JPS63151839A - ローダミン染料の５−及び６−スクシニミジルカルボキシレート異性体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景１ 本発明は、一般的に生物学的或いは生化学的対象分子を
標識化するための蛍光性プローブ／又は化合物に関し、
より詳しくはローグミン染料のＮ−ヒドロキシスクシニ
ミド活性化及び５−及び６−カルボキル異性体に関する
。

蛍光性標識は分子生物学、微生物学、生化学、分析化学
、及びこれらの原理に根付いた工業的及び医学的分野及
び例えばバイオテクノロジー及び環境的、工業的及び診
断的医学に広範な応用を有する。

多数の有機及び無機蛍光性物質が利用可能である。しか
しながら、その様な物質から蛍光性標識を構成する試み
において、多くの問題に遭遇する。

ここにおいて用いられる「ＩＲ光性標識」とは蛍光性に
結合させるような有機分子を意味する。

蛍光性標識の構成及び使用に伴なう′幾つかの重要な考
慮としては、蛍光性部分と結合部分の間の結合の安定性
、結合部分が＠標官能基との結合部分の強度、結合官能
基の精製操作に対する安定性、例えばアミド結合はチオ
ウレア結合よりも加水分解に対してより安定である、結
合官能基と目標官能基との反応性などが挙げられる。各
々非重複発光バンドなどの明確な蛍光特性を有する複数
の蛍光性標識が必要とされる場合には、特別の応用に対
する標識の選択は極めて困難となる可能性があり、しば
しば使用可能な蛍光性標識の所望特性の間の取換えを必
要とする。

蛍光性標識が生化学的分離操作成いは生物学的過程にお
いて目標分子を追跡するために用いられる場合において
、二つの重要な要因は、（１）蛍光性標識が目標分子の
挙動を混乱させる程度、及び（２）もしその様な混ｇＬ
　ＩＪｆ　Ｎ際に存在するならば目標分子間におけるよ
うな混乱の均一性である。この後者の要因はデル電気泳
動により、大きさに基づいて巨大分子を分離する方法に
おいて、特に重要であろ、特に、デオキンリボ核酸（’
ＤＮＡ５）を配列決定するための技術は、極めて、単一
の塩基のみにより異なるオリゴヌクレオチドを分離する
能力に依存している０例えば、スミス等（Ｓｍｉｔｈ　
ｅｔａｌ）ヌクレイツク・アッシズ・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ＾ａｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　Ｖａｔ、　
１３．２３９９−２４１２頁（１９８５年）、シェライ
ヤー等（Ｓｅｈｒｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル
・オプ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、）Ｖｏｌ、　１２９．１６９−１７２頁（１
歴卑）、及びサンが−等（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）
、ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ。

Ｖｏｌ、　１４３．１６１−１７８頁（１９８０年）。

最近、その様な方法論における改良は種数の蛍（上記）
、及びスミス等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖｏｌ
　３２１．６７４〜６７９頁（１９８６年）、蛍光性標
識の選択はその様な技術において重要であり、この技術
の能力を拡張する主たる拘束を表わしている。

更に、達成される自動化の程度に拘わらず、ユーザーは
クデオキシー基準配列決定のために自らの標識化オリゴ
ヌクレオチドプライマーを調製しなければならない、そ
の様なプライマーはオリゴヌクレオチＶの合成に伴なう
配列失敗があってはならない、オリゴヌクレオチド精製
の標準的技術はポリアクリル７ミドデル電気泳動を含む
　（例、Ａｐｐｌｉｅｄ　　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｗｓ　
　　Ｕｓｅｒｓ　　　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ。

発行番号１３．１９８４年１１月９日、［合成オリゴヌ
クレオチド類の評価及び精製（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　
　ａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　５ｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ　　Ｏｌｉｇｏｎｕ−ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
）Ｊ）。プライマーがそれに密接な電気泳動易動性を有
する染料異性体を結合して有するならば、プライマー精
製は不可能でないにせよ困難となる。単一異性体の使用
はこの種の精製を簡便化する。

蛍光的に標識化されたオリゴヌクレオチド類の電気泳動
分離において、重要な考慮としでは、相対的合成収量及
び蛍光的に標識化されたオリゴヌクレオチド複合体の安
定性、並びに、結合された標識により導入された電気泳
動易動性における変動性の量である。ｎなった染料に特
徴的なりＮＡ易動性の相違は染料をオリゴヌクレオチド
に連結するために用いられるリンカ−の適当な選択によ
り補正することができるが、しかし、個々の染料が１個
より多（存在するならば、結合標識は相当なバンドの広
がりを引き起こすか、或いは同一の大きさのオリゴヌク
レオチドの複数のバンドを生じ、それらは次いで疑似的
配列決定に導く。不幸にして、この技術において重要な
蛍光性標識の一群であるローグミン染料は異性体混合物
としてのみ利用可能である。例えば、ホーグランＦ（Ｈ
ａｕｇ−ｌａｎｃｌ）、　「蛍光性プローブ及び研究薬
品のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　　Ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｔ　　Ｐｒｏｂｅｓａｎｄ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）Ｊ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＰ　ｒｏｂｅｓ社、シャンクシタン　シティ　オレゴ
ン州、１９８５年）、及び、これらの異性体は標識化さ
れたオリゴヌクレオチド類の電気泳動易動性に異なった
程度で影響を及ぼす。

前記に霞み、蛍光性標識の純＃異性体形態での利用可能
性は蛍光性標識の応用性を増大し、又、デル電気泳動に
よって分離されるオリゴヌクレオチド類などの巨木分子
を識別するための蛍光基準方法の感度を増大するであろ
う。

〔発明の概要１ 本発明は、対称、或いは、非対称ローダミン染料の５−
及び６−スクシニミシルカルポキシレート異性体及びそ
の製法及び用法を含むものである。

（明細書中、ローダミン染料の炭素原子を示すためにカ
ラーインデックス　（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　　ｏｆ
Ｔｅｘｔｉｌｅ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　　第２版　１９
７１年）の付番方式を用いる。キサンチン様構造中の炭
素原子は下記に示すようにダッシュを付した番号により
示し、及（７９’−置換フェニルの炭素原子は下記の如
くダッシュを付さない番号により示す）。

より詳細には、本発明の化合物は下記一般式Ｉ、その塩
例えばカルボン酸塩、ハロゲン水素塩、オキシ酸塩など
により定義される： 式　　■ 式中、 Ｂはアニオン基、好ましくはカルボキシレート或いはス
ルホネート、より好ましくはカルボキシレートである。

Ｒ１及びＲ，は各々水素、ハロゲン、１〜８個の炭素原
子を有するアルキル、１〜８個の炭素原子を有するフル
キルエーテル、１〜８個の炭素原子を有するフルキルチ
オエーテル、及びＲ５はＲ２と共に及びＲ，はＲ７と共
に各々７′炭素を６゛炭素に結合した窒素に連結し、及
び２°炭素を３゛炭素に結合した窒素にそれぞれ連結す
る各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖である。

好ましくは、Ｒ１及びＲ８は各々水素、１〜３個の炭素
原子を有するフルキル、クロロ或いは１〜３個の炭素原
子を有するフルキルエーテルであり、及びＲ１はＲ２と
共に及びＲ，はＲ１と共に７’ＲＸを６“炭素に結合し
た窒素及び２°Ｒ索を３゛炭素に結合した窒素にそれぞ
れ連結する２〜３個の炭素原子を有するフルキルを各々
形成する。最も好ましくは、Ｒ１及びＲ８は各々水素で
あり、Ｒ１はＲ２と共に及びＲ，はＲ１と共に７′炭素
を６′炭素に結合した窒素に連結し、及び２゛炭素を３
゛炭素に結合した窒素にそれぞれ連結するアルキル鎖を
各々形成する。

Ｒ２及１／Ｒ，は各々１〜８個の炭素原子を有するアル
キルであり、及びＲ２はＲ１と共に及びＲ，はＲ，と共
に上記の如く２〜５個の炭素原子を有する各アルキル鎖
である。好ましくは、Ｒ２及びＲ１は各々１〜３個の炭
素原子を有するアルキルであり、Ｒ２はＲ１と共に、及
びＲ１はＲ１と共に７°炭素を６゛炭素に結合した窒素
に、及び２゛炭素を３゛炭素に結合した窒素にそれぞれ
連結する各々２〜３個の炭素原子を有するアルキル鎖で
ある。最も好ましくは、Ｒ２及びＲ１は各々メチル或い
はエチル、及びＲ２はＲ１と共に及びＲ？はＲ，と共に
７゛炭素を６゛炭素に結合した窒素に及び６゛炭素を３
゛炭素に結合した２゛炭素にそれぞれ連結する各々３個
の炭素原子を有するアルキル鎖である。

Ｒ５及びＲ６は各々１〜８個の炭素を有するアルキル及
びＲ１はＲ４と共に及びＲ８はＲ６と共に５゜炭素を６
°炭素に結合した窒素に、及び４°炭素を３゛炭素に結
合した窒素原子にそれぞれ連結する各り２〜５個の炭素
原子を有するアルキル鎖である。好ましくは、Ｒ３及び
Ｒ１は各々１〜３＠の炭素を有するフルキルであり、及
びＲ１はＲ４と共にである、最も好ましくは、Ｒ１及び
Ｒ６は各々メチル或いはエチルであり、及びＲ１はＲ１
と共に及びＲ，はＲ１と共に５°炭素原子を６゛炭素に
結合した窒素原子に及び４°炭素を３゛炭素に結合した
窒素原子にそれぞれ連結する各々３個の炭素原子を有す
るアルキル鎖である。

Ｒ１及びＲ，、は各々、水素、１〜８個の炭素原子を有
するアルキル基、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有す
るフルキルエーテル、或いは１〜８個のＲ素原子を有す
るアルキルチオエーテル、及びＲ４はＲ，と共に及びＲ
２はＲ６ど共に上記の如く各々２〜５個の炭素原子を有
するアルキル鎖である。

好ましくはＲ４及びＲ％は各々水素：クロロ、１〜３個
の炭素原子を有するアルキル、１〜３個の炭素原子を有
するアルキルエーテル、及びＲ４はＲ２と共に及びＲ２
はＲ６と共に上記の如く各々３個の炭素原子を有するア
ルキル値である。１ｉも好ましくは、Ｒ１及びＲ５は各
々水素原子であり、及びＲ４はＲ５と共に及Ｃ／Ｒ，は
Ｒ感と共に５゛炭素を６゛炭素に結合した窒素原子に及
び４゛炭素を３゛戻素に結合した窒素にそれぞれ連結す
る各々３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。

Ｗ、、Ｗ、及びＷ３は水素、或いはクロロ、好ましくは
水素である。

本発明は又ローダミン染料の５−及び６−スクシニミジ
ルカルボキシレートの製造方法も包含する。一つの方法
は、　（１）６−カルボキシルローダミン異性体を５−
カルボキシルローダミン異性体から分離する工程、　（
２）６−（又は５−）カルボキシルローダミンを当量の
ジーＮ−スクシニミノルカーポネー）（ＤＳＣ）及び４
−ジメチル７ミノビリクン（ＤＭＡＰ）と反応させて、
反応混合物中にローダミン−６−（又は−５−）スクシ
ニミジルカルボキシレートを形成する工程、及び（３）
ローダミン−６−（又は−５−）スクシニミジルカルボ
キシレートを反応混合物から分離する工程を含んでなる
ものである０本発明のもう一つの方法においては、５−
及び６−スクシニミジルカルボキシレートの混合物を先
ず形成し、次いで異性体に分離する１本発明の重要な特
徴は、化学量論量のＤＳＣ及びＤＭＡＰを用いることに
よりローダミンのカルボン酸からＮ−ヒドロキシスクシ
ニミド（ＮＨ８）を形成する一般的方法の発見である。

本発明は更に、本発明の化合物の巨大分子のデル電気泳
動分離、特に大きさに基づくオリゴヌクレオチド類のゲ
ル電気泳動分離における使用方法を含むものである０例
えば、分子生物学におけろ重要な技術はＤＮＡ配列決定
のジデオキシ領停止方法、例えばサンガー等（Ｓａｎｇ
ｅｒ　　ｅｔ　　ａｔ）（上記引用）である、そこでは
、異なった大きさの分子群よりなる標識化されたオリゴ
ヌクレオチド類の混合物が形成される。各大きさの群の
楕成貝は同一の標識を保有し、その結果、ゲル電気泳動
じより分子が混合物から分離されるにつれて同一の大き
さのオリゴヌクレオチド類の群からそれらの共通標識に
より検出される。ローダミン染料の純粋なカルボキシレ
ート異性体よりなる蛍光標識の使用がデル上におけるオ
リゴヌクレオチド類の異なった大きさの群を分解するた
めに必要とされる。

ここにおいて用いられる「ローダミン−Ｘ−５−スクシ
ニミジルカルポキンレート」及び「ローダミン−Ｘ−６
−スクシニミシルカルポキシレート」（それぞれ［５−
ＲＯＸ−ＮＨ８Ｊ　及び「６−ＲＯＸ−ＮＨ３Ｊと略称
される）といろ用語はＲ。

及びＲ７、Ｒ１及びＲいＲ６及びＲ６、及びＲ１及びＲ
１が共に上記の如＜３７ｉ素アルキル鎖であり、Ｂがカ
ルホキシレー）であり、及びＷ、、Ｖ／２１及びＷ、が
水素であり、及びスクシニミジル力ルポキシレート部分
がそれぞれ５−及び６−炭素に結合している一般式Ｉの
化合物を指すものである。

５−ＲＯＸ及び６−ＲＯＸはそれぞれこれらの化合物の
５−及び６−カルボキン前駆体を指すものである。ここ
において用いられる　「テトラメチルローダミン−５−
スクシニミジルカルボキシレート」及び［テトラメチル
ローダミン−６−スクシニミジルカルボキシレート」（
それぞれ［５−ＴＭＲ−ＮＨ９Ｊ及（／ｒＴＭＲ−６−
ＮＨ８Ｊと略称される）は、Ｒ，、Ｒ４，Ｒ１，Ｒ，、
Ｗ、、Ｗ、及びＷコが水素であり、Ｂがカルボキシレー
トであり、及びＲ２−Ｒコ、Ｒｓ及びＲ７がメチルであ
り、及びスクシニミノルカルポキンレート部分がそれぞ
れ５−及び６−炭素に結合している一般式Ｉの化合物を
意味する。５−ＴＭＲ及び６−ＴＭＲはそれぞれこれら
の化合物の５−及び６−カルボキシ前駆体を指す。

ローダミン染料の５−又は６−カルボキシレート、或い
は５−又は６−スクシニミシルカルポキンレートの異性
体形態に関しで用いられる「異性体的に純粋」という用
語はローダミンの精製された異性体により標識化された
オリゴヌクレオチドがデル電気泳動により分離される際
に両異性体の存在のために検出可能な二重バンド形成が
生じないことを意味する。

［発明の詳細な説明］ 本発明は５−及び６−カルボキシレ−グミンのＮ−ヒド
ロキシスクシニミドエステル類、及びその製造方法及び
使用方法を含むものである０本発明の′ｍ要な特徴は、
ローダミン染料の５−又は６−形態をエステル化して室
温において高収量をもたらすために存在するＤＳＣ及び
ＤＭＡＰの実質的に化学量論量を有する反応条件である
。本発明の一般的反応式は下記一般式■により定義され
る： 二一１−ｊ（−り これらの方法は５−又は６−カルボキンローダミンの酸
形態（異性体の混合物或いは純粋異性体いづれか）を当
量ジ−Ｎ−スクシニミノルカーボネー）（ＤＳＣ）及び
４−ジメチル７ミ／ビリノン（ＤＭＡＰ）を極性非プロ
トン性溶媒中で反応させてカルボキシルＮ−ヒドロキシ
スクニミド（ＮＨ８）エステル形成することよりなる。

適当な極性非プロトン溶媒としてはＮ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジン、ヘキサメチルホスホ
ルアミド（ＨＭＰＡ）などが挙げられる。最も好ましく
は、ＤＭＦが反応溶媒として用いられる。ｎ性体的に混
合されたＮＨＳエステルはそれらの個々の異性体に分離
されて更に使用される。最も好ましくは、試薬を保存す
るするためには、５−又は６−カルボ、キビローダミン
の酸形態を先ず標準的分離技術、例えばニドマンソン等
（Ｅ　ｄｍｕ口ｄｓｏｎｅｔ　　ａｌ　　）、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｉ　ｓｍｕｎｏｌｏｇｙ＊　　Ｖｏｌ。

２Ｌ　５６１頁（１９８４年）により、それらの個々の
異性体に分離し、次いで個々の５−或いは６−カルボキ
シル異性体を上記の如く反応させてそれぞれ５−又は６
−カルボキシルＮＨＳエステルを形成し、それらを再ゾ
標準的技術を用いて反応混合物から分離する。

本発明において用いられるローダミン染料のある異性体
混合物は、例えばＥａ’ｓｔｍａｎ　　Ｋｏｄａｋ社（
ロチニスター、ニューヨーク州）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｐ　ｒｏｂｅｓ社（ジャンクシ１ン　シティ、オレゴン
州）などから市販されており、及びその他のものは米国
特許第２．２４２．５７２号、同第２，１５３．０５９
号、同第３．８２２．２７０号、同第３゜９３２．４１
５号及び同第４．００５．０９２号などの教示に従って
合成することができる。これらの特許の全ては本発明に
おいて準用する。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

試薬の濃度、温度及びその他の可変パラメータの位は本
発明を例示するためのもののみであり、それを限定する
ものと考えられてはならない。

実施例１　　６−ＴＭＲ−ＮＨ８ ６−ＴＭＲａはカラムクロマトグラフィにより５−及び
６−ＴＭＲ酸異性体の混合物から分離された、８．８２
鋤ｇの６−ＴＲＭＩ！！及び１０．５−ｇのＤＳＣを０
．５−の乾燥ＤＭＦ中において、アルゴン下に溶解され
た。　　０．０９−の、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
中ＤＭＡＰのＱ、５モル溶液を一度に添加した。室温で
２時間復温合物を５０−のクロロホルム中に取り、１：
１の塩水対水溶液で３回洗浄した。クロロホルムを留去
し、残渣を２０ｇシリカゲルカラム上で精製した。　（
３００：３０：８塩化メチレン：メタジ−ル：酢酸溶出
）、　約０．４のＲすの両分を蒸発乾固し、８．６ｍｇ
の６−ＴＭＲ−ＮＨ３をその酢酸塩としで得た。

実施例２　５−ＴＭＲ−ＮＨＳ ５−ＴＭＲ−ＮＨ８を実施例１と同様にして２−の乾燥
ＤＭＦ中、８２．３ｍｇの５−Ｔ−Ｍ’Ｒ酸、７５−８
のＤＳＣ，０，７０−のＴＨＦ中０．５モル濃度のＤＭ
ＡＰから調製した。

実施例３　６−ＲＯＸ−ＮＨ８ ６−ＲＯＸ酸は、カラムクロマトグラフィにより、５−
及び６−ｗ１異性体の混合物から分離した。

４６．２ｇｍｇの６−ＲＯＸ及び５８輸ｇのＤＳＣをア
ルゴン下に２−の乾燥ＤＭＦに溶解し、０．４５−のＴ
　ＨＦ中の０．５モル濃度のＤＭＡＰＷｊ液を一度に添
加した。室温で１．５時間後、混合物を１００−のクロ
ロホルムにとり、１：１の塩水：水の溶液で３回洗浄し
た。クロロホルムを留去し、残渣を４０ｇシリ〃ゲルカ
ラム上で精製した（３００：３０：８塩化メチレン：メ
タジ−ル：酢酸溶出）、約０．５のＲ？の両分を蒸発乾
固し、５８．４ｍｇの６−ＲＯＸ−ＮＨ８をその酢酸塩
として得た。

実施例４　５−ＲＯＸ−ＮＨ３ ５−ＲＯＸ−ＮＨ８を実施例３と同様にして１．０−の
乾燥ＤＭＦ中２７．４ｍｇの５−ＲＯＸＩ！！、　３０
．２鵠ｇのＤＳＣ，０，２４−のＴＨＦ中０．５モル濃
度のＤＭＡＰから調製した。

０．５０ｍｇの６−ＴＭＲ−ＮＨＳを２０μ−見の水中
１．０ミリモル濃度の５゛−７ミノエチルホス７エート
オリゴヌクレオチド（１８−ｍａｒ）及び１０μｍＪの
１モル濃度のＮ　ａ　ＨＣＯｓ　／　Ｎ　ａ　＝　ＣＯ
−緩衝液、ｐＨ９，０よりなる溶液に添加した。暗所中
、１時間後、溶液を、　０．１モル濃度のトリエチルア
ンモニウムアセテート緩衝液、ＤＨ７，０と共に１０−
のＳ　ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（３体）カラムを通過さ
せた。非除容積内に溶出する着色物質のバンドを集めた
。逆相ＨＰＬＣは９０％を越えるオリゴヌクレオチドの
蛍光生成物への転換率を示した。

５−ＴＭＲ−ＮＨ３を実施例５と同様にして５Ｉ−アミ
／エチルホス７エートオリゴヌクレオチド（１８−ｅｖ
ｅｒ）と反応させた。標識化されたオリゴヌクレオチド
を実施例５と論様にして反応混合物から除去した。この
実施例からの及び実施例５からの生成物を調製ＨＰＬＣ
により精製し［アルファー３２Ｐ１−コルディセビン−
５゛−トリホスフェートにより末端デオキシヌクレオチ
ジルトランス７エラーゼを介して３゛末端−標識化し、
及び２０％ポリアクリルアミドデル上で隣接して電気泳
動させた。ゲルのＸ−線フイルムへの露光は実施例５の
生成物が本実施例の生成物よりもデル上で約１／２ヌク
レオチドの当量よりゆっくり移動することを示した。

２０μ−見の水中１．０ミリモル濃度の５゛−７ミノエ
チルホス７エートオリゴヌクレオチド（１８−ａｅｒ）
及び１０μＪの１モル濃度のＮ　ａ　ＨＣＯ３／　Ｎ　
ａ　−ＣＯ−緩衝液、９Ｈ９，０よりなる溶液に、　０
．４２ｍｇの６−ＲＯＸ−ＮＨ８を添加後、５μ、ｐの
ＤＭＦを添加した。暗所中１時間後、溶液を０．１モル
濃度のトリエチルアンモニウムアセテート緩衝１ｐＨ７
，０と共に１０−の５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−２５（
ｌｆ１体）カラムを通過させた。−１４Ｆ除容積内に溶
出する着色物質のバンドを集めた。逆相ＨＰＬＣはオリ
ゴヌクレオチドのフＯ％を越える蛍光生成物への転換を
示した。

５−ＲＯＸ−ＮＨ８を実施例７と同様にして５゛−７ミ
ノエチルホス７エートオリゴヌクレオチド（ＩＥｌｍｅ
ｒ）と反応させた。標識化オリゴヌクレオチドを実施例
７と同様にして反応混合物から除去した１本実施例から
の及び実施例７からの生成物をｍ！！＃ＨＰＬＣにより
精製し、実施例６と同様にして３゛−末ｍａｎ化し、及
び２０％ポリアクリルアミドゲル上で隣接して電気泳動
させた。このデルのＸ−＠フィルム上への露光は実施例
７からの生成物が本実施例の生成物よりも約１／２ヌク
レオチドの当量よりうつくりと移動することを示した。

ＤＮＡ配列分析は科学的に及び工業的に共に極めて有用
である。ＤＮＡ断片の配列決定のための二つの主たる技
術は、化学的方法、例えばマクサム及びギルバー）（Ｍ
ａｘａｍ　　ａｎｄ’Ｇ１１ｂｅｒｔ）、プロン−ディ
ンゲス・オプφナショナル・アカデミツク−サイエンス
　（Ｐｒｏｃ、　ＮＩＬｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、　）　Ｖｏｌ、フ４、ｐ、５６０　（１０００
年）、及びジデオキシ鎖停止方法　例、スミス（Ｓ＠１
ｔｈ）、メソッズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ、　６５
、Ｇ　ｒｏｓｓｍａｎ　　ａｎｄＭｏｌｄａｖｅ　編、
５８０−５８０頁、（ＡｃａｄｅｍｉｃＰ　ｒｅｓｓ、
　＝　ｚ−ヨーク、１９８０年）、及びサンが−等（Ｓ
ａｎｇｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ）、プｏシーディンクス暢
オブ・ナシａナル・アカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏ
ｅ、　Ｎａｋ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　Ｖｏｌ、
　７４゜５３６３〜５３６７頁（１９７７年）などであ
る１本発明の方法は放射性標識の代わりに蛍光性標識を
用いるためにいづれの技術にも適用することができる０
本実施例においては、本発明がＤＮＡ配列決定のジデオ
キシ鎖停止方法においで如何して用いられるかが示され
る。ジデオキシ鎖停止方法を説明する前に、次の用語を
定義することが有用であろう。

ＤＮＡポリメラーゼは一本鎖ＤＮＡ片 する大きな多−８！能酵素である。この方法において用
いられる特別の種類のＤＮＡポリメラーゼはエラセリシ
ア・コリ　（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｅｏｌｉ）Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩの所謂フレノウ断片である。

この断片は酵素の合成機能を有する。合成のために、Ｄ
ＮＡポリメラーゼは惰型、プライマー、デオキシリボヌ
クレオチド源を必要とする。

鋳型はＤＮＡボ１Ｊメラーゼにより合成される一本鎖Ｄ
ＮＡ片におけるヌクレオチド類の配列を決定する一本鎖
ＤＮＡ片である１合成に際して、ＤＮＡポリメラーゼは
鋳型に添って移動し、その各ヌクレオチド塩基に対して
ＤＮＡポリメラーゼは相補的ヌクレオチドを一本鎖ＤＮ
Ａの或艮頻に結合する。相補的ヌクレオチド　　塩基は
二本鎖ＤＮＡを形成するための塩基一対形成間に従って
所定の塩基に伴なうものである。塩基一対形成間は一つ
の鎖のアデノシンが常に他の頻のチミジンと対形成する
こと、及び一つの鎖のシチジンが常に他の鎖のグアノシ
ンと対形成することを要求する。

この様に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上で７デ／シンと
遭遇すると、それは合成される鎖にチミジンを付加し及
びシチジンと遭遇する場合にそれはグアノシンを付加す
る。ＤＮＡポリメラーゼの移動後、新たに合成された鎖
及び句型の相補的部分は二本鎖形態にある。

ブライマーは一本鎖ＤＮＡ片 イマーはＤＮＡポリメラーゼが合成過程においてヌクレ
オチド類の付加を開始する出発位置を提供する。ブライ
マーは二本鎖ＤＮＡの部分がＤＮＡポリメラーゼの出発
点として提供されるように鋳型を含有する一本１［ＤＮ
Ａ片にアニーリングされなければならない。

ジデオキシリボヌクレオチド類はそれらがデオキシリボ
ヌクレオチド類についての２゛−ヒドロキシルの代わり
にリボース部分と２゛−及び３゛−ヒドロキシル基の両
者を欠く以外はデオキシリボヌクレオチ）′類と同一で
ある。ジデオキシリボヌクレオチド類はＤＮＡポリメラ
ーゼがＤＮＡ合成過程において対応するデオキシリボヌ
クレオチドの代わりにジデオキシ誘導体を受入れる点の
おいて、デオキシリボヌクレオチド類のｆｆｌｔｉ体と
して称されることがある。この様な置換が生ずる場合に
は、ＤＮＡポリメラーゼが引続くヌクレオチドを結合さ
せる３゛−ヒドロキシル基を有さないので合成が停止す
る。

ノブオキシ鎖停止方法においては配列決定されるＤＮＡ
［をエラセリシアーコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｅｏ
ｌｉ）Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩのための匍型として用
いられる。プライマーを鋳型を形成する一本鎖ＤＮＡ片
にアニーリングし、次いで、それを放射＃ｉ楳識化した
デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート類、例えば
３２　ｐ　−ｆｉｌｌ化アデノシントリホスフェート、
及び四つのヌクレオチドの一つのジデオキシリボヌクレ
オチドトリホス７よ一ト類似体の存在下において４００
個以上のヌクレオチドまで酵素的に伸延される。即ち、
各々異なったジデオキシ［１体を含む四つの別々の反応
が行なわれる。ＤＮＡ頻成艮は３°−ヒドロキシルへの
デオキシリボヌクレオチドの付加を要請するので、ジデ
オキシリボヌクレオチドの導入は頻戊艮を停止する。正
常なヌクレオチドに代わるノデオキシ＊ａ体の導入はラ
ンダムに起こり、その結果、四つの反応の各々は、同一
ヌクレオチドで停止する不均質な数の標識比類を生成し
、それらは鎖長に従って電気泳動的に分離する。即ち、
存在する末端ジデオキシリボヌクレオチドのタイプに基
づいて四つの群のオリゴヌクレオチド類が確立される。

一本ＲＤＮＡ７アーノ　Ｈ１３を用いて配列決定される
べきＤＮＡ断片のコピーをクローニングする。十分な量
のＨ１３がクローニングされると、Ｍ１３ＤＮＡをＮＩ
Ｌ、四つの７リコートに分離する。各７リコートにおい
て、各々のジデオキシリボヌクレオチドの存在下におい
て合成或いは鎖成艮反応が生ずる。

本発明に従えば、オリゴヌクレオチド類を鎖成長相に際
して、放射性ヌクレオチド類の導入により標識化する代
わりにプライマーを合成し、次いで適当な結合官能基を
付着し、及びそれを染料と反応させること１により標識
化する。アミノ結合官能基は、プライマーを同時係属出
願中の米国特許５ｅｒｉａｌ　　Ｎｏ、８２７．３４８
号（１９８６年７月２日出顧及び本発明において準用）
に開示される２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル
−１，３，２−オキサザホス７７シクロベンタンと或い
はスミス等（Ｓｍｉｔｈ　　１！Ｌ　　ａｌ）ヌクレイ
ツクφ７ツンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（上記引用）などに開示さ
れるその他のホスホルアミゲイト結合剤と反応させるこ
とにより結合される。

このノブオキシ鎖停止方法のこの変法における重要な拘
束条件は、蛍光染料が分光的に分解可能であることであ
る。ここにおいて用いられる「分光的に分解可能」とい
う用語は四つの染料の蛍光発光バンドが標識的に光検出
方法を用いて区別されるように十分に非−重複的である
ことを意味する。

もう一つの重要な拘束条件は染料が電気泳動的に適合性
であることである。ここにおいて用いられるｒｔ電気泳
動的適合性である」とは電気泳動的に分離された染料−
標識化オリゴヌクレオチド類がオリゴヌクレオチド類の
大きさに従った序列に対応するように結合剤の選択が染
料に帰Ｒされる電気泳動易動性における相違をバランス
させるために利用可能であることを意味する。

保護基を除去し、及び６−ＲＯＸ−ＮＨ８を実施例７と
同様にして脱保護５゛−アミンと反応させてＲＯＭ−プ
ライマー複合体を形成する。別の合成において、保護基
を除去し、及び６−ＴＭＲ−ＮＨ８を実施例５と同様に
して脱保護５”−アミンと反応させてＴＭＲ−プライマ
ー複合体を形成する。これらのプライマー複合体を、次
いでスミス等（Ｓｍｉｔｈ　　ｅｔ　　ａｌ）　　　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ及びネ
イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）（両者共上記で引用及び共に
準用する）により開示されるジデオキシ値停止方法に従
って用いる。好ましくは、ヘキシル結合を介してそれら
のジデオキシオリゴヌクレオチド類の５”−７ミン類に
結合したカルボキシフルオレッセイン或いは２’、７’
−ノメトキシー４’、５’−ジクロロカルボキシフルオ
レッセインが６−ＲＯＸ及び６−ＴＭＲがエチル結合を
介して結合されている場合には常に用いられる。

延長プライマーの相対的大きさ及びそれらの末端ジデオ
キシリボヌクレオチドの性質は均質な大きさの延長プラ
イマーが電気泳動レーンを下降すると共に決定され、照
射後蛍光光度計或いは分光光度計により検出される。好
ましくは、上記染料の選択に対しては、バンドは５１４
ｎｍ及び４８８　ｎ　ｍレーブー光の両者により逐次或
いは同時に照射される。

６−ＲＯＭ或いは６−ＴＭＲ″Ｃ標識化された均質な大
きさの延長プライマーは狭いバンドとして電気泳動デル
を下降するのに対し、５−ＲＯＸ及１６−ＲＯＸ、或い
は５−ＴＭＲ及び６−ＴＭＲの混合物で標識化された均
質な大きさの延長プライマーは二つのバンドとしてデル
を下降し、不正確な配列情報を与える。

前記本発明の好ましい実施態様の開示は例示及び説明を
目的として示されたものである。それは、説明をし尽し
或いは開示された正確な形態に本発明を限定する趣旨の
ものではなく、明らかに上記教示に照らして多くの修正
及び変化が可能である。

これらの実施態様は本発明の原理及びその実際の応用を
最良に説明して当業者が本発明を各種実施態様において
、及び意図される特別な用途に適したように各種修正に
より最良に利用できるよ）に選択され及び説明されたも
のである。

本発明の範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲によって規
定されるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）異性体的に純粋な５−スクシニミジルカルボキシ
   ルローダミンよりなる化合物或いはその塩類。 （２）該５−スクシニミジルカルボキシルローダミンが
   ローダミン−Ｘ−５−スクシニミジルカルボキシレート
   或いはテトラメチルローダミンン−５−スクシニミジル
   カルボキシレートである特許請求の範囲第１項記載の化
   合物。 （３）異性体的に純粋な６−スクシニミジルカルボキシ
   ルローダミンよりなる化合物或いはその塩類。 （４）該６−スクシニミジルカルボキシルローダミンが
   ローダミン−Ｘ−６−スクシニミジルカルボキシレート
   或いはテトラメチルローダミンン−６−スクシニミジル
   カルボキシレートである特許請求の範囲第３項記載の化
   合物。 （５）ローダミンカルボン酸を当量のジ−Ｎ−スクシニ
   ミジルカーボネート及び４−ジメチルアミノピリジンと
   反応させて、スクシニミジルカルボキシレートを形成す
   る工程を含んでなることを特徴とするローダミンカルボ
   ン酸のＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形成方法
   。 （６）該反応工程が更に非プロトン極性溶媒中で反応さ
   せることを含む特許請求の範囲第５項記載の方法。 （７）該反応工程が更に室温で反応させることを含む特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 （８）該ローダミンカルボン酸が異性体的に純粋な５−
   カルボキシレートローダミン、異性体的に純粋な６−カ
   ルボキシレートローダミン、及び５−及び６−カルボキ
   シレートローダミンの混合物よりなる群から選ばれる特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 （９）一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法
   であって、下記工程を含んでなることを特徴とする方法
   ： 第１、第２、第３及び第４の蛍光的に標識化された塩基
   配列を有するプライマーを、 （１）第１、第２、第３及び第４の蛍光的に標識化され
   た塩基配列を有するプライマーが各々異なった蛍光染料
   で標識化され、 （２）異なった蛍光染料の少なくとも一つが異性体的に
   純粋な６−カルボキシルローダミン或いは異性体的に純
   粋な５−カルボキシルローダミンであり、及び （３）異なった蛍光染料がスペクトル的に分解可能であ
   り且つ電気泳動的に適合性であるように合成する工程、 一本鎖ＤＮＡを該プライマーの塩基配列に対する相補的
   領域に隣接した一本鎖プラスミド中に、該プライマーが
   ＤＮＡポリメラーゼにより挿入一本鎖ＤＮＡに相補的オ
   リゴヌクレオチドの合成を開始できるように挿入する工
   程、 この一本鎖ＤＮＡを含有する一本鎖プラスミドを複製す
   る工程、 複製一本鎖プラスミドを第１部分、第２部分、第３部分
   、及び第４部分に分離する工程、 第１の蛍光的に標識化したプライマーを第１部分の一本
   鎖プラスミドの相補的領域にアニーリングし、及び第１
   の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プラスミド
   をＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチ
   ジン、チミジン、及びジデオキシアデノシンのトリホス
   フェートの存在下において第１の組の二本鎖ＤＮＡを形
   成する工程、 第２の蛍光的に標識化したプライマーを第２部分の一本
   鎖プラスミドの相補的領域にアニーリングし、及び第２
   の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プラスミド
   をＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチ
   ジン、チミジン、及びジデオキシアデノシンのトリホス
   フェートの存在下において第２の組の二本鎖ＤＮＡを形
   成する工程、 第３の蛍光的に標識化したプライマーを第３部分の一本
   鎖プラスミドの相補的領域にアニーリングし、及び第３
   の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プラスミド
   をＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチ
   ジン、チミジン、及びジデオキシアデノシンのトリホス
   フェートの存在下において第３の組の一本鎖ＤＮＡを形
   成する工程、 第４の蛍光的に標識化したプライマーを第４部分の一本
   鎖プラスミドの相補的領域にアニーリングし、及び第４
   の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プラスミド
   をＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチ
   ジン、チミジン、及びジデオキシアデノシンのトリホス
   フェートの存在下において第４の組の二本鎖ＤＮＡを形
   成する工程、 第１、第２、第３及び第４の組の二本鎖ＤＮＡからの二
   本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を形成する工程、 第１、第２、第３及び第４の組の二本鎖ＤＮＡの混合物
   の二本鎖ＤＮＡを溶融して一本鎖オリゴヌクレオチド類
   を形成する工程、及び 大きさに従って混合物中の一本鎖オリゴヌクレオチド類
   をゲル電気泳動により分離する工程。