JPS6319559A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は医療検査において血液その他の生体成分を免疫
学的分析方法に関し、詳しくは病態の変動、疾患の種類
の同定、疾病の程度を診断するための乾式分析要素（一
体型多層分析要素）を用いた操作の簡易な免疫分析方法
に関するものである。

［従来技術］ 従来抗原−抗体反応からなる免疫反応を利用する診断器
具として試薬含浸Ｐ紙、試薬層と多孔性展開層を有する
一体型多層分析要素（以下、多層分析要素ということが
ある）等の乾式診断器具、及びそれ゛らを用いる分析方
法が多数提案されている。

しかしそれらの乾式診断器具は分析操作が簡単なかわり
に測定精度、感度等で実用の域に達していないものが多
い。

乾式分析要素を用いる免疫分析方法として、特表昭５８
−５０１１４４（Ｗｏ　８３１００３９１）に記載の抗
原を固定したグラスファイバーＰ紙状シート（多孔性Ｍ
）を収容したスライドに測定対象抗体を含む血清を点着
し、そのシート内で測定対象抗体と固定抗原を結合させ
１次いで蛍光標識抗原含有水性液をそのシートに点着し
て未反応まま残留している測定対象抗体と結合させ、シ
ートの反応領域に洗浄液を供給して未固定の標識抗原−
測定対象抗体結合物をシート内で外側に向かって放射状
に押し流して除去（Ｂ／Ｆ分離操作）シ、ゲラスフ、イ
バーに固定の標識抗原−測定対象抗体結合物の標識物に
基づいて発生する蛍光を測光して検量線から測定対象抗
体量を定量する方法が「日本臨床検査自動化学会会誌Ｊ
　１０（１）、５７−６０（１９８５）、ｒＣＩｉｎ、
Ｃｈｅｓ、」２８（９）、１８９４−１８９８（１９８
２）等に記載され、また実用されている。この方法はＢ
／Ｆ分離に小さなスライドの中心部に外部から洗浄液を
供給する操作が必要という問題点がある。

［発明の目的コ 本発明は簡単な溶液法の操作と一体型多層分析要素を用
いる簡単な乾式操作の組合せで高感度かつ高測定精度で
定量分析できる免疫分析方法を提供することである。

本発明は標識免疫成分と標識されていない免疫成分との
競合免疫反応を水性溶液中でおこなわせ。

次いで乾式操作の一体型多層分析要素を用いて特別なり
／Ｆ分離操作なしで定量分析できる免疫分析方法を提供
することである。

［発明の構成］ 本発明は。

■抗原（又は抗体）を固定した微粒子を含む水性溶液中
において測定対象抗体（又は抗原）と標識抗体（又は標
識抗原）とを競合反応させて、前記測定対象抗体（又は
抗原）と前記標識抗体（又は標識抗原）の一部を前記微
粒子に固定された抗原（又は抗体）と結合させ、未結合
（フリー）の標識抗体（又は未結合の標識抗原）を前記
溶液中にそのまま残留させ。

■前記溶液の一定量を採取し。

■前記微粒子を収納して濾過しうる多孔性層を有する一
体型多層分析要素に前記一定量の溶液を点着して、前記
微粒子を前記多孔性層内に収納し。

一方前記未結合の標識抗体（又は未結合の標識抗原）と
前記溶液の媒体である水を呈色試薬層又は検出層に供給
させ。

■前記未結合のｔ！ｓ識抗体（又は前記未結合の標識抗
Ｍ）の標識物に基づいて一体型多層分析要素の呈色試薬
層又は検出層において呈色させて比色測定することによ
り前記測定対象抗体（又は抗原）の量を測定する免疫分
析方法である。

一体型多層分析要素を用いて比色測定する操作の態様例
としては、未結合の標識抗体（又は未結合の標識抗原）
を含む溶液の一定量を多層分析要素に点着し、実質的に
一定の温度で実質的に一定の時間インクベーションし、
光透過性支持体側又は多孔性層側から要素内の色、蛍光
、混濁又は紫外線領域の吸収の光学濃度を反射測光又は
透過測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の
原理により前記溶液中の未結合の標識抗体ｌ（又は未結
合の標識抗原量）を求め、この量から水性液体試料中の
測定対象抗体量（又は測定対象抗原量）を間接的に求め
るか、あるいは検量線から直接測定対象抗体量（又は測
定対象抗原量）を求める方法がある。

［発明の構成の詳細な説明］ 本発明に用いることができる標識抗原又は標識抗体とし
ては。

Ｄ　、Ｍｏｎｒｏｅ：ｒＡｎａｌ、ｃｈｅｍ、ｊ、５６
（８）、９２０Ａ（１９８４）；石川栄治ら：［酵素免
疫測定法（第２版）Ｊ（１９８２年）；渡辺冨久子ら＝
「検査と技術」、え（７）　、５８３（１９８１）；Ｉ
　、Ｈｅ＋ｍｍ１ｌａｅ：ｒＣｌｉｎ、ｃｈｅｍ、」、
３１（３）、３５９（１９８５）；上能伊久雄：「ファ
ルマシア、、２１（２）　、１２６（１９８５）等に記
載の標識抗原又は標識抗体がある。

標識物の例としてＦＩＴＣ（フルオレスセインイソチオ
シアン酸）等の蛍光色素；グルコースオキシダーゼ（Ｇ
ＯＤ；　ＥＣ１，１，３，４＞、ガラクトースオキシダ
ーゼ（ＥＣ１，１，３，９＞等のオキシダーゼ；ペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ、　ＥＣ１，１１，１，７）；アル
カリ性ホスファターゼ（Ａ　Ｌ　Ｐ　、　ＥＣ３，１，
３，１＞　、α−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，１）等
の加水分解酵素；ルミノール等の化学発光色素；ルシフ
ェラーゼ等の酸化化学発光酵素等の公知の物質がある。

抗原又は抗体に標識物を結合させる方法は。

河合忠編「臨床検査技術全書４免疫血清検査」（医学書
院、１９７７年発行）、９７−１０２頁；’Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎｇ　、７
４，５３８（１９７７）　； ’Ｃｌ１ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ」、８３
，１６１（１９７８）；特開昭５３−７９０２４　、特
開昭５３−１４２５２２　、特開昭５１−１４６２９５
、特開昭５２−６７３８８等に記載の公知の方法による
ことができる。

標識抗原又は抗体の具体例として、ＧＯＤ結合抗ヒト免
疫グロブリン（Ｉ　ｇＧ）、ＡＬＰ結合抗■ｇＧ、ＰＯ
Ｄ標識α−フェトプロティン等がある。

抗原又は抗体を微粒子に固定させる方法も前記の抗原又
は抗体に標識物を結合させる方法について記載の前記の
文献及び特許明細書に記載の方法によることができる。

標識抗原又は標識抗体は後述の微粒子を含有させる溶液
と同様のｐＨ［’！剤を含有する水溶液に含有させて用
いる。特に標識物が酵素である場合には、　）！衝剤に
より標識抗原又は標識抗体含有溶液のｐＨ値を用いられ
る酵素の最適ａｎ近傍のｐＨ値に維持することが好まし
いし、場合によっては必須である。標識抗原又は標識抗
体の使用量は、水性液体試料中の測定対象抗原又は測定
対象抗体の最大含有量と同程度の量又はそれより多い量
である。

微粒子としては抗原−抗体反応（免疫反応）を実質的に
妨害しない天然又は合成有機ポリマー（例。

アガロース、ゼラチン、プルラン、セルロース、セルロ
ースアセテート、硬化ポリビニルアルコール、ポリスチ
レン等）からなる（内部空間のない充実）球形又は不定
型等の微粒子、同様な有機ポリマーからなる短繊維、同
様な有機ポリマーからなるミクロカプセル等公知の微粒
子で粒子径約０．１μｍから約１ｍｍ、好ましくは約０
．５Ｌｌｌ＠から約Ｌｏｏｕｓの範囲のものを用いるこ
とができる。

抗原又は抗体を結合させた微粒子を含有させる溶液とし
ては、公知のｐＨ１ｌｌｔｌｆｒ剤を含有する水溶液を
用いることが好ましい、特に標識物が酵素である場合に
は、緩衝剤により抗原又は抗体結合微粒子含有溶液のｐ
ｉｔ値を用いられる酵素の最適ｐＨ近傍のｐＨ値に維持
することが好ましいし、場合によっては必須である。用
いうるｐＨ［街剤としては。

日本化学命綱「化学便覧基礎編」（東京、丸首（株）。

１９６６年発行）１３１２−１３２０頁；Ｒ，Ｍ、Ｃ，
Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔａｌ’Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｅｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒ
ｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎＰ　ｒｅｓｓ　
、　１９６９年）４７６−５０８頁；’Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ」、５，４６７−４７７（１９８６）：’Ａ
ｎａ１．Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｇ　、１０４，３００−３１
０（１９８０）等がある。

本発明の方法を実施する際に用いる一体型多層分析要素
は、水不透過性光透過性（透明）支持体の上に親水性ポ
リマーバインダー層（吸水層、又は検出層）、又は親水
性ポリマーバインダー又は多孔性層に呈色試薬組成物が
含有されてなる呈色試薬層。

前記微粒子を濾過しうる多孔性層又は多孔性Ｂ間層をこ
の順に有する一体型多層分析要素である。

多孔性層又は多孔性展開層としては特開昭５５−１６４
３５８、特開昭５７−６８３５９等に記載の織物展開層
（例、ブロード、ボブリン等の平織等）；特開昭６０−
２２２７６９等に記載の編物展開層（例、トリコット編
。

ダブルトリコット編、ミラニーズ編等）；特開昭５７−
１４８２５０に記載の有機ポリマー繊維パルプ含有抄造
紙からなる展開層；特公昭５３−２１６７７、米国特許
３９９２１５８等に記載のメンブランフィルタ（ブラシ
ュボリマー層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロ
ビーズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持され
てなる連続微空隙含有多孔性層等の非繊維等方的多孔性
展開層；特開昭５５−９０８５９等に記載のポリマーミ
クロビーズが水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状
に接着されてなる連続微空隙含有多孔性層（三次元格子
状粒状構造物層）からなる非ｗＩ維等方的多孔性展開層
；特願昭６０−２３２７２６等に記載の多層塗布法又は
多層流延法等により形成された２層の高分子微多孔性層
がその界面で密着一体化してなる連続微空隙構造の複合
メンブランフィルタ（複合ブラシュボリマー層）；特開
昭６０−２３００６３に記載の抄紙法で作られた繊維質
体積濾過層と布（ｍ物又は編物）の２層がその界面で両
者のｍ維がからみあい一体をなす複合層；特開昭６０−
２３００６４に記載の抄紙法で作られた繊維質体積濾過
層とメンブランフィルタ等の非１ａ維微多孔性層の２層
がその界面で体積濾過層の繊維が非繊維微多孔性層の微
孔にアンカリングして一体をなす複合層；その他公知の
ガラス繊維１紙等を用いることができる。多孔性層又は
多孔性展開層は最上層に設けることが多くの場合好まし
い。

親水性ポリマーバインダー層（吸水層又は検出層）は水
を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主成分とする層で
、この層の界面に到達又は浸透した水性液体試料の水を
吸収できる層であり、全血試料を用いる場合には水性液
体成分、すなわち血漿の試薬層又は検出層等への浸透を
促進する作用を有する層である。親水性ポリマーバイン
ダー層に用いられる親水性ポリマーは水吸収時の膨潤率
が３０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約
２５０％から約１５００％の範囲のポリマーである。親
水性ポリマーの具体例として、特開昭５９−１７１８８
４．特開昭６０−１１５８５９等に記載の酸処理ゼラチ
ン、脱イオンゼラチン等のゼラチン、フタル化ゼラチン
、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等のゼラチ
ン誘導体、特開昭５９−１７１８６４．特開昭６０−１
１５８５９等に記載のアガロース、プルラン、プルラン
誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン等がある。これらの親水性ポリマ
ーは単独で、あるいは２種以上を組合わせて用いること
ができる。親水性ポリマーバインダー層には一般的には
ゼラチン又はゼラチン誘導体が好ましいが、ポリアクリ
ルアミド、ポリビニルアルコール等も好ましい。

親水性ポリマーバインダー層の乾燥時の厚さは約１ｕｍ
から約１００１ｍ、好ましくは約３１Ｊｍから約３０１
Ｊａ＋の範囲、被覆ｌでは約１ｇ／ｍ２から約１００Ｆ
ｉ／ｍ２．好ましくは約３ｇ／ｍ”から約３０ｇ／ａ＋
２の範囲である。親水性ポリマーバインダー層には公知
のｐＨＷｔｍ剤、有機カルボン酸、酸性ポリマー、塩基
性ポリマー等を含有させて使用時（分析操作実施時）の
ｐｌｌを調節することができる。さらに親水性ポリマー
バインダー層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含
有させることができる０Ｍ水性ポリマーバインダー層は
実質的に透明であることが好ましいが、必要に応じて層
中に二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボ
ンブラック等を少量分散含有させて光学的性能を調節す
ることができる。

［以下余白］ 呈色試薬層は標識抗体（又は標識抗原）の標識化合物又
は標識成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じさ
せる試薬組成′＄ＩＪ（呈色試薬組成物）が親水性ポリ
マーバインダー中に実質的に一様に分散含有されている
吸水性で水浸透性の層である。

光学的に検出可能な変化とは光学的測定方法により検出
できる変化を意味し２例えば色変化３発色（呈色）、蛍
光発生、紫外線領域における吸収波長の変化、混濁発生
等である。

呈色試薬層に用いられる親水性ポリマーバインダーとし
ては前述の親水性ポリマーバインダー層に用いられるの
と同様な親水性ポリマーがある。

呈色試薬層の乾燥時の厚さは約３μｍから約５０ＬＩｌ
ａ、好ましくは約５１から約３０ｕｍの範囲、被覆量で
は約３ｇ／＋ｓ２から約５０ｇ／ｍ２．好ましくは約５
ｇ／ｍ’から約３０ｇ／、２の範囲である。呈色試薬層
には公知のｐＨ緩衝剤。

有機カルボン酸、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含
有させて使用時（分析操作実施時）のｐｉ（を調節する
ことができる。さらに呈色試薬層には公知の媒染剤、ポ
リマー媒染剤等を含有させることができる、呈色試薬層
は実質的に透明であることが好ましいが、必要に応じて
、層中に二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子、カ
ーボンブラック等を少量分散含有させて光学的性能を調
節することができる。

呈色試薬層はまた。特開昭６１−４９５９に記載の方法
により前述の多孔性層と同様な多孔性層に呈色試薬組成
物を含有させて設けることもできる。

呈色試薬層に含有される呈色試薬組成物としては、公知
の諸種の呈色試薬組成物を用いることができる。標識物
質がグルコスオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ
等のオキシダーゼ：又はペルオキシダーゼの場合には、
好ましい試薬組成物の例として。

オキシダーゼ用： ■ペルオキシダーゼと色原体とカプラーを含み。

標識物質オキシダーゼの作用により発生した過酸化水素
によりペルオキシダーゼの存在下に色原体とカプラーが
酸化カプリングしてキノンイミン色素を形成して発色す
る試薬組成物。

■ロイコ色素又は自己酸化性色原体とペルオキシダーゼ
を含み、標為物質オキシダーゼの作用により発生した過
酸化水素によりペルオキシダーゼの存在下に酸化されて
色素になり発色する試薬組成物。

ペルオキシダーゼ用： ■オキシダーゼと色原体とカプラーを含み、標識物質ペ
ルオキシダーゼの存在下に過酸化水素により色原体とカ
プラーが酸化カプリングしてキノンイミン色素を形成し
て発色する試薬組成物。

■ロイコ色素又は自己酸化性色原体とオキシダーゼを含
み、標識物質ペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素に
より酸化されて色素になり発色する試薬組成物がある。

色原体として、「＾ｎｎ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
」、６．２４−２７（１９６９）に記載の４−アミノア
ンチとリン（別名４−アミノフェナジン、すなわち１−
フェニル−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾ
リン−５−オン）、特開昭５９−５４９６２等に記載の
１−（２，４，６−）ジクロロフェニル）−２，３−ジ
メチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン；１−
（３，５−ジクロロフェニル）−２，３−ジメチル−４
−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン等の１−トリ置換
フェニル−２゜３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾ
リン−５−オン類、特公昭５５−２５８４０等に記載の
１−フェニル−２，３−ジメチル−４−ジメチルアミン
−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミノアンチピリ
ン類似体を用いることができる。これらの化合物のうち
では、４−アミノアンチピリン；１−（２，４，６−）
ジクロロフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−
３−ピラゾリン−５−オン：　１−（３，５−ジクロロ
フェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラ
ゾリン−５−オン等が好ましい。

カプラーとして、「＾ｎｎ、ｃＩｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｇ　、６．２４−２７（１９６９）　、特公昭５５−２
５８４０　、特公昭５８−４５５９９　。

特公昭５８−１８６２８　、特開昭５５−１６４３５６
．特開昭５６−１２４３９８　、特開昭５６−１５５８
５２等に記載のフェノール；２−ヒドロキシ−１−ベン
ゼンスルホン酸；４−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホ
ン酸；３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼ
ンスルホン酸：２−ヒドロキシ−３−メトキシ−１−ベ
ンゼンスルホン酸等のフェノールスルホン！！顕（アル
カリ金属塩、アルカリ土類金属塩を含む）；１−ナフト
ール；２−ナフトール：１．ツージヒドロキシナフタレ
ン等のジヒドロキシナフタレン類、１−ヒドロキシ−２
−ナフタレンスルホン酸：１−ヒドロキシ−４−ナフタ
レンスルホン酸等のナフトールスルホン酸類（アルカリ
金属塩、アルカリ土類金属塩を含む）；その他のフェノ
ール又はナフトール誘導体等がある。これらの化合物の
うちでは１．７−ジしドロキシナフタレン：１−ヒドロ
キシ−２−ナフタレンスルホン酸（Ｎａ塩、に塩ルミ塩
を含む）；３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベ
ンゼンスルホン酸；２〜ヒドロキシ−３−メトキシ−１
−ベンゼンスルホン酸（Ｌｉ塩、に塩、Ｌｉ塩を含む）
等が好ましい。

ロイコ色素としては特公昭５７−５５１９に記載の２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４
，５−ビス［４−（ジメチルアミノ）フェニルコイミダ
ゾール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素類；特
開昭５９−１９３３５２に記載の２−（３，５−ジメト
キシ−４−ヒドロキシフェニル＞−４−ｒ４−＜ジメチ
ルアミノ）フェニルトラ−フェネチルイミダゾール等の
ジアリールイミダゾールロイコ色素類がある。

ペルオキシダーゼとしては、馬場、和田、北村。

奥田編著「臨床酵素ハンドブック」（講談社、１９８２
年）；丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」（朝倉書店
、１８９２年）；丁、Ｅ、Ｂａｒｍａｎ著ｒＥｎｚｙｍ
ｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌ
ａｇ、１９６９年）；特公昭５６−４５５９９　、特公
昭５７−５５２０等に記載のｍ物起源及び動物起源のペ
ルオキシダーゼ（ＥＣ１，１１，１，７）；特公昭５８
−５０３５等に記載の微生物起源のペルオキシダーゼ（
ＥＣＩ。

１１、Ｌ、））を用いることができる。これらのうちで
、　は植物起源又は微生物起源の非特異的ペルオキシダ
ーゼが好ましい、好ましいペルオキシダーゼの例として
、西洋わさびペルオキシダーゼ；大根ペルオキシダーゼ
；Ｃｏｃｈｌ　１ｏｂｏｌｕｓＥＫ　：Ｃｕｒｖｕｌａ
ｒｉａ属の微生物から抽出したペルオキシダーゼがある
。

分析操作時にｐｌ（５，０から８．０．好ましくはｐｉ
ｓ、ｏから７．０の範囲に維持されるようにペルオキシ
ダーゼが含有される層又はその隣接層等に公知のａｌｌ
緩衝剤を含有させることができる。ペルオキシダーゼの
含有量は通常一体型多層分析要素１ｍ″当り約１千〇か
ら約１０万υ、好ましくは約２千Ｕから約６万Ｕの範囲
である。

標Ｍ物質がアルカリ性ホスファターゼ、α−アミラーゼ
等の加水分解酵素の場合には、好ましい試薬組成物の例
として。

アルカリ性ホスファターゼ用： ■特開昭６１−１１００５８．特願昭６０−１１１１８
７等に記載のｐ−ニトロフェニルホスフェート（又はそ
の塩２例。

Ｎａ塩、Ｔｒｉｓ塩等）、ｐ−ニトロフェニルアゾナフ
チルホスフェート（又はその塩、Ｍ、ビス（２−エチル
アミノエタノール）塩等）の自己ｍ色性基質であるアリ
ールホスフェート又はその塩を含む呈色試薬組、酸物等 α−アミラーゼ用： ■特開昭５４−５１８９２に記載のｐ−ニトロフェニル
−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、特開昭５８−１２９９
９７．に記載のｐ−ニトロフェニル−α−〇−マルトペ
ンタオシド；特開昭５３−１３１０８９等に記載の色素
又は蛍光色素結合澱粉等の呈色性物質結合基質を含む呈
色試薬組成物等がある。

一体型多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公知
の方法によりｒＡ製することができる。多層分析要素は
１辺約１５ｓｕｓから約３０ｍ＋ａの正方形又はほぼ同
サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３
１　、実開昭５８−１４２４５４．特開昭５７−６３４
５２゜実開昭５８−３２３５０　、特表昭５８−５０１
１４４等に記載のスライド枠に収めて分析スライドとし
て用いることが好ましい、使用目的によっては長いテー
プ状でカセット又はマガジンに収めて用いること、又は
小片を開口のあるカードに収めて用いることもできる。

［以下余白］ 次に、標識抗体を用いて水性液体試料中の抗体の量を測
定するＲ様を例示して１本発明の免疫分析方法を説明す
る。

測定対象抗体に対する抗原を固定した微粒子を。

目的とする免疫反応に適したｐＨ値のＭ衝水溶液中に分
散させ、その分散液から一定容量を反応容器にとる。一
定容量の分散液に測定対象抗体を含む水性液体試料（血
漿、血清等）の一定容量と前記測定対象抗体の予測され
る最大量とほぼ同程度の量あるいはそれより多量の標識
抗体を含有する緩衝水溶液の一定容量を加え、約１０℃
から約４５℃、好ましくは約２０℃から約ａｏ’ｃの温
度範囲内の一定１度で約３分から約３０分、好ましくは
約５分から約２０分経過させて（この間の適当な時間に
わたり液を振盪又は撹拌する）抗体と標識抗体とを競合
させて免疫反応を進行又は完結させる。この操作により
測定対象抗体と標識抗体の一部は微粒子に固定された抗
原と結合しく反応を完結させた場合には測定対象抗体の
実質的に全部が微粒子に固定された抗原と結合する）、
未結合の（フリーの）標識抗体（未結合の標識抗体が実
質的にゼロの場合も含む）は反応容器中の緩衝水溶液中
にそのまま残留する。

次いで反応容器から約５４ＩＬから約１００１＋Ｌ、好
ましくは約６ｕＬから約７０ｕＬの範囲内のほぼ一定容
量、好ましくは一定容量を採取して一体型多層分析要素
の多孔性展開層又は多孔性層に点着し１微粒子に固定さ
れた抗原に結合した抗体と標識抗体を多孔性層又は多孔
性展開層内に収容し、未結合の標識抗体と溶媒の水を呈
色試薬層又は検出層に供給する（Ｂ／Ｆ分離に相当する
）、ついで公知の方法により分析要素内の色光学濃度を
測定し測定対象抗体量を比色定量する。

未結合標識抗体を一体型多層分析要素の呈色試薬層又は
検出層において呈色させて比色測定する方法は前述の諸
特許明細書等に記載の操作に従って実施することができ
る。すなわち未結合標識抗体を含む水性液体試料の上述
の一定量を展開層に点着し、１分から１０分の時間範囲
で、約２０℃から約４０℃の範囲の実質的に一定の温度
で、好ましくは約３７℃近傍（約３５℃から約４０℃の
範囲）の実質的に一定の温度でインクベーションし、光
透過性支持体側から要素内の呈色試薬層又は検出層の色
。

蛍光、混濁又は紫外線領域の吸収の光学濃度を反射測光
しく光学濃度の測定は展開層側から反射測光することも
できるし、支持体側又は展開層側から透過測光すること
もできる）、予め作成した検量線を用いて比色測定法の
原理により水性液体試料中の未結合標識抗体量を求め、
この量から測定対象抗体量を間接的に求めるか、あるい
は検量線から直接測定対象抗体量を求めることができる
。測定操作は特開昭５６−７７７４６　、特開昭５８−
２１５６６　、特開昭５８−１６１８６７等に記載の化
学分析装置を用いて容易な操作で高精度の測定をするこ
とができる。

測定対象成分が抗原の場合には、微粒子に測定対象抗原
に対する抗体を固定し、標識抗体を用いることにより、
上述の抗体量を求めるのと同様の操作により定量が実施
できることはいうまでもない、同様の操作により、ハプ
テンを定量することもできる。

［効果］ 本発明の免疫分析方法においては、固定抗原（固定抗体
）に対する抗体とＩＬＪ抗体く抗原と標識抗原）との競
合反応を水性液体中でおこなわせるので。

乾式の一体型多層分析要素内部の層中で少量の水性液体
中で競合反応させるよりも反応進行が速く確実である。

一方凛識抗体（標識抗原）の比色測定は乾式の分析要素
を用いて実施するので容易な操作で短時間に高精度の測
定が可能である。

免疫分析の操作において最も繁雑で難しい操作であるＢ
／Ｆ分離が競合反応後の水性液体試料を多孔性層又は多
孔性展開層に点着するだけで自動的に分析要素内で起こ
るので、Ｂ／Ｆ分離操作が不要である。

本発明の免疫分析方法は、溶液の操作が含まれるとはい
え、小さなスライドの中心部の反応領域に洗浄液を供給
するＢ／Ｆ分離操作が必要な「日本臨床検査自動化学会
会誌」跨、５７−６ｏ（ｉ９ｓ５）等に記載の方法に比
べて、洗浄液供給操作が不要で。

短時間で高精度の免疫定量分析が実施できる効果がある
。

実施例１ ■−一体型多層分析要素製造 厚さ１８０ｕｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート
（ＰＥＴ）フィルムく支持体）の上に乾燥厚さ１０ｕｍ
になるようにして下記組成の呈色試薬組成物水溶液を塗
布乾燥して呈色試薬層を設けた。

試薬層塗布水溶液の組成 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　　２００　ｇペ
ルオキシダーゼ　　　　　　　　　　２５０００１０１
．７−ジしドロキシナフタレン　　　　　　　５ｇ４−
アミノアンチピリン　　　　　　　　　　１２ｇ２ｇノ
ニルフェノキシポリエトキシエタノール均１０オキシ工
チレン単位含有＞　　　　　２ｇ一方太さ１００番手相
当のＰＥＴ紡績糸からなる平織布にグルコース水溶液を
含浸し乾燥させてグルコースを３０１７ｍ２の割合で含
有させた。ついでこのグルコース含浸平織布と最小孔径
１．２ｐｍ厚さ１４０四のセルロースアセテートメンブ
ランフィルタを特開昭６１−４９５９に記載の方法に従
って澱粉糊を用いて多孔性接着して一体化した。

ついで呈色試薬層を脱イオン水でほぼ一様に湿潤させ、
上記の２層一体化層の平織布層と呈色試薬、１を密接さ
せほぼ一様に軽く圧着してラミネートして一体型多層分
析要素を完成した。

■免疫分析操作 ヒト免疫グロブリンＩｇＧが固定された平均粒子サイズ
５４１１１のポリウレアミクロカプセルが分散されてい
るｐＨ７、ｏの燐酸バッフ、水溶液（固体成分含有濃度
１０％）　１ｍＬを試験管にとった。それに抗ＩｇＧを
含む検体（血清）　１００ｕＬとグルコースオキシダー
ゼ（以下（、ＯＤと略記する）標識抗ＩｇＧが分散され
ているｐＨ７，０の燐酸バック、水溶液１００μＬを添
加し、試験管を３分Ｎ盪し、さらに２分静置して抗Ｉｇ
Ｇと標識抗ＩｇＧを競合反応させた。ついで未結合のＧ
ＯＤ標識抗ＩｇＧを含むミクロカプセル分散液３０μＬ
を採取した。

前記の多層分析要素のメンブランフィルタ層に採取した
分散液３０μＬを点着し、３７℃で１０分インクベーシ
ョンした。この間に未結合のＧＯＤ標識抗ＩｇＧがメン
ブランフィルタを通過してグルコース含有平織布層に浸
透し、そこで標語物質であるＧＯＤがゴルコースを酸化
分解してＨ２０２を生成し、生成したＨ２Ｏ，が呈色試
薬層に浸透して酸化カプリング反応によりキノンイミン
色素が生成し発色した。

インクベーション後直ちにＰＥＴ支持体側から中心波長
５４０ｎｍの可視光で呈色試薬層の色光学濃度を反射測
光したところ１反射光学源度値は抗１ｇＧの量に相関し
ており、比色法で抗１　ｇＧＩｋが測定できることが明
らかになった。

実施例２ ■−一体型多層分析要素製造 厚さ１５０ＬＩＩ１１の無色透明ポリ塩化ビニル（ＰＶ
Ｃ）フィルム（支持体）の上に乾燥厚さ１５−になるよ
うにして下記組成の検出層組成物水溶液を塗布乾燥して
吸水層をかねる検出層を設けた。

検出層塗布水溶液の組成 アルカリ処理脱イオンゼラチン　　　　１０ｇ０ｇノニ
ルフェノキシポリエトキシエタノール均１０オキシ工チ
レン単位含有）　　　　０．５ｇ水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１００閤Ｌ２−アミノ−２−メチル−１−プロパツー
ル　　ＩＭ濃度一方太さ１２０番手の純綿紡績糸からな
る平織布にｐ−ニトロ燐酸二ル燐酸ジＴｒｉｓ（）リス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン）塩のグリシンバッ
フ？　（９１１１０，５）水溶液を含浸し乾燥させてｐ
−ニトロフェニル燐酸ジＴｒｉｓ塩を２０ｇ／ｍ２の割
合で含有させた。ついでこの試薬含浸平織布と最小孔径
０６凹厚さ１４０ｕＩ＋１のナイロンメンブランフィル
タを特開昭６１−４９５９に記載の方法に従って澱粉糊
を用いて多孔性接着して一体化した。

ついで検出層と上記の２層一体化層の平織布層とを上記
と同様にして多孔性接着して一体型多層分析要素を完成
した。

■免疫分析操作 ヒト免疫グロブリン１ｇＧが固定された平均粒子サイズ
０．８μ…のポリスチレン微粒子含有水性ラテックス（
固体成分含有濃度１０％）１ｍＬを試＠管にとった。そ
れに抗１ｇＧを含む検体（血清）　１００ｕＬとアルカ
リホスファターゼ（以下ＡＬＰと略記する）標識抗Ｉｇ
Ｇが分散されているｐＨ７，０の燐酸バッフ。

水溶液１００μＬを添加し、試験管を３分振盪し、さら
に２分静置して抗ＩｇＧと標識抗ＩｇＧを競合反応させ
た。ついで試験管から未結合のＡＬＰ標識抗ＩｇＧを含
む微粒子分散液５ＱｕＬを採取した。

前記の多層分析要素のメンブランフィルタ層に採取した
分散液５ｏｕｔ、を点着し、３７°Ｃで７分インクベー
ションした。この間に未結合のＡＬＰ標識抗ｊｇＧがメ
ンブランフィルタを通過して試薬含有平織布層に浸透し
、標識物質ＡＬＰがｐ−ニトロ７゜ニル燐酸塩を加水分
解してｐ−ニトロフェノールを放出し、放出された黄色
色素ｐ−ニトロフェノールが検出層に浸透し検出層が着
色した。

インクベーション後直ちにＰＶＣ支持体側から中心波長
４６０ｎｍの可視光で検出層の色光学濃度を反射測光し
たところ２反射光学源度値は抗１ｇＧの量に相関してお
り、比色法で抗Ｉ　ｇＧｊｔが測定できることが明らか
になった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］抗原（又は抗体）を固定した微粒子を含む
   水性溶液中において測定対象抗体（又は抗原）と標識抗
   体（又は標識抗原）とを競合反応させて、前記測定対象
   抗体（又は抗原）と前記標識抗体（又は標識抗原）の一
   部を前記微粒子に固定された抗原（又は抗体）と結合さ
   せ、未結合の標識抗体（又は未結合の標識抗原）を前記
   溶液中にそのまま残留させ、［２］前記溶液の一定量を
   採取し、 ［３］前記微粒子を収納して濾過しうる多孔性層を有す
   る一体型多層分析要素に前記一定量の溶液を点着して、
   前記微粒子を前記多孔性層内に収納し、一方前記未結合
   の標識抗体（又は未結合の標識抗原）と前記溶液の媒体
   である水を呈色試薬層又は検出層に供給させ、 ［４］前記未結合の標識抗体（又は前記未結合の標識抗
   原）の標識物に基づいて一体型多層分析要素の呈色試薬
   層又は検出層において呈色させて比色測定することによ
   り前記測定対象抗体（又は抗原）の量を測定することを
   特徴とする免疫分析方法。