以下、ＣＹＰと略す）ファミリー（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，８，１３３５−１３４７，２００２）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１５５４４−１５５４９，１９８６）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，３，３４９−３６６，２００２）などである。さらに、各々の抗癌剤に対する感受性を規定している遺伝子として例えば以下のものが報告されている。γ−グルタミルヒドロラーゼ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，３９２３−３９２７，１９７３，）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｃａｎｃｅｒ，５７，１９１２−１９１７，１９８６）はメトトレキセートに対する耐性因子である。また、チミジレートシンターゼ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，６，１６５３−１６６４，１９８８）、メタロチオネイン（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．，５７，２３３−２４９，１９９１）およびシチジンデアミナーゼ（Ｃａｎｃｅｒ，４０，５０９−５１８，１９７７）の活性増強は、それぞれ５−フルオロウラシル、シスプラチン、シトシンアラビノシドに対する抵抗性因子である。ＤＴ−ジアフォラーゼの活性増強は、マイトマイシンＣに対する感受性因子である（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，６９３６−６９３９，１９９２）。このように、多くの遺伝子が抗癌剤に対する感受性を決定する遺伝子として知られている。しかし、これらの既知の遺伝子だけでは抗癌剤に対する感受性を説明するには不十分であり、さらなる研究が求められている。
一方で、抗癌剤に対する感受性の予測あるいは抗癌剤に対する感受性に関与する遺伝子の予測を、ｃＤＮＡマイクロアレイやＳＮＰｓなどの解析を用いて行う試みも進んでいる。ヒト癌細胞株パネルやヒト癌のゼノグラフトでの遺伝子発現と抗癌剤に対する感受性との相関の解析も報告されている（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２４，２３６−２４４，２０００年；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２，５１８−５２７，２００２；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２，１１３９−１１４７，２００２；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８，１０７８７−１０７９２，２００１；特開２００３−６１６７８）。これらの研究で見出された遺伝子は、抗癌剤に対する感受性予測のマーカーとして使用することができる。さらに、これらの遺伝子のうちの一部は、実際に抗癌剤に対する感受性を決定している可能性がある。
紡錘体機能は細胞分裂時（細胞周期Ｍ期）における中心体の局在や染色体の正確な分離に必須であり、その機能の阻害は、正常な細胞分裂を阻害し癌細胞に細胞死を誘導することが知られている。
Ｍ期キネシンはＭ期紡錘体制御に関わる蛋白質であり、細胞周期のＭ期進行において必須の役割を担っている。これら蛋白質は、ＡＴＰ加水分解により生じたエネルギーを利用して、微小管に沿って蛋白質を移動させる機能を有しており、一般に「分子モーター」と呼ばれる機能蛋白質の一群である。Ｍ期においては、紡錘体の伸長と維持および紡錘体極と呼ばれる構造体形成に深く関わっており、さらに紡錘体微小管に沿った染色体の移動を通して、正しい細胞分裂の進行を制御している。
Ｅｇ５は、進化上保存されたサブファミリーを形成するＭ期キネシンの一つである。ヒト正常組織におけるＥｇ５の発現は、精巣や胸腺などに限定されることが知られており、また、癌患者組織を解析した結果より、非癌部に比べ癌部において高い発現を示すことが報告されている（ＵＳ６４１４１２１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９，４４６５−４４７０，２００２）。
したがってＭ期キネシンＥｇ５は新規Ｍ期作用薬の標的分子として重要であり、その阻害剤は癌などの細胞増殖制御の異常が原因となる疾患の治療剤として有望と考えられる。Ｅｇ５阻害活性を示す化合物としては、モナストロール（ｍｏｎａｓｔｒｏｌ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９７１−９７４，１９９９）、キナゾリン誘導体（ＷＯ０１／９８２７８）、フェナチアジン誘導体（ＷＯ０２／０５７２４４）、トリフェニルメタン誘導体（ＷＯ０２／０５６８８０）、ジヒドロピリミジン誘導体（ＷＯ０２／０７９１４９；ＷＯ０２／０７９１６９）などが報告されている。
Ｍ期紡錘体の構成分子である微小管に作用する抗癌剤の薬剤感受性に関与する因子としては、タキサン類に属するパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）に対しては薬剤トランスポーターであるＭＤＲ１などが報告され（Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，３，１−１９，２００３；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，１５１５−１５１９，２００３）、ＤＮＡマイクロアレイを用いた網羅的な解析も行われている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，２２００−２２０５，２００３）。またビンカアルカロイド系に属するビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）に対しては別のトランスポーターであるＭＲＰ１などが報告されている（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５，６７３−６８０，１９９９）。しかしながら、Ｅｇ５阻害剤の感受性の予測あるいはＥｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子の予測を行った報告は現在までにない。
一方、抗腫瘍活性を示すチアジアゾリン誘導体が知られている（ＷＯ０３／０５１８５４）。また、白血病の治療に有効なシステイン誘導体が知られている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１３，４１４−４１８，１９７０；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３−１６，１９７２）。
一方で、抗癌剤に対する感受性の予測あるいは抗癌剤に対する感受性に関与する遺伝子の予測を、ｃＤＮＡマイクロアレイやＳＮＰｓなどの解析を用いて行う試みも進んでいる。ヒト癌細胞株パネルやヒト癌のゼノグラフトでの遺伝子発現と抗癌剤に対する感受性との相関の解析も報告されている（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２４，２３６−２４４，２０００年；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２，５１８−５２７，２００２；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２，１１３９−１１４７，２００２；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８，１０７８７−１０７９２，２００１；特開２００３−６１６７８）。これらの研究で見出された遺伝子は、抗癌剤に対する感受性予測のマーカーとして使用することができる。さらに、これらの遺伝子のうちの一部は、実際に抗癌剤に対する感受性を決定している可能性がある。
紡錘体機能は細胞分裂時（細胞周期Ｍ期）における中心体の局在や染色体の正確な分離に必須であり、その機能の阻害は、正常な細胞分裂を阻害し癌細胞に細胞死を誘導することが知られている。
Ｍ期キネシンはＭ期紡錘体制御に関わる蛋白質であり、細胞周期のＭ期進行において必須の役割を担っている。これら蛋白質は、ＡＴＰ加水分解により生じたエネルギーを利用して、微小管に沿って蛋白質を移動させる機能を有しており、一般に「分子モーター」と呼ばれる機能蛋白質の一群である。Ｍ期においては、紡錘体の伸長と維持および紡錘体極と呼ばれる構造体形成に深く関わっており、さらに紡錘体微小管に沿った染色体の移動を通して、正しい細胞分裂の進行を制御している。
Ｅｇ５は、進化上保存されたサブファミリーを形成するＭ期キネシンの一つである。ヒト正常組織におけるＥｇ５の発現は、精巣や胸腺などに限定されることが知られており、また、癌患者組織を解析した結果より、非癌部に比べ癌部において高い発現を示すことが報告されている（ＵＳ６４１４１２１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９，４４６５−４４７０，２００２）。
したがってＭ期キネシンＥｇ５は新規Ｍ期作用薬の標的分子として重要であり、その阻害剤は癌などの細胞増殖制御の異常が原因となる疾患の治療剤として有望と考えられる。Ｅｇ５阻害活性を示す化合物としては、モナストロール（ｍｏｎａｓｔｒｏｌ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９７１−９７４，１９９９）、キナゾリン誘導体（ＷＯ０１／９８２７８）、フェナチアジン誘導体（ＷＯ０２／０５７２４４）、トリフェニルメタン誘導体（ＷＯ０２／０５６８８０）、ジヒドロピリミジン誘導体（ＷＯ０２／０７９１４９；ＷＯ０２／０７９１６９）などが報告されている。
Ｍ期紡錘体の構成分子である微小管に作用する抗癌剤の薬剤感受性に関与する因子としては、タキサン類に属するパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）に対しては薬剤トランスポーターであるＭＤＲ１などが報告され（Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，３，１−１９，２００３；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，１５１５−１５１９，２００３）、ＤＮＡマイクロアレイを用いた網羅的な解析も行われている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，２２００−２２０５，２００３）。またビンカアルカロイド系に属するビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）に対しては別のトランスポーターであるＭＲＰ１などが報告されている（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５，６７３−６８０，１９９９）。しかしながら、Ｅｇ５阻害剤の感受性の予測あるいはＥｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子の予測を行った報告は現在までにない。
一方、抗腫瘍活性を示すチアジアゾリン誘導体が知られている（ＷＯ０３／０５１８５４）。また、白血病の治療に有効なシステイン誘導体が知られている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１３，４１４−４１８，１９７０；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３−１６，１９７２）。
本発明の課題は、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法、およびそれらの遺伝子を利用して癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず、３８細胞株よりなるヒト癌細胞株パネルにおいて、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性と１１９種類のヒト遺伝子の発現量を測定した。そして特に肺癌由来の２６株において、発現がＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関のある１９遺伝子を選抜した。また、本発明者らは、それらの遺伝子の発現量から癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を予測する統計学的なモデルを構築し、さらに予測に用いる遺伝子の数を１１までに減少させたモデルの構築にも成功した。
このモデルを利用し、選抜された少数の遺伝子の発現を調べることで、癌患者の抗癌剤に対する感受性を判定する方法を提供することが可能になった。さらに、それらの遺伝子の発現を増加あるいは減少させることで、抗癌剤に対する感受性を増強させる方法、ならびにそれらの抗癌剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングする方法を提供することが可能になった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（５４）に関する。
（１） 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法。
（２） 工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒからなる大腸癌由来の細胞株、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＡＳＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３からなる膵臓癌由来の細胞株、ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３からなる卵巣癌由来の細胞株からなる群から選択される全てあるいは一部の細胞株である、（１）に記載の方法。
（３） 選択される細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株から選択される全てあるいは一部の細胞株である、（２）に記載の方法。
（４） 工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株である（１）に記載の方法。
（５） １つの特定の臓器が肺である（４）に記載の方法。
（６） 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（Ｉ）
＜式中、
Ｒ１およびＲ４は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表し、
Ｒ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−Ｃ（＝Ｗ）Ｒ６［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子を表し、Ｒ６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ７とＲ８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＯＲ９（式中、Ｒ９は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）または−ＳＲ１０（式中、Ｒ１０は前記のＲ９と同義である）を表す］、−ＮＲ１１Ｒ１２｛式中、Ｒ１１およびＲ１２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１３［式中、Ｒ１３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ７ＡＲ８Ａ（式中、Ｒ７ＡおよびＲ８Ａはそれぞれ前記のＲ７およびＲ８と同義である）、−ＯＲ９Ａ（式中、Ｒ９Ａは前記のＲ９と同義である）または−ＳＲ１０Ａ（式中、Ｒ１０Ａは前記のＲ９と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ２Ｒ１４（式中、Ｒ１４は前記のＲ９と同義である）を表すか、またはＲ１とＲ２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、
Ｒ５は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ４とＲ５が一緒になって−（ＣＲ１５ＡＲ１５Ｂ）ｍ１−Ｑ−（ＣＲ１５ＣＲ１５Ｄ）ｍ２−｛式中、Ｑは単結合、置換もしくは非置換のフェニレンまたはシクロアルキレンを表し、ｍ１およびｍ２は同一または異なって０〜４の整数を表すが、ｍ１とｍ２は同時に０とはならず、Ｒ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄは同一または異なって、水素原子、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、−ＯＲ１６［式中、Ｒ１６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＮＲ７ＢＲ８Ｂ（式中、Ｒ７ＢおよびＲ８Ｂは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ７ＢとＲ８Ｂが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＳＯ２ＮＲ７ＣＲ８Ｃ（式中Ｒ７ＣおよびＲ８Ｃはそれぞれ前記のＲ７ＢおよびＲ８Ｂと同義である）または−ＣＯＲ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］、−ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１８およびＲ１９は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＲ２０（式中、Ｒ２０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノまたは置換もしくは非置換のアリールアミノを表す）または−ＳＯ２Ｒ２１（式中、Ｒ２１は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］または−ＣＯ２Ｒ２２（式中、Ｒ２２は前記のＲ１７と同義である）を表すか、またはＲ１５ＡとＲ１５ＢまたはＲ１５ＣとＲ１５Ｄが一緒になって酸素原子を表し、ｍ１またはｍ２が２以上の整数であるとき、それぞれのＨ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄは同一でも異なっていてもよく、隣接するふたつの炭素原子に結合するＲ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄはそれぞれ一緒になって結合を形成してもよい｝を表し、
Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝ＷＡ）Ｒ２３（式中、ＷＡおよびＲ２３はそれぞれ前記のＷおよびＲ６と同義である）を表す＞で表されるチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７） Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６Ａ（式中、Ｒ６Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ３が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２３Ａ（式中、Ｒ２３Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ４が置換低級アルキルであり、Ｒ５がフェニルである（６）に記載の方法。
（８） Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎａＮＨＳＯ２Ｒａ（式中、ｎａは１または２であり、Ｒａは置換もしくは非置換の低級アルキルを表す）である（６）または（７）に記載の方法。
（９） 一般式（Ｉ）で表されるチアジアゾリン誘導体が下記式（Ａ）〜（Ｃ）および（Ｅ）〜（Ｐ）で表される化合物からなる群から選択される化合物である（６）に記載の方法。
（１０） 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（ＩＩ）
（式中、Ｒ２４は置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｒ２５およびＲ２６は同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表すか、またはＲ２５とＲ２６が一緒になって酸素原子、硫黄原子または結合を表す）で表されるシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（１１） システイン誘導体がＬ−システイン誘導体である（１０）に記載の方法。
（１２） Ｒ２４がフェニル、４−メチルフェニル、２−ナフチル、４−ピリジル、または１，３−ベンゾジオキソール−５−イルであり、Ｒ２５およびＲ２６が同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはヒドロキシメチルである（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３） 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、下記式（Ｑ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（１４） 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程
（ａ）（１）から（１３）のいずれか１項に記載の方法により同定された遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に応じた点数を決定する工程、
（ｂ）被験癌細胞について、工程（ａ）で選択された遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程、
（ｄ）選択された全遺伝子についての割り当てられた点数から、被験癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の指標となる数値を求める工程、
（ｅ）あらかじめ決定した閾値と（ｄ）で得られた数値とを比較する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法。
（１５） 工程（ａ）で選択する遺伝子が、以下の（ｉ）〜（ｘｉｘ）それぞれの遺伝子からなる遺伝子群から選択される１以上の遺伝子である（１４）に記載の方法。
（ｉ）チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＣＹＰ２４Ａ１）
（ｉｉ）レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＯＢＲＧＲＰ）
（ｉｉｉ）Ｂ因子（ＢＦ）
（ｉｖ）アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）
（ｖ）バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＢＩＲＣ３）
（ｖｉ）シーケストソーム１（ＳＱＳＴＭ１）
（ｖｉｉ）腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＴＮＦＡＩＰ２）
（ｖｉｉｉ）膜内在性蛋白質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）
（ｉｘ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＡＢＣＣ２）
（ｘ）アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）
（ｘｉ）相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＦＡＭ３Ｃ）
（ｘｉｉ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＡＢＣＣ３）
（ｘｉｉｉ）仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＢＣ００７４３６）
（ｘｉｖ）微小管関連蛋白質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）
（ｘｖ）サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
（ｘｖｉ）ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＨＳＰＣＡ）
（ｘｖｉｉ）サイクリンＢ２（ＣＣＮＢ２）
（ｘｖｉｉｉ）仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＦＬＪ２３２６９）
（ｘｉｘ）溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＳＬＣ１２Ａ２）
（１６） （ａ）の工程で選択される遺伝子が、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９である（１５）に記載の方法。
（１７） Ｅｇ５阻害剤が、（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８） Ｅｇ５阻害剤が、（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１９） Ｅｇ５阻害剤が、（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（２０） 癌細胞が肺癌細胞である（１４）から（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２３） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをノーザンブロットにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２４） （２２）に記載の方法において使用するための、該ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡの定量試薬。
（２５） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を免疫化学的方法により定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２６） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をＥＬＩＳＡにより定量することにより行う、（２５）に記載の方法。
（２７） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をウエスタンブロットにより定量することにより行う、（２５）に記載の方法。
（２８） （２５）から（２７）のいずれか１項に記載の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬。
（２９） ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（３０） 細胞が肺癌細胞である（２９）に記載の感受性増強薬。
（３１） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３２） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３３） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３４） 細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を増加させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
（３５） 細胞が肺癌細胞である（３４）に記載のスクリーニング方法。
（３６） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３７） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３８） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３９） ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４０） 癌細胞が肺癌細胞である（３９）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４１） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４２） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４３） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４４） （３９）から（４３）のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクター。
（４５） （３９）から（４３）のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは（４４）に記載のベクターを含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（４６） ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択されるいずれかの遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子にコードされる蛋白質に対する抗体を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（４７） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（４８） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（４９） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（５０） 細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を減少させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
（５１） 細胞が肺癌細胞である（５０）に記載のスクリーニング方法。
（５２） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
（５３） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
（５４） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
以下、一般式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）といい、一般式（ＩＩ）で表される化合物を化合物（ＩＩ）という。さらに一般式（Ａ）で表される化合物を化合物Ａという。他の式番号の化合物についても同様である。
以下に本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
（Ａ）癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法
本発明のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子の同定方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程が含まれる。
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程
（１）ヒト癌細胞株
本発明で測定に用いるヒト癌細胞株は、ヒト由来の癌細胞株であれば、いずれの細胞株でもよいが、細胞株の種類が多いほど、上記工程（ｂ）の相関解析の際に、得られた相関値が有意である可能性が高くなるので好ましい。具体的な細胞株のパネルとしては、肺癌由来の２６細胞株であるＡ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９、大腸癌由来の６細胞株であるＣｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒ、膵臓癌由来の４細胞株であるＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３、卵巣癌由来の２細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３の細胞株からなるパネルの全部あるいは一部を用いることができる。
また、臓器により、発現する遺伝子およびその遺伝子の機能の細胞に対する重要性が異なるので、癌細胞が由来する臓器によって、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子が異なることが考えられる。したがって、測定に用いる細胞株を、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株にすることにより、その臓器の癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性により特異的に関与する遺伝子を同定することができる。たとえば、Ｅｇ５阻害剤を肺癌の治療に用いる場合のように、肺癌細胞のＥｇ５阻害剤の感受性に関する遺伝子を特に同定したい場合、肺癌細胞株だけ、例えば、肺癌由来の２６細胞株であるＡ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９の全部あるいは一部を用いて測定を行うことにより、肺癌細胞のＥｇ５阻害剤の感受性に関する遺伝子を同定することができる。
（２）Ｅｇ５阻害剤
本発明で用いるＥｇ５阻害剤は、Ｅｇ５阻害作用を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、ＷＯ２００４／０９２１４７に記載の化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物（ＩＩ）またはその薬理学的に許容される塩、ＷＯ０１／０３０７６８、ＷＯ０１／０９８２７８などに記載の化合物Ｑ（ＳＢ−７１５９９２）またはその薬理学的に許容される塩、ＷＯ０２／０５７２４４、ＷＯ０３／０９４８３９、ＷＯ０３／０９７０５３、ＷＯ０３／１０３５７５、ＷＯ０３／１０６４２６、ＷＯ０４／００６８６５、ＷＯ０４／００９０３６、ＷＯ０４／０２４０８６、ＷＯ０４／０３２８４０、ＷＯ０４／０３４９７２、ＷＯ０３／０３９４６０、ＷＯ０３／０４９５２７、ＷＯ０３／０５０１２２、ＷＯ０３／０５００６４、ＷＯ０３／０４９６７８、ＷＯ０３／０４９６７９、ＷＯ０３／０７９９７３、ＷＯ０３／０９９２１１、ＷＯ０３／１０５８５５、ＷＯ０４／０３７１７１、ＷＯ０４／０３９７７４、ＷＯ０４／０５８７００、ＷＯ０４／０５８１４８、ＷＯ０２／０７８６３９、ＷＯ０２／０７９１４９、ＷＯ０２／０７９１６９、ＷＯ０３／０９９２８６、ＷＯ０４／０７８７５８などに記載の化合物などがあげられ、好ましくは化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物（ＩＩ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物Ｑまたはその薬理学的に許容される塩などがあげられる。
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の各基の定義において、
（ｉ）低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルアミノおよびジ低級アルキルアミノの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数１〜１０のアルキル、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどがあげられる。
ジ低級アルキルアミノの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい。
（ｉｉ）低級アルケニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルケニル、具体的にはビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニルなどがあげられる。
（ｉｉｉ）低級アルキニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルキニル、具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニルなどがあげられる。
（ｉｖ）シクロアルキルとしては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキル、具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどがあげられる。
（ｖ）アリール、アリールオキシおよびアリールアミノのアリール部分としては、例えばフェニル、ナフチルなどがあげられる。
（ｖｉ）複素環基としては、例えば脂肪族複素環基、芳香族複素環基などがあげられる。脂肪族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性脂肪族複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性脂肪族複素環基などがあげられ、具体的にはピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジノ、モルホリノ、オキサゾリニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、１−デカヒドロキシイソキノリニルなどがあげられる。芳香族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性芳香族複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性芳香族複素環基などがあげられ、具体的にはフリル、チエニル、ベンゾチエニル、ピロリル、ピリジル、ピラジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリミジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、ピラニル、１，３−ベンゾジオキソール−５−イルなどがあげられる。
（ｖｉｉ）芳香族複素環基としては、上記（ｖｉ）であげた芳香族複素環基があげられる。
（ｖｉｉｉ）隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも１個の窒素原子を含む脂肪族複素環基などがあげられる。該少なくとも１個の窒素原子を含む脂肪族複素環基は、酸素原子、硫黄原子または他の窒素原子を含んでもいてよく、例えばピロリジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、ピラゾリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アジリジニル、アゼチジニル、ペルヒドロアゼピニル、ペルヒドロアゾシニル、スクシンイミジル、ピロリドニル、グルタルイミジル、ピペリドニルなどがあげられる。
（ｉｘ）シクロアルキレンとしては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキレン、具体的にはシクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレンなどがあげられる。
（ｘ）フェニレンとしては、１，４−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，２−フェニレンがあげられる。
（ｘｉ）ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。
（ｘｉｉ）置換低級アルキル、置換低級アルコキシ、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換シクロアルキル、置換低級アルキルアミノおよび置換ジ低級アルキルアミノにおける置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、アジド、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＣＯＮＲ２７Ｒ２８＜式中、Ｒ２７およびＲ２８は同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル｛該置換低級アルキルにおける置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、低級アルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、ハロゲン、−ＣＯＮＲ２９Ｒ３０［式中、Ｒ２９およびＲ３０は同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ａ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アリール、複素環基、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノなどがあげられる）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ２９とＲ３０が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する］、−ＮＲ３１Ｒ３２［式中、Ｒ３１およびＲ３２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は前記置換低級アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ３１とＲ３２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する］などがあげられる｝、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシ（該置換低級アルコキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル（該置換アリールオキシカルボニルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ２７とＲ２８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する＞、−ＣＯ２Ｒ３３｛式中、Ｒ３３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル［該置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＣＯＮＲ３４Ｒ３５（式中、Ｒ３４およびＲ３５はそれぞれ前記Ｒ２９およびＲ３０と同義である）、−ＮＲ３６Ｒ３７（式中、Ｒ３６およびＲ３７はそれぞれ前記Ｒ３１およびＲ３２と同義である）などがあげられる］置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す｝、−ＣＯＲ３８（式中、Ｒ３８は前記Ｒ３３と同義である）、−ＮＲ３９Ｒ４０＜式中、Ｒ３９およびＲ４０は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル｛該置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＲ４１（式中、ｎは１〜１５の整数を表し、Ｒ４１は低級アルキルを表す）、−ＣＯＮＲ４２Ｒ４３（式中、Ｒ４２およびＲ４３はそれぞれ前記Ｒ２９およびＲ３０と同義である）、−ＳＯ２Ｒ４４［式中、Ｒ４４は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す］、−ＮＲ４５Ｒ４６（式中、Ｒ４５およびＲ４６はそれぞれ前記Ｒ３１およびＲ３２と同義である）などがあげられる｝、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、−ＣＯＲ４７｛式中、Ｒ４７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＮＲ４８Ｒ４９（式中、Ｒ４８およびＲ４９はそれぞれ前記のＲ３１およびＲ３２と同義である）または−ＯＲ５０［式中、Ｒ５０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ２Ｒ５１（式中、Ｒ５１は前記Ｒ４７と同義である）を表すか、またはＲ３９とＲ４０が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する＞、−Ｎ＋Ｒ５２Ｒ５３Ｒ５４Ｘ−（式中、Ｒ５２およびＲ５３は同一または異なって、低級アルキルを表すか、またはＲ５２とＲ５３が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成し、Ｒ５４は低級アルキルを表し、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素の各原子を表す）、−ＯＲ５５｛式中、Ｒ５５は置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）または−ＣＯＲ５６（式中、Ｒ５６は前記Ｒ４７と同義である）を表す｝、−ＳＲ５７（式中、Ｒ５７は前記Ｒ５５と同義である）、−ＳＯ２Ｒ５８［式中、Ｒ５８は置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）または−ＮＲ５９Ｒ６０（式中、Ｒ５９およびＲ６０はそれぞれ前記Ｒ３１およびＲ３２と同義である）を表す］−ＯＳＯ２Ｒ６１（式中、Ｒ６１は前記Ｒ５８と同義である）などがあげられる。
ここで示した低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、アリール、アロイルおよびアリールオキシカルボニルのアリール部分、複素環基、隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基ならびにハロゲンは、それぞれ前記低級アルキル（ｉ）、低級アルケニル（ｉｉ）、低級アルキニル（ｉｉｉ）、シクロアルキル（ｉｖ）、アリール（ｖ）、複素環基（ｖｉ）、隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基（ｖｉｉｉ）およびハロゲン（ｘｉ）と同義である。また、ここで示したアラルキルオキシカルボニルのアラルキル部分（ｘｉｉｉ）としては、例えば炭素数７〜１５のアラルキル、具体的にはベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチルなどがあげられる。
（ｘｉｖ）置換アリール、置換アリールオキシ、置換アリールアミノ、置換フェニレン、置換複素環基のうちの置換芳香族複素環基および置換芳香族複素環基における置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ホルミル、メチレンジオキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アリール、複素環基などがあげられる）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシ（該置換低級アルコキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルチオ（該置換低級アルキルチオにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ（該置換低級アルキルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノ（該置換ジ低級アルキルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルオキシ（該置換低級アルカノイルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルアミノ（該置換低級アルカノイルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルチオ（該置換低級アルカノイルチオにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノカルボニル（該置換低級アルキルアミノカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該置換低級アルキルアミノカルボニルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノカルボニル（該置換ジ低級アルキルアミノカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル（該置換低級アルコキシカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該置換ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換、アリールにおける置換基（ｅ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノなどがあげられる）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールスルホニル（該置換アリールスルホニルにおける置換基は前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールオキシ（該置換アリールオキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールアミノ（該置換アリールアミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールチオ（該置換アリールチオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルオキシ（該置換アロイルオキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルチオ（該置換アロイルチオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルアミノ（該置換アロイルアミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環アミノ（該置換複素環アミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環オキシ（該置換複素環オキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環チオ（該置換複素環チオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）などがあげられる。
ここで示した低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ（該ジ低級アルキルアミノの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、低級アルカノイル、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルカノイルチオ、低級アルキルアミノカルボニル、低級アルキルアミノカルボニルオキシ、ジ低級アルキルアミノカルボニル（該ジ低級アルキルアミノカルボニルの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、低級アルコキシカルボニルおよびジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）の低級アルキル部分は前記の低級アルキル（ｉ）と同義であり低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキルおよびハロゲンはそれぞれ前記の低級アルケニル（ｉｉ）、低級アルキニル（ｉｉｉ）、シクロアルキル（ｉｖ）およびハロゲン（ｘｉ）と同義である。さらにここで示したアリール、アリールスルホニル、アリールオキシ、アリールチオ、アリールアミノ、アロイル、アロイルオキシ、アロイルチオおよびアロイルアミノのアリール部分は前記のアリール（ｖ）と同義であり、複素環基、複素環アミノ、複素環オキシおよび複素環チオの複素環基部分は前記の複素環基（ｖｉ）と同義である。
（ｘｖ）置換複素環基のうちの置換脂肪族複素環基および隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基としては、前記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）の定義であげた基に加え、オキソなどがあげられる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの薬理学的に許容される塩は、例えば薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩などを包含する。化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの薬理学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機酸塩などがあげられ、薬理学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などがあげられ、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩があげられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジンなどの付加塩があげられ、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの付加塩があげられる。
化合物（Ｉ）は、ＷＯ０３／０５１８５４またはＷＯ２００４／０９２１４７に記載の方法、あるいはそれに準じて製造することができる。
化合物（ＩＩ）は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１３，４１４−４１８，１９７０またはＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３−１６，１９７２に記載の方法、あるいはそれらに準じて製造することができる。
化合物Ｑは、例えばＷＯ０３／０７０７０１に記載の方法またはそれに準じて製造することができる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの中には、位置異性体、幾何異性体、光学異性体、互変異性体などの立体異性体が存在し得るものもあるが、本発明の遺伝子を同定する方法などには、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を使用することができる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの塩を取得したいとき、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱが塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱを適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えることにより塩を形成させて単離、精製すればよい。
また、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱならびにその薬理学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の遺伝子を同定する方法などに使用することができる。
化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の具体例を第１表および第２表に示す。
次に、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）のＥｇ５阻害作用について、試験例を用いて説明する。
試験例１ 免疫細胞化学染色によるＭ期細胞表現型解析
免疫細胞化学染色によるＭ期細胞表現型解析は文献（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，５３０３−５３１３，２０００）を参考にして実施した。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１８５）を被験化合物とともに１７時間培養した。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄後、−２０℃で保冷したメタノールで１分間処理し、細胞を固定化した。ＰＢＳで洗浄後、０．２％トリトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を含むＰＢＳで１５分間浸透化した。ＰＢＳで洗浄後、ブロッキング溶液（１％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）で３０分間ブロッキングし、１次抗体溶液｛０．２％マウスモノクローナル抗α−チューブリン抗体〔シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、カタログ番号Ｔ９０２６〕および０．２％ウサギ抗γ−チューブリン抗体（シグマ・アルドリッチ社、カタログ番号Ｔ３５５９）を含むブロッキング溶液｝と３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体溶液｛０．０２５％アレクサ・フロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）５４６結合抗マウスＩｇＧ抗体〔モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社、カタログ番号Ａ−１１０３０〕、０．５％アレクサ・フロー４８８結合抗ウサギＩｇＧ抗体（モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ａ−１１０３４）および１μｍｏｌ／ｌヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２を含むブロッキング溶液｝と３０分間反応させ、微小管、中心体および染色体を可視化した。倒立蛍光顕微鏡を用いてＭ期の細胞の表現型を観察した。被験化合物として化合物Ａまたは化合物Ｄ〔アクロス（Ａｃｒｏｓ）社〕を用いた場合、化合物Ａおよび化合物ＤによりＭ期に集積した細胞は、単星状微小管（モナストラル・マイクロチューブル・アレイ）、単極性中心体（モノポーラー・スピンドル）、環状に分布した染色体の局在、という特徴的な表現型を示した。このようなＭ期の表現型は文献に記載されたＥｇ５に対する中和抗体（Ｃｅｌｌ，８３，１１５９−１１６９，１９９５）やＥｇ５特異的阻害剤モナストロール（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９７１−９７４，１９９９）で処理した細胞と同様な表現型であった。
以上の結果から、化合物Ａおよび化合物ＤはＥｇ５を阻害することが示唆された。
試験例２ Ｅｇ５の酵素活性に対する阻害試験
全長ヒトＥｇ５組換体の調製は文献（Ｃｅｌｌ，８３，１１５９−１１６９，１９９５）を参考にして実施した。ＨｉｓタグをＮ末端に融合した全長ヒトＥｇ５を発現するバキュロウイルスをスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９昆虫細胞に感染させ、培養後、培養液を遠心して細胞を回収した。回収した細胞をバッファーに懸濁し、遠心により上清を回収した。上清をニッケルアガロースカラムに通塔し、ＨｉｓタグをＮ末端に融合したＥｇ５をアフィニティー精製して部分精製標品を取得した。
Ｅｇ５のＡＴＰａｓｅ活性の測定は文献（ＥＭＢＯ Ｊ．，１３，７５１−７５７，１９９４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，４８８４−４８８７，１９９２）を参考にして実施した。段階的に希釈した被験化合物とともに、２５ｍｍｏｌ／ｌピペラジンＮ，Ｎ’−ビス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）／ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、１ｍｍｏｌ／ｌエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５μｍｏｌ／ｌパクリタキセル、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２５μｇ／ｍｌチューブリン〔サイトスケルトン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）社、カタログ番号ＴＬ２３８〕、２００μｍｏｌ／ｌ ２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボサイド（ＭＥＳＧ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ｅ−６６４６）、１Ｕ／ｍｌプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ｅ−６６４６）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ、１２．５μｇ／ｍｌ Ｅｇ５部分精製標品から構成される反応溶液で酵素反応を行った。酵素反応は３０℃で３０分間実施した。ＡＴＰａｓｅ活性の指標となる３６０ｎｍでの吸光度をプレートリーダー〔モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）社、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ３８４〕で測定した。Ｅｇ５存在下、化合物非存在下での吸光度を１００％、Ｅｇ５非存在下、化合物非存在下の吸光度を０％として相対活性を計算し、ＩＣ５０値を算出した。
被験化合物として化合物Ａまたは化合物Ｄを用いて測定した場合、化合物Ａおよび化合物Ｄは濃度依存的にＥｇ５のＡＴＰａｓｅ活性を阻害し、そのＩＣ５０値は化合物Ａが２μｍｏｌ／ｌ、化合物Ｄは０．８μｍｏｌ／ｌであった。
以上、試験例１および試験例２の結果から、化合物Ａおよび化合物ＤはＥｇ５阻害作用を有することが示された。すなわち、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）はＥｇ５阻害剤として利用できることが示された。
（３）抗癌剤に対する感受性の測定法
本発明における、癌細胞の抗癌剤に対する感受性の測定法としては、Ｅｇ５阻害剤と（１）のヒト癌細胞を一定期間接触させた後、該細胞について、生細胞数、ＤＮＡ合成速度または総蛋白質量を測定する方法があげられる。感受性は例えば、種々の濃度のＥｇ５阻害剤について上記の測定を行い、Ｅｇ５阻害剤の濃度と測定値との相関を表す検量線を作成し、Ｅｇ５阻害剤を接触させなかった細胞について同様に測定したときの値を１００％としたときの５０％に相当する値を与えるＥｇ５阻害剤の濃度（ＧＩ５０）、またはＧＩ５０の濃度をｍｏｌ／ｌで表したときのその対数（ｌｏｇ１０ＧＩ５０）もしくは−ｌｏｇ１０ＧＩ５０で表すことができる。生細胞数は、ＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３，１９８３）、ＸＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４２，２５７−２６５，１９９１）などの発色反応を利用した方法で測定することができる。また、ＤＮＡ合成速度は、３Ｈで標識したチミジンの細胞への取り込みを測定することなどにより、測定することができる。総蛋白質量は、スルフォローダミンＢアッセイ法などにより測定できる。
（４）遺伝子の発現量の測定
本発明における遺伝子の発現量の測定は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡまたは遺伝子産物である蛋白質を定量することにより行うことができる。
（ｉ）ＲＮＡまたは蛋白質の抽出
（１）のヒト癌細胞株から以下の一般的な方法でＲＮＡまたは蛋白質を抽出できる。ＲＮＡの場合、例えばトリゾル（ＴＲＩＺＯＬ）試薬〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社〕を用いた場合、添付の操作法に従って行えばよい。蛋白質の場合、例えばＴｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）などの成書に従って行えばよい。
（ｉｉ）ｍＲＮＡの定量
ｍＲＮＡの定量は（１）で抽出したＲＮＡを測定試料として、ＤＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲなどの技術により行うことができる。また、ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用するための、該ＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡの定量試薬も本発明の範囲に含まれる。
（ｉｉｉ）蛋白質の定量
蛋白質の定量は特異的抗体を用いた免疫化学的定量法によって行うことができる。蛋白質に対する抗体は、例えば成書Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）に記載の方法に従って、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を作製することができる。また、市販の抗体が利用可能な場合は、特異性を確認の上、使用することもできる。得られた抗体を用いて、成書（例えば「酵素免疫測定法」医学書院（１９８２））に記載の方法に従って、ＥＬＩＳＡあるいはＲＩＡ、ウェスタンブロットを行い、蛋白質を定量することができる。また、上記の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬も本発明の範囲に含まれる。
遺伝子の発現量は、上記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の方法で測定された、一定量のＲＮＡまたは蛋白質あたりのシグナル強度またはその対数で表される。ＲＴ−ＰＣＲの一種であるリアルタイムＰＣＲでｍＲＮＡを定量した場合は、増幅反応が対数的に進行する、あるシグナル強度に達するまでの反応サイクル数（Ｃｔ値）で表すこともできる。
（５）遺伝子の選抜
本発明では、各遺伝子ごとに、各細胞株における発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関を解析し、その発現量と細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関のある遺伝子を選抜する。ここで行なう相関解析は、遺伝子の発現量およびＥｇ５阻害剤に対する感受性がシグナル強度の対数、Ｃｔ値、ＧＩ５０の対数などで表される場合には、その数値は正規分布になると仮定し、例えばピアソンの相関係数（以下、単に相関係数ともいう）を計算することによって行うことができる。相関の有無は、相関係数が０であるかどうかで決定され、相関係数が０の場合は相関はなく、０でなければ相関があるといえる。また、相関係数は１から−１の間の値を取るが、相関係数の絶対値が１に近いほど相関が高く、０に近いほど相関が低いといえる。なお、得られた相関係数の有意性は、帰無仮説に基づいて標本数から求められるＰ値（母集団の相関係数が０になる確率）により検定できる。例えば、Ｐ値＜０．０５であれば、その相関係数は５％の有意水準で有意であるといえる。 以上のようにして選抜される、その発現量がＥｇ５阻害剤に対する感受性と負の相関のある遺伝子、すなわちＥｇ５阻害剤に対する感受性が高い細胞ほどその発現量が低い遺伝子（以下、耐性遺伝子ともいう）の例として、以下の１２遺伝子があげられる。
（ｉ）ＣＹＰ２４Ａ１：チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＮＭ＿０００７８２）
（ｉｉ）ＯＢＲＧＲＰ：レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＮＭ＿０１７５２６）
（ｉｉｉ）ＢＦ：Ｂ因子（ＮＭ＿００１７１０）
（ｉｖ）ＡＰＲＴ：アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＮＭ＿０００４８５）
（ｖ）ＢＩＲＣ３：バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＮＭ＿００１１６５）
（ｖｉ）ＳＱＳＴＭ１：シーケストソーム１（ＮＭ＿００３９００）
（ｖｉｉ）ＴＮＦＡＩＰ２：腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＮＭ＿００６２９１）
（ｖｉｉｉ）ＩＴＭ２Ｂ：膜内在性蛋白質２Ｂ（ＮＭ＿０２１９９９）
（ｉｘ）ＡＢＣＣ２：ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＮＭ＿０００３９２）
（ｘ）ＡＮＸＡ３：アネキシンＡ３（ＮＭ＿００５１３９）
（ｘｉ）ＦＡＭ３Ｃ：相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＮＭ＿０１４８８８）
（ｘｉｉ）ＡＢＣＣ３：ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＮＭ＿００３７８６）
また、正の相関のある遺伝子、すなわちＥｇ５阻害剤に対する感受性が高い細胞ほどその発現量も高い遺伝子（以下、感受性遺伝子ともいう）の例として、以下の７遺伝子があげられる。
（ｉ）ＢＣＯ０７４３６：仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＸＭ＿０３７３１７）
（ｉｉ）ＭＡＰ１Ｂ：微小管関連蛋白質１Ｂ（ＮＭ＿００５９０９）
（ｉｉｉ）ＣＣＮＢ１：サイクリンＢ１（ＮＭ＿０３１９６６）
（ｉｖ）ＨＳＰＣＡ：ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＢＣ０２３００６）
（ｖ）ＣＣＮＢ２：サイクリンＢ２（ＮＭ＿００４７０１）
（ｖｉｉ）ＦＬＪ２３２６９：仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＡＫ０２６９２２）
（ｖｉｉ）ＳＬＣ１２Ａ２：溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＮＭ＿００１０４６）
これらの遺伝子は、かっこ内に示したＤＮＡ配列データーベースＧｅｎＢａｎｋの登録番号の配列を有する遺伝子として規定される。
あるＥｇ５阻害剤を用いて、その発現量がＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関のある遺伝子と同定された遺伝子は、そのＥｇ５阻害剤だけでなく、他のＥｇ５阻害剤に対する感受性とも相関のある遺伝子と考えられる。
（Ｂ）癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法
本発明はさらに、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法を提供する。判定の方法としては、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法があげられる。
（ａ）上記（Ａ）の方法により同定した遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に対応した点数を決定する工程
（ｂ）感受性を判定する癌細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程
（ｄ）選択された全遺伝子について割り当てられた点数から感受性の指標となる数値を求める工程
（ｅ）予め決定した閾値と（ｄ）で求めた数値とを比較することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を判定するという工程
上記点数の決定、感受性の指標となる数値の計算、閾値との比較は、重回帰分析、判別分析、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）法、主成分分析、自己組織化マップ法などの多変量解析の手法（ＳＡＳによる実験データの解析、竹内啓監修、東京大学出版会、１９９０などに記載）を用いることで行うことができる。
以下に、重回帰分析を用いた場合の各工程を説明する。選択した遺伝子がｎ個、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性Ｙを−ｌｏｇ１０ＧＩ５０で、各遺伝子の発現量をＣｔ値あるいはシグナル強度の対数で表した場合、重回帰分析モデルでは、遺伝子の発現量Ｘを説明変量として、以下の式１で目的変量である感受性Ｙを表すことができる。
Ｙ＝ａ１Ｘ１＋ａ２Ｘ２＋・・・・＋ａｎＸｎ＋ｂ （式１）
Ｙ：目的変量（感受性：−ｌｏｇ１０ＧＩ５０）
Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎ：説明変量（遺伝子の発現量：Ｃｔ値あるいはシグナル強度の対数）
ａ１、ａ２、…ａｎ：偏回帰係数
ｂ：定数項
以下、各遺伝子の発現量をＣｔ値で表した場合で説明するが、シグナル強度の対数を用いた場合もＣｔ値の代わりにシグナル強度の対数を用いて同様にして判定を行うことができる。
この式にｎ＋１種類の細胞株についての感受性Ｙ（−ｌｏｇ１０ＧＩ５０）および各遺伝子の発現量Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎ（Ｃｔ値）を実測した値をそれぞれ代入することにより、ｎ＋１個の一次線形多項式を作成し、これらの一次線形多項式を解くことにより、各遺伝子についての偏回帰係数ａ１、ａ２、…ａｎおよび定数項ｂを求めることができる。この方法で用いる遺伝子は、上記（Ａ）の方法により同定した遺伝子群から、任意に選ぶことができるが、Ｃｐ統計量、自由度調整ずみ決定係数、赤池の情報量基準などの基準用の統計量を最適化の指標として、指標が小さくなるように遺伝子を選択していくことが望ましい。このようにして、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に重要な遺伝子を選択することにより、複雑さを抑えながら、予測精度を上げること、すなわち最適化を行うことができる。重回帰分析モデルの場合、各遺伝子の点数は、上記で得られた偏回帰係数と遺伝子の発現量の積として表される。
重回帰分析モデルを最適化した場合に選択される、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に重要な遺伝子の例としては、（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関がある遺伝子としてあげた１９遺伝子から選択された、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９があげられる。
以上のようにして選択した遺伝子の、感受性を判定する癌細胞における発現量（Ｃｔ値）は、上記（Ａ）（３）に記載した方法により測定することができる。得られた各遺伝子のＣｔ値から、上述した各遺伝子の点数、すなわち上記で得られた偏回帰係数ａとそのＣｔ値の積を割り当てる。式１に基づき、割り当てられた各遺伝子の点数の合計に定数項ｂの値を加えることにより、感受性の指標となる数値−ｌｏｇ１０ＧＩ５０が求められる。したがって、−ｌｏｇ１０ＧＩ５０の閾値として、例えば、上記（Ａ）の遺伝子の選抜の際に測定した、各癌細胞の感受性の指標となる数値（−ｌｏｇ１０ＧＩ５０）の平均値など、適当なある数値を設定し、その閾値と比較することにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定することができる。
癌細胞として、癌患者から生検などにより取り出した癌組織由来の癌細胞を用いることにより、その癌患者の癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定することができる。その癌患者由来の癌細胞が、Ｅｇ５阻害剤に感受性が高いと判定された場合に、Ｅｇ５阻害剤を治療に用いることにより、効果的に治療を行うことができる。
（Ｃ）癌細胞の感受性を規定する遺伝子の選択
（Ａ）の方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関があると判断された遺伝子が、実際に感受性を規定しているか、すなわち遺伝子の発現量を変化させることによりＥｇ５阻害剤に対する感受性を変化させることができるかを調べるには、以下の方法を用いることができる。
（１）遺伝子の強制発現
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に正の相関がある遺伝子群から選ばれた遺伝子蛋白質コード領域を含むｃＤＮＡを適当な動物細胞の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを癌細胞に導入することで、該遺伝子を強制発現させその発現量を上げることができる。この癌細胞にＥｇ５阻害剤を添加しＥｇ５阻害剤に対する感受性を測定する。発現ベクターを導入しない場合と比較してＥｇ５阻害剤に対する感受性が高くなる場合には、その遺伝子は癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子であり、その発現量を上げることにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することができる遺伝子であることがわかる。
発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２〔クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社〕、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社〕、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社）、ｐＭＳＧ〔アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社〕、ｐＡＭｏ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７，１９９３）などを例示することができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などをあげることができる。
（２）遺伝子の発現抑制
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に負の相関がある遺伝子群から選ばれた遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスポリヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの発現ベクターを癌細胞に導入することで、該遺伝子の発現を抑制し、その発現量を下げることができる。この癌細胞にＥｇ５阻害剤を添加し、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を測定する。遺伝子発現を抑制しない場合と比較してＥｇ５阻害剤に対する感受性が高くなる場合には、その遺伝子は癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子であり、その発現量を下げることにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することができる遺伝子であることがわかる。
ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドの発現ベクターは下記（Ｅ）に記載に基づいて作製および癌細胞への導入を行うことができる。
（Ｄ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬（ｉ）
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性の間に正の相関がある遺伝子、例えばＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２の中から選択される単独または複数の遺伝子であって、上記（Ｃ）の（１）に記載した方法により癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子を含有する遺伝子治療薬は、該Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として用いることができる。また、該遺伝子の強制発現の結果、癌細胞における該遺伝子がコードする蛋白質の量が増加することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性が増強されると考えられるので、該遺伝子がコードする蛋白質を含有する蛋白製剤は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として使用することができる。
上記したＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。このような医薬製剤の詳細については、本明細書中の（Ｇ）に後記する。
（Ｅ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬（ｉｉ）
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性の間に負の相関がある遺伝子、例えばＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３の中から選択される単独または複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは該ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターは、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として使用することができる。また、その感受性の増強は、該遺伝子がコードする蛋白質の機能が関与していると考えられるので、該遺伝子がコードする蛋白質に対する抗体、好ましくは該蛋白質の機能を抑制する中和抗体を含有する薬剤は、該Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として用いることができる。
次に本発明で用いるｓｉＲＮＡについて説明する。ｓｉＲＮＡとは、ある標的遺伝子のｍＲＮＡの一部の配列とその相補的な配列を含む短い二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により、該遺伝子の発現を抑制できるものをいう。ｓｉＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡの塩基配列から文献（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１３，３１９１−３１９７，１９９９）の条件に基づいて適宜設計することができる。好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳領域中の開始コドンより５０〜１００塩基下流の領域中で、ＡＡに続く１９塩基、ＧＣ含量が３０〜７０％、より好ましくは５０％前後の配列を選択する。選択した１９塩基の配列および相補的な配列それぞれの３’端にＴＴを付加した配列を有する２本のＲＮＡをＤＮＡ合成機により合成し、アニーリングすることによりｓｉＲＮＡを作製できる。また、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０−Ｕ６〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社〕、ｐＳＵＰＥＲ〔オリゴエンジン（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）社〕などのｓｉＲＮＡ発現用ベクターに上記の選択した１９塩基の配列に相当するＤＮＡを挿入することにより、該遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡを発現するベクターを作製することができる。
また、本発明で用いるアンチセンスポリヌクレオチドとは、標的遺伝子の塩基配列中の連続した１５塩基以上の配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチドの誘導体が含まれる。ポリヌクレオチド誘導体としては、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたポリヌクレオチド誘導体、あるいはポリヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたポリヌクレオチド誘導体などをあげることができる。
アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術（バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２，１９９２；化学，４６，６８１，１９９１；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８−３６２，１９９２；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，８７−９１，１９９２；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１５２−１５８，１９９２；細胞工学，１６，１４６３（１９９７））、トリプル・ヘリックス技術（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１３２−１３６，１９９２）に基づき、上記のアンチセンスポリヌクレオチドを癌細胞に投与することにより、癌細胞での標的遺伝子の転写または翻訳を抑制し、その結果、標的遺伝子の発現を抑制することができる。特に標的遺伝子のポリペプチドをコードする領域の開始コドンを含む１５〜１００塩基と相補的な塩基配列が好ましい。また、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼによる分解を受けないポリヌクレオチド誘導体が好ましい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、市販のＤＮＡ合成機、ＷＯ９３／２００９５、ＷＯ０２／１０１８５に記載した方法などを用いて製造することができる。また、（Ｃ）の（１）の遺伝子の強制発現に用いる発現ベクターのプロモーターの下流に標的遺伝子を逆向きにつなげた組換え体ベクターを作製し、この組換え体ベクターを癌細胞に導入することにより、細胞内でアンチセンスＲＮＡを発現することができる。
蛋白質に対する抗体は（Ａ）（４）（ｉｉｉ）に記載したような当業者に公知の方法により取得することができる。該蛋白質の機能を抑制する中和抗体は、該蛋白質に対する抗体と該蛋白質とを結合させて該蛋白質の機能を測定し、抗体を結合させない場合と比較して、該蛋白質の機能が抑制されるような抗体を、該蛋白質に対する抗体の中から選択することにより得ることができる。
上記した各種Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示すｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド、該ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターならびに抗体は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。このような医薬製剤の詳細については、本明細書中の（Ｇ）に後記する。
（Ｆ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法
細胞に試験物質を投与して、（Ａ）で選抜されたその発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に正の相関がある遺伝子、例えばＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２から選択される１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を投与しない場合の発現量と比較し、該遺伝子の発現量が上昇する物質を選択することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質の候補物質をスクリーニングすることができる。特に、遺伝子が（Ｃ）の（１）に記載の方法で選択されたＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子である場合には、この方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングすることができる。
また、細胞に試験物質を投与して、（Ａ）で選抜されたその発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に負の相関がある遺伝子、例えばＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択される１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を投与しない場合の発現量と比較し、該遺伝子の発現量が減少する物質を選択することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質の候補物質をスクリーニングすることができる。特に、遺伝子が（Ｃ）の（２）に記載の方法で選択されたＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子である場合には、この方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングすることができる。
これらの物質がＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させることは、癌細胞にこれらの物質を投与し、そのＥｇ５阻害剤に対する感受性を測定して、物質を投与しない場合の感受性と比較することにより確認できる。
遺伝子の発現量は、細胞として、癌細胞、特に測定する遺伝子を選抜する際に用いたヒト癌細胞株パネルの中から選択した癌細胞株を用い、（Ａ）の（３）に記載した方法で、該遺伝子のｍＲＮＡや該遺伝子がコードする蛋白質量を測定することにより測定できる。あるいは、以下のようにして、発現量を測定する遺伝子の発現制御領域を含むレポーター発現細胞を作製し、該細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を、目的の遺伝子の発現量として測定することができる。レポーター発現細胞は、ヒトゲノムＤＮＡから発現量を測定する遺伝子のコード領域の上流に存在する発現制御領域を単離し、適当な動物細胞用の発現ベクターの外来遺伝子発現用のプロモーターを除いて、代わりにその発現制御領域を挿入し、その下流に適当なレポーター遺伝子に結合したベクターを細胞に導入して作製することができる。レポーター遺伝子としてはホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などを用いることができる。レポーター遺伝子の発現量の測定は、ルシフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼの酵素活性により発光または発色する基質を利用した発光量または発色量の測定、ＧＦＰの発する蛍光量の測定により行うことができる。
被験試料としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出物などをあげることができる。
上記した本発明のスクリーニング方法により取得される物質は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として有用である。
（Ｇ）本発明のＥｇ５阻害剤に対する感受性増強薬の医薬製剤
本明細書中の上記（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）に記載した通りの各種の遺伝子、蛋白質、抗体および物質などはＥｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることも可能ではあるが、通常は各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路としては、予防または治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤などがあげられる。
経口投与に適当な例えば錠剤などは、乳糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤および希釈剤、防腐剤、フレーバー類などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩は、上記の目的で用いる場合、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度などにより異なるが、通常経口の場合、成人１人あたり、１回につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５００ｍｇの範囲で、１日１回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、通常成人一人当り０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜３００ｍｇを一日一回ないし数回投与するか、または１日１〜２４時間の範囲で静脈内に持続投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
また、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強のための有効成分としてＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を利用する遺伝子治療剤の場合には、該ＤＮＡまたはＲＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記に記載した常法に従って製剤化、処方および投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法を使用することができる。
組換えウイルスベクターは、以下に記載の方法に従い作製することができる。
有効成分として使用するＤＮＡ（以下、対象ＤＮＡとも称する）の断片を調製する。該ＤＮＡ断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
ＲＮＡウイルスベクターの場合には、対象ＤＮＡに相同なＲＮＡ断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほか、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同なＲＮＡを、センスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同なＲＮＡを選択する。
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなど、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶ由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなど、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂなど、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５、ｐ１９、ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質があげられる。
ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で対象ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７，１９９５）、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，３５８７−３５９６，１９９０）、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８１５０−８１５７，１９９８）、ｐＡｄｅｘ１（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，３８１６−３８２１，１９９５）などが用いられる。プロモーターとしては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などをあげることができる。
また、上記組換えウイルスベクターの投与方法としては、上記の方法に加え、リポソームデリバリーを用いる直接的イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）遺伝子移入と組み合わせることにより、患者の癌組織にウイルスベクターを指向させるようにすることもできる。すなわち、適当なサイズの対象ＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
本発明においては、対象ＤＮＡあるいはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターは非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７，１９７３；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２，１９８０）、マイクロインジェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３，１９８０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４，１９８０；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１，１９８１；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４，１９８１）、リポソー厶を介した膜融合−介在移入法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４，１９８９；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９，１９８９；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５，１９９２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８，１９９０；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１，１９９２）あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体を介したＤＮＡ移入法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，１９９０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９，１９９０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７，１９８９；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４，１９９１；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４，１９９１）などをあげることができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能である。ＤＮＡを患者の癌組織に直接標的化するには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体を介したＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず、３８細胞株よりなるヒト癌細胞株パネルにおいて、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性と１１９種類のヒト遺伝子の発現量を測定した。そして特に肺癌由来の２６株において、発現がＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関のある１９遺伝子を選抜した。また、本発明者らは、それらの遺伝子の発現量から癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を予測する統計学的なモデルを構築し、さらに予測に用いる遺伝子の数を１１までに減少させたモデルの構築にも成功した。
このモデルを利用し、選抜された少数の遺伝子の発現を調べることで、癌患者の抗癌剤に対する感受性を判定する方法を提供することが可能になった。さらに、それらの遺伝子の発現を増加あるいは減少させることで、抗癌剤に対する感受性を増強させる方法、ならびにそれらの抗癌剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングする方法を提供することが可能になった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（５４）に関する。
（１） 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法。
（２） 工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒからなる大腸癌由来の細胞株、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＡＳＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３からなる膵臓癌由来の細胞株、ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３からなる卵巣癌由来の細胞株からなる群から選択される全てあるいは一部の細胞株である、（１）に記載の方法。
（３） 選択される細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株から選択される全てあるいは一部の細胞株である、（２）に記載の方法。
（４） 工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株である（１）に記載の方法。
（５） １つの特定の臓器が肺である（４）に記載の方法。
（６） 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（Ｉ）
Ｒ１およびＲ４は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表し、
Ｒ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−Ｃ（＝Ｗ）Ｒ６［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子を表し、Ｒ６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ７とＲ８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＯＲ９（式中、Ｒ９は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）または−ＳＲ１０（式中、Ｒ１０は前記のＲ９と同義である）を表す］、−ＮＲ１１Ｒ１２｛式中、Ｒ１１およびＲ１２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１３［式中、Ｒ１３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ７ＡＲ８Ａ（式中、Ｒ７ＡおよびＲ８Ａはそれぞれ前記のＲ７およびＲ８と同義である）、−ＯＲ９Ａ（式中、Ｒ９Ａは前記のＲ９と同義である）または−ＳＲ１０Ａ（式中、Ｒ１０Ａは前記のＲ９と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ２Ｒ１４（式中、Ｒ１４は前記のＲ９と同義である）を表すか、またはＲ１とＲ２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、
Ｒ５は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ４とＲ５が一緒になって−（ＣＲ１５ＡＲ１５Ｂ）ｍ１−Ｑ−（ＣＲ１５ＣＲ１５Ｄ）ｍ２−｛式中、Ｑは単結合、置換もしくは非置換のフェニレンまたはシクロアルキレンを表し、ｍ１およびｍ２は同一または異なって０〜４の整数を表すが、ｍ１とｍ２は同時に０とはならず、Ｒ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄは同一または異なって、水素原子、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、−ＯＲ１６［式中、Ｒ１６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＮＲ７ＢＲ８Ｂ（式中、Ｒ７ＢおよびＲ８Ｂは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ７ＢとＲ８Ｂが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＳＯ２ＮＲ７ＣＲ８Ｃ（式中Ｒ７ＣおよびＲ８Ｃはそれぞれ前記のＲ７ＢおよびＲ８Ｂと同義である）または−ＣＯＲ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］、−ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１８およびＲ１９は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＲ２０（式中、Ｒ２０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノまたは置換もしくは非置換のアリールアミノを表す）または−ＳＯ２Ｒ２１（式中、Ｒ２１は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］または−ＣＯ２Ｒ２２（式中、Ｒ２２は前記のＲ１７と同義である）を表すか、またはＲ１５ＡとＲ１５ＢまたはＲ１５ＣとＲ１５Ｄが一緒になって酸素原子を表し、ｍ１またはｍ２が２以上の整数であるとき、それぞれのＨ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄは同一でも異なっていてもよく、隣接するふたつの炭素原子に結合するＲ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄはそれぞれ一緒になって結合を形成してもよい｝を表し、
Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝ＷＡ）Ｒ２３（式中、ＷＡおよびＲ２３はそれぞれ前記のＷおよびＲ６と同義である）を表す＞で表されるチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７） Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６Ａ（式中、Ｒ６Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ３が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２３Ａ（式中、Ｒ２３Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ４が置換低級アルキルであり、Ｒ５がフェニルである（６）に記載の方法。
（８） Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎａＮＨＳＯ２Ｒａ（式中、ｎａは１または２であり、Ｒａは置換もしくは非置換の低級アルキルを表す）である（６）または（７）に記載の方法。
（９） 一般式（Ｉ）で表されるチアジアゾリン誘導体が下記式（Ａ）〜（Ｃ）および（Ｅ）〜（Ｐ）で表される化合物からなる群から選択される化合物である（６）に記載の方法。
（１１） システイン誘導体がＬ−システイン誘導体である（１０）に記載の方法。
（１２） Ｒ２４がフェニル、４−メチルフェニル、２−ナフチル、４−ピリジル、または１，３−ベンゾジオキソール−５−イルであり、Ｒ２５およびＲ２６が同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはヒドロキシメチルである（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３） 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、下記式（Ｑ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）（１）から（１３）のいずれか１項に記載の方法により同定された遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に応じた点数を決定する工程、
（ｂ）被験癌細胞について、工程（ａ）で選択された遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程、
（ｄ）選択された全遺伝子についての割り当てられた点数から、被験癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の指標となる数値を求める工程、
（ｅ）あらかじめ決定した閾値と（ｄ）で得られた数値とを比較する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法。
（１５） 工程（ａ）で選択する遺伝子が、以下の（ｉ）〜（ｘｉｘ）それぞれの遺伝子からなる遺伝子群から選択される１以上の遺伝子である（１４）に記載の方法。
（ｉ）チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＣＹＰ２４Ａ１）
（ｉｉ）レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＯＢＲＧＲＰ）
（ｉｉｉ）Ｂ因子（ＢＦ）
（ｉｖ）アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）
（ｖ）バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＢＩＲＣ３）
（ｖｉ）シーケストソーム１（ＳＱＳＴＭ１）
（ｖｉｉ）腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＴＮＦＡＩＰ２）
（ｖｉｉｉ）膜内在性蛋白質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）
（ｉｘ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＡＢＣＣ２）
（ｘ）アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）
（ｘｉ）相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＦＡＭ３Ｃ）
（ｘｉｉ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＡＢＣＣ３）
（ｘｉｉｉ）仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＢＣ００７４３６）
（ｘｉｖ）微小管関連蛋白質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）
（ｘｖ）サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
（ｘｖｉ）ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＨＳＰＣＡ）
（ｘｖｉｉ）サイクリンＢ２（ＣＣＮＢ２）
（ｘｖｉｉｉ）仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＦＬＪ２３２６９）
（ｘｉｘ）溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＳＬＣ１２Ａ２）
（１６） （ａ）の工程で選択される遺伝子が、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９である（１５）に記載の方法。
（１７） Ｅｇ５阻害剤が、（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８） Ｅｇ５阻害剤が、（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１９） Ｅｇ５阻害剤が、（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（２０） 癌細胞が肺癌細胞である（１４）から（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２３） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをノーザンブロットにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２４） （２２）に記載の方法において使用するための、該ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡの定量試薬。
（２５） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を免疫化学的方法により定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２６） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をＥＬＩＳＡにより定量することにより行う、（２５）に記載の方法。
（２７） 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をウエスタンブロットにより定量することにより行う、（２５）に記載の方法。
（２８） （２５）から（２７）のいずれか１項に記載の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬。
（２９） ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（３０） 細胞が肺癌細胞である（２９）に記載の感受性増強薬。
（３１） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３２） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３３） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３４） 細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を増加させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
（３５） 細胞が肺癌細胞である（３４）に記載のスクリーニング方法。
（３６） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３７） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３８） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３９） ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４０） 癌細胞が肺癌細胞である（３９）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４１） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４２） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４３） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４４） （３９）から（４３）のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクター。
（４５） （３９）から（４３）のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは（４４）に記載のベクターを含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（４６） ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択されるいずれかの遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子にコードされる蛋白質に対する抗体を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（４７） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（４８） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（４９） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（５０） 細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を減少させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
（５１） 細胞が肺癌細胞である（５０）に記載のスクリーニング方法。
（５２） Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
（５３） Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
（５４） Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
以下、一般式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）といい、一般式（ＩＩ）で表される化合物を化合物（ＩＩ）という。さらに一般式（Ａ）で表される化合物を化合物Ａという。他の式番号の化合物についても同様である。
以下に本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
（Ａ）癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法
本発明のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子の同定方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程が含まれる。
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程
（１）ヒト癌細胞株
本発明で測定に用いるヒト癌細胞株は、ヒト由来の癌細胞株であれば、いずれの細胞株でもよいが、細胞株の種類が多いほど、上記工程（ｂ）の相関解析の際に、得られた相関値が有意である可能性が高くなるので好ましい。具体的な細胞株のパネルとしては、肺癌由来の２６細胞株であるＡ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９、大腸癌由来の６細胞株であるＣｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒ、膵臓癌由来の４細胞株であるＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３、卵巣癌由来の２細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３の細胞株からなるパネルの全部あるいは一部を用いることができる。
また、臓器により、発現する遺伝子およびその遺伝子の機能の細胞に対する重要性が異なるので、癌細胞が由来する臓器によって、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子が異なることが考えられる。したがって、測定に用いる細胞株を、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株にすることにより、その臓器の癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性により特異的に関与する遺伝子を同定することができる。たとえば、Ｅｇ５阻害剤を肺癌の治療に用いる場合のように、肺癌細胞のＥｇ５阻害剤の感受性に関する遺伝子を特に同定したい場合、肺癌細胞株だけ、例えば、肺癌由来の２６細胞株であるＡ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９の全部あるいは一部を用いて測定を行うことにより、肺癌細胞のＥｇ５阻害剤の感受性に関する遺伝子を同定することができる。
（２）Ｅｇ５阻害剤
本発明で用いるＥｇ５阻害剤は、Ｅｇ５阻害作用を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、ＷＯ２００４／０９２１４７に記載の化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物（ＩＩ）またはその薬理学的に許容される塩、ＷＯ０１／０３０７６８、ＷＯ０１／０９８２７８などに記載の化合物Ｑ（ＳＢ−７１５９９２）またはその薬理学的に許容される塩、ＷＯ０２／０５７２４４、ＷＯ０３／０９４８３９、ＷＯ０３／０９７０５３、ＷＯ０３／１０３５７５、ＷＯ０３／１０６４２６、ＷＯ０４／００６８６５、ＷＯ０４／００９０３６、ＷＯ０４／０２４０８６、ＷＯ０４／０３２８４０、ＷＯ０４／０３４９７２、ＷＯ０３／０３９４６０、ＷＯ０３／０４９５２７、ＷＯ０３／０５０１２２、ＷＯ０３／０５００６４、ＷＯ０３／０４９６７８、ＷＯ０３／０４９６７９、ＷＯ０３／０７９９７３、ＷＯ０３／０９９２１１、ＷＯ０３／１０５８５５、ＷＯ０４／０３７１７１、ＷＯ０４／０３９７７４、ＷＯ０４／０５８７００、ＷＯ０４／０５８１４８、ＷＯ０２／０７８６３９、ＷＯ０２／０７９１４９、ＷＯ０２／０７９１６９、ＷＯ０３／０９９２８６、ＷＯ０４／０７８７５８などに記載の化合物などがあげられ、好ましくは化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物（ＩＩ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物Ｑまたはその薬理学的に許容される塩などがあげられる。
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の各基の定義において、
（ｉ）低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルアミノおよびジ低級アルキルアミノの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数１〜１０のアルキル、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどがあげられる。
ジ低級アルキルアミノの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい。
（ｉｉ）低級アルケニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルケニル、具体的にはビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニルなどがあげられる。
（ｉｉｉ）低級アルキニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルキニル、具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニルなどがあげられる。
（ｉｖ）シクロアルキルとしては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキル、具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどがあげられる。
（ｖ）アリール、アリールオキシおよびアリールアミノのアリール部分としては、例えばフェニル、ナフチルなどがあげられる。
（ｖｉ）複素環基としては、例えば脂肪族複素環基、芳香族複素環基などがあげられる。脂肪族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性脂肪族複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性脂肪族複素環基などがあげられ、具体的にはピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジノ、モルホリノ、オキサゾリニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、１−デカヒドロキシイソキノリニルなどがあげられる。芳香族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性芳香族複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性芳香族複素環基などがあげられ、具体的にはフリル、チエニル、ベンゾチエニル、ピロリル、ピリジル、ピラジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリミジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、ピラニル、１，３−ベンゾジオキソール−５−イルなどがあげられる。
（ｖｉｉ）芳香族複素環基としては、上記（ｖｉ）であげた芳香族複素環基があげられる。
（ｖｉｉｉ）隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも１個の窒素原子を含む脂肪族複素環基などがあげられる。該少なくとも１個の窒素原子を含む脂肪族複素環基は、酸素原子、硫黄原子または他の窒素原子を含んでもいてよく、例えばピロリジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、ピラゾリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アジリジニル、アゼチジニル、ペルヒドロアゼピニル、ペルヒドロアゾシニル、スクシンイミジル、ピロリドニル、グルタルイミジル、ピペリドニルなどがあげられる。
（ｉｘ）シクロアルキレンとしては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキレン、具体的にはシクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレンなどがあげられる。
（ｘ）フェニレンとしては、１，４−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，２−フェニレンがあげられる。
（ｘｉ）ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。
（ｘｉｉ）置換低級アルキル、置換低級アルコキシ、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換シクロアルキル、置換低級アルキルアミノおよび置換ジ低級アルキルアミノにおける置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、アジド、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＣＯＮＲ２７Ｒ２８＜式中、Ｒ２７およびＲ２８は同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル｛該置換低級アルキルにおける置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、低級アルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、ハロゲン、−ＣＯＮＲ２９Ｒ３０［式中、Ｒ２９およびＲ３０は同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ａ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アリール、複素環基、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノなどがあげられる）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ２９とＲ３０が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する］、−ＮＲ３１Ｒ３２［式中、Ｒ３１およびＲ３２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は前記置換低級アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ３１とＲ３２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する］などがあげられる｝、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシ（該置換低級アルコキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル（該置換アリールオキシカルボニルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ２７とＲ２８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する＞、−ＣＯ２Ｒ３３｛式中、Ｒ３３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル［該置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＣＯＮＲ３４Ｒ３５（式中、Ｒ３４およびＲ３５はそれぞれ前記Ｒ２９およびＲ３０と同義である）、−ＮＲ３６Ｒ３７（式中、Ｒ３６およびＲ３７はそれぞれ前記Ｒ３１およびＲ３２と同義である）などがあげられる］置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す｝、−ＣＯＲ３８（式中、Ｒ３８は前記Ｒ３３と同義である）、−ＮＲ３９Ｒ４０＜式中、Ｒ３９およびＲ４０は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル｛該置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＲ４１（式中、ｎは１〜１５の整数を表し、Ｒ４１は低級アルキルを表す）、−ＣＯＮＲ４２Ｒ４３（式中、Ｒ４２およびＲ４３はそれぞれ前記Ｒ２９およびＲ３０と同義である）、−ＳＯ２Ｒ４４［式中、Ｒ４４は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す］、−ＮＲ４５Ｒ４６（式中、Ｒ４５およびＲ４６はそれぞれ前記Ｒ３１およびＲ３２と同義である）などがあげられる｝、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、−ＣＯＲ４７｛式中、Ｒ４７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＮＲ４８Ｒ４９（式中、Ｒ４８およびＲ４９はそれぞれ前記のＲ３１およびＲ３２と同義である）または−ＯＲ５０［式中、Ｒ５０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ２Ｒ５１（式中、Ｒ５１は前記Ｒ４７と同義である）を表すか、またはＲ３９とＲ４０が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する＞、−Ｎ＋Ｒ５２Ｒ５３Ｒ５４Ｘ−（式中、Ｒ５２およびＲ５３は同一または異なって、低級アルキルを表すか、またはＲ５２とＲ５３が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成し、Ｒ５４は低級アルキルを表し、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素の各原子を表す）、−ＯＲ５５｛式中、Ｒ５５は置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）または−ＣＯＲ５６（式中、Ｒ５６は前記Ｒ４７と同義である）を表す｝、−ＳＲ５７（式中、Ｒ５７は前記Ｒ５５と同義である）、−ＳＯ２Ｒ５８［式中、Ｒ５８は置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）または−ＮＲ５９Ｒ６０（式中、Ｒ５９およびＲ６０はそれぞれ前記Ｒ３１およびＲ３２と同義である）を表す］−ＯＳＯ２Ｒ６１（式中、Ｒ６１は前記Ｒ５８と同義である）などがあげられる。
ここで示した低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、アリール、アロイルおよびアリールオキシカルボニルのアリール部分、複素環基、隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基ならびにハロゲンは、それぞれ前記低級アルキル（ｉ）、低級アルケニル（ｉｉ）、低級アルキニル（ｉｉｉ）、シクロアルキル（ｉｖ）、アリール（ｖ）、複素環基（ｖｉ）、隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基（ｖｉｉｉ）およびハロゲン（ｘｉ）と同義である。また、ここで示したアラルキルオキシカルボニルのアラルキル部分（ｘｉｉｉ）としては、例えば炭素数７〜１５のアラルキル、具体的にはベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチルなどがあげられる。
（ｘｉｖ）置換アリール、置換アリールオキシ、置換アリールアミノ、置換フェニレン、置換複素環基のうちの置換芳香族複素環基および置換芳香族複素環基における置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ホルミル、メチレンジオキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アリール、複素環基などがあげられる）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシ（該置換低級アルコキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルチオ（該置換低級アルキルチオにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ（該置換低級アルキルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノ（該置換ジ低級アルキルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルオキシ（該置換低級アルカノイルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルアミノ（該置換低級アルカノイルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルチオ（該置換低級アルカノイルチオにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノカルボニル（該置換低級アルキルアミノカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該置換低級アルキルアミノカルボニルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノカルボニル（該置換ジ低級アルキルアミノカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル（該置換低級アルコキシカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該置換ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換、アリールにおける置換基（ｅ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノなどがあげられる）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールスルホニル（該置換アリールスルホニルにおける置換基は前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールオキシ（該置換アリールオキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールアミノ（該置換アリールアミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールチオ（該置換アリールチオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルオキシ（該置換アロイルオキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルチオ（該置換アロイルチオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルアミノ（該置換アロイルアミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環アミノ（該置換複素環アミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環オキシ（該置換複素環オキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環チオ（該置換複素環チオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）などがあげられる。
ここで示した低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ（該ジ低級アルキルアミノの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、低級アルカノイル、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルカノイルチオ、低級アルキルアミノカルボニル、低級アルキルアミノカルボニルオキシ、ジ低級アルキルアミノカルボニル（該ジ低級アルキルアミノカルボニルの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、低級アルコキシカルボニルおよびジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）の低級アルキル部分は前記の低級アルキル（ｉ）と同義であり低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキルおよびハロゲンはそれぞれ前記の低級アルケニル（ｉｉ）、低級アルキニル（ｉｉｉ）、シクロアルキル（ｉｖ）およびハロゲン（ｘｉ）と同義である。さらにここで示したアリール、アリールスルホニル、アリールオキシ、アリールチオ、アリールアミノ、アロイル、アロイルオキシ、アロイルチオおよびアロイルアミノのアリール部分は前記のアリール（ｖ）と同義であり、複素環基、複素環アミノ、複素環オキシおよび複素環チオの複素環基部分は前記の複素環基（ｖｉ）と同義である。
（ｘｖ）置換複素環基のうちの置換脂肪族複素環基および隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基としては、前記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）の定義であげた基に加え、オキソなどがあげられる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの薬理学的に許容される塩は、例えば薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩などを包含する。化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの薬理学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機酸塩などがあげられ、薬理学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などがあげられ、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩があげられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジンなどの付加塩があげられ、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの付加塩があげられる。
化合物（Ｉ）は、ＷＯ０３／０５１８５４またはＷＯ２００４／０９２１４７に記載の方法、あるいはそれに準じて製造することができる。
化合物（ＩＩ）は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１３，４１４−４１８，１９７０またはＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３−１６，１９７２に記載の方法、あるいはそれらに準じて製造することができる。
化合物Ｑは、例えばＷＯ０３／０７０７０１に記載の方法またはそれに準じて製造することができる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの中には、位置異性体、幾何異性体、光学異性体、互変異性体などの立体異性体が存在し得るものもあるが、本発明の遺伝子を同定する方法などには、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を使用することができる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの塩を取得したいとき、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱが塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱを適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えることにより塩を形成させて単離、精製すればよい。
また、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱならびにその薬理学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の遺伝子を同定する方法などに使用することができる。
化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の具体例を第１表および第２表に示す。
試験例１ 免疫細胞化学染色によるＭ期細胞表現型解析
免疫細胞化学染色によるＭ期細胞表現型解析は文献（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，５３０３−５３１３，２０００）を参考にして実施した。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１８５）を被験化合物とともに１７時間培養した。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄後、−２０℃で保冷したメタノールで１分間処理し、細胞を固定化した。ＰＢＳで洗浄後、０．２％トリトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を含むＰＢＳで１５分間浸透化した。ＰＢＳで洗浄後、ブロッキング溶液（１％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）で３０分間ブロッキングし、１次抗体溶液｛０．２％マウスモノクローナル抗α−チューブリン抗体〔シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、カタログ番号Ｔ９０２６〕および０．２％ウサギ抗γ−チューブリン抗体（シグマ・アルドリッチ社、カタログ番号Ｔ３５５９）を含むブロッキング溶液｝と３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体溶液｛０．０２５％アレクサ・フロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）５４６結合抗マウスＩｇＧ抗体〔モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社、カタログ番号Ａ−１１０３０〕、０．５％アレクサ・フロー４８８結合抗ウサギＩｇＧ抗体（モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ａ−１１０３４）および１μｍｏｌ／ｌヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２を含むブロッキング溶液｝と３０分間反応させ、微小管、中心体および染色体を可視化した。倒立蛍光顕微鏡を用いてＭ期の細胞の表現型を観察した。被験化合物として化合物Ａまたは化合物Ｄ〔アクロス（Ａｃｒｏｓ）社〕を用いた場合、化合物Ａおよび化合物ＤによりＭ期に集積した細胞は、単星状微小管（モナストラル・マイクロチューブル・アレイ）、単極性中心体（モノポーラー・スピンドル）、環状に分布した染色体の局在、という特徴的な表現型を示した。このようなＭ期の表現型は文献に記載されたＥｇ５に対する中和抗体（Ｃｅｌｌ，８３，１１５９−１１６９，１９９５）やＥｇ５特異的阻害剤モナストロール（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９７１−９７４，１９９９）で処理した細胞と同様な表現型であった。
以上の結果から、化合物Ａおよび化合物ＤはＥｇ５を阻害することが示唆された。
試験例２ Ｅｇ５の酵素活性に対する阻害試験
全長ヒトＥｇ５組換体の調製は文献（Ｃｅｌｌ，８３，１１５９−１１６９，１９９５）を参考にして実施した。ＨｉｓタグをＮ末端に融合した全長ヒトＥｇ５を発現するバキュロウイルスをスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９昆虫細胞に感染させ、培養後、培養液を遠心して細胞を回収した。回収した細胞をバッファーに懸濁し、遠心により上清を回収した。上清をニッケルアガロースカラムに通塔し、ＨｉｓタグをＮ末端に融合したＥｇ５をアフィニティー精製して部分精製標品を取得した。
Ｅｇ５のＡＴＰａｓｅ活性の測定は文献（ＥＭＢＯ Ｊ．，１３，７５１−７５７，１９９４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，４８８４−４８８７，１９９２）を参考にして実施した。段階的に希釈した被験化合物とともに、２５ｍｍｏｌ／ｌピペラジンＮ，Ｎ’−ビス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）／ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、１ｍｍｏｌ／ｌエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５μｍｏｌ／ｌパクリタキセル、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２５μｇ／ｍｌチューブリン〔サイトスケルトン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）社、カタログ番号ＴＬ２３８〕、２００μｍｏｌ／ｌ ２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボサイド（ＭＥＳＧ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ｅ−６６４６）、１Ｕ／ｍｌプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ｅ−６６４６）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ、１２．５μｇ／ｍｌ Ｅｇ５部分精製標品から構成される反応溶液で酵素反応を行った。酵素反応は３０℃で３０分間実施した。ＡＴＰａｓｅ活性の指標となる３６０ｎｍでの吸光度をプレートリーダー〔モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）社、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ３８４〕で測定した。Ｅｇ５存在下、化合物非存在下での吸光度を１００％、Ｅｇ５非存在下、化合物非存在下の吸光度を０％として相対活性を計算し、ＩＣ５０値を算出した。
被験化合物として化合物Ａまたは化合物Ｄを用いて測定した場合、化合物Ａおよび化合物Ｄは濃度依存的にＥｇ５のＡＴＰａｓｅ活性を阻害し、そのＩＣ５０値は化合物Ａが２μｍｏｌ／ｌ、化合物Ｄは０．８μｍｏｌ／ｌであった。
以上、試験例１および試験例２の結果から、化合物Ａおよび化合物ＤはＥｇ５阻害作用を有することが示された。すなわち、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）はＥｇ５阻害剤として利用できることが示された。
（３）抗癌剤に対する感受性の測定法
本発明における、癌細胞の抗癌剤に対する感受性の測定法としては、Ｅｇ５阻害剤と（１）のヒト癌細胞を一定期間接触させた後、該細胞について、生細胞数、ＤＮＡ合成速度または総蛋白質量を測定する方法があげられる。感受性は例えば、種々の濃度のＥｇ５阻害剤について上記の測定を行い、Ｅｇ５阻害剤の濃度と測定値との相関を表す検量線を作成し、Ｅｇ５阻害剤を接触させなかった細胞について同様に測定したときの値を１００％としたときの５０％に相当する値を与えるＥｇ５阻害剤の濃度（ＧＩ５０）、またはＧＩ５０の濃度をｍｏｌ／ｌで表したときのその対数（ｌｏｇ１０ＧＩ５０）もしくは−ｌｏｇ１０ＧＩ５０で表すことができる。生細胞数は、ＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３，１９８３）、ＸＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４２，２５７−２６５，１９９１）などの発色反応を利用した方法で測定することができる。また、ＤＮＡ合成速度は、３Ｈで標識したチミジンの細胞への取り込みを測定することなどにより、測定することができる。総蛋白質量は、スルフォローダミンＢアッセイ法などにより測定できる。
（４）遺伝子の発現量の測定
本発明における遺伝子の発現量の測定は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡまたは遺伝子産物である蛋白質を定量することにより行うことができる。
（ｉ）ＲＮＡまたは蛋白質の抽出
（１）のヒト癌細胞株から以下の一般的な方法でＲＮＡまたは蛋白質を抽出できる。ＲＮＡの場合、例えばトリゾル（ＴＲＩＺＯＬ）試薬〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社〕を用いた場合、添付の操作法に従って行えばよい。蛋白質の場合、例えばＴｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）などの成書に従って行えばよい。
（ｉｉ）ｍＲＮＡの定量
ｍＲＮＡの定量は（１）で抽出したＲＮＡを測定試料として、ＤＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲなどの技術により行うことができる。また、ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用するための、該ＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡの定量試薬も本発明の範囲に含まれる。
（ｉｉｉ）蛋白質の定量
蛋白質の定量は特異的抗体を用いた免疫化学的定量法によって行うことができる。蛋白質に対する抗体は、例えば成書Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）に記載の方法に従って、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を作製することができる。また、市販の抗体が利用可能な場合は、特異性を確認の上、使用することもできる。得られた抗体を用いて、成書（例えば「酵素免疫測定法」医学書院（１９８２））に記載の方法に従って、ＥＬＩＳＡあるいはＲＩＡ、ウェスタンブロットを行い、蛋白質を定量することができる。また、上記の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬も本発明の範囲に含まれる。
遺伝子の発現量は、上記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の方法で測定された、一定量のＲＮＡまたは蛋白質あたりのシグナル強度またはその対数で表される。ＲＴ−ＰＣＲの一種であるリアルタイムＰＣＲでｍＲＮＡを定量した場合は、増幅反応が対数的に進行する、あるシグナル強度に達するまでの反応サイクル数（Ｃｔ値）で表すこともできる。
（５）遺伝子の選抜
本発明では、各遺伝子ごとに、各細胞株における発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関を解析し、その発現量と細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関のある遺伝子を選抜する。ここで行なう相関解析は、遺伝子の発現量およびＥｇ５阻害剤に対する感受性がシグナル強度の対数、Ｃｔ値、ＧＩ５０の対数などで表される場合には、その数値は正規分布になると仮定し、例えばピアソンの相関係数（以下、単に相関係数ともいう）を計算することによって行うことができる。相関の有無は、相関係数が０であるかどうかで決定され、相関係数が０の場合は相関はなく、０でなければ相関があるといえる。また、相関係数は１から−１の間の値を取るが、相関係数の絶対値が１に近いほど相関が高く、０に近いほど相関が低いといえる。なお、得られた相関係数の有意性は、帰無仮説に基づいて標本数から求められるＰ値（母集団の相関係数が０になる確率）により検定できる。例えば、Ｐ値＜０．０５であれば、その相関係数は５％の有意水準で有意であるといえる。 以上のようにして選抜される、その発現量がＥｇ５阻害剤に対する感受性と負の相関のある遺伝子、すなわちＥｇ５阻害剤に対する感受性が高い細胞ほどその発現量が低い遺伝子（以下、耐性遺伝子ともいう）の例として、以下の１２遺伝子があげられる。
（ｉ）ＣＹＰ２４Ａ１：チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＮＭ＿０００７８２）
（ｉｉ）ＯＢＲＧＲＰ：レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＮＭ＿０１７５２６）
（ｉｉｉ）ＢＦ：Ｂ因子（ＮＭ＿００１７１０）
（ｉｖ）ＡＰＲＴ：アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＮＭ＿０００４８５）
（ｖ）ＢＩＲＣ３：バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＮＭ＿００１１６５）
（ｖｉ）ＳＱＳＴＭ１：シーケストソーム１（ＮＭ＿００３９００）
（ｖｉｉ）ＴＮＦＡＩＰ２：腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＮＭ＿００６２９１）
（ｖｉｉｉ）ＩＴＭ２Ｂ：膜内在性蛋白質２Ｂ（ＮＭ＿０２１９９９）
（ｉｘ）ＡＢＣＣ２：ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＮＭ＿０００３９２）
（ｘ）ＡＮＸＡ３：アネキシンＡ３（ＮＭ＿００５１３９）
（ｘｉ）ＦＡＭ３Ｃ：相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＮＭ＿０１４８８８）
（ｘｉｉ）ＡＢＣＣ３：ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＮＭ＿００３７８６）
また、正の相関のある遺伝子、すなわちＥｇ５阻害剤に対する感受性が高い細胞ほどその発現量も高い遺伝子（以下、感受性遺伝子ともいう）の例として、以下の７遺伝子があげられる。
（ｉ）ＢＣＯ０７４３６：仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＸＭ＿０３７３１７）
（ｉｉ）ＭＡＰ１Ｂ：微小管関連蛋白質１Ｂ（ＮＭ＿００５９０９）
（ｉｉｉ）ＣＣＮＢ１：サイクリンＢ１（ＮＭ＿０３１９６６）
（ｉｖ）ＨＳＰＣＡ：ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＢＣ０２３００６）
（ｖ）ＣＣＮＢ２：サイクリンＢ２（ＮＭ＿００４７０１）
（ｖｉｉ）ＦＬＪ２３２６９：仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＡＫ０２６９２２）
（ｖｉｉ）ＳＬＣ１２Ａ２：溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＮＭ＿００１０４６）
これらの遺伝子は、かっこ内に示したＤＮＡ配列データーベースＧｅｎＢａｎｋの登録番号の配列を有する遺伝子として規定される。
あるＥｇ５阻害剤を用いて、その発現量がＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関のある遺伝子と同定された遺伝子は、そのＥｇ５阻害剤だけでなく、他のＥｇ５阻害剤に対する感受性とも相関のある遺伝子と考えられる。
（Ｂ）癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法
本発明はさらに、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法を提供する。判定の方法としては、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法があげられる。
（ａ）上記（Ａ）の方法により同定した遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に対応した点数を決定する工程
（ｂ）感受性を判定する癌細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程
（ｄ）選択された全遺伝子について割り当てられた点数から感受性の指標となる数値を求める工程
（ｅ）予め決定した閾値と（ｄ）で求めた数値とを比較することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を判定するという工程
上記点数の決定、感受性の指標となる数値の計算、閾値との比較は、重回帰分析、判別分析、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）法、主成分分析、自己組織化マップ法などの多変量解析の手法（ＳＡＳによる実験データの解析、竹内啓監修、東京大学出版会、１９９０などに記載）を用いることで行うことができる。
以下に、重回帰分析を用いた場合の各工程を説明する。選択した遺伝子がｎ個、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性Ｙを−ｌｏｇ１０ＧＩ５０で、各遺伝子の発現量をＣｔ値あるいはシグナル強度の対数で表した場合、重回帰分析モデルでは、遺伝子の発現量Ｘを説明変量として、以下の式１で目的変量である感受性Ｙを表すことができる。
Ｙ＝ａ１Ｘ１＋ａ２Ｘ２＋・・・・＋ａｎＸｎ＋ｂ （式１）
Ｙ：目的変量（感受性：−ｌｏｇ１０ＧＩ５０）
Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎ：説明変量（遺伝子の発現量：Ｃｔ値あるいはシグナル強度の対数）
ａ１、ａ２、…ａｎ：偏回帰係数
ｂ：定数項
以下、各遺伝子の発現量をＣｔ値で表した場合で説明するが、シグナル強度の対数を用いた場合もＣｔ値の代わりにシグナル強度の対数を用いて同様にして判定を行うことができる。
この式にｎ＋１種類の細胞株についての感受性Ｙ（−ｌｏｇ１０ＧＩ５０）および各遺伝子の発現量Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎ（Ｃｔ値）を実測した値をそれぞれ代入することにより、ｎ＋１個の一次線形多項式を作成し、これらの一次線形多項式を解くことにより、各遺伝子についての偏回帰係数ａ１、ａ２、…ａｎおよび定数項ｂを求めることができる。この方法で用いる遺伝子は、上記（Ａ）の方法により同定した遺伝子群から、任意に選ぶことができるが、Ｃｐ統計量、自由度調整ずみ決定係数、赤池の情報量基準などの基準用の統計量を最適化の指標として、指標が小さくなるように遺伝子を選択していくことが望ましい。このようにして、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に重要な遺伝子を選択することにより、複雑さを抑えながら、予測精度を上げること、すなわち最適化を行うことができる。重回帰分析モデルの場合、各遺伝子の点数は、上記で得られた偏回帰係数と遺伝子の発現量の積として表される。
重回帰分析モデルを最適化した場合に選択される、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に重要な遺伝子の例としては、（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関がある遺伝子としてあげた１９遺伝子から選択された、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９があげられる。
以上のようにして選択した遺伝子の、感受性を判定する癌細胞における発現量（Ｃｔ値）は、上記（Ａ）（３）に記載した方法により測定することができる。得られた各遺伝子のＣｔ値から、上述した各遺伝子の点数、すなわち上記で得られた偏回帰係数ａとそのＣｔ値の積を割り当てる。式１に基づき、割り当てられた各遺伝子の点数の合計に定数項ｂの値を加えることにより、感受性の指標となる数値−ｌｏｇ１０ＧＩ５０が求められる。したがって、−ｌｏｇ１０ＧＩ５０の閾値として、例えば、上記（Ａ）の遺伝子の選抜の際に測定した、各癌細胞の感受性の指標となる数値（−ｌｏｇ１０ＧＩ５０）の平均値など、適当なある数値を設定し、その閾値と比較することにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定することができる。
癌細胞として、癌患者から生検などにより取り出した癌組織由来の癌細胞を用いることにより、その癌患者の癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定することができる。その癌患者由来の癌細胞が、Ｅｇ５阻害剤に感受性が高いと判定された場合に、Ｅｇ５阻害剤を治療に用いることにより、効果的に治療を行うことができる。
（Ｃ）癌細胞の感受性を規定する遺伝子の選択
（Ａ）の方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関があると判断された遺伝子が、実際に感受性を規定しているか、すなわち遺伝子の発現量を変化させることによりＥｇ５阻害剤に対する感受性を変化させることができるかを調べるには、以下の方法を用いることができる。
（１）遺伝子の強制発現
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に正の相関がある遺伝子群から選ばれた遺伝子蛋白質コード領域を含むｃＤＮＡを適当な動物細胞の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを癌細胞に導入することで、該遺伝子を強制発現させその発現量を上げることができる。この癌細胞にＥｇ５阻害剤を添加しＥｇ５阻害剤に対する感受性を測定する。発現ベクターを導入しない場合と比較してＥｇ５阻害剤に対する感受性が高くなる場合には、その遺伝子は癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子であり、その発現量を上げることにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することができる遺伝子であることがわかる。
発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２〔クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社〕、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社〕、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社）、ｐＭＳＧ〔アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社〕、ｐＡＭｏ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７，１９９３）などを例示することができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などをあげることができる。
（２）遺伝子の発現抑制
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に負の相関がある遺伝子群から選ばれた遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスポリヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの発現ベクターを癌細胞に導入することで、該遺伝子の発現を抑制し、その発現量を下げることができる。この癌細胞にＥｇ５阻害剤を添加し、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を測定する。遺伝子発現を抑制しない場合と比較してＥｇ５阻害剤に対する感受性が高くなる場合には、その遺伝子は癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子であり、その発現量を下げることにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することができる遺伝子であることがわかる。
ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドの発現ベクターは下記（Ｅ）に記載に基づいて作製および癌細胞への導入を行うことができる。
（Ｄ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬（ｉ）
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性の間に正の相関がある遺伝子、例えばＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２の中から選択される単独または複数の遺伝子であって、上記（Ｃ）の（１）に記載した方法により癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子を含有する遺伝子治療薬は、該Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として用いることができる。また、該遺伝子の強制発現の結果、癌細胞における該遺伝子がコードする蛋白質の量が増加することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性が増強されると考えられるので、該遺伝子がコードする蛋白質を含有する蛋白製剤は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として使用することができる。
上記したＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。このような医薬製剤の詳細については、本明細書中の（Ｇ）に後記する。
（Ｅ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬（ｉｉ）
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性の間に負の相関がある遺伝子、例えばＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３の中から選択される単独または複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは該ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターは、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として使用することができる。また、その感受性の増強は、該遺伝子がコードする蛋白質の機能が関与していると考えられるので、該遺伝子がコードする蛋白質に対する抗体、好ましくは該蛋白質の機能を抑制する中和抗体を含有する薬剤は、該Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として用いることができる。
次に本発明で用いるｓｉＲＮＡについて説明する。ｓｉＲＮＡとは、ある標的遺伝子のｍＲＮＡの一部の配列とその相補的な配列を含む短い二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により、該遺伝子の発現を抑制できるものをいう。ｓｉＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡの塩基配列から文献（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１３，３１９１−３１９７，１９９９）の条件に基づいて適宜設計することができる。好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳領域中の開始コドンより５０〜１００塩基下流の領域中で、ＡＡに続く１９塩基、ＧＣ含量が３０〜７０％、より好ましくは５０％前後の配列を選択する。選択した１９塩基の配列および相補的な配列それぞれの３’端にＴＴを付加した配列を有する２本のＲＮＡをＤＮＡ合成機により合成し、アニーリングすることによりｓｉＲＮＡを作製できる。また、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０−Ｕ６〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社〕、ｐＳＵＰＥＲ〔オリゴエンジン（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）社〕などのｓｉＲＮＡ発現用ベクターに上記の選択した１９塩基の配列に相当するＤＮＡを挿入することにより、該遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡを発現するベクターを作製することができる。
また、本発明で用いるアンチセンスポリヌクレオチドとは、標的遺伝子の塩基配列中の連続した１５塩基以上の配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチドの誘導体が含まれる。ポリヌクレオチド誘導体としては、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたポリヌクレオチド誘導体、あるいはポリヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたポリヌクレオチド誘導体などをあげることができる。
アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術（バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２，１９９２；化学，４６，６８１，１９９１；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８−３６２，１９９２；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，８７−９１，１９９２；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１５２−１５８，１９９２；細胞工学，１６，１４６３（１９９７））、トリプル・ヘリックス技術（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１３２−１３６，１９９２）に基づき、上記のアンチセンスポリヌクレオチドを癌細胞に投与することにより、癌細胞での標的遺伝子の転写または翻訳を抑制し、その結果、標的遺伝子の発現を抑制することができる。特に標的遺伝子のポリペプチドをコードする領域の開始コドンを含む１５〜１００塩基と相補的な塩基配列が好ましい。また、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼによる分解を受けないポリヌクレオチド誘導体が好ましい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、市販のＤＮＡ合成機、ＷＯ９３／２００９５、ＷＯ０２／１０１８５に記載した方法などを用いて製造することができる。また、（Ｃ）の（１）の遺伝子の強制発現に用いる発現ベクターのプロモーターの下流に標的遺伝子を逆向きにつなげた組換え体ベクターを作製し、この組換え体ベクターを癌細胞に導入することにより、細胞内でアンチセンスＲＮＡを発現することができる。
蛋白質に対する抗体は（Ａ）（４）（ｉｉｉ）に記載したような当業者に公知の方法により取得することができる。該蛋白質の機能を抑制する中和抗体は、該蛋白質に対する抗体と該蛋白質とを結合させて該蛋白質の機能を測定し、抗体を結合させない場合と比較して、該蛋白質の機能が抑制されるような抗体を、該蛋白質に対する抗体の中から選択することにより得ることができる。
上記した各種Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示すｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド、該ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターならびに抗体は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。このような医薬製剤の詳細については、本明細書中の（Ｇ）に後記する。
（Ｆ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法
細胞に試験物質を投与して、（Ａ）で選抜されたその発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に正の相関がある遺伝子、例えばＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２から選択される１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を投与しない場合の発現量と比較し、該遺伝子の発現量が上昇する物質を選択することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質の候補物質をスクリーニングすることができる。特に、遺伝子が（Ｃ）の（１）に記載の方法で選択されたＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子である場合には、この方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングすることができる。
また、細胞に試験物質を投与して、（Ａ）で選抜されたその発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に負の相関がある遺伝子、例えばＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択される１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を投与しない場合の発現量と比較し、該遺伝子の発現量が減少する物質を選択することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質の候補物質をスクリーニングすることができる。特に、遺伝子が（Ｃ）の（２）に記載の方法で選択されたＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子である場合には、この方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングすることができる。
これらの物質がＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させることは、癌細胞にこれらの物質を投与し、そのＥｇ５阻害剤に対する感受性を測定して、物質を投与しない場合の感受性と比較することにより確認できる。
遺伝子の発現量は、細胞として、癌細胞、特に測定する遺伝子を選抜する際に用いたヒト癌細胞株パネルの中から選択した癌細胞株を用い、（Ａ）の（３）に記載した方法で、該遺伝子のｍＲＮＡや該遺伝子がコードする蛋白質量を測定することにより測定できる。あるいは、以下のようにして、発現量を測定する遺伝子の発現制御領域を含むレポーター発現細胞を作製し、該細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を、目的の遺伝子の発現量として測定することができる。レポーター発現細胞は、ヒトゲノムＤＮＡから発現量を測定する遺伝子のコード領域の上流に存在する発現制御領域を単離し、適当な動物細胞用の発現ベクターの外来遺伝子発現用のプロモーターを除いて、代わりにその発現制御領域を挿入し、その下流に適当なレポーター遺伝子に結合したベクターを細胞に導入して作製することができる。レポーター遺伝子としてはホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などを用いることができる。レポーター遺伝子の発現量の測定は、ルシフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼの酵素活性により発光または発色する基質を利用した発光量または発色量の測定、ＧＦＰの発する蛍光量の測定により行うことができる。
被験試料としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出物などをあげることができる。
上記した本発明のスクリーニング方法により取得される物質は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として有用である。
（Ｇ）本発明のＥｇ５阻害剤に対する感受性増強薬の医薬製剤
本明細書中の上記（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）に記載した通りの各種の遺伝子、蛋白質、抗体および物質などはＥｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることも可能ではあるが、通常は各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路としては、予防または治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤などがあげられる。
経口投与に適当な例えば錠剤などは、乳糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤および希釈剤、防腐剤、フレーバー類などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩は、上記の目的で用いる場合、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度などにより異なるが、通常経口の場合、成人１人あたり、１回につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５００ｍｇの範囲で、１日１回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、通常成人一人当り０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜３００ｍｇを一日一回ないし数回投与するか、または１日１〜２４時間の範囲で静脈内に持続投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
また、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強のための有効成分としてＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を利用する遺伝子治療剤の場合には、該ＤＮＡまたはＲＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記に記載した常法に従って製剤化、処方および投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法を使用することができる。
組換えウイルスベクターは、以下に記載の方法に従い作製することができる。
有効成分として使用するＤＮＡ（以下、対象ＤＮＡとも称する）の断片を調製する。該ＤＮＡ断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
ＲＮＡウイルスベクターの場合には、対象ＤＮＡに相同なＲＮＡ断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほか、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同なＲＮＡを、センスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同なＲＮＡを選択する。
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなど、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶ由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなど、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂなど、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５、ｐ１９、ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質があげられる。
ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で対象ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７，１９９５）、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，３５８７−３５９６，１９９０）、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８１５０−８１５７，１９９８）、ｐＡｄｅｘ１（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，３８１６−３８２１，１９９５）などが用いられる。プロモーターとしては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などをあげることができる。
また、上記組換えウイルスベクターの投与方法としては、上記の方法に加え、リポソームデリバリーを用いる直接的イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）遺伝子移入と組み合わせることにより、患者の癌組織にウイルスベクターを指向させるようにすることもできる。すなわち、適当なサイズの対象ＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
本発明においては、対象ＤＮＡあるいはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターは非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７，１９７３；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２，１９８０）、マイクロインジェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３，１９８０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４，１９８０；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１，１９８１；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４，１９８１）、リポソー厶を介した膜融合−介在移入法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４，１９８９；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９，１９８９；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５，１９９２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８，１９９０；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１，１９９２）あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体を介したＤＮＡ移入法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，１９９０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９，１９９０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７，１９８９；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４，１９９１；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４，１９９１）などをあげることができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能である。ＤＮＡを患者の癌組織に直接標的化するには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体を介したＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
ヒト３８細胞株パネルからなるＥｇ５阻害剤に対する感受性試験
細胞株としては、第３表に示す肺癌由来細胞株２６株、大腸癌由来細胞株６株、膵臓癌由来細胞株４株、卵巣癌由来細胞株２株からなる３８種類を用いた。入手先のＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＪＣＲＢはＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）細胞バンク、西尾は国立がんセンターの西尾先生からの供与を表す。
全ての細胞株はＲＰＭＩ１６４０（日水製薬製）培地（１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、各培養細胞を０．０５ｍｌずつ分注した。炭酸ガスインキュベーター内で２４時間、３７℃で培養後、上記培地により適宜希釈した薬剤を各ウェルに０．０５ｍｌずつ加え、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃、７２時間培養した。薬剤としては、Ｅｇ５阻害剤として化合物Ａおよび化合物Ｄ、対照とする微小管作用薬としてパクリタキセルおよびビノレルビンの４種を用いた。
各ウェルの細胞数の測定には、細胞増殖キットＩＩ〔Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ、ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社〕を用いた。各ウェルにキットの発色反応試薬を５０μｌ添加後、炭酸ガスインキュベーター内で３時間、３７℃で保温した後、マイクロプレートリーダー（Ｍ−Ｓｐｍａｘ２５０、和光純薬製）により、測定波長４９０ｎｍの吸光度から対照波長６５５ｎｍの吸光度を差し引いた吸光度差を測定し、細胞数の指標とした。薬剤を添加しない場合の吸光度差に対する各薬剤濃度での吸光度差の比を算出し、細胞生存率とした。マイクロプレートリーダー付属の解析ソフト ソフトマックス・プロ（ＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ、和光純薬社）を用いて、検討した薬剤濃度とその細胞生存率から、以下に示す計算式により４−パラメーターロジスティック検量線を作成し、ＧＩ５０値（Ｙ＝５０％のときのＸの値、単位ｍｏｌ／ｌ）を算出した。
Ｙ＝｛（Ａ−Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）Ｂ）｝＋Ｄ、Ｘ：薬剤濃度（ｍｏｌ／ｌ）、Ｙ：細胞生存率（％）
用いた４種の薬剤の３８細胞株のそれぞれに対する−ｌｏｇ１０ＧＩ５０の値（小数点以下２けたまで）を第４表に示す。
細胞株としては、第３表に示す肺癌由来細胞株２６株、大腸癌由来細胞株６株、膵臓癌由来細胞株４株、卵巣癌由来細胞株２株からなる３８種類を用いた。入手先のＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＪＣＲＢはＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）細胞バンク、西尾は国立がんセンターの西尾先生からの供与を表す。
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、各培養細胞を０．０５ｍｌずつ分注した。炭酸ガスインキュベーター内で２４時間、３７℃で培養後、上記培地により適宜希釈した薬剤を各ウェルに０．０５ｍｌずつ加え、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃、７２時間培養した。薬剤としては、Ｅｇ５阻害剤として化合物Ａおよび化合物Ｄ、対照とする微小管作用薬としてパクリタキセルおよびビノレルビンの４種を用いた。
各ウェルの細胞数の測定には、細胞増殖キットＩＩ〔Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ、ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社〕を用いた。各ウェルにキットの発色反応試薬を５０μｌ添加後、炭酸ガスインキュベーター内で３時間、３７℃で保温した後、マイクロプレートリーダー（Ｍ−Ｓｐｍａｘ２５０、和光純薬製）により、測定波長４９０ｎｍの吸光度から対照波長６５５ｎｍの吸光度を差し引いた吸光度差を測定し、細胞数の指標とした。薬剤を添加しない場合の吸光度差に対する各薬剤濃度での吸光度差の比を算出し、細胞生存率とした。マイクロプレートリーダー付属の解析ソフト ソフトマックス・プロ（ＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ、和光純薬社）を用いて、検討した薬剤濃度とその細胞生存率から、以下に示す計算式により４−パラメーターロジスティック検量線を作成し、ＧＩ５０値（Ｙ＝５０％のときのＸの値、単位ｍｏｌ／ｌ）を算出した。
Ｙ＝｛（Ａ−Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）Ｂ）｝＋Ｄ、Ｘ：薬剤濃度（ｍｏｌ／ｌ）、Ｙ：細胞生存率（％）
用いた４種の薬剤の３８細胞株のそれぞれに対する−ｌｏｇ１０ＧＩ５０の値（小数点以下２けたまで）を第４表に示す。
ヒト３８細胞株パネルの遺伝子発現プロファイルの取得
第３表に示したヒト３８癌細胞株について第５−１表〜第５−４表に示す１１９種類のヒト遺伝子の発現を、以下の方法に従い定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。第５−１表〜第５−４表の遺伝子名の略称は、ヒトゲノム解析機構（ＨＵＧＯ）遺伝子命名委員会（Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が認めた遺伝子の記号（ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ）がある場合は、それを用いた。
（１）ｃＤＮＡ合成
第３表に示したヒト３８細胞株を実施例１と同様に培養し、対数増殖期に細胞を回収し、全ＲＮＡをＲＮイージー〔ＲＮｅａｓｙ、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社〕を用いて抽出した。
ｃＤＮＡ合成はＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプト第１鎖合成システム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロジェン社）を用い、添付のマニュアルに従い、以下のように行った。取得した全ＲＮＡ ５μｇに対して１０ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ １μｌおよび０．５μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）１２−１８１μｌを添加し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理をした水で９μｌにフィルアップした。６５℃で５分間加熱変性後、氷上で急冷し１分以上静置し、１０×ＲＴバッファー２μｌ、２５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２４μｌ、０．１ｍｏｌ／ｌ ＤＴＴ ２μｌおよびリボヌクレアーゼアウト（ＲＮａｓｅＯＵＴ）１μｌを添加し、４２℃で２分間保温した。さらにスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴａｓｅ）１μｌ（５０単位）を加えて４２℃で５０分間の逆転写反応を行い、７０℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。この後、リボヌクレアーゼＨ １μｌを添加して３７℃で２０分間の反応後、水で希釈し全量を１ｍｌとした。以下の定量的ＲＴ−ＰＣＲの反応系には、さらに５倍希釈した溶液１０μｌを用いた。
（２）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の測定
試薬は全てＦｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ（宝酒造）を用いた。１サンプルあたり、１０×Ｒ−ＰＣＲバッファー（Ｍｇ２＋不含）２．０μｌ、２５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｍｇ２＋溶液０．２μｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ ０．６μｌ、１／２５００希釈サイバー・グリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）Ｉ １．０μｌ、４μｍｏｌ／ｌ遺伝子特異的プライマー各１．５μｌ、ＥｘＴａｑ Ｒ−ＰＣＲ ０．２μｌ、Ｈ２Ｏ ３μｌからなる反応液を調製後、９６ウェルＰＣＲプレートに１０μｌずつ分注した。各遺伝子特異的なプライマーは第５−１〜第５−４表の配列番号に示すものを用いた。さらに鋳型として（１）で調製したｃＤＮＡ １０μｌを添加しピペッティングにより撹拌した。隙間のないようにプレートをシールし、リアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲはＡＢＩ配列検出システム〔ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社〕を製品説明書に従って使用し、９５℃で５分間加熱後、９５℃で１分間（変性）、５５〜６０℃で１分間（アニーリング）、７２℃で１〜２分間（伸長）の反応サイクルを４５サイクル繰り返し、７２℃で５分間加熱する条件（アニーリング温度、伸長時間は遺伝子により異なる）でＰＣＲを行った。
得られた結果から、各遺伝子についてバックグラウンド補正後のシグナル強度が１，０００に達するサイクル数（Ｃｔ値）を求め、発現量の指標とした。このシグナル強度は増幅反応が対数的に進行し、どのようなサンプルでもプラトーに達しない条件として設定した。Ｃｔ値が小さい方が発現量が高いことを示し、Ｃｔ値差１の違いは理論的に約２倍の発現差があるものとして解釈できる。第６−１表〜第６−９表に、以上のようにして得られた３８細胞株の１１９遺伝子についてのバックグラウンド補正後のＣｔ値（小数点以下２桁まで）を、遺伝子発現プロファイルとして示した。なお、第６−７表〜第６−９表の「平均」は、各遺伝子のＣｔ値の３８細胞株間の平均値を示す。遺伝子は第５−１〜第５−４表の略称で表した。
第３表に示したヒト３８癌細胞株について第５−１表〜第５−４表に示す１１９種類のヒト遺伝子の発現を、以下の方法に従い定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。第５−１表〜第５−４表の遺伝子名の略称は、ヒトゲノム解析機構（ＨＵＧＯ）遺伝子命名委員会（Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が認めた遺伝子の記号（ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ）がある場合は、それを用いた。
第３表に示したヒト３８細胞株を実施例１と同様に培養し、対数増殖期に細胞を回収し、全ＲＮＡをＲＮイージー〔ＲＮｅａｓｙ、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社〕を用いて抽出した。
ｃＤＮＡ合成はＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプト第１鎖合成システム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロジェン社）を用い、添付のマニュアルに従い、以下のように行った。取得した全ＲＮＡ ５μｇに対して１０ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ １μｌおよび０．５μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）１２−１８１μｌを添加し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理をした水で９μｌにフィルアップした。６５℃で５分間加熱変性後、氷上で急冷し１分以上静置し、１０×ＲＴバッファー２μｌ、２５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２４μｌ、０．１ｍｏｌ／ｌ ＤＴＴ ２μｌおよびリボヌクレアーゼアウト（ＲＮａｓｅＯＵＴ）１μｌを添加し、４２℃で２分間保温した。さらにスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴａｓｅ）１μｌ（５０単位）を加えて４２℃で５０分間の逆転写反応を行い、７０℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。この後、リボヌクレアーゼＨ １μｌを添加して３７℃で２０分間の反応後、水で希釈し全量を１ｍｌとした。以下の定量的ＲＴ−ＰＣＲの反応系には、さらに５倍希釈した溶液１０μｌを用いた。
（２）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の測定
試薬は全てＦｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ（宝酒造）を用いた。１サンプルあたり、１０×Ｒ−ＰＣＲバッファー（Ｍｇ２＋不含）２．０μｌ、２５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｍｇ２＋溶液０．２μｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ ０．６μｌ、１／２５００希釈サイバー・グリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）Ｉ １．０μｌ、４μｍｏｌ／ｌ遺伝子特異的プライマー各１．５μｌ、ＥｘＴａｑ Ｒ−ＰＣＲ ０．２μｌ、Ｈ２Ｏ ３μｌからなる反応液を調製後、９６ウェルＰＣＲプレートに１０μｌずつ分注した。各遺伝子特異的なプライマーは第５−１〜第５−４表の配列番号に示すものを用いた。さらに鋳型として（１）で調製したｃＤＮＡ １０μｌを添加しピペッティングにより撹拌した。隙間のないようにプレートをシールし、リアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲはＡＢＩ配列検出システム〔ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社〕を製品説明書に従って使用し、９５℃で５分間加熱後、９５℃で１分間（変性）、５５〜６０℃で１分間（アニーリング）、７２℃で１〜２分間（伸長）の反応サイクルを４５サイクル繰り返し、７２℃で５分間加熱する条件（アニーリング温度、伸長時間は遺伝子により異なる）でＰＣＲを行った。
得られた結果から、各遺伝子についてバックグラウンド補正後のシグナル強度が１，０００に達するサイクル数（Ｃｔ値）を求め、発現量の指標とした。このシグナル強度は増幅反応が対数的に進行し、どのようなサンプルでもプラトーに達しない条件として設定した。Ｃｔ値が小さい方が発現量が高いことを示し、Ｃｔ値差１の違いは理論的に約２倍の発現差があるものとして解釈できる。第６−１表〜第６−９表に、以上のようにして得られた３８細胞株の１１９遺伝子についてのバックグラウンド補正後のＣｔ値（小数点以下２桁まで）を、遺伝子発現プロファイルとして示した。なお、第６−７表〜第６−９表の「平均」は、各遺伝子のＣｔ値の３８細胞株間の平均値を示す。遺伝子は第５−１〜第５−４表の略称で表した。
遺伝子発現プロファイルとＥｇ５阻害剤に対する感受性の相関解析
Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関係する遺伝子群を探索するため、実施例１で得られたＥｇ５阻害剤に対する感受性のデータと実施例２で得られた遺伝子発現プロファイルのデータを統合し、その相関解析を行った。同じ組織由来の細胞株毎に解析することが重要であると考え、肺癌由来２６細胞株についての、実施例２の第６−１表〜第６−６表に示した１１９遺伝子の発現プロファイルと実施例１の第４表に示したＥｇ５阻害剤を含む４種の薬剤に対する感受性のデータを用いて、以下に示す計算式で計算されるピアソンの相関係数ｒの計算を行った。
ここで、ｘｉは細胞ｉにおける遺伝子ｘのバックグラウンド補正後のＣｔ値（Ｃｔｘ）であり、遺伝子ｘの発現量を示す。ｙｉは細胞ｉにおける薬剤ｙのＧＩ５０値（ＧＩ５０ｙ）の対数に−１を掛けたもの（−ｌｏｇ１０ＧＩ５０ｙ）であり、細胞ｉの薬剤ｙに対する感受性を示す。ｘｍは遺伝子ｘの発現量（Ｃｔｘ）の細胞株間の平均値を示し、ｙｍは薬剤ｙに対する感受性（−ｌｏｇ１０ＧＩ５０ｙ）の細胞株間の平均値を示す。各遺伝子の発現量と各薬剤に対する感受性との相関係数ｒを第７−１表〜第７−３表に示す。各遺伝子は第５−１表〜第５−４表の略称で示した。
相関係数ｒは−１から１までの値をとりうるが、０から離れ、１に近いほど遺伝子ｘの発現量と薬剤ｙに対する感受性に正の相関が、−１に近いほど負の相関があることを示す。Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子として、その発現量と化合物Ａに対する感受性との相関係数ｒの絶対値が０．３３以上（ｒが「−０．３３と等しいかより小さい」かまたは「０．３３と等しいかより大きい」）を示す遺伝子１９種を選抜した。第８表に、このようにして選抜された１９遺伝子の各薬剤における相関係数を示した。感受性・耐性の欄は、化合物Ａにおける相関係数ｒが負の数で、化合物Ａに対する感受性が低い、つまり耐性が高い細胞株ほど発現量が高い遺伝子には「耐性」を、化合物Ａにおける相関係数ｒが正の数で、化合物Ａに対する感受性が高いほど、発現量が高い遺伝子には「感受性」を記載した。
第８表に示す通り、７種の遺伝子が感受性遺伝子（感受性の高い細胞株で高発現している遺伝子）、１２種の遺伝子が耐性遺伝子（感受性の低い細胞株で高発現している遺伝子）として選抜された。これら全ての遺伝子が、化合物Ｄにおいても相関係数の値の符号が一致しており、うち１７種（感受性７種中６種、耐性１２種中１１種）については、化合物Ｄにおいても相関係数の絶対値が０．３３以上であった。以上の結果と、化合物Ａと化合物Ｄの構造に共通性はないことを考え合せると、第８表に示した選抜された１９遺伝子は、Ｅｇ５阻害剤という共通の作用機構を有する化合物群の薬剤感受性に一般的に関与する遺伝子であると考えられる。一方、Ｅｇ５阻害活性を有さないパクリタキセルおよびビノレルビンについてはＢＩＲＣ３のみが共通に高い相関係数の絶対値を示したのみであり、Ｅｇ５阻害剤とは異なる薬剤感受性決定機構が存在することが示唆された。
これら遺伝子のうち、耐性遺伝子であるＢＩＲＣ３は細胞死を抑制する遺伝子として知られ、感受性遺伝子であるＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２は細胞周期に関係する遺伝子である。また、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３といった薬剤トランスポーター遺伝子、乳癌での高発現が報告されているチトクロームＰ４５０ファミリーに属するＣＹＰ２４Ａ１が含まれていた。
これらの遺伝子群はＥｇ５阻害剤に対する感受性予測のマーカーとして利用できるものを含む他、あるものは実際にＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定していると考えられる。
Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関係する遺伝子群を探索するため、実施例１で得られたＥｇ５阻害剤に対する感受性のデータと実施例２で得られた遺伝子発現プロファイルのデータを統合し、その相関解析を行った。同じ組織由来の細胞株毎に解析することが重要であると考え、肺癌由来２６細胞株についての、実施例２の第６−１表〜第６−６表に示した１１９遺伝子の発現プロファイルと実施例１の第４表に示したＥｇ５阻害剤を含む４種の薬剤に対する感受性のデータを用いて、以下に示す計算式で計算されるピアソンの相関係数ｒの計算を行った。
これら遺伝子のうち、耐性遺伝子であるＢＩＲＣ３は細胞死を抑制する遺伝子として知られ、感受性遺伝子であるＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２は細胞周期に関係する遺伝子である。また、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３といった薬剤トランスポーター遺伝子、乳癌での高発現が報告されているチトクロームＰ４５０ファミリーに属するＣＹＰ２４Ａ１が含まれていた。
これらの遺伝子群はＥｇ５阻害剤に対する感受性予測のマーカーとして利用できるものを含む他、あるものは実際にＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定していると考えられる。
Ｅｇ５感受性相関遺伝子による感受性予測モデルの構築
（１）統計モデルの適用
Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に相関する遺伝子の発現量と肺癌由来細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の関係から統計モデルを構築し、遺伝子発現量から感受性を予測するモデルとした。統計モデルとしては重回帰モデルを用いた。一般的な重回帰モデル式を式１として示す。式１に、（ｎ＋１）個の標本の説明変量と目的変量それぞれの実際の値を導入した（ｎ＋１）個の一次線形多項式を解くことにより各項の偏回帰係数ａ１、ａ２、…ａｎおよび定数項ｂを決定することができる。得られた偏回帰係数ａ１、ａ２、…ａｎおよび定数項ｂを用いた式１に、説明変量の値Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎを代入することにより、目的変量の予測値Ｙを計算することができる。
Ｙ＝ａ１Ｘ１＋ａ２Ｘ２＋・・・・＋ａｎＸｎ＋ｂ （式１）
Ｙ：目的変量
Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎ：説明変量
ａ１、ａ２、…ａｎ：偏回帰係数
ｂ：定数項
上記の重回帰モデル式の目的変量に肺癌細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性、説明変量にＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関する遺伝子の発現量を適用することで感受性予測モデルとした。具体的には、遺伝子の発現量としてはＣｔ値を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性としては、−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値を用いた。
（２）肺癌由来細胞における感受性相関遺伝子による感受性予測モデルの構築と評価
（ｉ）初期モデルの構築
実施例３で選抜された肺由来細胞株の感受性に相関する１９遺伝子（第８表）の、肺癌２０細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９におけるＣｔ値と、同じ肺癌２０細胞株の−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値を（１）の重回帰モデルに適用した。得られる２０個の一次線形多項式を解くことにより各偏回帰係数項および定数項を決定した。第９表に、決定された各遺伝子の偏回帰係数を示した。なお、定数項ｂの値は０であった。得られた式を初期重回帰モデルＡとした。遺伝子ｉに割り当てられる点数は、ｉ項の偏回帰係数ａｉと遺伝子ｉのＣｔ値（Ｃｔｉ）の積ａｉＣｔｉで表される。ある細胞について、上記の１９遺伝子それぞれの点数ａ１Ｃｔ１、ａ２Ｃｔ２、…ａ１９Ｃｔ１９の合計とｂの値から、該細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値−ｌｏｇ１０ＧＩ５０を計算できる。
（ｉｉ）最適化モデルの構築
（ｉ）で構築された初期モデルは、説明変量の数が１９個と多いため、複雑である。この初期モデルに対し、重回帰モデルを最適化することにより目的変量の予測に重要な説明変量を選択し、モデルの複雑さを抑えながら、予測精度を上げることができる。モデルの最適化の指標としては、Ｃｐ統計量（「すぐわかる統計用語」石村貞夫著、東京図書）用いた。具体的には統計解析ソフト「Ｓ−Ｐｌｕｓ２０００」（（株）数理システム）上でステップワイズ線形回帰法（Ｓ＿ＰＬＵＳ２０００ユーザーズガイド）を実行することで、初期モデルに対し説明変量を１つずつ除いた場合のモデルについての各偏回帰係数項を決定し、その結果からＣｐ統計量を計算し、Ｃｐ統計量の値がより小さいモデルをよりすぐれたモデルとして選択することを繰り返すことにより、モデルの最適化を行った。これにより、説明変量の数を８少なくした、１１遺伝子からなる肺癌最適化モデルＡ’が構築された。最適化モデルＡ’で選択された説明変量となる遺伝子と偏回帰係数の値を第１０表に示す。なお、定数項ｂの値は０であった。
（ｉｉｉ）モデルの評価
実施例１の肺癌細胞株中、モデル構築に用いなかった６細胞株（Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｎ４１７、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４およびＳＨＰ−７７）の遺伝子発現量を、（ｉｉ）で構築した最適化モデルＡ’に適用することで６細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値を計算し、残差（実測値−予測値）を見ることで本最適化モデルＡ’の評価を行った。最適化モデルＡ’で決定した各１１遺伝子の偏回帰係数ａと、実施例２で測定した各遺伝子の発現量（Ｃｔ値）から各遺伝子の点数（ａとＣｔの積）を計算し、これらの点数から感受性（−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値）の予測値を計算した（第１１表）。この予測値と実施例１の第４表に示した−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の実測値を比較したところ、６株中４株（Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｎ４１７およびＳＢＣ−３）で−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の残差の絶対値が０．３以下で、また６株の残差の絶対値の平均＝０．２２であり、残差の少ない良い予測値が得られていた（第１１表）。したがって、本最適化モデルＡ’が肺癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性予測に有効であることが示された。
（３）他の癌種への応用
実施例１のヒト３８細胞株中、肺癌以外の他の癌腫１２細胞株（大腸癌６株：ＣＯＬＯ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒ、すい臓癌４株：ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、卵巣癌２株：ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３）の遺伝子発現量を実施例４（２）で構築した肺癌最適化モデルＡ’に適用することで１２細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値を計算し、残差を見ることで本最適化モデルＡ’の評価を行った。肺癌最適化モデルＡ’で決定した各１１遺伝子の偏回帰係数ａと、実施例２で測定した各遺伝子の発現量（Ｃｔ値）から各遺伝子の点数（ａとＣｔの積）を計算し、これらの点数から感受性（−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値）の予測値を計算した。この予測値と実施例１の第４表に示した−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の実測値を比較したところ、１２株中７株で−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の残差の絶対値が０．３以下で、また１２株の残差の絶対値の平均＝０．２８であり、肺癌細胞株に近い予測精度が得られていた（第１２−１表および第１２−２表）。したがって、肺癌を基に作成された本モデルが肺癌のみならず、他の癌腫のＥｇ５阻害剤に対する感受性予測にも有効であることが示された。
（１）統計モデルの適用
Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に相関する遺伝子の発現量と肺癌由来細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の関係から統計モデルを構築し、遺伝子発現量から感受性を予測するモデルとした。統計モデルとしては重回帰モデルを用いた。一般的な重回帰モデル式を式１として示す。式１に、（ｎ＋１）個の標本の説明変量と目的変量それぞれの実際の値を導入した（ｎ＋１）個の一次線形多項式を解くことにより各項の偏回帰係数ａ１、ａ２、…ａｎおよび定数項ｂを決定することができる。得られた偏回帰係数ａ１、ａ２、…ａｎおよび定数項ｂを用いた式１に、説明変量の値Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎを代入することにより、目的変量の予測値Ｙを計算することができる。
Ｙ＝ａ１Ｘ１＋ａ２Ｘ２＋・・・・＋ａｎＸｎ＋ｂ （式１）
Ｙ：目的変量
Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｎ：説明変量
ａ１、ａ２、…ａｎ：偏回帰係数
ｂ：定数項
上記の重回帰モデル式の目的変量に肺癌細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性、説明変量にＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関する遺伝子の発現量を適用することで感受性予測モデルとした。具体的には、遺伝子の発現量としてはＣｔ値を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性としては、−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値を用いた。
（２）肺癌由来細胞における感受性相関遺伝子による感受性予測モデルの構築と評価
（ｉ）初期モデルの構築
実施例３で選抜された肺由来細胞株の感受性に相関する１９遺伝子（第８表）の、肺癌２０細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９におけるＣｔ値と、同じ肺癌２０細胞株の−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値を（１）の重回帰モデルに適用した。得られる２０個の一次線形多項式を解くことにより各偏回帰係数項および定数項を決定した。第９表に、決定された各遺伝子の偏回帰係数を示した。なお、定数項ｂの値は０であった。得られた式を初期重回帰モデルＡとした。遺伝子ｉに割り当てられる点数は、ｉ項の偏回帰係数ａｉと遺伝子ｉのＣｔ値（Ｃｔｉ）の積ａｉＣｔｉで表される。ある細胞について、上記の１９遺伝子それぞれの点数ａ１Ｃｔ１、ａ２Ｃｔ２、…ａ１９Ｃｔ１９の合計とｂの値から、該細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値−ｌｏｇ１０ＧＩ５０を計算できる。
（ｉ）で構築された初期モデルは、説明変量の数が１９個と多いため、複雑である。この初期モデルに対し、重回帰モデルを最適化することにより目的変量の予測に重要な説明変量を選択し、モデルの複雑さを抑えながら、予測精度を上げることができる。モデルの最適化の指標としては、Ｃｐ統計量（「すぐわかる統計用語」石村貞夫著、東京図書）用いた。具体的には統計解析ソフト「Ｓ−Ｐｌｕｓ２０００」（（株）数理システム）上でステップワイズ線形回帰法（Ｓ＿ＰＬＵＳ２０００ユーザーズガイド）を実行することで、初期モデルに対し説明変量を１つずつ除いた場合のモデルについての各偏回帰係数項を決定し、その結果からＣｐ統計量を計算し、Ｃｐ統計量の値がより小さいモデルをよりすぐれたモデルとして選択することを繰り返すことにより、モデルの最適化を行った。これにより、説明変量の数を８少なくした、１１遺伝子からなる肺癌最適化モデルＡ’が構築された。最適化モデルＡ’で選択された説明変量となる遺伝子と偏回帰係数の値を第１０表に示す。なお、定数項ｂの値は０であった。
実施例１の肺癌細胞株中、モデル構築に用いなかった６細胞株（Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｎ４１７、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４およびＳＨＰ−７７）の遺伝子発現量を、（ｉｉ）で構築した最適化モデルＡ’に適用することで６細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値を計算し、残差（実測値−予測値）を見ることで本最適化モデルＡ’の評価を行った。最適化モデルＡ’で決定した各１１遺伝子の偏回帰係数ａと、実施例２で測定した各遺伝子の発現量（Ｃｔ値）から各遺伝子の点数（ａとＣｔの積）を計算し、これらの点数から感受性（−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値）の予測値を計算した（第１１表）。この予測値と実施例１の第４表に示した−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の実測値を比較したところ、６株中４株（Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｎ４１７およびＳＢＣ−３）で−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の残差の絶対値が０．３以下で、また６株の残差の絶対値の平均＝０．２２であり、残差の少ない良い予測値が得られていた（第１１表）。したがって、本最適化モデルＡ’が肺癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性予測に有効であることが示された。
実施例１のヒト３８細胞株中、肺癌以外の他の癌腫１２細胞株（大腸癌６株：ＣＯＬＯ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒ、すい臓癌４株：ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、卵巣癌２株：ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３）の遺伝子発現量を実施例４（２）で構築した肺癌最適化モデルＡ’に適用することで１２細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値を計算し、残差を見ることで本最適化モデルＡ’の評価を行った。肺癌最適化モデルＡ’で決定した各１１遺伝子の偏回帰係数ａと、実施例２で測定した各遺伝子の発現量（Ｃｔ値）から各遺伝子の点数（ａとＣｔの積）を計算し、これらの点数から感受性（−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値）の予測値を計算した。この予測値と実施例１の第４表に示した−Ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の実測値を比較したところ、１２株中７株で−ｌｏｇ１０ＧＩ５０値の残差の絶対値が０．３以下で、また１２株の残差の絶対値の平均＝０．２８であり、肺癌細胞株に近い予測精度が得られていた（第１２−１表および第１２−２表）。したがって、肺癌を基に作成された本モデルが肺癌のみならず、他の癌腫のＥｇ５阻害剤に対する感受性予測にも有効であることが示された。
選抜されたＥｇ５感受性関与遺伝子のヒト臨床癌組織における発現
実施例３で示した遺伝子発現プロファイルと感受性の相関解析の実験結果から選抜された１９遺伝子中の１４遺伝子（ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３Ｃ、ＡＢＣＣ３、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９）およびポジティブコントロールとしてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤについて、ヒト癌組織における発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。
クロンテック社市販の同一患者に由来する癌および正常組織のｃＤＮＡ〔Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒｓ、ヒト卵巣１〜５、Ａ〜Ｅ（計１０サンプル）、ヒト乳房４、Ａ〜Ｅ（計６サンプル）〕を用いて解析を行った。リアルタイムＰＣＲ法は実施例２に示した方法で行った。コントロールとして、鋳型をいれずに代わりに水を用いたものも行った。
結果は実施例１と同様にして求めたＣｔ値で示した。卵巣ｃＤＮＡの結果を第１３表に、乳房ｃＤＮＡの結果を第１４表に示す。各遺伝子の上段は、正常組織での発現量、下段は癌組織での発現量を示す。
ＡＢＣＣ２を除く１３種の遺伝子群では調べた卵巣癌、乳癌組織のほぼ全てにおいて４０以下のＣｔ値を示した。このことは、これらの癌組織で調べた遺伝子が発現していることを意味している。
今回の解析結果より、１４種中１３種の遺伝子で癌組織での発現が認められた。従って、今回選択された第８表に示した１９遺伝子のヒト癌組織での発現を調べることで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に利用できると考えられる。
実施例３で示した遺伝子発現プロファイルと感受性の相関解析の実験結果から選抜された１９遺伝子中の１４遺伝子（ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３Ｃ、ＡＢＣＣ３、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９）およびポジティブコントロールとしてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤについて、ヒト癌組織における発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。
クロンテック社市販の同一患者に由来する癌および正常組織のｃＤＮＡ〔Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒｓ、ヒト卵巣１〜５、Ａ〜Ｅ（計１０サンプル）、ヒト乳房４、Ａ〜Ｅ（計６サンプル）〕を用いて解析を行った。リアルタイムＰＣＲ法は実施例２に示した方法で行った。コントロールとして、鋳型をいれずに代わりに水を用いたものも行った。
結果は実施例１と同様にして求めたＣｔ値で示した。卵巣ｃＤＮＡの結果を第１３表に、乳房ｃＤＮＡの結果を第１４表に示す。各遺伝子の上段は、正常組織での発現量、下段は癌組織での発現量を示す。
今回の解析結果より、１４種中１３種の遺伝子で癌組織での発現が認められた。従って、今回選択された第８表に示した１９遺伝子のヒト癌組織での発現を調べることで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に利用できると考えられる。
本発明により、癌患者より取り出された癌細胞および癌細胞株における、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を予測する遺伝子を選抜することができ、それらの遺伝子を用いた癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の判定が可能となる。また、それらの遺伝子を用いて、あるいはそれら遺伝子の発現を制御することにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することが可能となる。その結果、Ｅｇ５阻害剤による癌の治療を効果的に行うことができる。
配列番号１−発明者：篠原 史一；大林 正也；吉田 哲郎
発明者：辻田 徹也；中井 龍一郎
発明者：山下 順範
発明者：辻田 徹也；中井 龍一郎
発明者：山下 順範
Claims (54)
- 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法。 - 工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒからなる大腸癌由来の細胞株、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３からなる膵臓癌由来の細胞株、ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３からなる卵巣癌由来の細胞株からなる群から選択される全てあるいは一部の細胞株である、請求項１に記載の方法。
- 選択される細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株から選択される全てあるいは一部の細胞株である、請求項２に記載の方法。
- 工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株である請求項１に記載の方法。
- １つの特定の臓器が肺である請求項４に記載の方法。
- 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（Ｉ）
＜式中、
Ｒ１およびＲ４は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表し、
Ｒ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−Ｃ（＝Ｗ）Ｒ６［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子を表し、Ｒ６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ７とＲ８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＯＲ９（式中、Ｒ９は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）または−ＳＲ１０（式中、Ｒ１０は前記のＲ９と同義である）を表す］、−ＮＲ１１Ｒ１２｛式中、Ｒ１１およびＲ１２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１３［式中、Ｒ１３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ７ＡＲ８Ａ（式中、Ｒ７ＡおよびＲ８Ａはそれぞれ前記のＲ７およびＲ８と同義である）、−ＯＲ９Ａ（式中、Ｒ９Ａは前記のＲ９と同義である）または−ＳＲ１０Ａ（式中、Ｒ１０Ａは前記のＲ９と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ２Ｒ１４（式中、Ｒ１４は前記のＲ９と同義である）を表すか、またはＲ１とＲ２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、
Ｒ５は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ４とＲ５が一緒になって−（ＣＲ１５ＡＲ１５Ｂ）ｍ１−Ｑ−（ＣＲ１５ＣＲ１５Ｄ）ｍ２−｛式中、Ｑは単結合、置換もしくは非置換のフェニレンまたはシクロアルキレンを表し、ｍ１およびｍ２は同一または異なって０〜４の整数を表すが、ｍ１とｍ２は同時に０とはならず、Ｒ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄは同一または異なって、水素原子、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、−ＯＲ１６［式中、Ｒ１６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＮＲ７ＢＲ８Ｂ（式中、Ｒ７ＢおよびＲ８Ｂは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ７ＢとＲ８Ｂが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＳＯ２ＮＲ７ＣＲ８Ｃ（式中Ｒ７ＣおよびＲ８Ｃはそれぞれ前記のＲ７ＢおよびＲ８Ｂと同義である）または−ＣＯＲ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］、−ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１８およびＲ１９は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＲ２０（式中、Ｒ２０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノまたは置換もしくは非置換のアリールアミノを表す）または−ＳＯ２Ｒ２１（式中、Ｒ２１は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］または−ＣＯ２Ｒ２２（式中、Ｒ２２は前記のＲ１７と同義である）を表すか、またはＲ１５ＡＲ１５ＢまたはＲ１５ＣとＲ１５Ｄが一緒になって酸素原子を表し、ｍ１またはｍ２が２以上の整数であるとき、それぞれのＲ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄは同一でも異なっていてもよく、隣接するふたつの炭素原子に結合するＲ１５Ａ、Ｒ１５Ｂ、Ｒ１５ＣおよびＲ１５Ｄはそれぞれ一緒になって結合を形成してもよい｝を表し、
Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝ＷＡ）Ｒ２３（式中、ＷＡおよびＲ２３はそれぞれ前記のＷおよびＲ６と同義である）を表す＞で表されるチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。 - Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６Ａ（式中、Ｒ６Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ３が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２３Ａ（式中、Ｒ２３Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ４が置換低級アルキルであり、Ｒ５がフェニルである請求項６に記載の方法。
- Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎａＮＨＳＯ２Ｒａ（式中、ｎａは１または２であり、Ｒａは置換もしくは非置換の低級アルキルを表す）である請求項６または７に記載の方法。
- 一般式（Ｉ）で表されるチアジアゾリン誘導体が下記式（Ａ）〜（Ｃ）および（Ｅ）〜（Ｐ）で表される化合物からなる群から選択される化合物である請求項６に記載の方法。
- 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（ＩＩ）
（式中、Ｒ２４は置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｒ２５およびＲ２６は同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表すか、またはＲ２５とＲ２６が一緒になって酸素原子、硫黄原子または結合を表す）で表されるシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。 - システイン誘導体がＬ−システイン誘導体である請求項１０に記載の方法。
- Ｒ２４がフェニル、４−メチルフェニル、２−ナフチル、４−ピリジル、または１，３−ベンゾジオキソール−５−イルであり、Ｒ２５およびＲ２６が同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはヒドロキシメチルである請求項１０または１１に記載の方法。
- 感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、下記式（Ｑ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
- 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程
（ａ）請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法により同定された遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に応じた点数を決定する工程、
（ｂ）被験癌細胞について、工程（ａ）で選択された遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程、
（ｄ）選択された全遺伝子についての割り当てられた点数から、被験癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の指標となる数値を求める工程、
（ｅ）あらかじめ決定した閾値と（ｄ）で得られた数値とを比較する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法。 - 工程（ａ）で選択する遺伝子が、以下の（ｉ）〜（ｘｉｘ）それぞれの遺伝子からなる遺伝子群から選択される１以上の遺伝子である請求項１４に記載の方法。
（ｉ）チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＣＹＰ２４Ａ１）
（ｉｉ）レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＯＢＲＧＲＰ）
（ｉｉｉ）Ｂ因子（ＢＦ）
（ｉｖ）アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）
（ｖ）バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＢＩＲＣ３）
（ｖｉ）シーケストソーム１（ＳＱＳＴＭ１）
（ｖｉｉ）腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＴＮＦＡＩＰ２）
（ｖｉｉｉ）膜内在性蛋白質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）
（ｉｘ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＡＢＣＣ２）
（ｘ）アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）
（ｘｉ）相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＦＡＭ３Ｃ）
（ｘｉｉ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＡＢＣＣ３）
（ｘｉｉｉ）仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＢＣ００７４３６）
（ｘｉｖ）微小管関連蛋白質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）
（ｘｖ）サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
（ｘｖｉ）ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＨＳＰＣＡ）
（ｘｖｉｉ）サイクリンＢ２（ＣＣＮＢ２）
（ｘｖｉｉｉ）仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＦＬＪ２３２６９）
（ｘｉｘ）溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＳＬＣ１２Ａ２） - （ａ）の工程で選択される遺伝子が、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９である請求項１５に記載の方法。
- Ｅｇ５阻害剤が、請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
- Ｅｇ５阻害剤が、請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
- Ｅｇ５阻害剤が、請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
- 癌細胞が肺癌細胞である請求項１４から１９のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイにより定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをノーザンブロットにより定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項２２に記載の方法において使用するための、該ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡの定量試薬。
- 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を免疫化学的方法により定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をＥＬＩＳＡにより定量することにより行う、請求項２５に記載の方法。
- 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をウエスタンブロットにより定量することにより行う、請求項２５に記載の方法。
- 請求項２５から２７のいずれか１項に記載の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬。
- ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
- 細胞が肺癌細胞である請求項２９に記載の感受性増強薬。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項２９または３０に記載の感受性増強薬。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項２９または３０に記載の感受性増強薬。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項２９または３０に記載の感受性増強薬。
- 細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を増加させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
- 細胞が肺癌細胞である請求項３４に記載のスクリーニング方法。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３４または３５に記載のスクリーニング方法。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３４または３５に記載のスクリーニング方法。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項３４または３５に記載のスクリーニング方法。
- ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
- 癌細胞が肺癌細胞である請求項３９に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３９または４０に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３９または４０に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項３９または４０に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
- 請求項３９から４３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクター。
- 請求項３９から４３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは請求項４４に記載のベクターを含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
- ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択されるいずれかの遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子にコードされる蛋白質に対する抗体を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項４６に記載の感受性増強薬。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項４６に記載の感受性増強薬。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項４６に記載の感受性増強薬。
- 細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を減少させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
- 細胞が肺癌細胞である請求項５０に記載のスクリーニング方法。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項５０または５１に記載のスクリーニング方法。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項５０または５１に記載のスクリーニング方法。
- Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項５０または５１に記載のスクリーニング方法。
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