JPWO2005053741A1 - ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬 - Google Patents

Abstract

ヒトＣＣケモカイン受容体４に対する遺伝子組換え抗体あるいはその抗体断片、または薬剤のいずれかの単独投与よりも高い治療効果を与える医薬を提供する。

Description

本発明は、ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬に関する。

ケモカイン受容体にリガンドが結合すると、白血球の遊走が誘導される。正常組織において主としてＴｈ２型のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞上に発現しているヒトＣＣケモカイン受容体４（以下ＣＣＲ４と称する）はケモカイン受容体ファミリーの一種である［Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，８１（１９９９）］。ＣＣＲ４はリガンドであるＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）またはＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）と特異的に結合する。Ｔｈ２型のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は液性免疫における制御細胞であり、アレルギーや自己免疫疾患において重要な役割を果たしていると考えられている。
Ｔ細胞系統の白血病／リンパ腫細胞では、種々のケモカイン受容体が発現しており、Ｔ細胞白血病／リンパ腫のサブタイプと細胞で発現される受容体の種類との間には関連がある。白血病／リンパ腫細胞においてＣＣＲ４は高い頻度で発現していることが報告された［Ｂｌｏｏｄ，９６，６８５（２０００）］。ＣＣＲ４はＡＬＫ−陽性異型性大細胞リンパ腫（ＡＬＫ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、菌状息肉症細胞（ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ）で高頻度に発現しているので、特定の癌種においては非常に選択性の高い腫瘍マーカーとなりうる可能性が示唆された［Ｂｌｏｏｄ，９６，６８５（２０００）、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５，８３８（２００２）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１９，１４０５（２００２）］。またヒトＴ細胞性白血病ウイルス１型（ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）の感染が原因である成人Ｔ細胞性白血病（以下ＡＴＬと称す；ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）でも、ＣＣＲ４が非常に高い頻度で発現していることが報告された［Ｂｌｏｏｄ，９９，１５０５（２００２）］。また、ＡＴＬにおけるＣＣＲ４発現に関しては、ＣＣＲ４の発現は予後不良と有意に相関する［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９，３６２５（２００３）］。さらに慢性Ｔ細胞性白血病（以下ＣＴＬと称す；ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）の細胞でもＣＣＲ４は選択的に発現している［Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１９，１４０５（２００２）］。
白血病／リンパ腫に対する主な治療法は、複数の低分子抗癌剤の組み合わせを中心とした化学療法である。しかしながら、これまでに充分な治療効果が得られる化学療法は知られていない［癌と化学療法、２６，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ，１６５−１７２，（１９９９）］。
上記のＣＣＲ４陽性の白血病／リンパ腫の中でも、特にＡＴＬの予後が不良である。通常行われているＣＨＯＰ療法（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ｄｏｘｒｕｂｉｃｉｎ、ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅの併用療法）を行なったＡＴＬ全体の７割以上を占める急性型あるいはリンパ腫型患者のうち、４年生存率は５％程度である［Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７９，４２８−４３７（１９９１）］。
通常の化学療法では、薬剤耐性腫瘍細胞の出現などにより寛解を導入することが難しい場合があるが、化学療法と抗体との併用により優れた治療成績が得られる場合がある。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕヒト化抗体ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ／ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｏｃｈｅ社）はｔａｘａｎｅ系抗癌剤との併用療法により乳癌に対して顕著な効果を示した［Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２１，３０９（１９９９）］。また、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘａｎ／ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ＩＤＥＣ社）は多剤療法との併用療法によりＢ細胞リンパ腫に対して顕著な効果を示した［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，２６８（１９９９）］。
抗体とサイトカインとを用いる併用療法も腫瘍に対する新たな免疫療法として期待されている。サイトカインは免疫反応における細胞間相互作用を司る種々の液性因子の総称である。細胞障害活性の一つである抗体依存性細胞障害活性（以下ＡＤＣＣ活性と称す）は、単核球、マクロファージ、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞に抗体が結合することにより引き起こされる［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，１９９２（１９８７）］。サイトカインはエフェクター細胞を活性化する目的で、抗体とサイトカインを組み合わせて用いる併用療法が試みられている。Ｂ細胞系の白血病／リンパ腫に対しては、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８とインターロイキン（ＩＬ）−２［Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１１７，８２８−８３４（２００２）］、あるいはＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８と顆粒球コロニー刺激因子［Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７，１６５８−１６６４（２００３）］との併用投与の臨床試験が行われているが、抗体を単独で使用した場合と比較して顕著な治療効果は認められていない。
上記のＣＣＲ４陽性の白血病／リンパ腫に対し、抗ＣＣＲ４抗体ＫＭ２７６０は、ＡＤＣＣ活性を介して選択的に腫瘍細胞を減少させる治療薬として知られている（ＷＯ０３／１８６３５）。これまでに抗ＣＣＲ４抗体と化学療法剤またはサイトカインとの併用については知られていない。
癌、特に白血病・リンパ腫の治療において、十分な効果を奏する治療方法はこれまでに知られていない。

本発明の目的は、ＣＣＲ４に対する遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（２６）に関する。
（１） ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬。
（２） ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを併用して投与するための医薬。
（３） ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを同時に又は逐次的に投与するための医薬。
（４） 医薬が、抗腫瘍剤であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の医薬。
（５） 腫瘍がＣＣＲ４を発現している腫瘍である上記（４）に記載の医薬。
（６） ＣＣＲ４が発現している腫瘍が造血器腫瘍である上記（５）に記載の医薬。
（７） ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合し、ヒト血小板に反応性を示さない抗体である上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の医薬。
（８） ＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ＣＣＲ４リガンドであるＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）またはＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）のＣＣＲ４への結合を阻害する活性を有さない上記（７）に記載の医薬。
（９） 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６および２７１〜２８４番目からなる群から選ばれる細胞外領域である上記（７）または（８）に記載の医薬。
（１０） 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２〜２９番目に存在するエピトープである上記（７）〜（９）のいずれか１項に記載の医薬。
（１１） 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２９番目に存在するエピトープである上記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の医薬。
（１２） 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目に存在するエピトープである上記（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の医薬。
（１３） ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目を含むペプチドのうち、１６、１９、２０および２２番目の少なくとも１つのチロシン残基が硫酸化されたペプチドへの結合性が配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目を含むペプチドへの結合性よりも低いことを特徴とする上記（１２）に記載の医薬。
（１４） ＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ハイブリドーマＫＭ２１６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００９０）が生産するモノクローナル抗体が認識するエピトープに特異的に反応する抗体または該抗体断片である、上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の医薬。
（１５） ヒト型遺伝子組換え抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である上記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の医薬。
（１６） ヒト型キメラ抗体がＣＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、上記（１５）に記載の医薬。
（１７） ヒト型キメラ抗体が配列番号５、６、７で表されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１５）または（１６）に記載の医薬。
（１８） ヒト型キメラ抗体が配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および／または配列番号１２で表される抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む上記（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の医薬。
（１９） ヒト型ＣＤＲ移植抗体がＣＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、上記（１５）に記載の医薬。
（２０） ヒト型ＣＤＲ移植抗体が配列番号５、６、７で表されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１５）または（１９）に記載の医薬。
（２１） ヒト型ＣＤＲ移植抗体が配列番号１６または１７で示されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列からなる抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および／または配列番号１８で表される抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む、上記（１５）、（１８）および（２０）のいずれか１項に記載の医薬。
（２２） 薬剤が、蛋白質または低分子の薬剤である上記（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の医薬。
（２３） 蛋白質が、サイトカインまたは抗体である、上記（２２）記載の医薬。
（２４） サイトカインが、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、ＩＬ−２およびＩＬ−１５から選ばれるサイトカインである上記（２３）記載の医薬。
（２５） 低分子の薬剤が、化学療法剤またはホルモン療法剤である上記（１）〜（２４）のいずれか１項に記載の医薬。
（２６） 化学療法剤が、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、エトポシドおよびメトトレキセートから選ばれる薬剤である上記（２５）に記載の薬剤。
本発明の医薬の形態としては、ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬、ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを併用して投与するための医薬、ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを同時に又は逐次的に投与するための医薬があげられる。
ここで、組み合わせてなる医薬とは、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片と少なくとも１種類の薬剤とを別々に調製し、これらの薬剤を組み合わせて同時にまたは逐次的に投与する医薬であってもよいし、それぞれの薬剤成分を混合させた合剤であってもよい。それぞれの薬剤成分を混合させた合剤には、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片に少なくとも１種類の薬剤を結合させた融合抗体なども包含する。
本発明におけるＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片（以下、両者を総称して本発明における抗体と表記することもある）としては、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に反応する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片があげられるが、ヒト血小板に反応性を示さない遺伝子組換え抗体またはその抗体断片、高いＡＤＣＣ活性を有する遺伝子組換え抗体またはその抗体断片などが好ましい。
ここで抗体がヒト血小板に反応性を示さないとは、抗体がヒト血小板と実質的に反応しないことをいい、具体的には、フローサイトメーターによる測定で反応性を示さないことをいう。
また、本発明における抗体として、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６または２７１〜２８４番目を含む領域、より好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列の２〜２９番目（配列番号２）、さらに好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列の１２〜２９番目（配列番号３）、特に好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目（配列番号４）に、特異的に反応する抗体があげられる。また、ハイブリドーマＫＭ２１６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００９０）が生産するＣＣＲ４に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープに特異的に反応する抗体もあげられる。ハイブリドーマＫＭ２１６０は平成１６年８月１２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−１００９０として寄託されている。
本発明における抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目を含むペプチドに対する結合性が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目を含むペプチドのうち、１６、１９、２０および２２番目の少なくとも１以上のチロシン残基が硫酸化されたペプチドに対する結合性が低い抗体が好ましい。
また、本発明における抗体は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞（ＷＯ０２／３１１４０、ＷＯ０３／８５１１８、ＷＯ０３／８５１０７）で生産された抗体も包含される。
本発明における遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体等があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明におけるヒト型キメラ抗体は、ＣＣＲ４に特異的に反応するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、更にＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明におけるヒト型キメラ抗体としては、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号５、配列番号６および配列番号７、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で表されたアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、より具体的にはＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表されたアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体、さらに具体的には、ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１、Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体ＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号１２で表されたアミノ酸配列、Ｌ鎖Ｃ領域がヒト抗体κクラスのアミノ酸配列からなるヒト型キメラ抗体があげられる。例えばＷＯ０１／６４７５４に開示された抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０があげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
本発明におけるヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＣＣＲ４に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬと表記する）をコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択方法としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられる。
本発明における抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明におけるヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、それぞれ配列番号５、６、７で表されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、１０で表されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片などがあげられる。
好ましくは、抗体のＶＨが配列番号１３または１４、および／またはＶＬが配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
より好ましくは、
抗体のＶＨが、配列番号１３で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＨが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａのうち少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＬが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ，３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＨが、配列番号１３で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａ、ならびに抗体のＶＬが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＨが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａ、ならびに抗体のＶＬが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、
さらに好ましくは、抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号１６または１７で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、などがあげられる。
これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつＣＣＲ４と特異的に反応する抗体または抗体断片も本発明の範囲に包含される。
本発明におけるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、０−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明におけるヒト型ＣＤＲ移植抗体の具体例としては、ＷＯ０３／１８６３５に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体、ＷＯ００／４２０７４に記載のモノクローナル抗体１Ｇ１、２Ｂ１０または１０Ｅ４から作製されるヒト型ＣＤＲ移植抗体、ＷＯ９９／１５６６６に記載のヒト化抗体またはモノクローナル抗体２５２Ｙまたは２５２Ｚから作製されるヒト型ＣＤＲ移植抗体、ＵＳ６２４５３３２に記載のモノクローナル抗体から作製されるヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えばヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より、該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーはレパートリーを増やすために、人為的に変異を導入したライブラリーを用いることもできる。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有するファージを回収できる。該抗体断片は、さらに蛋白質工学的手法により、二本の完全なＨ鎖および二本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することもできる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組み込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚に移植後、発生させることにより作製されたヒト抗体産生トランスジェニックマウスなどがあげられる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常の細胞融合法によるハイブリドーマ作製方法により、ヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル又はウサギ等があげられる。
本発明における抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明におけるＦａｂは、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明におけるＦ（ａｂ’）_２は、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはＳ−Ｓ結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明におけるＦａｂ’は、本発明のＣＣＲ４に特異的に結合するＦ（ａｂ’）_２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、ＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明におけるｓｃＦｖは、ＣＣＲ４に特異的に結合するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明におけるＤｉａｂｏｄｙは、例えば、ＣＣＲ４に特異的に結合する２価のＤｉａｂｏｄｙは、本発明のＣＣＲ４に特異的に結合するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３〜１０残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明におけるｄｓＦｖは、ＣＣＲ４に特異的に結合するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
本発明におけるＣＤＲを含むペプチドは、ＣＣＲ４に特異的に結合するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを構築し、該ｃＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明に用いられる薬剤としては、蛋白質、低分子の薬剤などがあげられる。
蛋白質としては、サイトカイン、抗体などがあげられる。
サイトカインとしては、免疫担当細胞であるＮＫ細胞、マクロファージ、単球、顆粒球などのエフェクター細胞を活性化するサイトカイン、または当該サイトカインの誘導体などがあげられる。具体的なサイトカインとしては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β等があげられる。
抗体としては、Ｔ細胞表面マーカーに特異的に反応する抗体、抗体断片または融合抗体などがあげられる。具体的な抗体としては、抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ社）、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２５抗体（Ｚｅｎａｐａｘ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ社）、抗ＣＤ５２抗体（Ｃａｍｐａｔｈ，Ｉｌｅｘ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社）などがあげられる。
本発明に用いられる低分子の薬剤としては、アミフォスチン（エチオール）［ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ（ｅｔｈｙｏｌ）］、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）［ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ（ＤＴＩＣ）］、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）［ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）］、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）［ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ（ＢＣＮＵ）］、ロムスチン（ＣＣＮＵ）［ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ（ＣＣＮＵ）］、ドキソルビシン（アドリアマイシン）［ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）］、ドキソルビシンリポ（ドキシル）［ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｌｉｐｏ（ｄｏｘｉｌ）］、ゲムシタビン（ゲムザール）［ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ｇｅｍｚａｒ）］、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシンリポ（ダウノゾーム）［ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｌｉｐｏ（ｄａｕｎｏｘｏｍｅ）］、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、パクリタキセル（タキソール）［ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ｔａｘｏｌ）］、ドセタキセル（タキソテア）［ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）］、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）［１０−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｅｔｈｙｌ−ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ（ＳＮ３８）］、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、メスナ（ｍｅｓｎａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｒａｎ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、ペガスパラガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、ウラシルマスタード（ｕｒａｃｉｌｍｕｓｔａｒｄ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｓｔｉｎｅ）、セムスチン（ｓｅｍｕｓｔｉｎ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、トムデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）、アザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ＵＦＴ、オキザロプラチン（ｏｘａｌｏｐｌａｔｉｎ）、ゲフィチニブ（イレッサ）［ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ（Ｉｒｅｓｓａ）］、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）［ｉｍａｔｉｎｉｂ（ＳＴＩ５７１）］、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、オール−トランスレチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ベキサロテン（ターグレチン）［ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ（ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）］、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、アナストロゾール（アリミデックス）［ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ（Ａｌｉｍｉｄｅｘ）］、ロイプリン（ｌｅｕｐｌｉｎ）あるいはこれらの組み合わせがあげられる。望ましくは、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、エトポシド、メトトレキセートあるいはこれらの組み合わせがあげられる。
上記の薬剤は、単独で高用量を生体内に投与した場合には副作用が懸念される。しかしながら、本発明においてはＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片と組み合わせることにより、上述の薬剤を低用量で用いることができる。したがって、十分な治療効果に加えて、副作用を軽減することができる。
本発明の医薬は、ＣＣＲ４を発現している細胞に対して用いることができるが腫瘍細胞が好ましい。腫瘍の具体例としては、造血器腫瘍があげられる。
造血器腫瘍としては、急性白血病、慢性白血病、ホジキン病、非ホジキン病などがあげられる。
急性白血病としては、急性リンパ性白血病などがあげられ、急性リンパ性白血病には前駆Ｔ細胞系急性リンパ性白血病などがあげられる。
慢性白血病としては、慢性リンパ性白血病があげられ、慢性リンパ性白血病には、Ｔ細胞型慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞型前リンパ性白血病、成人Ｔ細胞性白血病リンパ腫（ＡＴＬ）、セザリー症候群などがあげられる。
非ホジキン病としては、Ｔ／ＮＫ細胞性リンパ腫があげられ、Ｔ／ＮＫ細胞性リンパ腫には前駆Ｔリンパ芽球型リンパ腫／白血病、成熟Ｔ細胞腫瘍などがあげられる。
成熟Ｔ細胞腫瘍としては、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、セザリー症候群、菌状息肉腫、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、皮下蜂窩織炎様Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型腸Ｔ細胞リンパ腫、肝脾γδＴ細胞リンパ腫、血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞性リンパ腫、未分化型大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫などがあげられる。
本発明の医薬の効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞障害活性測定系によって調べることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞障害活性測定系の例としては、ＡＤＣＣ活性の測定系が挙げられる。ＡＤＣＣ活性は、抗体の存在下で、抗原であるＣＣＲ４を発現する標的細胞と、ヒトあるいはその他の動物より採取した末梢血単核球、単球、マクロファージ、顆粒球等のエフェクター細胞を接触させ、障害された標的細胞の度合いを検出し、これを定量することにより測定することができる。障害された標的細胞の度合いは、^５１Ｃｒ遊離法、標的細胞の酵素活性を検出する方法、フローサイトメーターによる検出法などによって検出することができる。ＡＤＣＣ活性測定系における本発明の医薬の効果は、ＡＤＣＣ活性測定系中に薬剤を添加するか、あるいは標的細胞、またはエフェクター細胞、またはその両者にあらかじめこれらの薬剤を一定期間曝露してＡＤＣＣ活性に与える影響を観察することにより、測定することができる。
また本発明の医薬の効果は、動物モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を測定することによっても調べることができる。
動物モデルとしては、ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移植した異種移植モデル、培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した同系移植モデルなどがあげられる。
異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。
本発明の医薬の評価用の同系移植モデルは、ＥＬ４細胞などのマウス培養細胞株に、ＣＣＲ４遺伝子を導入することにより、ＣＣＲ４陽性の形質転換株を作製し、該形質転換株を正常な免疫系を有する野生型マウスの様々な部位へ移植することにより作製することができる。
上記動物モデルを用いて抗体の単独投与、薬剤の単独投与の効果と、本発明の医薬の効果とを比較することにより、本発明の医薬の効果を評価することができる。
本発明の医薬は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該医薬そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該医薬を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該医薬および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１回当たり抗体量として０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである。抗体と併用する薬剤は、単独で臨床に用いられる場合の投与量と同用量またはそれより少ない用量である。

第１図は抗ＣＣＲ４抗体の細胞障害活性に対するサイトカインの増強効果を示す。縦軸は細胞障害活性を表す。■はサイトカイン非添加時、□はＩＬ−２添加時、斜線はＩＬ−１５添加時の細胞障害活性をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
第２図はヌードマウスに移植したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する抗ＣＣＲ４抗体とビンクリスチンの併用効果を示す。縦軸はＶ／ＶＯの値を表す。□は陰性対照群、斜線はＫＭ２７６０投与群、灰色はビンクリスチン投与群、■はＫＭ２７６０とビンクリスチンの併用投与群のＶ／ＶＯの値をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
第３図はヌードマウスに移植したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する抗ＣＣＲ４抗体とシクロフォスファミドの併用効果を示す。縦軸はＶ／ＶＯの値を表す。□は陰性対照群、斜線はＫＭ２７６０投与群、灰色はシクロフォスファミド投与群、■はＫＭ２７６０とシクロフォスファミドの併用投与群のＶ／ＶＯの値をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
第４図はヌードマウスに移植したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する抗ＣＣＲ４抗体とエトポシドの併用効果を示す。縦軸はＶ／ＶＯの値を表す。□は陰性対照群、斜線はＫＭ２７６０投与群、灰色はエトポシド投与群、■はＫＭ２７６０とエトポシドの併用投与群のＶ／ＶＯの値をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
第５図はヌードマウスに移植したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する抗ＣＣＲ４抗体とメトトレキセートの併用効果を示す。縦軸はＶ／ＶＯの値を表す。□は陰性対照群、斜線はＫＭ２７６０投与群、灰色はメトトレキセート投与群、■はＫＭ２７６０とメトトレキセートの併用投与群のＶ／ＶＯの値をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
第６図はＣ５７ＢＬ／６マウスに移植したＣＣＲ４／ＥＬ４細胞に対する抗ＣＣＲ４抗体とＧ−ＣＳＦの併用効果を示す。横軸は腫瘍移植後の日数、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ表す。×は陰性対照群、▲はＫＭ２７６０単独群、●はＧ−ＣＳＦ単独群、□は併用群をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
第７図はＣ５７ＢＬ／６マウスに移植したＣＣＲ４／ＥＬ４細胞に対する抗ＣＣＲ４抗体とＩＦＮ−αの併用効果を示す。縦軸は肝臓重量比率を表す。バーは標準偏差を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１２月４日および２００４年５月２５日に出願された日本国特許出願２００３−４０６５９０号および２００４−１５５１４１の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書及び／または図面に記載される内容を包含する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性における抗ＣＣＲ４抗体とサイトカインとの併用効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性における抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０５４、ＷＯ０１／６４７５４）とサイトカインとの併用効果を以下の方法により測定した。
（ａ）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混合した。これをＭＯＮＯ−ＰＯＬＹ分離溶液（大日本製薬株式会社製）を用いて添付の説明書に従って、単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地［ＦＣＳを５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）］で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて３×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（ｂ）エフェクター細胞のサイトカインによる刺激
上記（ａ）で得られたエフェクター細胞溶液を５０μＬずつ、９６穴Ｕ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に分注した。さらにＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で希釈した２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２（ペプロテック社製）溶液、２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（ペプロテック社製）溶液およびサイトカイン非添加の陰性対照であるＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）を各々５０μＬずつ別のサンプルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター内にて３日間静置した。
（ｃ）標的細胞溶液の調製
Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を０．５ｍｇ／ｍＬで含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地［ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）］で培養した、マウス胸腺腫細胞株ＥＬ４にヒトＣＣＲ４遺伝子を導入した形質転換株である腫瘍細胞であるＣＣＲ４／ＥＬ４細胞（ＷＯ０１／６４７５４）を遠心分離操作及び懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で２×１０^５細胞／ｍＬの濃度に調整し、標的細胞溶液とした。
（ｄ）細胞障害活性の測定
上記（ｂ）でサイトカインによる刺激を与えたエフェクター細胞を含む９６ウェルＵ字底プレートの各ウェルに（ｃ）で調製した標的細胞溶液を１×１０^４細胞／ウェルになるように５０μＬを添加した。このときエフェクター細胞と標的細胞の比は１５：１となる。更に、ＫＭ２７６０を最終濃度がそれぞれ１あるいは１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加して、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨと称す）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書に従って吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりにそれぞれ同容量のＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにそれぞれ同容量のＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりにそれぞれ同容量のＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地を用いて反応を行い、反応終了４５分前に１５μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行うことで、上清のＬＤＨ活性を測定した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
（式１）
細胞障害活性（％）＝［（検体の吸光度）−（エフェクター細胞自然遊離の吸光度）−（標的細胞自然遊離の吸光度）］／［（標的細胞全遊離の吸光度）−（標的細胞自然遊離の吸光度）］×１００
第１図に結果を示した。ＫＭ２７６０の細胞障害活性は濃度依存的に増加していた。また、サイトカインの添加により、より増加した。この結果は、抗ＣＣＲ４抗体の細胞障害活性が、エフェクター細胞を活性化するサイトカインによって増強されることを示している。

抗ＣＣＲ４抗体とビンクリスチンとの併用投与による抗腫瘍効果
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ヒトＴ細胞白血病細胞株）を２×１０^８個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に懸濁し、該懸濁液１００μＬをＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア、雄）の腹側部皮内に移植した。細胞移植後１５日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、次式より腫瘍体積を算出した。
（式２）
腫瘍体積＝短径×短径×長径×０．５
腫瘍体積が１４０〜３４２ｍｍ^３（平均２６０ｍｍ^３）の範囲内の腫瘍を有する個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に、下記のＡ〜Ｄの各薬剤をマウスへ投与した。なお、群分けした日をＤａｙ０とした。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ２７６０単独群：Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇ投与した。
Ｃ．ビンクリスチン（以下ＶＣＲ；オンコビン注射用、日本イーライリリー株式会社）単独群：Ｄａｙ０に１匹あたり０．５５ｍｇ／ｋｇ投与した。
Ｄ．ＫＭ２７６０＋ＶＣＲ併用群：ＶＣＲを、Ｄａｙ０に１匹あたり０．５５ｍｇ／ｋｇ、ＫＭ２７６０を、Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇそれぞれ投与した。
実験は各群５匹で行った。各薬剤は生理食塩水（大塚製薬）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。Ｄａｙ１０に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群のＤａｙ０の腫瘍体積をＶＯとしたときのＤａｙ１０の腫瘍体積変化（Ｖ／ＶＯ）の平均値の比較で行った。
各群のＶ／ＶＯの平均値を第２図に示す。第２図に示したように、ＫＭ２７６０とＶＣＲとの併用投与は、ＶＣＲ単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。
各群のＶ／ＶＯを陰性対照群のＶ／ＶＯで除した値（Ｔ／Ｃ）を第１表に示す。ＫＭ２７６０、ＶＣＲ両薬剤の薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃの理論値、すなわち各薬剤単独群のＴ／Ｃを掛け合わせた値と比べると、実際の併用群のＴ／Ｃ（表中のＣ）は、Ｄａｙ１０において理論値である０．２１よりも低い値（０．１１）を示した。

以上より、ＫＭ２７６０とＶＣＲの併用投与は、それぞれ単独投与より、高い抗腫瘍効果を有し、相乗効果を示すことが明らかとなった。

抗ＣＣＲ４抗体とシクロフォスファミドとの併用投与による抗腫瘍効果
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ヒトＴ細胞白血病細胞株）を２×１０^８個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に懸濁し、該懸濁液１００μＬをＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア、雄）の腹側部皮内に移植した。細胞移植後１８日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、実施例２の式２により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積が１１６〜３４９ｍｍ^３（平均２１９ｍｍ^３）の範囲内の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に、下記のＡ〜Ｄの各薬剤をマウスへ投与した。群分けした日をＤａｙ０とした。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ２７６０単独群：Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇ投与した。
Ｃ．シクロフォスファミド（以下ＣＰＡ；注射用エンドキサン、バクスター社）
単独群：Ｄａｙ０に１匹あたり６５ｍｇ／ｋｇ投与した。
Ｄ．ＫＭ２７６０＋ＣＰＡ併用：ＣＰＡを、Ｄａｙ０に１匹あたり６５ｍｇ／ｋｇ、ＫＭ２７６０を、Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇそれぞれ投与した。
実験は各群５匹で行った。各薬剤は生理食塩水（大塚製薬）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。Ｄａｙ４に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群のＤａｙ０の腫瘍体積をＶＯとしたときの各測定日の腫瘍体積変化（Ｖ／ＶＯ）の平均値の比較で行った。
各群のＶ／ＶＯの平均値の経日的推移を第３図に示す。第３図に示したように、ＫＭ２７６０とＣＰＡとの併用投与は、ＣＰＡ単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。
各群のＶ／ＶＯを陰性対照群のＶ／ＶＯで除した値（Ｔ／Ｃ）を第２表に示す。ＫＭ２７６０、ＣＰＡ両薬剤の薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃの理論値、すなわち各薬剤単独群のＴ／Ｃを掛け合わせた値と比べると、実際の併用群のＴ／Ｃ（表中のＤの値）は理論値である０．３９よりも低い値（０．３５）を示した。

以上より、ＫＭ２７６０とＣＰＡとの併用投与は、それぞれ単独投与より、高い抗腫瘍効果を有し、相乗効果を示すことが明らかとなった。

抗ＣＣＲ４抗体とエトポシドの併用投与による抗腫瘍効果
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ヒトＴ細胞白血病細胞株）を２×１０^８個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に懸濁し、該懸濁液１００μＬをＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア、雄）の腹側部皮内に移植した。細胞移植後１７日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、実施例２の式２により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積が１２１〜３４８ｍｍ^３（平均１９５ｍｍ^３）の範囲内の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後、下記のＡ〜Ｄの各薬剤をマウスへ投与した。なお、群分けした日をＤａｙ０とした。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ２７６０単独群：Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇ投与した。
Ｃ．エトポシド（以下ＶＰ−１６；ラステット注、日本化薬株式会社）単独群：Ｄａｙ０からＤａｙ４の５日間、１匹あたり１０ｍｇ／ｋｇ投与した。
Ｄ．ＫＭ２７６０＋ＶＰ−１６併用群：ＶＰ−１６を、Ｄａｙ０からＤａｙ４の５日間、１匹あたり１０ｍｇ／ｋｇ、ＫＭ２７６０を、Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇ投与した。
実験は各群５匹で行った。各薬剤は生理食塩水（大塚製薬）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。Ｄａｙ７に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群のＤａｙ０の腫瘍体積をＶＯとしたときのＤａｙ７の腫瘍体積変化（Ｖ／ＶＯ）の平均値の比較で行った。
各群のＶ／ＶＯの平均値を第４図に示す。第４図に示したように、ＫＭ２７６０とＶＰ−１６との併用投与は、ＶＰ−１６単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。
各群のＶ／ＶＯを陰性対照群のＶ／ＶＯで除した値（Ｔ／Ｃ）を第３表に示す。ＫＭ２７６０、ＶＰ−１６両薬剤の薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃの理論値、すなわち各薬剤単独群のＴ／Ｃを掛け合わせた値と比べると、実際の併用群のＴ／Ｃ（表中のＤの値）は理論値である０．４６よりも低い値（０．３８）を示した。

以上より、ＫＭ２７６０とＶＰ−１６との併用投与は、それぞれ単独投与より、高い抗腫瘍効果を有し、相乗効果を示すことが明らかとなった。

抗ＣＣＲ４抗体とメトトレキセートの併用投与による抗腫瘍効果
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ヒトＴ細胞白血病細胞株）を２×１０^８個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に懸濁し、該懸濁液１００μＬをＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア、雄）の腹側部皮内に移植した。細胞移植後１７日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、式２により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積が１２１〜３４８ｍｍ^３（平均１９５ｍｍ^３）の範囲内の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に、下記のＡ〜Ｄの各薬剤をマウスヘ投与した。群分けした日をＤａｙ０とした。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ２７６０単独群：Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇ投与した。
Ｃ．ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（以下ＭＴＸ；メソトレキセート注射液、日本ワイスレダリー株式会社）単独群：Ｄａｙ０からＤａｙ４の５日間、１匹あたり１５ｍｇ／ｋｇ投与した。
Ｄ．ＫＭ２７６０＋ＭＴＸ併用群：ＭＴＸを、Ｄａｙ０からＤａｙ４の５日間、１匹あたり１５ｍｇ／ｋｇ、ＫＭ２７６０を、Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり８００μｇそれぞれ投与した。
実験は各群５匹で行った。各薬剤は生理食塩水（大塚製薬）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。Ｄａｙ７に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群のＤａｙ０の腫瘍体積をＶＯとしたときの腫瘍体積変化（Ｖ／ＶＯ）の平均値の比較で行った。
各群のＶ／ＶＯの平均値の経日的推移を第５図に示す。第５図に示したように、ＫＭ２７６０とＭＴＸとの併用投与は、ＭＴＸ単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。
各群のＶ／ＶＯを陰性対照群のＶ／ＶＯで除した値（Ｔ／Ｃ）を第４表に示す。ＫＭ２７６０、ＭＴＸ両薬剤の薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃの理論値、すなわち各薬剤単独群のＴ／Ｃを掛け合わせた値と比べると、実際の併用群のＴ／Ｃ（第４表中のＤの値）は理論値０．０４よりも低い値（０．０１）を示した。

以上より、ＫＭ２７６０とＭＴＸとの併用投与は、それぞれ単独投与より、高い抗腫瘍効果を有し、相乗効果を示すことが明らかとなった。

抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０とＧ−ＣＳＦの併用投与による抗腫瘍効果
ＣＣＲ４／ＥＬ４細胞（ＷＯ０１／６４７５４）を１×１０^６個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に懸濁し、該懸濁液１００μｌをＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア、雄、８週齢）の右側腹側部皮内に移植した。さらにＡ〜Ｄまで群分けした後、各マウスにＡ〜Ｄの各薬剤を投与した。なお、腫瘍を移植した日をＤａｙ０とした。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ２７６０単独群：Ｄａｙ０とＤａｙ４に１匹あたり１００μｇを静脈内投与した。
Ｃ．Ｇ−ＣＳＦ単独群：腫瘍移植日４日前（以下、Ｄａｙ−４と記す）からＤａｙ５までの１０日間、Ｇ−ＣＳＦ（ノイアップ注１００、協和発酵工業社製）を１日１回、１匹あたり１０μｇを皮下投与した。投与部位は腫瘍移植部位と重ならない右側腹側部の後肢付近である。
Ｄ．ＫＭ２７６０＋Ｇ−ＣＳＦ併用群：ＫＭ２７６０をＤａｙ０とＤａｙ４に１日１回、１匹あたり１００μｇで静脈内投与し、Ｇ−ＣＳＦをＤａｙ−４からＤａｙ５までの１０日間、１日１回、１匹あたり１０μｇを皮下投与した。投与部位は腫瘍移植部位と重ならない右側腹側部の後肢付近である。
実験はＡ群１０匹、Ｂ、Ｃ、Ｄ群は各７匹で行った。ＫＭ２７６０はクエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６）、Ｇ−ＣＳＦは生理食塩水（大塚製薬）で希釈調製し、それぞれ１００μＬずつ投与した。各群のＤａｙ０より経日的にノギスによる腫瘍径の測定を行い、実施例２の式２に示す式により、腫瘍体積を算出した。
Ｄａｙ１７以降にＡ群ではマウスの腫瘍死が始まったため、腫瘍体積の評価はＤａｙ１４で終了した。
各群の腫瘍体積の平均値の経日的推移を第６図に示す。第６図に示したように、Ｂ群およびＣ群においては未処理のＡ群に対して弱い抗腫瘍効果しか見られないものの、Ｄ群においては顕著な抗腫瘍効果が観察された。
さらに評価最終日におけるＴ／Ｃ値を第５表に示す。各群における抗腫瘍効果の判定（Ｔ／Ｃ値）は、評価最終日（Ｄａｙ１４）におけるＡ群の腫瘍体積の平均値に対する各群の腫瘍体積の平均値の比（Ｔ／Ｃ値）の比較を行うため、以下の式３に従い算出した。
（式３）
（Ｔ／Ｃ値）＝（Ｄａｙ１４の各群の腫瘍体積の平均値）／（Ｄａｙ１４のＡ群の腫瘍体積の平均値）
ＫＭ２７６０、Ｇ−ＣＳＦ両薬剤の薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃ値の理論値、すなわち各薬剤単独群のＴ／Ｃ値を掛け合わせと比べると、実際の併用群のＴ／Ｃ値（表中のＣ）は、理論値である０．３０よりも低い値（０．１０）を示した。

以上より、ＫＭ２７６０とＧ−ＣＳＦとの併用投与は、それぞれの単独投与より、高い抗腫瘍効果を示し、相乗効果を示すことが明らかとなった。

抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０とＩＦＮ−αの併用投与による抗腫瘍効果
ＣＣＲ４／ＥＬ４細胞を５×１０^５個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）に懸濁し、該懸濁液１００μｌをＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア、雄、８週齢）の尾静脈内に移植した。さらにマウスを下記Ａ〜Ｄまで群分けした後、各マウスにＡ〜Ｄの各薬剤を投与した。なお、腫瘍を移植した日をＤａｙ０とした。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＩＦＮ−α単独群：ＩＦＮ−α（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、ＰＢＬバイオメディカルラボラトリーズ社製）をＤａｙ１からＤａｙ５の５日間、１日１回、１匹あたり５×１０^４ｕｎｉｔｓを静脈内投与した。
Ｃ．ＫＭ２７６０単独群：ＫＭ２７６０をＤａｙ１とＤａｙ５に１日１回、１匹あたり０．５μｇで静脈内投与した。
Ｄ．ＫＭ２７６０＋ＩＦＮ−α併用群：ＫＭ２７６０をＤａｙ１とＤａｙ５に１日１回、１匹あたり０．５μｇで静脈内投与し、ＩＦＮ−αをＤａｙ１からＤａｙ５の５日間、１日１回、１匹あたり５×１０^４ｕｎｉｔｓで静脈内投与した。
実験はＡ群７匹、Ｂ、Ｃ、Ｄ群は各６匹で行った。ＫＭ２７６０はクエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６）、ＩＦＮ−αは０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで希釈調製し、それぞれ１００μＬずつ投与した。Ｄａｙ１４に全てのマウスの体重を測定し、エーテル麻酔と放血を行った後に頚椎脱臼して安楽死させて、肝臓を摘出したのち肝臓重量を測定し、各個体の体重に対する肝臓重量の割合（以降、肝臓重量比率と称する）を百分率で算出した。
抗腫瘍効果の評価は、同時に測定した未処理の健康なマウスの肝臓重量比率（６匹の平均値）に対し、腫瘍細胞の転移によって増加した各群の肝臓重量比率を比較することにより行った。
各群の肝臓重量比率を第７図に示す。第７図に示したように、Ｂ群およびＣ群においては未処理のＡ群に対して弱い抗腫瘍効果しか見られないものの、Ｄ群においては顕著な抗腫瘍効果が観察された。
さらに各群における肝臓中の腫瘍細胞の残存の程度を、Ｔ／Ｃ値として下式に従い算出した。
（式４）
Ｔ／Ｃ＝（各群の肝臓重量比率の平均値−未処理マウス肝臓重量比率の平均値）／（陰性対照群の肝臓重量比率の平均値−未処理マウス肝臓重量比率の平均値）
得られたＴ／Ｃ値を表６に示す。ＫＭ２７６０、ＩＦＮ−α両薬剤の薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃ値の理論値、すなわち各薬剤単独群のＴ／Ｃ値を掛け合わせた値と比べると、実際の併用群のＴ／Ｃ値（表中のＣ）は、理論値である０．２５よりも低い値（０．０８８）を示した。

以上より、ＫＭ２７６０とＩＦＮ−αの併用投与は、それぞれの単独投与より、高い抗腫瘍効果を有し、相乗効果を示すことが明らかとなった。

抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０とＭ−ＣＳＦの併用投与による抗腫瘍効果
ＣＣＲ４／ＥＬ４細胞（ＷＯ０１／６４７５４）を１×１０^５個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）に懸濁し、該懸濁液２００μＬをＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア、雄、８週齡）の腹腔内に移植した。さらに下記のＡ〜Ｄに群分けした後、各マウスにＡ〜Ｄの各薬剤を投与した。腫瘍を移植した日をＤａｙ０とした。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．Ｍ−ＣＳＦ単独群：Ｍ−ＣＳＦ（ロイコプロール、協和醗酵工業社製）をＤａｙ−３からＤａｙ−１まで１日２回、Ｄａｙ０は１日１回、計７回、１匹あたり１００μｇで腹腔内投与した。
Ｃ．ＫＭ２７６０単独群：ＫＭ２７６０をＤａｙ０に１日１回、１匹あたり５０μｇで腹腔内投与した。
Ｄ．ＫＭ２７６０＋Ｍ−ＣＳＦ併用群：ＫＭ２７６０をＤａｙ０に１日１回、１匹あたり５０μｇで腹腔内投与し、Ｄａｙ−３からＤａｙ−１まで１日２回、Ｄａｙ０は１日１回、計７回、１匹あたり１００μｇで腹腔内投与した。
実験は各群８匹で行った。各薬剤はＫＭ２７６０はクエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６）、Ｍ−ＣＳＦは生理食塩水（大塚製薬）で希釈調製し、１００μＬずつ投与した。抗腫瘍効果の評価は、各群におけるマウスの生存日数の平均値の、陰性対照群の生存日数の平均値に対する割合（以降、延命率と称する）で行った。各マウスの生存日数および各群の延命率を第７表に示す。

第７表に示したとおり、Ｂ群では未処理のＡ群と比較して抗腫瘍効果が現れず、Ｃ群では弱い抗腫瘍効果しか見られないものの、Ｄ群においては顕著な抗腫瘍効果が観察された。ＫＭ２７６０、Ｍ−ＣＳＦ両薬剤の薬効が単純に加算された時の延命率の理論値、すなわち各薬剤単独群の延命率を掛け合わせた値と比べると、実際の併用群の延命率（表中のＤ）は理論値である１．１６より高い値（＞１．４９）を示した。なお、Ｄ群中の１匹は、観察期間（Ｄａｙ５０）を超えてもなお生存していた。
以上より、ＫＭ２７６０とＭ−ＣＳＦの併用投与は、それぞれの単独投与により、高い抗腫瘍効果を有し、相乗効果を示すことが明らかとなった。

ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬が提供される。
配列番号１３−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１４−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１５−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１６−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１７−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１８−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列

Claims (26)

1. ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬。
2. ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを併用して投与するための医薬。
3. ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の薬剤とを同時に又は逐次的に投与するための医薬。
4. 医薬が、抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
5. 腫瘍がＣＣＲ４を発現している腫瘍である請求項４に記載の医薬。
6. ＣＣＲ４が発現している腫瘍が造血器腫瘍である請求項５に記載の医薬。
7. ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合し、ヒト血小板に反応性を示さない抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。
8. ＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ＣＣＲ４リガンドであるＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）またはＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）のＣＣＲ４への結合を阻害する活性を有さない請求項７に記載の医薬。
9. 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６および２７１〜２８４番目からなる群から選ばれる細胞外領域である請求項７または８に記載の医薬。
10. 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２〜２９番目に存在するエピトープである請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬。
11. 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２９番目に存在するエピトープである請求項７〜１０のいずれか１項に記載の医薬。
12. 細胞外領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目に存在するエピトープである請求項７〜１１のいずれか１項に記載の医薬。
13. ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目を含むペプチドのうち、１６、１９、２０および２２番目の少なくとも１つのチロシン残基が硫酸化されたペプチドへの結合性が配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目を含むペプチドへの結合性よりも低いことを特徴とする請求項１２に記載の医薬。
14. ＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ハイブリドーマＫＭ２１６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００９０）が生産するモノクローナル抗体が認識するエピトープに特異的に反応する抗体または該抗体断片である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬。
15. ヒト型遺伝子組換え抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬。
16. ヒト型キメラ抗体がＣＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５に記載の医薬。
17. ヒト型キメラ抗体が配列番号５、６、７で表されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む請求項１５または１６に記載の医薬。
18. ヒト型キメラ抗体が配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる抗体分子の重鎖（Ｈ鎮）可変領域（Ｖ領域）および／または配列番号１２で表される抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の医薬。
19. ヒト型ＣＤＲ移植抗体がＣＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５に記載の医薬。
20. ヒト型ＣＤＲ移植抗体が配列番号５、６、７で表されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む請求項１５または１９に記載の医薬。
21. ヒト型ＣＤＲ移植抗体が配列番号１６または１７で示されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列からなる抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および／または配列番号１８で表される抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む、請求項１５、１８および２０のいずれか１項に記載の医薬。
22. 薬剤が、蛋白質または低分子の薬剤である請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬。
23. 蛋白質が、サイトカインまたは抗体である、請求項２２記載の医薬。
24. サイトカインが、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、ＩＬ−２およびＩＬ−１５から選ばれるサイトカインである請求項２３記載の医薬。
25. 低分子の薬剤が、化学療法剤またはホルモン療法剤である請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬。
26. 化学療法剤が、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、エトポシドおよびメトトレキセートから選ばれる薬剤である請求項２５に記載の薬剤。

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