JPS63163164A - 多層分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体ｔ−試料とし、その中のアナライト（分
析目ｓ底分）を定量するフィルム状多層分析素子に関す
る。

〔従来の技術〕

シート状又はフィルム状の分析素子は、分析試薬や必要
な操作の一部を、素子中にドライの形で組込み、液体試
料をその上に、点着させることで、簡便かつ迅速に液体
試料中のアナライトを分析することが可能である。これ
ら分析素子のうち、単層のもので試薬を担持する層の材
料として、１紙、メンブレンフィルター等を用いるもの
（特公昭５６−４１９Ｂ号、米国特許第５６０７０９５
号等）がある。

また、単なる積層やはく離を前提とした非一体型多層分
析素子として、ガラスフィルターやメンブレンフィルタ
ーを用いたり（特開昭４９−１１５９５号）、２枚の１
紙の上に網をかけたもの（特開昭５４−１５１０９６号
、米国特許第５５２６４ＢＯ号）などが知られている。

これら単＃あるいけ単なる積層型多層の分析素子は、半
定量用として用いられているが、定量用としては十分な
信頼性を得ているとけいいがたい。

液体不浸透性、元透過性支持体上に複数の層を配置し、
かつ各層間が流体接触という言葉で示される各層が隙間
なく接着された状態で積層された多層分析素子が、特公
昭５３−２１６７７号、特開昭５５−１６４５５９号、
同５５−９０８５９号、同５７−１９７４６６号、同５
７−１０１７６１号、同５７−ｊ０１７６０号各公報等
に開示されている。これらは、透明支持体の片側に、多
孔性展開層及び機能層が多層状に配置されはく離できな
い状態で一体化されている。多孔性展開層は最外層、す
なわち最上層に位置し、液体試料が点着供給される層で
、点着された液体試料を展開作用、すなわち、試料の容
量にほぼ比例して液が広がる。換言すれば、単位面積当
りほぼ一足量の試料が分布するように、点着供給された
液体試料を広げる作用をする層で、展延層又は計量（メ
ータリング費）層とも称せられ、この層によって展開さ
れた液体試料は、直ちに、下層に位置する機能層に均一
に（単位面積当りほぼ一定量の試料が分布するように）
供給される。

機能層とは、代表的にはに薬層であシ更に、反応層、検
出層、元遮へい層、元反射層、濾過層、半透明層、バリ
ヤ一層、トラップ層、吸水層、前処理層、マイグレーシ
ョン阻止層、その他多くの種類があシ、分析に必要な試
薬や機能を受けもつものである。展開層も機能層も一層
一機能の場合と一層多機能の場合とがある。例えば展開
層が分析試薬の一部？：含んでいて、試薬層を兼ねるこ
ともあシ、また分析試薬の全部を含んでいて試薬層と反
応層とを兼ねる展開層であることもある。

各層を構成するための材料として、展開層は、特公昭５
５−２１６７７号公報記載のプラッシュポリマ一層、特
開昭５５−１６４５５９号公報に記載の織物、編物、特
開昭５７−１９７４６６号公報記載のバラバラの繊維及
び反応性高分子材料から成る線維展開層、及び特開昭５
５＝９０８５９号、同５７−１０１７６０号、同５７−
１０１７６０号各公報に示される粒状構造物等が一般的
である。

また、機能層はゼラチン、ポリアクリルアミド、ポリビ
ニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アガロース等
の親水性高分子材料、セルロース誘導体等を挙げること
が可能である。

前述の多層分析素子の中で、オキシダーゼを用いて過酸
化水素を生成させ、この過酸化水素の作用によシ検知可
能な有色の物質を生成することのできる組成物（呈色試
薬）の組合せによって、定量を行うものがある。これら
は、例えばグルコース検出に用いられるトリンダー試薬
として知られる試薬組成物及びそれに類するものが挙げ
られる。例えば、Ａｎｎ、　Ｃｈｉｎ、　Ｂｉｒｃｈｅ
ｎ。

第６巻　第２４頁〜第２７頁（１９６９年）に記載の文
献、米国特許第３９９２１５８号明細書、特公昭５６−
４５５９９号公報等の記載が参照される。

この試薬組成物を用いた分析は溶血の影響があることが
知られている。これらは主として全血における赤血球中
のカタラーゼやヘムタンパクによる過酸化水素の消費作
用等に起因することが知られている。このような影響を
排除するための方法として、米国特許第３３３５０６９
号、同第５５４９００６号、同第５８６２８８５号等各
明細書には、カタラーゼ阻害剤を、オキシダーゼを含む
試薬に含有させ、液体試料とオキシダーゼが反応時にカ
タラーゼ活性を有する物質の影響を除去し、更に検知可
能な呈色試薬を含む試薬と反応させることが開示されて
いる。

更に、特開昭５９−１０９１９２号公報には、多層分析
素子の展開層に近い１層又は展開層にカタラーゼ阻害剤
を含有させることが開示されている。これは該公報によ
れば、展開層素材にカタラーゼ阻害剤溶液を含浸、乾燥
させるか、又はスプレーすることで展開層中に含有させ
ることができることが開示されている。これらは前記米
国特許と同様に溶血の影響を排除できる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、カタラーゼ阻害剤は、過酸化水素を呈色
試薬によって検知可能な呈色物質に変化する際の触媒で
あるペルオキシダーゼをも阻害することが知られておシ
、呈色色素濃度を低下させ、その結果感度を著しく低下
させる。

これによって、分析の精度すなわち同時再現性の悪化と
いう結果を引起す。

本発明の目的は、オキシダーゼにより生成する過酸化水
素の作用で検知可能な物質を与える反応性組成物試薬系
を含有する多層分析素子において、溶血の影響が排除さ
れた多層分析素子を提供することにある。

ま九本発明の目的は、カタラーゼ阻害剤を含有した多層
分析素子において、反射濃度低下、感度低下、ひいては
同時再現性の劣化を回避した一体型多層分析素子を提供
することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は多層分析素子に関する発
明であって、液体不浸透性でかつ光透過性の支持体上に
、過酸化水素の作用を受けて検知可能な物質を生成する
反応性組成物及び過酸化水素を検知可能な呈色物質に変
換させる物質を含む試薬層、及び該試薬層の上方に多孔
性展開層を有する多層分析素子において、該試薬層にカ
タラーゼ活性阻害剤が、１ｘｉｏ″″１モル／ｍ！〜Ｉ
　Ｘ　１０−４モル／　ｍ２の濃度で含有されているこ
とを特徴とする。

本発明者らは、実験を重ねた結果、カタラーゼ活性阻害
剤を上記試薬層に上記添加量の範囲で含有させることに
よシ前記欠点が解消されることを見出して本発明に到達
した。

本発明の多層分析素子に用いられるカタラーゼ活性阻害
剤は、公知のカタラーゼ活性を阻害するものであれば良
く、例えばシアン化合物、アジド化合物、フッ素化合物
、ギ酸及びその塩、酢酸及びその塩、アミノトリアゾー
ル類、アスコルビン酸、２価銅イオン、セミカルバジド
、ピラゾール、ジエチルジチオカルバミン酸塩、亜硝醗
塩、Ｎ−エチルマレイミド等を挙げることができる。特
に、アジド化合物、フッ素化合物、アミノトリアゾール
類、酢酸塩等は阻害効果が強く好ましい。

これらカタラーゼ活性阻害剤の添７７ｕｆｉ−は、１×
１０″″１〜Ｉ　Ｘ　１０”−４モル／　ｔｎ”でよく
、好ましくは５×１０−ｓ〜３　Ｘ　１０−４モル／　
ｍ”である。

本発明の多層分析素子は、水不浸透性でかつ光透過性の
支持体上に、過酸化水素の作用を受けて検知可能な物質
を生成する反応性組成物を含む試薬層、及び多孔性展開
層を必須の構成層として有するが、必要に応じて他の機
能を有する機能層（例えば、光反射層、濾過層、バリヤ
一層、マイグレーション阻止層等）、若しくは構造補助
層（例えば接着層等）を有していても良い。

前記カタラーゼ活性阻害剤は試薬層に含有される。該阻
害剤を試薬層に含有させることにより、均一に含有され
、大面積をとっても、その位置に依存せず、均一に分布
させることができる０ オキシダーゼの関与の下に生成したＨ２ｏ、を、検知可
能な呈色物質に変換させるためには、ペルオキシダーゼ
様活性又は過酸化物活性を示す物質が必要である。一般
にペルオキシダーゼが用いられるが、他に合成ペルオキ
シダーゼ、ヘミン、メトヘモグロビン、オキシヘモグロ
ビン、ヘモグロビン、ヘモクロモーゲン、アルカリヘマ
チン、ヘミン誘導体、スルホシアン酸鉄、タンニン酸鉄
、フェロシアン化鉄、クロム酸塩等も本発明の実施に有
用である。

上記、ペルオキシダーゼ様活性又は過酸化物活性を示す
物質は試薬層に含有される。

多孔性展開層としてＶｉ特開昭５７−１９７４６６号公
報に開示されている、バラバラの繊維及び反応性高分子
から成る繊維展開層、特公昭５３−２１６７７号公報に
開示された、非繊維質多孔性媒体層、いわゆるプラッシ
ュ・ポリマ一層、特開昭５７−１０１７６０号及び同５
７−１０１７６１持分公報に開示された粒子が直接又は
低分子化合物を介して結合された粒子結合体、特開昭５
５−９０８５９号公報に開示された粒子と接着剤微粒子
から成る粒状構造物、特開昭５５−１６４３５６号公報
記載の親水化処理された織物等が挙げられる。

当然のことながら、アナライト分析のために必要な酵素
や緩衝剤を含有することができる。

過酸化水素の存在で、検知可能な変化を生じる呈色組成
物は、任意に適当な組成物を用いることができる。使用
しうる代表的な例としては、必要に応じて発色剤と共に
下記の物質を含むものが挙げられる。

モノアミン類、例えばアニリン及びその誘導体、ジアミ
ン類、例えばＯ−フェニレンジアミン、ベンジジン等、
フェノール類、例１−１’フェノール、チモール、クレ
ゾール、ナフトール等、ポリフェノール類、例えばカテ
コール、グアヤコール、ピロガロール等、芳香族カルボ
ン酸、例えばサリチル酸、没食子酸等、ロイコ染料、例
えばロイコマラカイトグリーン、米国特許第４０８９７
４７号明細書に記載されているトリアリールイミダゾー
ル類及びトリアリールメタン類［Ｂ、Ｅ、パブ（Ｂ、　
Ｅ、　Ｂａｂｂ　）及びり、　Ｓ、　　ダニｘ　ル（Ｄ
、　Ｓ、　Ｄａｎｉｓｈ　）らの名で１９８４年５月２
１日に出願された米国特許明細書６１２５０９号明細書
に記載されているものを含む〕、着色した染料、例えば
２，６−シクロロフエノールインドフエノール、程々の
生物学的物質、例えばエピネフリン、フラボン酸、チロ
シン等、及びその他、臨床化学における当業者に公知の
もの。

特に有用な呈色組成物は、前記のロイコ染料及び特に米
国特許明細書に記載されたトリアリールイミダゾール含
有物である。

他の好ましい呈色組成物は、酸化可能な顕色化合物と反
応して色の変化を生じうる色形成発色剤上官むものであ
る。有用な色形成発色剤は、米国特許第４２５１６２９
号、同第４２６０６７９号及び同第４５９６７１４号各
明細書、持分昭５８−２２２００号公報、ヨーロッパ特
許出願第６８５５６号明細書、英国特許第２１０７８６
３号明細書及び特公昭５８−８９８号公報に記載されて
いるものを含めて置換アニリン類（すなわち、トルイジ
ン類）を含むものである。代表的な酸化可能な顕色化合
物には、ベンジジン及びその同族体、ｐ−７二二レンジ
アミン、ｐ−アミノフェノール、アミノアンチピリン、
例えば４−アミノアンチピリン等が含まれる。好ましい
顕色化合物は４−アミノアンチピリンである０ 本発明に組込むことが可能なオキシダーゼ酵素としては
、グルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ピルビン酸
オキシダーゼ、グリセリンオキシダーゼ、グリセロリン
酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、乳酸オキシダー
ゼ等が挙げられる。

更に、アナライトとして、コレステロールのように疎水
性の化合物であって試薬層に代表される親水性ポリマー
マトリックス中に拡散することが困難な化合物の場合、
オキシダーゼ酵素で１６コレステロールオキシダーゼは
展開層あるいは展開層に隣接する層に含有することが好
ましいが、この場合本発明が好ましく適用される一例と
して挙げられる。

これらオキシダーゼ酵素は、アナライトに従って選択さ
れ、また他の酵素と組合せて使用される。更に、好まし
いｐＨ範囲及び濃度の緩衝剤と組合せて使用するのが、
当然望ましいことである。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によシ更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例−１ 下引き済み、厚さ１８０μｍの透明なポリエチレンテレ
フタレート支持体上に、下記の組成の試薬層全塗布乾燥
した。

セラｆ　７　　　　　　　　　　　　１５．０９　ｆ　
７ｍ”アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　第１表参
照４−アミノアンチピリン塩酸塩　　　　　（Ｌ８２３
９７ｍ”１．７−’）ヒ）”（１−’Ｆシ＋７．（ｔ、
’ｙ　　　　　　　（Ｌ６１２　ｔ／ｒｎ”ペルオキシ
ダーゼ　　　　　　　　　１５５００Ｕ／ｙｎ２ジメド
ン　　　　　　　　　　　　α１５７９／ｍ”リン酸カ
リウム緩衝剤（ｐＨ６，７〜６．９　）　　　　Ａ　２
２７　ｆ　７ｍ”アルカノールＸＣ（商品名）２ｓｏＩ
ｓｌＦ／ｍ”１．２−ビス（ビニルスルホニル）エタン
　　１００１１Ｆ／ｍ”から成る乾燥膜厚１６μｍの試
薬層。

上記試薬層上に、下記のとと＜ｖ４裏した塗布液を塗布
し展開層とした。

トリトンＸ−１００１４，００９７ｍ２コレステロール
オキシダーゼ　　　　　　　３０００　Ｕ／ｍ”コレス
テロールエステラーゼ　　　　　　５０００　Ｕ／ｍ”
牛血清アルブミン　　　　　　　　　　　五〇　〇　ｔ
　７ｍ”から成る乾燥膜厚３００μｍの展開層。

更に、比較分析素子（１）及び（２）として前記試薬層
の組成に、アジ化ナトリウムを下記第１表に示す量にな
るよう添加した。

上記本発明の分析素子（Ｉｌ　、　（２１、比較分析素
子（＋１、（２）に総コレステロール量が１８０．５０
０．４５０η／ｄｔの血清を用い、１０μｔを点着し、
３７℃７分間インキュベーションを行った後、５４６　
ｎｍのフィルターを用い、反射濃度を測定した。反射濃
度の同時再現性の測定結果を第２表に示す。更にヒト全
血から赤血球を分離し、超音波処理を行って溶血させ、
赤血球膜を除去してヘモグロビン溶液とし、ヘモグロビ
ン量が０．５０．１００．２００．５００．５００η７
ｄｔになるように添加を行った。ただし、こノ時ノ総コ
ＶスｆロールＩＩＨ１８０１Ｑ／ｄｔＶｃｆｌるように
した。同様に点着、インキュベーションの後、５４６ｎ
ｍで反射濃度を測定した。結果を第３表に示す。

第　　１　　表 第２表 （各ｎ＝１０） 第　　５　　表 以上の結果より本発明の分析素子は、十分な感度、及び
良好な同時再現性を有している。更に赤血球の溶血に対
して、どのレベルにおいても、溶血がないものと比較し
て反射濃度の変動がないことが明らかである。

一方比較分析素子（１）は、コレステロール高値での反
射濃度の低下が著るしく、同時再現性は本発明の分析素
子と比較して悪いことが明らかである。更に比較分析素
子（２）は、感度、同時再現性は良好であるが、溶血の
影響を犬きくうけていることが明らかである。

実施例−２ 下塗υ済み、厚さ１８０μｍの透明なポリエチレンテレ
フタレート支持体上に、下記組成の試薬層を塗布した。

ゼラチン　　　　　　　　　　　　　１０９／ｍ”ペル
オキシダーゼ　　　　　　　　　　７０００Ｕ／ｍ”’
７　！Ｊ　カーゼ（ｅ母由来）　　　　　　　　　２５
００７ｍ”フタル酸ジプチル　　　　　　　　　　　　
６．７　ｆ　／　ｍ”ホウ酸塩緩衝剤（ｐＨａ５　）　
　　　　　　７．５９７ｍ”アジ化ナトリウム　　　　
　　　　ｌＸ１０−３モル／ｍ”から成る乾燥膜厚的１
５μｍの試薬層。

更に、上記試薬層上に、下記組成の展開層を塗布した。

ト　リ　ト　ン　　Ｘ−１００１α２　　ｆ／ｒｙｔ”
ｐ−トルエンスルホン酸塩　　　　　　　　　１１５ｒ
／ｍ”から成る乾燥膜厚的３００μｍの展開層。

上記の尿酸分析素子を、本発明の分析素子（３）とした
。

本発明の分析素子（３）に、尿酸濃度が４．５■／ｄｚ
。

９．５■／ｄ！、、’Ｉ五５岬／６ｔのヒト血清を、１
０Ａｔ点着し、５７℃７分間インキュベーションを行っ
た後、５４６ｎｍのフィルターを用い反射濃度を測定し
た。更に、尿酸濃度９．５８９７ｄｔのヒト血清に、カ
タラーゼ（シグマ社製）が、Ｏ８，Ｕ／ｄ、１０００Ｓ
、Ｕ／＋ｄ、２５００Ｓ、Ｕ／−５５０００Ｓ、Ｕ／ｄ
、１００００Ｓ、Ｕ／ｄになるように添加した血清を用
い同様に測定を行った。結果全第４表及び第５表に示す
。

第　　４　　表 第　　５　　表 以上のように本発明の分析素子は尿酸分析においても良
好な感度を有し、血中カタラーゼの影響を受けないこと
が明らかである。

実施例−５ 実施例−１で示した本発明の分析素子の試薬層のアジ化
す）　ＩＪウムを、下記第６表に示したカタラーゼ活性
阻害剤に代えた以外は同一の分析素子を作成した。

これらコレステロール分析素子を、本発明の分析素子＋
４１．　（５１とした。

第　　６　　表 上記本発明の分析素子＋４１．　（５１に、実施例−１
と同様にして総コレステロール量が１８０゜３００．４
５０　”Ｐ／　ｄｔＯ血清を用い、１０　ＡＬを点着し
、３７℃７分間インキュベーションを行った後、５４６
ｎｍのフィルターを用い反射濃度を測定した。結果を第
７表に示す。

第　　７　　表 更に、同様にヘモグロビンｔｉ（、ｏ、５０．１００．
２００．５００．５００”ｌ／ｒ３ＬｌＣ’ｌｋるよう
に添加した、総コレステロール量が１８０ｑ７’ａｚの
血清を用い、同様に１０μを点着の後、５７℃７分間イ
ンキユペーションシ、ソの後５４６ｎｍで反射濃度を測
定した。結果を第８表に示す。

第　　８　　表 以上の結果よシ、カタラーゼ活性阻害剤を、フッ化ナト
リウム又はアミノトリアゾールに代え念場合でも本発明
の分析素子は溶血の影響を十分に排除していることが明
らかである。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の分析素子によれば、溶血
の影響が排除されると共に、感度低下ひいては同時再現
性の劣化を回避することができるという顕著な効果が奏
せられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体不浸透性でかつ光透過性支持体上に、過酸化水
   素の作用を受けて検知可能な物質を生成する反応性組成
   物及び過酸化水素を検知可能な呈色物質に変換させる物
   質を含む試薬層、及び該試薬層の上方に多孔性展開層を
   有する多層分析素子において、該試薬層にカタラーゼ活
   性阻害剤が、１×１０＾−＾２モル／ｍ＾２〜１×１０
   ＾−＾４モル／ｍ＾２の濃度で含有されていることを特
   徴とする多層分析素子。 ２、該過酸化水素を検知可能な呈色物質に変換させる物
   質が、ペルオキシダーゼ、合成ペルオキシダーゼ、ヘミ
   ン、メトヘモグロビン、オキシヘモグロビン、ヘモグロ
   ビン、ヘモクロモーゲン、アルカリヘマチン、ヘミン誘
   導体、スルホシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン
   化鉄及びクロム酸塩よりなる群から選択した少なくとも
   １種の物質である特許請求の範囲第１項記載の多層分析
   素子。 ３、該カタラーゼ活性阻害剤が、シアン化合物、アジド
   化合物、フッ素化合物、ギ酸及びその塩、酢酸及びその
   塩、アミノトリアゾール類、アスコルビン酸、２価銅イ
   オン、セミカルバジド、ピラゾール、ジエチルジチオカ
   ルバミン酸塩、亜硝酸塩及びＮ−エチルマレイミドより
   なる群から選択した少なくとも１種の物質である特許請
   求の範囲第１項記載の多層分析素子。 ４、該過酸化水素を検知可能な呈色物質に変換させる物
   質がペルオキシダーゼであり、かつ該カタラーゼ活性阻
   害剤が、アジド化合物、フッ素化合物、アミノトリアゾ
   ール類及び酢酸塩よりなる群から選択した少なくとも１
   種の物質である特許請求の範囲第１項記載の多層分析素
   子。