JPS6324900A - グルコ−ス定量用安定化液体酵素組成物、それを用いる試薬キット及び定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はグルコース定量分析操作における酵素ヘキソキ
ナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素の使用法
に関する。

（従来の技術） 酵素及びその他の生物学的成分の定量において反応は一
般に酵素、補酵素及び基質を含む。

酵素は大きい分子量を有するタンパク質複合体であＤ、
通常その化学的構造は未知である。酵素はその基質の特
異性及び触媒活性に応じて分類される。酵素は生物学的
な触媒であＤ、単一の基質の反応又は−群の同質基質の
反応の触媒作用を行うことができる。

補酵素は明確に限定された化学的構造を有する有機化学
薬品である。分子量は通常酵素よりも小さい。補酵素・
は特定の酵素検定又は酵素反応において必要とされる。

補酵素は検定試験においてその構造及び／ｌは原子組成
を検出可能に変化する。その反応は基質について化学量
論的に行われる０強い吸光性を有するある種の補酵素の
場合、吸光性形態の出現又は消滅は測光学的に追求する
ことができる。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）及びニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド還元体（ＮＡＤＨ）は多くの重要な臨床検定に
用いられる。両者は約７００の分子量を有している。Ｎ
ＡＤＨは３４０ｎｍで強く吸光し、一方ＮＡＤは吸光し
ない。

基質は構造既知の有機化学薬品で、その反応及び相互作
用は酵素により触媒され、基質の化学的構造、原子組成
又は立体化学性の変化が生じる。

一般に、基質は化学的にも、微生物学的にも分解されや
すい。基質は水性媒体中で分解又は加水分解され、細菌
、かび及びその他の微生物の餌となる。典型的な基質は
グルコース、乳酸塩又は乳酸、グルコン酸塩などである
。

高度の特異性の故に、酵素定量法の使用は近年非常に多
くなった。現在、酵素試薬使用の最大の限界はその中の
薬品の不安定性に由来する０通常、多数の反応活性成分
が含有されている。問題を複雑にするのは酵素の正確な
性質がその作用の機構とともに大部分未知であることで
ある。それ故、精密かつ首尾一貫した結果を確保するた
め、厳密な品質コントロール手段が必要とされる。その
ような手段はコスト高になり易い。

従来の技術においては、厳密な品質コントロールを行う
ため試薬中の反応活性成分を安定化する。すなわちその
分解を防止することに重点がおかれていた。例えば、酵
素及び補酵素は固体マトリックス中へ乾燥混合、凍結乾
燥又は酵素の化学的構造の固体マトリックス上の固定の
いずれかにより固定させることができる。これらの方法
は費用がかかＤ、複雑な製造工程が必要であＤ、ユーザ
ーにとって便利なものではない。固体試薬では生成物の
均一性を維持することは困難である。例えば、多くの凍
結乾燥基準血清商品には各びん間の許容し得る酵素成分
の変動は平均値の±１０％であると記載されている。よ
り重要なことは、ユーザーが希釈した場合の品質管理を
自分で確認すること及び固体試薬を使用することなどの
負担に耐えねばならないことである。固体酵素又は補酵
素試薬については品質管理の難点があＤ、かつ筒便性の
面から、ユーザーは一般に液体で使い易く、固体（例え
ば凍結乾燥）組成物よりも均質な試薬を望んでいる。

グルコース／ＨＫ／Ｇ、−６−ＰＤ）（の化学ここて使
用する符号は次のような成分を表わす。

ＡＤＰ＝アデノシン−５′−二リン酸 ＡＴＰ＝アデノシン三リン酸 ＨＫ＝ヘキソキナーゼ ＮＡＤ＝ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド ＮＡＤＨ＝ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド還
元体 Ｇ−６−ＰＤＨ＝グルコース−６−リン酸脱水素酵素 Ｇ−６−Ｐ＝ニブルコース６一リン酸 次の反応式は酵素ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨの存在下で補
酵素ＡＴＰ及びＮＡＤを用いるグルコース定量の反応を
示す。

一次反応 ）ＩＫ、　Ｍｇ” グルコース＋ＡＴＰ石二：二：：：！Ｇ−６−Ｐ＋　Ａ
ＤＰ　（１）測定反応 Ｇ−６−ＰＤＩ（ Ｇ−６−Ｐ＋　ＮＡＤ苓ニユニー土ＮＡＤＨ＋　６−ホ
スホグルコナート十ＡＤＰ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　（２）上記の反応式において、−次反応を生
じさせる酵素はＨＫであＤ、測定反応を生じさせる酵素
はＧ−６−ＰＤＨである。グルコースの定量は測定反応
においてＮＡＤＨか形成される速度を測定することによ
り行われる。上記の反応式は、血清、血漿、血液全体、
脳液／骨髄液、及び尿などの体液中のグルコースの濃度
が高いのは糖尿病に伴なったものであることが指摘され
た場合の臨床検定に広く用いられている。

グルコースの定量においては上記の反応は一般に完了す
るまで行われる。形成されたＮＡＤＨの量は試験試料中
のグルコースの量に対応する。

ＮＡＤＨは３４０ｎｍで強く吸光するが他の試薬及び生
成物は吸光しない。形成されたＮＡＤＨの量、すなわち
試験試料中のグルコースの量は分光光度計を用いて３４
０ｎｍで追求することができる。酵素の活性は通常国際
単位（ＩＵ）により示される。１国際軍位は特定された
条件下で１分間あたり基質１マイクロモルの転化を触媒
する酵素の量として定義される。グルコース検定試験の
条件下では比較的速い反応速度を得るため十分な量の酵
素（ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨ）及び補酵素（ＡＴＰ及び
ＮＡＤ）が添加される。上記検定における反応は好まし
くは数１０分以内、より好ましくは１０分以内に実質的
に完了するよう行われる。

上記グルコース検定に含まれる成分は反応活性か大きい
から、一般に定量用試薬の各成分は別々に貯蔵され、検
定か行われる直前においてのみ混合される。例えば、市
販の上記グルコース検定用試薬は通常それぞれ補酵素試
薬と酵素試薬からなる２種の試薬包装として出されてい
る。補酵素は酵素はど反応活性が大きくなく、一般に便
利さのため溶液にされている。グルコース検定用の液体
補酵素試薬は一般にＡＴＰとＮＡＤの両袖酵素、マグネ
シウム塩（通常酢酸マグネシウム）、保存剤、及びグル
コース検定を行うのに好ましいＰＨである約７．５のＰ
Ｈを保持する緩衝剤を含有している。

酵素ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨに関しては安定性の問題が
重大である。従来、グルコース検定用酵素試薬は乾燥包
装品又は冷凍乾燥品の形とされている。乾燥酵素は検定
が行われる直前に溶液に入れられる。

液体ＨＫ／Ｇ−６−ＰＤＨ酵素の安定化固体酵素試薬が
多くの欠点を有しているため、酵素ＨＫ及びＧ−６−Ｐ
ＤＨを溶液中で安定化する試みがなされてきた。そのう
ち一般的な例は保存剤として高濃度（例えば３モル）の
硫酸アンモニウムを使用することである。酵素ＨＫとＧ
−６−ＰＤＨは最初水溶液にされ、次に硫酸アンモニウ
ムが添加される。この液体酵素試薬の安定性は満足すべ
きものであるが、この方式は重大な障害を有している。

第一に、硫酸塩は上述のグルコース検定反応に対するよ
く知られた反応阻害剤である。反応を許容し得る速度で
進行させるためには、阻害を克服するため比較的多量の
酵素（ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨ）を使用することか必要
である。これはコストを追加する。第二に、硫酸アンモ
ニウムか一度添加されると酵素が溶液から沈殿する。従
って、この液体試薬は均質なものではなく、実際は「懸
濁液」試薬である。この懸濁液試薬では強烈なかきまぜ
を行ってさえも再現可能な結果を得るのは困難である。

沈殿した酵素を正確な量で測定する（例えば、ピペット
により）ことは難しいことである。さらに、この懸濁液
酵素試薬は使用可能にするためよくかきまぜなければな
らない。僅かではあるが、最近使用される分光光度計に
は成分試薬を予備混合する設備をつけたものがある。さ
らに、硫酸アンモニウムの強力な阻害効果の故に、この
懸濁液酵素試薬は最低容量使用する必要かある。典型的
には、酵素試薬と補酵素試薬は１：１００又はそれ以上
の比率て混合される。使用されるこの均質な酵素試薬が
少量なことは再現性のある検定結果を得ることを困難に
さえしている。

また、ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨなどの酵素を水性媒体中
で安定化する、すなわち、水と混合てきるポリオール有
機溶媒（グリセリンなど）を１０−５０％（ｖ／ｖ）添
加することによって分解を阻止し得ることが提案されて
いる。しかしながら、実際にはこの提案はしばしば作用
しないことが見いだされた。酵素は時間とともになお分
解し、このポリオール−安定化液体酵素試薬は推奨され
た貯蔵温度範囲２−８℃（高温では酵素の分解が急激に
増加する）においてさえも比較的貯蔵寿命が短かい、か
りにポリオール溶媒が何らかの安定化効果をもっている
としても、安定化の程度は許容し得るものではない０分
解の生じたことは上述のグルコース検定反応の速度低下
によって証明される。

酵素ＨＫとＧ−６−ＰＤＨの分解はロフト間、特に貯蔵
時間の相違した試薬間の変動で明らかにすることができ
る。この変動はグルコース検定の信頼性に逆効果を与え
るものである。

酵素ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素
酵素は高度に反応活性であＤ、ともに時間経過によＤ、
特に高温度で分解することがよく知られている。グリセ
リンのような水と混合可使な有機ポリオール溶媒の存在
が水溶液中のこれら酵素を安定化し得ることがすでに提
案されている。しかしながら、有機ポリオール溶媒によ
り試みられた安定化は、特に市販級の溶媒を用いた場合
首尾一貫しない結果を与えることが見いだされた。また
、市販級の有機ポリオール溶媒、例えばグリセリンは特
に不適切な処理及び／ｌは貯蔵されたもの及び酵素試薬
を調合するのに用いられた水はともに事実上酵素ＨＫ及
びＧ−６−ＰＤＨの分解を助成する汚染物を含有するこ
とが見いだされた。

それ故、グルコース検定用として再現性のある検定結果
を与え、かつ急速にグルコース定量終点を与える貯蔵寿
命の長い均質な液体ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨ酵素試薬へ
の要望がなされている。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは上記問題点を解決すべき鋭意研究を重ねた
結果、有機ポリオール溶媒の存在するある種の安定剤系
により酵素ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨを含有する均質な液
体酵素溶液の安定性が改善でき上記の要望が満足される
ことを見いだした。この安定剤系に適した成分はその酵
素安定効率、グルコース酵素反応に対する非阻害性、コ
スト、溶解性、無臭性及び易廃棄性などに基づいて選択
される０本発明はこの知見に基づいてなされたものであ
る。

すなわち本発明は、補酵素としてアデノシン三リン酸及
びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを用い、過
剰の補酵素の存在下で行うグルコース検定によりグルコ
ースな定量測定するのに使用される酵素試薬で、はじめ
に （ａ）少なくとも６０％（ｖ／ｖ）の水（ｂ）水と混合
し得る約２０〜約４０％（ｖ／ｖ）の量のポリオール有
機溶媒 （ｃ）ヘキソキナーゼ酵素 （ｄ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｅ）該酵素
試薬か約２℃から約８℃の温度範囲で貯蔵された時に少
なくとも２年間の貯蔵寿命を有するよう少なくとも０．
５ｍＭの十分な量の重金属イオンキレート剤からなる安
定化剤系 からなる成分て調製される長い貯蔵寿命を有する均質な
液体酵素試薬を提供するものである。

好ましくはキレート剤はＥＤＴＡである。好ましくは安
定化剤系はまた酸化防止剤又は微生物コントロール剤か
らなる。酸化防止剤としては牛の血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、又はポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＤ−４０
）とＮ−アセチルシステインの混合物をあげることがで
きる。微生物コントロール剤としてはアジ化ナトリウム
かある。

好ましくは酵素試薬はマグネシウムイオンと補酵素アデ
ノシン三リン酸及びニコチンアミド−アデニンジヌクレ
オチドを含有する補酵素試薬とともに使用される。酵素
試薬を補酵素試薬及びグルコース含有試験試料と混合し
て検定反応混合液を形成させる場合、好ましくは酵素試
薬からのキレート剤の量は補酵素試薬からのマグネシウ
ムイオンの約半分よりも多くなく、より好ましくは約１
／１０よりも多くない。

本発明に用いられる安定剤系は重金属イオンキレート剤
からなる。このことはマグネシウムイオンがグルコース
とＡＴＰとの間の一次反応を触媒するのに必要であＤ、
マグネシウムイオンは一般に補酵素試薬の１成分として
含有され、キレート剤はマグネシウムイオンを触媒とし
ては無効なものとし、グルコース検定に悪影響すると予
期されていたという事実の観点からすれば驚くべきこと
である。適した重金属イオンキレート剤には、例えば、
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれる。

好ましくは安定剤系はまた酸化防止剤からなる。適した
酸化防止剤には例えば、下記のものが含まれる。

１、Ｌ−システィンエチルエステル塩化水素（ｃＥＥ） ２、Ｎ−アセチル−システィン（ＮＡＣ）３、ＤＬ−ホ
モシスティンチオラクトン塩化水素（ＨＣＴＬ） ４、Ｌ−システィン ５、メルカプトエタノール（ＭＥ） ６、ジチオトレイトール（ＤＴＴ） ７、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ） ８、アミノエチルイソチオウロニウムブロマイド（ＡＥ
Ｔ） ９、グルタチオン（ＧＳＨ） １０、チオグリコール酸（ＴＧＡ） １１、Ｎ−グアニル−し−システィン ！２．Ｎ−グアニル−ＤＬ−インシアナート１３、Ｎ−
アセチル−８−グアニル−し−システィン １４、Ｎ−アセチル−３−ベンゾイル−Ｌ−システィン １５、Ｎ、Ｓ−ジグアニル−し−システィン１６、Ｓ−
カルバモイル−Ｌ−システィン１７．８−カルボキシメ
チル−Ｌ−システィン１８、Ｌ−チアゾリジン−４−カ
ルボン酸１９．８−グアニル−し−システィンヒダント
イン ２０．５−アセチルグアニル−ＤＬ−システィンアズラ
クトン ２１．２−イミノ−し−システィンヒダントイン ２２、Ｎ−アセチル−ＤＬ−ホモシスティンチオラクト
ン ２３．１．３−ジメチルカプト−２−プロパノ−２４，
２，３−ジメチルカプト−１−プロパツール ２５．１．２−ジメチルカプト−エタン２６、Ｌ−シス
ティンメチルエステル ２７、Ｌ−システィンエチルエステル ２８、Ｎ−アセチル−ＤＬ−イソシスティン２９、ポリ
エチレングリコールジメルカプトアセテート ３０、チオグリコース ３１、ポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−３２、牛
の血清アルブミン 好ましくは安定剤系はまたミクロバイオスタット又は殺
菌剤のような微生物コントロール剤からなる。適した微
生物コントロール剤には１例えば、アジ化ナトリウム、
安息香酸、フェノール、チモール、又はペンタクロロフ
ェノールが含まれる。

検定反応混合液における酵素試薬からのキレート剤の量
は好ましくは補酵素試薬からのマグネシウムイオンに対
しモル比で半分よりも多くなく、より好ましくは１／１
０よりも多くない。

上述のように、グルコース検定反応は反応が実質的に完
了するまで行わせる。＃定反応はＮＡＤＨを発生するが
、これは分光光度計を用いて容易に認めることができる
。検定反応の実質的な完了点すなわち終点は一般にＮＡ
ＤＨの濃度がＮＡＤＨの最終平衡濃度の少なくとも約９
８％になる点であると定義される。この終点は分光光度
計の（３４０ｎｍにおける）読みを時間経過で走査する
ことにより観察することができる。吸光度、すなわちＮ
ＡＤＨの濃度ははじめ増大し、徐々に横ばいになり比較
的一定な値になる。吸光度が最初に横ばい（反応完了時
の９８％以上）になった点を終点とする。

グルコース検定の終点はできる限り短時間で到達するこ
とが望ましい。急速終点定量は特にグルコース検定を自
動化する場合、血清分析機のコストが高くなるのに関与
するから重要である。

上記の安定剤系と共用される本発明の酵素試薬は２年以
上の貯蔵寿命を有している。酵素試薬の貯蔵寿命は酵素
試薬が標準グルコース検定において許容し得る成果を与
える時間的な期間であると一般に定義される。標準グル
コース検定はグルコース酵素試薬１部とグルコース補酵
素試薬１０部を混合して配合試薬とし、次いてこの配合
試薬１００部とグルコースを含有する試験試料１部を混
合して検定反応混合液を形成することと定義される。こ
れらの部はすべて容積部である。

グルコース検定ＨＫ／Ｇ−６−ＰＤＨの仕様は特定され
た時間（例えば１０分間）内に終点に達するのに必要な
量であると一般に定義され、試験試料中のグルコース濃
度は酵素試薬が作動できる濃度範囲内にあるようにされ
る。この濃度範囲は酵素試薬の「動的範囲Ｊ　（ｄｙｎ
ａｍｉｃ　ｒａｎｇｅ）と呼ばれる。本発明の酵素試薬
の貯蔵寿命は上記の標準グルコース試験の試験試料中に
１０〜５００　ｍ　ｇ／ｄｌの動的範囲内のグルコース
が含まれた場合に１０分以下で終点に到達させるものと
定義される。終点に５分以下て到達することがより好ま
しい。終点に２分以下て到達するのがもっとも好ましい
。

連日グルコース検定を行う場合、検定反応混合液中の補
酵素の量を使用される酵素試薬のグルコースの動的範囲
の最大量に比して実質的に過剰な量を使用するのが通例
である。反応混合液中のＡＴＰ対グルコースのモル比は
約３：１から約１４：ｌの範囲にあるのが好ましい。反
応混合液中のＮＡＤ対グルコースのモル比は５：１以上
であるのが好ましい。これらの比率は酵素試薬の動的範
囲の上限のグルコース濃度を用いて算出される。これら
の補酵素濃度範囲は本発明の酵素試薬に対する上記定義
内にあると想定される。それゆえ、検定反応混合液中に
ある与えられたグルコース濃度にΣける測定反応の速度
に影響する決定的な変数は酵素試薬中の酵素の活性度で
ある。酵素を多重添加することは理論的には反応速度を
大きくし、より速い終点の測定がもたらされる。しかし
ながら対照的な考え方がある。酵素のコストは実質的な
過剰量の使用を阻止する。さらに、汚染物及び阻害物が
ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素
の精製品中に存在することが知られている。例えば、汚
染物ホスホヘキソースイソメラーゼが精製へキンキナー
ゼ中に存在することがあるのが知られている。この汚染
物はグルコース−６−リン酸（グルコース検定中の中間
精製物）をフラクトース−６−リン酸に変える。

そのためグルコース検定結果は不自然に低いものとなる
。それらの汚染物及び阻害物の量を制限するには汚染物
及び阻害物の有害な影響が小さくなるよう酵素ＨＫ及び
Ｇ−６−ＰＤＨを少量使用することが望ましい。

貯蔵寿命は酵素試薬が貯蔵される温度に非常に大きく依
存する。酵素ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨは温度が高いと非
常に急速に分解する。実用上許容されるのは酵素試薬を
約２〜約８℃の温度て貯蔵することで、最も好ましいの
は約４℃の貯蔵である。

上述のグルコース検定反応混合液配合に関し、下記の実
施例３及び第７図、第８図に示すように上限濃度か５０
０ｍｇ／ｃｌｌのグルコース濃度の動的範囲に対する酵
素試薬中のＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨの最適濃度範囲は次
のようになるニ一般に濃度範囲の下限は終点に到達し得
る時間により制限され、その上限はコストによって制限
される。濃度範囲の下限については１００分終が好まし
く、２分終点が最も好ましいとされる。

酵素試薬中のＨＫの濃度範囲は好ましくは約６〜約８０
ＫＩＵ／ｌ、より好ましくは約１０〜約６０　Ｋ　Ｉ　
Ｕ／ｌ、最も好ましくは約１５〜約３５ＫＩＵ／ｌであ
る。これらの濃度は検定反応混合液中のＨＫの濃度範囲
として好ましくは約０．５４〜約７．２ＫＩＵ／ｌ、よ
り好ましくは約０．９〜約５．４ＫＩＵ／ｌ、最も好ま
しくは約１．３５〜約３．１５ＫＩＵ／ｌに対応する。

酵素試薬中のＧ−６−ＰＤＨの対応する最適濃度は約３
〜約６０ＫＩＵ／ｌ、より好ましくは約１５〜約４０Ｋ
ＩＵ／ｌ、最も好ましくは約２０〜約３５ＫＩＵ／見で
ある。これらの濃度は検定反応混合液中のＧ−６−ＰＤ
Ｈの濃度範囲として好ましくは０．２７〜約５．４ＫＩ
Ｕ／見、より好ましくは約１．３５〜約３．６ＫＩＵ／
ｌ、最も好ましくは約１．８〜約３．１５ＫＩＵ／ｌに
対応する。

グルコースＨＫ／Ｇ−６−ＰＤＨ酵素試薬の安定性の今
１つの測定標準は半反応時間、Ｔ（１／２）である。こ
の時間はグルコース検定中の測定反応が半分完了した時
間である。これはグルコース検定用の３４０ｎｍにおけ
る最終と最初の吸光度の比較により求められる。吸光度
が最初と最終の吸光度間の中央になった時の反応時間が
半反応時間である。補酵素濃度が過剰である場合半反応
時間は検定反応混合液のグルコース及び未分解酵素の濃
度に依存する。酵素試薬の貯蔵寿命期間中、貯蔵した本
発明の酵素試薬を用いるグルコース検定の半反応時間は
好ましく製造直後のその酵素試薬を用いる同じ検定にお
ける半反応時間の１．５倍を越えない。

上述のグルコース検定において半反応時間が３０秒及び
１．５分であることはそれぞれ終点３分及び１０分に相
当する。

グルコース検定に関しここで述べるすべての議論はその
検定にとって最適の温度及びｐＨにおいてその検定が行
われる場合に基づいている。温度は約３７℃、ｐＨは約
７６５にすべきであると一般に認められている。

本発明の酵素試薬の好ましい説明では、酵素試薬ははじ
めに調製された詩法の成分からなっている。

（ａ）少なくとも約６０％（ｖ／Ｖ）の水、（ｂ）約２
０〜約４０％（ｖ／ｖ）の量の水と混合可能なポリオー
ル有機溶媒 ＜−Ｃ＞約６〜約８０ＫＩＵ／ｌの量のヘキソキナーゼ
酵素 （ｄ）約３〜約６０ＫＩＵ／ｌの量のグルコース−６−
リン酸脱水素酵素 （ｅ）次の成分からなる安定剤系 （ｉ）約０．５〜約５ｍＭの量のエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）である重金属イオンキレート剤、 （ｉｉ）約２〜約８ｇ／ｌの量の牛の血清アルブミンで
ある酸化防止剤、 （ｉｉｉ）約０．２５〜約１．０ｇ／ｌの量のアジ化ナ
トリウムである微生物抑制剤、 （ｆ）約０．０５〜０．２ｍＭの量のトリス−塩酸緩衝
剤。

ここに酵素試薬のｐＨは好ましくは氷酢酸を用いて約７
．５に調製される。

酵素試薬のもう１つの好ましい組成（ｖｅｒｓｉｏｎ）
では牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）の代りに約２〜約８
　ｇ　／　ｆＬの量のポリビニルピロリドン−４０と約
０．４〜約１．６ｇ／ｌのＮ−アセチルシステインが用
いられる。その他の成分はすべて同じである。

上述の酵素試薬の好ましい組成は上述の標準グルコース
濃度の動的範囲が好ましくは１０〜１０００　ｍ　ｇ　
／　ｄ　ｌ、最も好ましくは１０〜５００　ｍ　ｇ　／
　ｄ　ｌの場合に使用するのに適している。

本発明の酵素試薬は次の組成を有する均質な補酵素試薬
と用いるように設計されている。

（ａ）少なくとも約８０％（ｖ／ｖ）の水、（ｂ）約５
〜約２０％（ｖ／ｖ）の量の水と混合可能なポリオール
有機溶媒、 （ｃ）アデノシン三リン酸補酵素、及び（ｄ）ニコチン
アミド−アデニンジヌクレオチド補酵素。

好ましくは補酵素系試薬もまたＭｇ　　イオンを含有す
る。好ましくは補酵素試薬はトリス−塩酸で緩衝され、
そのｐＨは約７．５に調整される。補酵素試薬はまた微
生物コントロール剤を含有してもよい。

補酵素試薬中における補酵素アデノシン三リン酸とニコ
チンアミド−アデニンジヌクレオチドの最適量は下記の
第９図及び第１０図に示す。補酵素試薬における２種の
補酵素の好ましい濃度範囲は、ＡＴＰ約０．３〜約６．
０ｍＭ、より好ましくは約１〜約４．２ｍＭ、ＮＡＤ約
１．４〜４．２ｍＭ、より好ましくは約２．５〜約３．
５ｍＭである。標準グルコース検定反応混合液における
補酵素の対応濃度は、ＡＴＰ約０．３〜約５．４ｍＭ、
より好ましくは０．９〜約３．８ｍＭ、ＮＡＤ約１．３
〜約３．８ｍＭ、より好ましくは約２．２〜約３．２ｍ
Ｍである。試験試料中のグルコース濃度が５００　ｍ　
ｇ　／　ｄ　ｌの時の検定反応混合液中のＡＴＰ体グル
コースのモル比は、好ましくは約１：１から約２０：１
の範囲内に、より好ましくは３：１から約１４＝１まで
の間にある。試験試料中のグルコース濃度か５００ｍ　
ｇ　／　ｄ　ｌである検定反応混合液中のＮＡＤ対グル
コースのモル比は、好ましくは５：Ｊと１３＝１の間、
より好ましくは９：ｌと１１＝１の間にある。

（実施例） 以下に本発明を実施例に基づきさらに詳細に説、明する
。なお、ここで用いた薬品及び供給源、処方、測定機、
実験操作及び計算法は次の通りである。

特記しない限Ｄ、次の供給源からの薬品を用いた。

グルコース標準液はロードアイランド、イーストプロピ
デンスのニューイングランド・リエイジエント・ラボラ
トリ−（ＮＥＲＬ）から得られる。グルコース、安息香
酸、グリセリン、酢酸マグネシウム、アジ化ナトリウム
、氷酢酸、及びＥＤＴＡはニューシャーシー、フィリッ
プスバーブのＪ、Ｔ、ベーカー・ケミカル会社から得ら
れル、トリスー塩酸緩衝剤、ＢＳＡ、ＰＶＰ−４０及び
Ｎ−アセチルシステインはミズリー、セントルイスのシ
グマ・ケミカル会社から得られる。補酵素ＡＴＰ及びＮ
ＡＤ、及び酵素ＨＫ及びＧ−６−ＰＤＨはインディアナ
、インディアナポリスのボーリンガ−・マンハイム・バ
イオケミカルスから得られる。

Ｂ、処方 特記しない限Ｄ、次の処方を用いた。

（１）グルコース標準液 次の２種のグルコース標準液を用いた。

（ａ）研究室調製グルコース標準液−固形グルコースな
乾燥器（８０℃）中に２４時間入れた。

その後デシケータ−中で冷却した。予め決められた種々
の濃度の標準グルコース溶液はこの乾燥グルコースから
重量分析的に調製した。標準液はまた防腐剤として０．
２％の安息香酸を含有している。

（ｂ）ＮＥＲＬグルコース標準液−ＮＥＲＬグルコース
標準液は購入品を使用した。必要な場合標準液を希釈す
る（例えば５０　ｍ　ｇ　／　ｄ文から２５　ｍ　ｇ　
／　ｄ　ｌへ）には脱イオン水を使用した。ＮＥＲＬグ
ルコース標準液は５０，１００．２００．４００及び７
５０ｍｇ／ｄｌの各濃度で入手した。

（２）補酵素溶液 グリセリン　　　　　　　　　　１００ｍｇトリス−塩
酸　　　　　　　　　　１２．０ｇ酢酸マグネシウム　
　　　　　　　２．２２ｇアジ化ナトリウム　　　　　
　　　　０．５ｇ氷酢酸（ｐＨ７−５へ）　　　　　　
　４．６ｄＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２．５２６ｇＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２．０２６ｇ上記成分を脱イオン水を用い
てｌｆＬに希釈した。

（３）酵素溶液 （ａ）ＢＳＡ組成 グリセリン　　　　　　　　　　３００摺トリス−塩酸
　　　　　　　　　２．１１ｇＥＤＴＡ　（遊離酸）　
　　　　　　０．２９ｇ氷酢酸（ｐＨ７，５へ）　　　
　　４．２８ｇＢＳＡ　　　　　　　　　　　　　　４
．ＯｇＨＫ　　　　　　　　　　１９．２ＫＩＵ／ｌＧ
−６−ＰＤＨ３０ＫＩＵ／ｌ上記 成分を脱イオン水を用いて１！；Ｌに希釈した。

（ｂ）ＰＶＰ−４０組成−ＢＳＡを次に変えた以外ＢＳ
Ａ組成と同じである。

ポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−４０）４、Ｏｇ Ａ−アセチルシステイン（ＮＡＣ） ０．８１５ｇ Ｃ１測定機及び計装 ベックマン・インスツルメンツ社のモデルＤＵ−７分光
光度計を用いた。この分光光度計のセツティングは次の
ようにした。

モード　：　タイムドライブ 機　能　：　［吸光］ 波長：　３４０ｎｍ 速度：　［１２００］ 全時間　：　５分間 上限：３ 下限二〇 温度：３７℃ またロシエ・アナリティカル・コバス・バイオ臨床分析
計（コバスバイオ）を用いた。計器のセツティングは次
のようにした。

１、単位　　　　　　　　　　　ｍ　ｇ　／　ｄ文２、
計算ファクター　　　　　　　　　　　０３、標準ｌコ
ンク　　　　　　　　　１５０４、標準２コンク　　　
　　　　　　１５０５、標準３コンク　　　　　　　　
　１５０６、リミット　　　　　　　　　　　　　０７
、温度　　　　　　　　　　　　　３７℃８、分析型式
　　　　　　　　　　　　　１％式％ １０、試料容量［Ｊｌ、文コ　　　　　　　　　３１１
、希釈液容量［ＪＬｆＬ］　　　　　　　１０１２、試
薬容量［ｐ−１コ　　　　　　３００１３、温置時間［
秒］　　　　　　　１８０１４、開始試薬容量［ル又コ
　　　　　　０１５、最初の読みの時間［秒］　　　１
８０１６、時間間隔　　　　　　　　　　１８０１７、
読みの数　　　　　　　　　　　　１１８、ブランクモ
ード　　　　　　　　　　１１９、印刷モード　　　　
　　　　ｌ及び３Ｄ、遺庇 （１）酵素溶液の熱解離 酵素溶液試料を標識のついたバレツクスカートリッジに
びんづめし、種々の温度にセットしたインキュベーター
中へ入れた。各温度に３ける分解を異なった温置時間に
ついて下記に示すグルコース検定の温度酵素試薬を用い
ることにより監視した。高温での温度は分解を加速し、
低温長時間での分解に近付く。

（２）グルコース検定 （ａ）ＤＵ−７分光光度計−試薬としてはじめに酵素溶
液０．１８ｍＪｌ（１部）と補酵素溶液１．８１ｍ文（
１０部）の割合でキューペット中で混合した。この結合
試薬を３７℃で４分間温置した６次に試料２０ｐ、ｆＬ
をキューペットに添加して反応を開始させた。試料をキ
ューペットへ添加するのと同時にＤＵ−７の作動ボタン
を押し分光光度計をスタートさせた。試料は対にして試
験した。

（ｂ）コバスバイオー上述のセツティングをプログラム
した後、対にした２試料を試料カップ中に入れた。グル
コース酵素試薬及び補酵素試薬の成分をコバスバイオ試
薬トレイ中て次のように混合した：酵素試薬成分１舟又
及び補酵素試薬１０ｍ文。ベツグマンＡＳＴＲＡ校正標
準液（部品番号８８６３８４）をトレイの標準仕切りの
中に入れた。

上記の検定操作において両方とも結合試薬中の酵素溶液
と補酵素溶液の合端比率は１：１０であった。結合試薬
と試験試料との比率は容積で１００：１であった。

Ｅ、■ （１）ジ応時間 半反応時間、Ｔ　（１／２）はグルコース検定の測定反
応が最終及び最初の３４０ｎｍの吸光度に基づいて半分
終了する時間である。この時間は次のようにして計算さ
れた０反応終了後、２１０秒での吸光度をＤＵ−７の結
果から測定した。最初の吸光度を最終の吸光度から差引
き、その差を２て割って半反応の吸光度を求めた。この
吸光度に対応する時間（ＤＵ−７分光光度計の結果から
の読み）が半反応時間Ｔ　（１／２）である。

（２）直線性検討 酵素試薬の分解の程度は半反応時間Ｔ（１／２）の変化
に比例する。コハスバイオで得た結果を印刷モード１及
び３て表示した。印刷モート３から各試料のデルタ吸光
度を最初の読みと最終の吸光度の差を求めることにより
計算した。最終吸光度は３．５分後に測定した。この結
果はｍ　ｇ　／　ｄ　ｌで示す標準濃度にたいしてプロ
ットした。

実施例１ 酵素溶液のＢＳＡ組成及びＰＶＰ−４０の試料を４．１
５．２５．３２．３７及び４１”Ｃの各温度において熱
解離処理した。酵素溶液の活性度は上記のグルコース検
定法においてそれぞれ６５０及び１０００　ｍ　ｇ　／
　ｄ　ｌのグルコースを含有する研究室調製グルコース
標準液を用いて検討した。

これら比較的高いグルコース濃度は酵素分解が高いグル
コース濃度でより大きな有害効果を受けることから選ば
れた。また、これらグルコース高濃度はＴ　（１／２）
測定を容易にする。

安定性試験の結果はそれぞれ酵素溶液のＢＳＡ組成及び
ＰＶＰ−４０組成の結果を示す第１図及び第２図に示し
た。第１図及び第２図はともに分解の速度（傾斜値）対
温度（６Ｋ）の逆数の関係を示すアルレニウスプロット
である。傾創値は各温度ごとに直線関数Ｉ　ｎ　［１／
Ｔ　（１／２）］対時間（日数）をプロットすることに
より測定した。各アルレニウスプロットに示す２木の線
はこの試験に使用した２種のグルコース濃度（標準）を
示している。

第１表は各温度における酵素溶液のＴ（１／２）が２５
秒に到達する時間を求めるように決められた線型回帰に
基づく算出寿命を示す。このＴ　（１／Ｚ）２５秒は反
応完了時間約３〜４分にほぼ対応する。計算は最初のＴ
（１／２）が６５０ｍｇ／ｄｌでは１９秒、１０００ｍ
ｇ／ｄｌでは２２秒であることに基づいて行われた。

実施例２ ＨＫ／Ｇ−６−ＰＤＨ酵素溶液の直線性の検討新しく調
製した酸素溶液（日数０，４℃）をそれぞれ２５．５０
，１００，１５０．２００．４００．５００，６５０及
び１０００　ｍ　ｇ　／　ｄ　１濃度の研究室調製グル
コース標準液を用いるグルコース検定に使用した。第３
図に最初と最後の吸光度の差（Δ吸光度）をグルコース
濃度に対してプロットした。最初の吸光度は両酵素溶液
とも約０．０６てあった。４℃で０日貯蔵した酵素溶液
ＢＳＡ組成、ＰＶＰ−４０組成とも良好な直線性を示し
ている。

同じ操作を２５℃で１０６日貯蔵した２種の組成の溶液
について繰り返した。研究室調製グルコース標準液のグ
ルコース濃度はそれぞれ２５．１５０．６５０及び１０
００ｍｇ／ｄｕであった。１０６日における両酵素組成
の最初の吸光度は約Ｏ１ｌであった。結果を第４図に示
した。グルコース濃度１０ｏｏ′ｍｇ／ｄ！；Ｌまては
再び良好な直線性を示した。

別の現実時間直線試験では、４℃で約１年間貯蔵した後
の２種の組成の酵素溶液について同じ操作を繰り返した
。最初の吸光度は０，１７まで増大したが、得られた直
線性は残っていた。第５図は両組成の酵素溶液に対する
Δ吸光度対グルコース濃度をプロットしたものである。

１０００ｍｇ７ｄｌまで直線性は優れていた。

間貯蔵したＢＳＡ、＠成酵素溶液について同じ操作を綴
り返した。それぞれ２５．５０．１５０．４５０及び６
００ｍｇ／ｄｌの濃度を有するＮＥＲＬグルコース標準
液を用いた。最初の吸光増加した。しかし、吸光度差対
グルコース濃度のプロットである第６図に示すように直
線性は６００　ｍ　ｇ　／　ｄ　！Ｑまで優れている。

実施例３ 試薬成分の最適化 各酵素（ＨＫ及びＧ−６ＰＤＨ）及び補酵素（ＡＴＰ及
びＮＡＤ）の濃度の変化の影喜を、他の試薬成分を一定
（上記の処方に示すとおり）にしたままて、グルコース
濃度６５０ｍｇ／ｄｌを有する研究室調製グルコース標
準液を用いる上述のグルコース検定法を使用して試験し
た。この標準研究では酵素溶液のＢＳＡ組成を用いた。

第７．８．９．１０図は試薬成分のＴ（１／２）に対す
る影響を示す。結果は上記した処方に使用した酵素及び
補酵素濃度は最適範囲内にあることを示した。ＨＫ及び
Ｇ−６−ＰＤＨはともに酵素濃か高くなるほど反応が早
くなＤ、したがってＴ（１／２）か短時間になる。最適
化はコストと反応速度のバランスに実質上基づくもので
ある。

実施例４ 間にわたって貯蔵した。グルコース検定をそれた０反応
経過は３４０ｎｍにおける吸光度対時間（秒）を走査し
て追跡した。１年貯蔵の研究では、グルコース濃度１５
０及び６５０　ｍ　ｇ　／　ｄ　１貯蔵の研究ではグル
コース濃度５００　ｍ　ｇ　／　ｄ　１のＮＥＲＬグル
コース標準液を用いた。第１１〜したものである。全て
の検定において半反応時間もまた測定した。

貯蔵した場合の半反応時間Ｔ（１／２）と実質的に反応
が完了する（終点）時間を比較したものである。

以上本発明をある好ましい組成に関連して相当詳細に説
明したが、他の組成は可能である。それゆえ、特許請求
の範囲の精神及び範囲は好ましい組成についての記載に
必然的に限定されるべきものではない。

（発明の効果） 本発明の酵素試薬は多くの利点を有している。

この酵素試薬を４℃において正常に貯蔵したときの算定
寿命は１５年以上になり得る。このことは試薬が貯蔵ま
たは輸送中受ける時々の誤処理に耐年まで可能である。

５００ｍｇ／ｄｌグルコース標準液での反応は２分以内
に完了する。終点安定性は５分までである。これによっ
てグルコースの非常に迅速な定量を可能にする。最初の
ブランクは低い値であＤ、高い感度を与えることになる
。

試薬の直線性はグルコース濃度的１０００ｍｇ／ｄｌま
で優れている。この試薬のＢＳＡ組成の５００　ｍ　ｇ
　／　ｄ　ｌ標準液を用いた場合の計算上の感度はキュ
ーペット光路１ｃｍにおいて３４０ｎｍて０．００３２
吸光度／　ｍ　ｇ　／　ｄ　Ａである。

また、本発明の安定な液体酵素試薬は均質性であるため
従来技術のグルコース試薬の問題点、特に試薬取り扱い
上及び検定の品質管理上の問題点が解決される。本発明
の酵素試薬は硫酸アンモニウム安定化酵素試薬の場合の
ように液体懸濁物が存在しないから容易にピペット採取
及び秤取することができる。本酵素試薬を用いる検定結
果は再現性のあるものである６本発明の酵素試薬は手動
分析器及び自動分析器の両方に容易に適用される。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の酵素試薬のＢＳＡ及びＰＶ
Ｐ−４０組成に対する分解速度（傾斜）対温度の逆数を
アルレニウスプロットしたものであり。 第３〜６図は本発明の酵素試薬の直線性をそれぞれ（ａ
）調製直後、（ｂ）２５℃で１０６日貯蔵、（ｃ）４℃
で１年間貯蔵、（ｄ）４℃でる。 第７〜１０図はそれぞれＨＫ、Ｇ−６−ＰＤＨ，ＡＴＰ
及びＮＡＤの濃度を他の成分の濃度を一定に保って変え
た場合の半反応時間Ｔ　（Ｍ）に対する影響を示す。 期間を変えて貯蔵した本発明の酵素試薬を用いた場合の
反応経過である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、補酵素としてアデノシン三リン酸及びニコチンアミ
   ド−アデニンジヌクレオチドを用い、補酵素を過剰に存
   在させて行うグルコース検定におけるグルコース定量用
   であり、 （ａ）少なくとも約６０％（ｖ／ｖ）の水 （ｂ）水と混合できる約２０〜約４０％（ｖ／ｖ）のポ
   リオール有機溶媒 （ｃ）ヘキソキナーゼ酵素、 （ｄ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素、 （ｅ）約２℃から約８℃の範囲の温度で貯蔵したとき少
   なくとも２年の貯蔵寿命を有するのに十分な少なくとも
   ０．５ｍＭの重金属イオンキレート剤からなる安定剤系 からなる成分ではじめに調製された貯蔵寿命の長い均質
   液体酵素試薬。 ２、キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である特許請
   求の範囲第１項記載の酵素試薬。 ３、安定剤系が酸化防止剤かならる請求の特許範囲第１
   項記載の酵素試薬。 ４、酸化防止剤が少なくとも２ｇ／ｌの量の牛の血清ア
   ルブミンである特許請求の範囲第３項記載の酵素試薬。 ５、酸化防止剤が少なくとも約２ｇ／ｌの量のポリビニ
   ルピロリドン−４０及び少なくとも約０．４ｇ／ｌの量
   のＮ−アセチルシステインからなる特許請求の範囲第３
   項記載の酵素試薬。 ６、安定剤系が微生物コントロール剤からなる特許請求
   の範囲第１項記載の酵素試薬。 ７、微生物コントロール剤が少なくとも約０．２５ｇ／
   ｌの量のアジ化ナトリウムである特許請求の範囲第６項
   記載の酵素試薬。 ８、ポリオール溶媒がグリセリンであり、 （ａ）約６〜約８０ＫＩＵ／ｌの量のヘキソキナーゼ酵
   素、 （ｂ）約３〜約６０ＫＩＵ／ｌの量のグルコース−６−
   リン酸脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約８ｇ／ｌの量の牛の血清アルブミン、 （ｄ）約０．５〜約５ｍＭの量のエチレンジアミン四酢
   酸、 （ｅ）約０．２５〜約１．０ｇ／ｌの量のアジ化ナトリ
   ウム、 （ｆ）約０．０５〜約０．２ｍＭの量のトリス−塩酸緩
   衝剤、 からなり、ｐＨを約７（１／２）に調整された特許請求
   の範囲第４項記載の酵素試薬。 ９、ポリオールがグリセリンであり、 （ａ）約６〜約８０ＫＩＵ／ｌの量のヘキソキナーゼ酵
   素、 （ｂ）約３〜約６０ＫＩＵ／ｌの量のグルコース−６−
   リン酸脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約８ｇ／ｌの量のポリビニルピロリドン−
   ４０及び約０．４〜約１．６ｇ／ｌの量のＮ−アセチル
   システイン、 （ｄ）約０．５〜約５ｍＭの量のエチレンジアミン四酢
   酸、 （ｅ）約０．２５〜約１．０ｇ／ｌの量のアジ化ナトリ
   ウム、 （ｆ）約０．０５〜約０．２ｍＭの量のトリス−塩酸緩
   衝剤、 からなり、ｐＨを約７（１／２）に調整された特許請求
   の範囲第５項記載の酵素試薬。 １０、貯蔵期間中にグルコース検定に使用され、マグネ
   シウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸及びニコチ
   ンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有する液体補酵
   素試薬及びグルコースを含有する試験試料と混合されて
   検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試薬：試験試
   料が１０００：１１に対し１００の割合で混合され、試
   験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５００ｍｇ／ｄ
   ｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素が同液中の
   グルコース濃度に比較してグルコース検定用としては実
   質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレート剤濃度が
   同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％より多くな
   く存在する場合、グルコース検定の終点が約１０分より
   多くない時間内に到達することを特徴とする特許請求の
   範囲第８項記載の酵素試薬。 １１、ヘキソナーゼが約１．５〜約３．５ＫＩＵ／ｌの
   量であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約２０
   〜３５ＫＩＵ／ｌの量であり、アデノシン三リン酸のグ
   ルコースに対するモル比が反応混合液中で約３：１より
   も大きく、ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの
   グルコースに対するモル比が５：１よりも大きく、検定
   の終点が約２分以内の時間に到達する特許請求の範囲第
   １０項記載の酵素試薬。 １２、貯蔵期間中にグルコース検定に使用され、マグネ
   シウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸及びニコチ
   ンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有する液体補酵
   素試薬及びグルコースを含有する試験試料と混合されて
   検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試薬：試験試
   料が１０００：１１に対し１００の割合で混合され、試
   験試料中のグルコース濃度が約１０〜５００ｍｇ／ｄｌ
   の範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素が同液中のグ
   ルコース濃度に比較してグルコース検定用としては実質
   的に過剰に存在し、反応混合液中のキレート剤濃度が同
   液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％より多くなく
   存在する場合、グルコース検定の終点が約１０分より多
   くない時間内に到達することを特徴とする特許請求の範
   囲第９項記載の酵素試薬。 １３、ヘキソナーゼが約１．５〜約３．５ＫＩＵ／ｌの
   量であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約２０
   〜３５ＫＩＵ／ｌの量であり、アデノシン三リン酸のグ
   ルコースに対するモル比が反応混合液中で約３：１より
   も大きく、ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの
   グルコースに対するモル比が５：１よりも大きく、検定
   の終点が約２分以内の時間に到達する特許請求の範囲第
   １２項記載の酵素試薬。 １４、貯蔵期間中にグルコース検定に使用され、マグネ
   シウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸及びニコチ
   ンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有する液体補酵
   素試薬及びグルコースを含有する試験試料と混合されて
   検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試薬：試験試
   料が１０００：１１に対し１００の割合で混合され、試
   験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５００ｍｇ／ｄ
   ｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素が同液中の
   グルコース濃度に比較してグルコース検定用としては実
   質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレート剤濃度が
   同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％より多くな
   く存在する場合、グルコース検定の半反応時間が調製当
   初の同じ検定における半反応時間の約１．５倍より大き
   くないことを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の酵
   素試薬。 １５、貯蔵期間中にグルコース検定に使用され、マグネ
   シウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸及びニコチ
   ンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有する液体補酵
   素試薬及びグルコースを含有する試験試料と混合されて
   検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試薬：試験試
   料が１０００：１１に対し１００の割合で混合され、試
   験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５００ｍｇ／ｄ
   ｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素が同液中の
   グルコース濃度に比較してグルコース検定用としては実
   質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレート剤濃度が
   同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％より多くな
   く存在する場合、グルコース検定の半反応時間が調製当
   初の同じ検定における半反応時間の約１．５倍より大き
   くないことを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の酵
   素試薬。 １６、（ａ）（ｉ）少なくとも６０％（ｖ／ｖ）の水、 （ｉｉ）水と混合可能な約２０〜約４０％（ｖ／ｖ）の
   量のポリオール有機溶媒、 （ｉｉｉ）ヘキソキナーゼ酵素、 （ｉｖ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素、 （ｖ）約２℃から約８℃の範囲の温度で貯蔵したとき少
   なくとも２年の貯蔵寿命を有するのに十分な少なくとも
   約０．５ｍＭの量の重金属イオンキレート剤からなる安
   定剤系 からなる成分ではじめに調製された貯蔵寿命の長い均質
   液体酵素試薬、及び （ｂ）（ｉ）少なくとも８０％（ｖ／ｖ）の水、 （ｉｉ）水と混合可能な約５〜約２０％（ｖ／ｖ）の量
   のポリオール有機溶媒、 （ｉｉｉ）アデノシン三リン酸補酵素、 （ｉｖ）ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド補酵
   素、及び （ｖ）マグネシウムイオンからなる均質液体補酵素試薬 からなり、両試薬が混合されてグルコース検定に適した
   結合試薬とされるとき結合試薬中において酵素試薬から
   のキレート剤の量がモル比で補酵素試薬からのマグネシ
   ウムイオンの量の約半分よりも多くないように処方され
   るグルコース検定におけるグルコース定量用キット。 １７、結合試薬が酵素試薬及び補酵素試験を１：１０（
   ｖ／ｖ）で混合して形成され、結合試薬中での酵素試薬
   からのキレート剤の量が補酵素試薬からのマグネシウム
   イオンの量の約１／１０よりも多くない特許請求の範囲
   第１０項記載のキット。 １８、キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である特許
   請求の範囲第１６項記載のキット。 １９、安定剤系が酸化防止剤からなる特許請求の範囲第
   １６項記載のキット。 ２０、酸化防止剤が少なくとも２ｇ／ｌの量の牛の血清
   アルブミンである特許請求の範囲第１９項記載のキット
   。 ２１、酸化防止剤が少なくとも約２ｇ／ｌの量のポリビ
   ニルピロリドン−４０及び少なくとも約０．４ｇ／ｌの
   Ｎ−アセチルシステインからなる特許請求の範囲第１９
   項記載のキット。 ２２、安定剤系が微生物コントロール剤からなる特許請
   求の範囲第１６項記載のキット。 ２３、微生物コントロール剤が少なくとも約０．２５ｇ
   ／ｌの量のアジ化ナトリウムである特許請求の範囲第２
   ２項記載のキット。 ２４、ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵素試薬が （ａ）約６〜約８０ＫＩＵ／ｌの量のヘキソキナーゼ酵
   素、 （ｂ）約３〜約６０ＫＩＵ／ｌの量のグルコース−６−
   リン酸脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約８ｇ／ｌの両の牛の血清アルブミン、 （ｄ）約０．５〜約５ｍＭの量のエチレンジアミン四酢
   酸、 （ｅ）約０．２５〜約１．０ｇ／ｌの量のアジ化ナトリ
   ウム、 （ｆ）約０．０５〜約０．２ｍＭの量のトリス−塩酸緩
   衝剤、 からなり、ｐＨを約７（１／２）に調整されたものであ
   る特許請求の範囲第２０項記載のキット。 ２５、ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵素試薬が （ａ）約６〜約８０ＫＩＵ／ｌの量のヘキソキナーゼ酵
   素、 （ｂ）約３〜約６０ＫＩＵ／ｌの量のグルコース−６−
   リン酸脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約８ｇ／ｌの量のポリビニルピロリドン−
   ４０及び約０．４〜約１．６ｇ／ｌの量のＮ−アセチル
   システイン、 （ｄ）約０．５〜約５ｍＭの量のエチレンジアミン四酢
   酸、 （ｅ）約０．２５〜約１．０ｇ／ｌの量のアジ化ナトリ
   ウム、 （ｆ）約０．０５〜約０．２ｍＭの量のトリス−塩酸緩
   衝剤、 からなり、ｐＨを約７（１／２）に調整されたものであ
   る特許請求の範囲第２１項記載のキット。 ２６、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５０
   ０ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素
   が同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用
   としては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレー
   ト剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％
   より多くなく存在する場合、グルコース検定の終点が約
   １０分より多くない時間内に到達し得るものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第２４項記載のキット。 ２７、ヘキソナーゼが約１．５〜約３．５ＫＩＵ／ｌの
   量であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約２０
   〜３５ＫＩＵ／ｌの量であり、アデノシン三リン酸のグ
   ルコースに対するモル比が反応混合液中で約３：１より
   も大きく、ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの
   グルコースに対するモル比が５：１よりも大きく、検定
   の終点が約２分以内の時間に到達し得るものである特許
   請求の範囲第２６項記載のキット。 ２８、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜５００
   ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素が
   同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用と
   しては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレート
   剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％よ
   り多くなく存在する場合、グルコース検定の終点が約１
   ０分より多くない時間内に到達し得るものであることを
   特徴とする特許請求の範囲第２５項記載のキット。 ２９、ヘキソナーゼが約１．５〜約３．５ＫＩＵ／ｌの
   量であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約２０
   〜３５ＫＩＵ／ｌの量であり、アデノシン三リン酸のグ
   ルコースに対するモル比が反応混合液中で約３：１より
   も大きく、ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの
   グルコースに対するモル比が５：１よりも大きく、検定
   の終点が約２分以内の時間に到達する特許請求の範囲第
   ２８項記載のキット。 ３０、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５０
   ０ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素
   が同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用
   としては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレー
   ト剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％
   より多くなく存在する場合、グルコース検定の半反応時
   間が調製当初の同じ検定における半反応時間の約１．５
   倍より大きくないことを特徴とする特許請求の範囲第２
   ４項記載のキット。 ３１、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５０
   ０ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素
   が同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用
   としては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレー
   ト剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％
   より多くなく存在する場合、グルコース検定の半反応時
   間が調製当初の同じ検定における半反応時間の約１．５
   倍より大きくないことを特徴とする特許請求の範囲第２
   ５項記載のキット。 ３２、（ａ）（ｉ）グルコースを含有する試験試料、（
   ｉｉ）Ａ、少なくとも約６０％（ｖ／ｖ）の水 Ｂ、水と混合可能な少なくとも約２０〜約４０％（ｖ／
   ｖ）のポリオール有機溶媒 Ｃ、ヘキソキナーゼ酵素 Ｄ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素 Ｅ、約２℃から約８℃の範囲で貯蔵したとき少なくとも
   ２年の貯蔵寿命を有するのに十分な少なくとも約０．５
   ｍＭの量の金属イオンキレートからなる安定剤系 からなる成分ではじめに調製された貯蔵寿命の長い均質
   液体酵素試薬、及び （ｉｉｉ）Ａ、少なくとも約８０％（ｖ／ｖ）の水 Ｂ、水と混合可能な少なくとも５〜２０％（ｖ／ｖ）の
   量のポリオール有機溶媒 Ｃ、アデノシン三リン酸補酵素 Ｄ、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド補酵素、
   及び Ｅ、マグネシウムイオンからなる均質補酵素試薬 を混合するに際し、酵素試薬からのキレート剤の量がモ
   ル比で補酵素試薬からのマグネシウムイオンの量の約半
   分より大きくならないような割合で試薬と試験試料を混
   合する段階及び （ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレチオ還元物を測
   定する段階 からなるグルコース定量方法。 ３３、混合段階が最初に酵素試薬と補酵素試薬を１：１
   ０（ｖ／ｖ）で混合して結合試薬を形成させるに際し混
   合試薬中において酵素試薬からのキレート剤の量が補酵
   素試薬からのマグネシウムイオンの量の約１／１０より
   も多くならないように混合することからなる特許請求の
   範囲第３２項記載の方法。 ３４、キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である特許
   請求の範囲第３２項記載の方法。 ３５、安定剤系が酸化防止剤からなる特許請求の範囲第
   ３２項記載の方法。 ３６、酸化防止剤が少なくとも２ｇ／ｌの量の牛の血清
   アルブミンである特許請求の範囲第３５項記載の方法。 ３７、酸化防止剤が少なくとも約２ｇ／ｌの量であるポ
   リビニルピロリデン−４０及び少なくとも約０．４ｇ／
   ｌのＮ−アセチルシステインからなる特許請求の範囲第
   ３５項記載の方法。 ３８、安定剤系が微生物コントロール剤からなる特許請
   求の範囲第３２項記載の方法。 ３９、微生物コントロール剤が少なくとも約０．２５ｇ
   ／ｌの量のアジ化ナトリウムである特許請求の範囲第３
   ８項記載の方法。 ４０、ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵素試薬が （ａ）約６〜約８０ＫＩＵ／ｌの量のヘキソキナーゼ酵
   素、 （ｂ）約３〜約６０ＫＩＵ／ｌの量のグルコース−６−
   リン酸脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約８ｇ／ｌの量の牛の血清アルブミン、 （ｄ）約０．５〜約５ｍＭの量のエチレンジアミン四酢
   酸、 （ｅ）約０．２５〜約１．０ｇ／ｌの量のアジ化ナトリ
   ウム、 （ｆ）約０．０５〜約０．２ｍＭの量のトリス−塩酸緩
   衝剤、 からなり、ｐＨを約７（１／２）に調整されたものであ
   る特許請求の範囲第３６項記載の方法。 ４１、ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵素試薬が （ａ）約６〜約８０ＫＩＵ／ｌの量のヘキソキナーゼ酵
   素、 （ｂ）約３〜約６０ＫＩＵ／ｌの量のグルコース−６−
   リン酸脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約８ｇ／ｌの量のポリビニルピロリドン−
   ４０及び約０．４〜約１．６ｇ／ｌの量のＮ−アセチル
   システイン、 （ｄ）約０．５〜約５ｍＭの量のエチレンジアミン四酢
   酸、 （ｅ）約０．２５〜約１．０ｇ／ｌの量のアジ化ナトリ
   ウム、 （ｆ）約０．０５〜約０．２ｍＭの量のトリス−塩酸緩
   衝剤、 からなり、ｐＨを約７（１／２）に調整されたものであ
   る特許請求の範囲第３７項記載の方法。 ４２、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５０
   ０ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素
   が同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用
   としては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレー
   ト剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％
   より多くなく存在する場合、グルコース検定の終点が約
   １０分より多くない時間内に到達し得るものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第４０項記載の方法。 ４３、ヘキソナーゼが約１．５〜約３．５ＫＩＵ／ｌの
   量であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約２０
   〜３５ＫＩＵ／ｌの量であり、アデノシン三リン酸のグ
   ルコースに対するモル比が反応混合液中で約３：１より
   も大きく、ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの
   グルコースに対するモル比が５：１よりも大きく、検定
   の終点が約２分以内の時間に到達し得るものである特許
   請求の範囲第４２項記載の方法。 ４４、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜５００
   ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素が
   同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用と
   しては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレート
   剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％よ
   り多くなく存在する場合、グルコース検定の終点が約１
   ０分より多くない時間内に到達し得るものであることを
   特徴とする特許請求の範囲第４１項記載の方法。 ４５、ヘキソナーゼが約１．５〜約３．５ＫＩＵ／ｌの
   量であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約２０
   〜３５ＫＩＵ／ｌの量であり、アデノシン三リン酸のグ
   ルコースに対するモル比が反応混合液中で約３：１より
   も大きく、ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの
   グルコースに対するモル比が５：１よりも大きく、検定
   の終点が約２分以内の時間に到達し得るものである特許
   請求の範囲第４４項記載の方法。 ４６、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５０
   ０ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素
   が同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用
   としては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレー
   ト剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％
   より多くなく存在する場合、グルコース検定の半反応時
   間が調製当初の同じ検定における半反応時間の約１．５
   倍より大きくないことを特徴とする特許請求の範囲第４
   ０項記載の方法。 ４７、酵素試薬が貯蔵期間中にグルコース検定に使用さ
   れ、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
   及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
   る液体補酵素試薬及びグルコースを含有する試験試料と
   混合されて検定反応混合液を形成し、容積比で補酵素試
   薬：試験試料が１０００：１１に対し１００の割合で混
   合され、試験試料中のグルコース濃度が約１０〜約５０
   ０ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、検定反応混合液中の補酵素
   が同液中のグルコース濃度に比較してグルコース検定用
   としては実質的に過剰に存在し、反応混合液中のキレー
   ト剤濃度が同液中のマグネシウムイオン濃度の約５０％
   より多くなく存在する場合、グルコース検定の半反応時
   間が調製当初の同じ検定における半反応時間の約１．５
   倍より大きくないことを特徴とする特許請求の範囲第４
   １項記載の方法。