JPS63119495A - 白血球及び血小板の形成を増進するポリリボヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌や動物器官の細胞から抽出されたＧ（グアニシン）
およびＡ（アデニン）の豊富な、リポソーム・リボ核酸
に対して、Ｇ−Ａ系列に影響を与えないリボヌクレアー
ゼ（特にパンクレアチン・リボヌクレアーゼ）を作用さ
せて、ｒ　ＲＮＡ　（リボ核酸）−フラグメント」と呼
ばれる、ポリリボヌクレオチドを製造する方法が最近発
表された（フランス特許出願第７４／３８，７６８並び
に科学アカデミ−報告、）ぐり・シリーズＤ、２８０巻
、１９７５年１月２０日、３６３−３６６−２−ジ）。

こうして得られたポリリボヌクレオチドは、リゾヌクレ
オチド単位的２０〜８０を有する単純な連鎖で形成され
ておシ、ピリミジン塩基に比較するとプリン塩基が過剰
で、Ｇ−Ａ系列単位が優勢である。

このポリリボヌクレオチドは、ｐＨ７，４のＶ１００ト
リス緩衝液中のｒ　５ｅｐｈａｄｓｘ　Ｇ２５、微細」
の商品名で市販されているモレキュラーシープの充填し
たカラムを通し、同緩衝液で溶離することによっている
いろな留分に選別されている。こうして分離された各留
分は、第１図に表わされ念曲線の頂部に対応し、溶離の
順序に従って、Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３　　ｒ　Ｐ４　　ｒ　
Ｐ５　と命名されている。第１図において、縦座標には
溶出物の体積が、そして横座標には２６０ｍμで測定さ
れた吸収度がそれぞれプロットされている。

こうして得られたポリリぎヌクレオチドの各種の族は、
吸光、分光によシ分析されておシ、それらのプリン塩基
含量すなわちグアニン（Ｇ）とアデニン（Ａ）、さらに
はピリミジン含量すなわちシトシン（Ｃ）とウラシル（
Ｕ）が決定されている。これらの６族は上記塩基の量と
比率によって相互に区別されており、プリン塩基Ｇおよ
びＡについては族Ｐｉ及びＰ２が最も豊富である。

大腸菌Ｍ５００のリポソーム・ＲＮＡから出発し【得ら
れｆＣＰ　１及びＰ２と呼ばれる族が特に、ショップ繊
維腫ビールス、牛痘連ビールス及び庖診ビールスに対し
て、抗ビールス作用を有することはすでに報告されてい
る。

この発明は、微生物１次は動物の器官から抽出されたり
？ノームリゴ核酸の変性によって得た、２０ないし８０
のリゾヌクレオチド単位を有する単純連鎖のポリリボヌ
クレオチドよシなり、このポリリボヌクレオチドにおけ
るプリン塩基とピリミジン塩基との比［：（Ｇ＋Ａ）／
（Ｃ＋Ｕ））が１．０ないし２．５であることを特徴と
する白血球・血小板欠乏治療剤の製造方法を提供するも
のである。プリン塩基とピリミジン塩基との総体比［（
Ｇ＋Ａ）／（Ｃ＋Ｕ））が１．０と２．３の間に含まれ
るようなポリリボヌクレオチドが白血球及び血小板の形
成を促進し、白血球及び血小板の欠乏が明らかな場合に
、それらの形成を促進するための薬品として有効である
ことが、本発明によって明らかにされている。

特に、大腸菌Ｍ５００５ｈｏ−Ｒのり？ソーム・ＲＮＡ
から出発して、ノクンクレアデン・リボヌクレアーゼの
作用で得られ、Ｐ３及びＰ４で示される生成物は、両者
とも（Ｇ＋Ａ）／（Ｃ＋Ｕ）の比率が１．０と２．５の
間であって、血小板の回復剤として有効である。本発明
にかかわる薬品は、フランス特許出願第７４／３８，７
６８号に記載された製法により酵母、バクテリア、動物
器官等異なった原材料から出発して得られ、とくに、大
腸菌Ｍ５００Ｓｈｏ−Ｒ’ｉモレキュラーシーブに通し
く　Ｇ＋Ａ　）／（Ｃ＋Ｕ）の比率が１．０と２．５の
間に含まれる留分を選別することによりて製造できる。

しかし本発明は、よシ簡単な方法で、はるかに効率よく
ポリリボヌクレオチドを製造する新製法をも提供するも
のであって、その製法は微生物から抽出された（Ｇ＋Ａ
）／（Ｃ＋Ｕ）比が１．０ないし２．５のリデソームリ
？核酸をり？ヌクレアーゼまたは化学剤で変性すること
よシなるものである。

この発明の改良製法におけるバクテリアの培養、１）　
ｚソーム・す？核酸（ｒ　−ＲＮＡ　）の分離及びそれ
らの保存は、フランス特許出願７４／３８，７６８に記
載されたものと同じものであってもかまわない。

改良点は以下の３点に関する。

（１）　　バクテリア菌株、あるいはキノコ、酵母、動
物器官等の出発の物質の選択。

（２）　　ｒ−ＲＮＡ　ｆ　ＲＮＡフラグメントに分割
するための変性剤。

（３）　　カラムを通しての選別過程の省略に関するも
の。

第−点をみると、通常は腸内植物相寄生種に属する、病
原虫のない大腸菌Ｔ３０００　（Ｋ１２）の野生菌株を
使うことが望ましい。この菌株においｔは、プリン塩基
／ピリミジン塩基の比率は、大腸菌Ｍ５００８ｈｏ−Ｈ
のそれに対応する比率よりは低く、約１．０である。し
かしながら、バクテリア、キノコ、酵母等の他の菌株あ
るいは動物器官から分離され７’ｃ　ｒ−ＲＮＡであっ
て、プリン塩基／ピリミジン塩基の比率の適当なものを
利用することもできる。

本発明に関して使用されるｒ−ＲＮＡの変性剤について
いうと、パンクレアチン・リボヌクレアーゼあるいはア
カパンカビから抽出したり？ヌクレアーゼのようなり？
ヌクレアーゼのみならず、強塩基（水酸化ナトリウムあ
るいは水酸化カリウム）も用いることができ、後者の場
合、反応溶液における最終濃度が０．１Ｎであるのが好
ましい。このようにして適切な原材料物質から出発して
得られたＲＮＡフラグメントは、（Ｇ＋Ａ）／（Ｃ＋Ｕ
）の総体比が１．０と２．５の間にあシカラムを通して
分別する必要はない。

ペルジャンスキー他によって詳述され（科学アカデミ−
報告、パリ、シリーズＤ、２７２、Ｒ−ジ２１０７−２
１１０　）、Ｃｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　Ｖｏｏ
ｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕ！ｔｕｒｓｓに、ＣＢ５６１５
−７４で登録されておυ、下記の例では、大腸菌Ｍ５０
０−８ｈｏ−Ｒとして記載されているところの、シワウ
ドマイシン（Ｓｈｏｗｄｏｍｙｃｌｎｓ　）に対して抗
性となった大腸菌の菌株から出発して、Ｂ３及びＢ４を
製造する実施例を以下に述べる。

実施例１：大腸菌Ｍ５００−５ｈｏ−Ｒから出発するＢ
３及びＢ４の製法。

この菌株のバクテリアは、十分に空気にさらされた培養
基中で、３７℃で培養きれる。培養基１リツトル当シに
、パクト・トリプトンＩＯＪ、酵母抽出物５ｇ、塩化ナ
トリウム５ｇ及びｐＨ’ｉ７．３とするための水酸化ナ
トリウム水溶液を含有する肥沃な培養基を用いるか、あ
るいはＢ３及びＢ４の生成物と同時に、抗ビールス性の
生成物Ｐ１及びＰｇ　’に分離したい場合には、培養基
１リツトル当シに、 １３６９／ｌの燐酸二水素カリウム　　　１００ｍ２０
チの硫酸アンモニウム　　　　　１０ｍ７０．０５％の
硫酸鉄溶液　　　　　　　１ｍｊ２０　ｇ／ｌ　００ｍ
１の硫酸Ｙグネシウム溶液　　　１ｄ０．５部／１００
０のビタミンＢ１溶液　　　　２ｄ及びｐＨ’ｉ　７．
２とするための水酸化カリウム水溶液を含有する培養基
で、滅菌の後、別途に滅菌され次ブドウ糖（２０チ溶液
）を、４ないし５，９／１０００添加した培養基を用い
ることができる。

培養の終了後、バクテリア細胞は遠心分離で集められ、
凝結して保持する。その後緩衝液Ａ（２Ｍトリス／　Ｈ
Ｃｌ　：　５　ｒｎｌ、　２ＭＫＣｚ　：　３０　ｒｎ
ｌ、酢酸マグネシウムの３０　Ｎ／１００ｒＩｔｌ溶液
＝１０１１ｔｌ）中テバクテリア細胞を冷間均質化し、
粉砕し、そして、超音波処理によって破壊を完了する。

緩衝液Ｂ（Ａに類似するが、酢酸マグネシウム０．５−
及びメルカプタン・エタノールＯ，ｌ　ｍ／　Ｌか含有
しない。）で希釈した後、これを２０分間遠心分離しく
２５〜３０，０００９）　、−当９１０〜２０μｇのデ
ソキシリゲヌクレアーゼを液体表面上に添加する。デツ
キシリ？ヌクレアーゼヲ３０°−３７℃で１５分間作用
させ、その後、２０分間遠心分離する（２５〜３０，０
００．！ｉ＋）。表面の液体を４０，０００ｒｐｍで２
時間、再び遠心分離し、す、）−ソームを収集し、不用
なＲＮＡ４Ｓの全部を除去する。

リポソームケーキを緩衝液Ｂの存在下で均質化し、ラウ
リル硫酸塩の２０％溶液を２〜３滴加え、十分に機械攪
拌をおこなう。緩衝液Ｂの存在下で、常法によって、す
？ソーム・ＲＮＡ　ｉフェノールによシ抽出した。何回
かの抽出が必要である。残っテイルフェノールとプロテ
ィンを完全に除去するためにクロロホルムによる最終抽
出をおこなう。

水相を一緒にしＲＮＡの析出を助長するために少量のＫ
Ｃｔ′ｔ−含有する濃度９６°の冷却アルコールを添加
する。ｓ、ｏｏｏｙで５分間遠心分離してＲＮＡを収集
し、それ′ｔ−０，１ＭＫＣ２’ｌｉ含有する蒸留水に
よって一晩透析する。

翌朝、蒸留水だけによって１間間透析を行う。

分光光度計を使って、２６０ｎｍ（Ｕ’Ｖ）でＲＮＡ　
’ｉ測定する。２６０７２８０　　の比率で、ＲＮＡ製
造の純度をチェックできる。この比率は、２にきわめて
近似であるべきである。　ＲＮＡは凍結して、あるいは
凍結真空乾燥粉末状態で保存される。

ＲＮＡ　ｉポリリゲヌクレオチド（ＲＮＡフラグメント
）に分別するはけ、以下の方法で行う。ｖ＆ソー　ムＲ
ＮＡ　７０■（約１０ｍ）を結晶化したパンクレアチン
・すメヌクレアーゼ溶液０．２　ｍ／の存在下に置く、
（５１Ｗ／ｄのパンクレアチン・リボヌクレアーゼ溶液
は事前に１０分間沸騰させ、その後冷却しておく。） ＩＪ　、％”ヌクレアーゼと共に、正確に３０分間３６
℃で上記ＲＮＡ　’ｉインキュベートする（水浴）。同
量のクロロホルムを加えることによって変性を停止し、
数分間激しく攪拌する。この混合物を５、０００１１で
５分間遠心分離する。水相（上相）を除去し、再び同量
のクロロホルムを加え、攪拌し、遠心分離する。水相は
、ｐＨ７，４ＯＨ２０−ｏ、ＩＭトリス／　ＨＣＬ緩衝
液と均衡し次微細な５ｓｐｈａｄｓｘＧ−２５のカラム
上にすぐに保持された。

ＲＮＡフラグメントは上記緩衝液によって溶離される。

この条件下において、溶離曲線に図示されたように、２
６０　ｎｍにおける吸収によって、５つのピークが検証
できる。これらピークをカラムからの溶離順序に従って
、１〜５と指示する。

ピーク１及び２を構成するＲＮＡフラグメントは抗ビー
ルス活性を有する。

ピーク３及び４を構成するＲＮＡフラグメントは白血球
及び血小板を増進させるすばらしい作用を常に有し、本
発明にかかわる薬品を構成するものである。

ピーク５を構成するＲＮＡフラグメントは保持されない
。

各ピークを構成する留分は一緒に合せ、凍結乾燥する。

乾燥残渣を極少量の蒸留水で処理し、同量のクロロホル
ムで一度激しく攪拌し、遠心分離し、液体表面に浮いて
いるものは、滅菌した蒸留水によって２４時間透析（無
菌条件下で）した後ＰＩ　　＋　Ｐ２　　＋　Ｐ３　　
ｒ　Ｐ４の生成物を得る。生成物Ｐ３及びＰ４さらにそ
のあらゆる割合での混合物も本発明にかかわる生成物で
ある。

ヌクレオチド２５〜５０からなる単純連鎖で構成されｆ
ｃＲＮＡフラグメントＰ３及びＰ４の構成を、フランス
特許出願筒７４／３８，７６８　　に記載された技術に
従って分析し、プリン塩基とピリミジン塩基の含有ｊｌ
ｔ−ｌデーた。

ＲＮＡフラグメント１５０μｇを１００℃で１時間加水
分解する（沸騰水浴中）。デシケータで蒸発後、Ｇ、Ｒ
，Ｂｊｏｒｋ　、　Ｌ、５ｖｅｎｓｓｏｎの技術（１９
６７、生化学・生物物理学、１３８ページ４３０−４３
２）に従って、残渣を蒸留水０．０２ｄ中に塩９出し、
薄層クロマトグラフィー（エクテオラ・セルロース）に
かける。加水分解によってプリン塩基が解離しピリミジ
ン塩基はヌクレオチドの形態で残る。

ＲＮＡフラグメントｐ３及びＰ４の成分は閉鎖セルクロ
マトグラフィーにかけてＲＮＡフラグメントＰ１及びＰ
２に関して先に記載され念技術によって確認できる。

ＲＮＡフラグメントの構成：Ａ：２９．ＯＧ：４１．１ （Ｇ＋Ａ／Ｃ＋Ｕ＝２．３） Ｃ：１５．２ Ｕ二１５．０ ＲＮＡフラグメントＰ４の構成：Ａ二　２５．６Ｇ：２
６．３ （Ｇ＋Ａ／Ｃ＋Ｕ＝１．０６） Ｃ：２１．Ｏ Ｕ：２７．１ これらの数値は、分析されたヌクレオチド１００モルに
対するモル数で示されている。この場合、Ａ＝１３、Ｇ
＝１２．８、Ｃ＝１１．５、Ｕ＝１０に応じた拡大係数
を用い、最大吸収値に対応している。（参照：酵素学の
方法刈、核酸、パートＡ、Ｅｄ、Ｇｒｏａｓｍａｎ　ｒ
　Ｋ、Ｍｏ１ｄａｔｅ　ｅアカデミツク・プレス（１９
６７）、ページ３８６） ＲＮＡフラグメントＰ３及びＰ４はＤＮＡの痕跡も含有
しない。これは、比色分析（ジフェニルアミン）及び酵
素学（ＤＮＡ−ポリメラーゼ存在下の作用）によって厳
格にチェックされた。

次に下記の実施例２〜４において、大腸菌Ｔ−３０００
のｒ−ＲＮＡから出発して各種のり？ヌクレアーゼとア
ルカリ金属塩基を用いて、本発明にかかわるＲＮＡ−断
片の製造方法を記述する。

実施例２：ノやンクレアチン・リゾヌクレアーゼＡによ
る大腸菌Ｔ３０００のｒ−ＲＮＡの変性。

大腸菌Ｔ３０００の培養から出発して、ｒ−ＲＮＡ’ｉ
得る過程は、大腸菌Ｍ５００５ｈｏ−Ｒのｒ　−ＲＮＡ
に関する実施例１で記載されたと同じ方法による。

得られたＲＮＡ　’ｉ変性するために、本発明では事前
に１００℃で１０分間処理しく沸騰水浴中）その後、急
速に冷却された、５　ｍｙ／ｒｔｔｌの／４’ンクレア
チン・リゾヌクレアーゼ溶液（グレードＡ　）　’Ｉｌ
ｌ／％る。

実施例１におけると同じリボヌクレアーゼ濃度のり？ヌ
クレアーゼと、ｒ−ＲＮＡの混合物ｔ−３６℃で保温培
養するが、時間は実施例１の３０分よシも短く、２０分
間である。（もしも多少とも結晶化され次別のＡンクレ
アデン・リゾヌクレアーゼのサンプルを用いる場合には
、す？ヌクレアーゼ濃度を調整するか、あるいは保温培
養時間を調整するかしなくてはならない。） 蒸留水１０％を含有するフェノール溶液（反応混合物１
容量に対して、この容液１容址）ヲ加えることによって
反応を停止させ、リゾヌクレアーゼを除去するためにこ
の混合物を激しく攪拌する。

１０．０００　ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ次後、水
相（上相）に同量のフェノールを加え、この混合物を攪
拌し、ついで遠心分離する。この操作を同容蓋、のクロ
ロホルムを用いて繰返した。相の分離と、この作業を２
．３回繰返した後、１６時間無菌状態のもとて４℃の滅
菌蒸留水に対して、水相を透析する。

透析不可能なＲＮＡフラグメントの総量は２６０℃ｍに
おける紫外線の吸収によって確定される・リデソーム・
ＲＮＡの当初総量に対する活性ＲＮＡフラグメントの収
率は５０〜６０チの間で変動する。

このＲＮＡフラグメントは、凍結真空乾燥の後保存され
る。

ＲＮＡ−断片のアクリルアミド・グル上での電気泳動に
よって４Ｓ変換ＲＮＡのサイズよシ小さなＲＮＡフラグ
メントの単一ピークが存在することが第２図に示すよう
に、明らかになっている。第２図では２６０　ｎｒｎで
の吸収度を縦座標に、１．５時間内に動く距離全横座標
にとっである。（Ｂｅｌｊａｎｓｋｉ　Ｐ・Ｂｏｕｒｇ
ａｒｅｌおよびＭｒｓ　、Ｒｅ　１　ｊａｎａｋｉによ
る方法；パスツール研究所年巻１９７０．１１８、Ｒ−
ジ２５３）。

実施例３：　りはヌクレアーゼＮｌによる大腸菌’ｌ’
３０００のｒ−ＲＮＡの変性。

赤パンカビ溶滓を原材料物質として、カサイ他の方法（
日本生化学、１９６９．６６、ページ３８９）で製造さ
れ、純化され、１度結晶化されたりメヌクレアーゼＮ１
は塩基Ｇのところでポリリビヌクレオチド連鎖を変性さ
せる。ｒ−ＲＮＡに対してこの作用を制御しつつ行うと
、白血球形成及び血小板の形成に有効作用のあるＲＮＡ
フラグメントが得られる。用い次諸条件は下記の通り。

蒸留水内に溶解され九大腸菌のＲＮＡ−ｒ　１００〜を
りＲヌクレアーゼＮ＋０．７３ｍｊの存在下でインキュ
ベートする（当初の溶液は１０００単位７２ｍ１　）。

３６℃で保温培養時間３０分。

υｇヌクレアーゼＡの場合と同様に、フエ／　−ル及び
クロロホルムを用いてすぐに、リゾヌクレアーゼを除去
する。上記断片を、滅菌蒸留水に対して透析する。得ら
れた生成物を凍結真空乾燥する。

実施例４；　水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムに
よる大腸菌Ｔ３０００のｒ−ＲＮＡの変性。

ｒ−ＲＮＡ　７〜１０ｍ９／Ｔｎｌの溶液にＮａＯＨあ
るいはＫＯＨの溶液を加え、後者の最終濃度が０．１Ｎ
となるようにする。３６℃で３０分間保温培養する。こ
の混合物を同量のＨＣＬ　Ｏ，Ｉ　Ｎですぐさま中和す
る。

４℃で１６時間、その溶液を蒸留水によって透析する。

こうして得られた透析不可能な生成物全凍結乾燥する。

実施例２．３および４における各種ＲＮＡフラグメント
ヲ加水分解した後、プリン塩基／ピリミジン塩基比率全
確定する。この結果は、分析されたヌクレオチド１００
モルに対するモル値で下表に示される。

表 上述された条件下で、先にあげた各徨変性剤によって得
られ７’ＣＲＮＡフラグメント相互間に、特に意味ある
差異は見つからない。これらＲＮＡフラグメントのサイ
ズは実際上同一で、ＲＮＡ　４　Ｓに比べると常に小さ
くなっている（第２図参照）薬理的特性： マウスまたはウサギに静脈注射して、　１４Ｃでラベル
化した実施例１のＲＮＡフラグメントＰ３及びＰ４の生
体内分布が研究された。

１４Ｃラベル化ＲＮＡフラグメントＰ４は基本的には膵
臓に定着するが、肝臓にも骨髄にも少量は集まる。１４
Ｃラベル化ＲＮＡフラグメントＰ３は基本的には同じ器
官内に似たように定着するが、その率は弱い。この生成
物の投与されたマウスを犠牲にして調べた結果、Ｐａ’
ｆｃ投与された動物にだけ膵臓が増大し重くなっている
のがわかった（第３図および第４図）。第３図では膵臓
の重量（り）、第４図では肝臓の重量（ｇ）を縦座標に
とり、横座標には、静脈内投与あるいは腹腔内投与によ
って、マウスの体重２０ｇ当りに０．３１ｎ９用量の生
成物Ｐ３（曲線３）あるいは生成物Ｐ４　（曲線４）を
動物に与えた後の経過した日数を関数としてとっている
。膵臓、肝臓とも５〜６週間経ってから正常な重量を回
復し、自然消滅した放射能は検出されなくなる。

白血球及び血小板形成における作用は、ウサギにメント
レキサートを投与して研究された。メソトレキサートの
投与（ウサギ−匹当り３５■、筋肉内ＣＩ、Ｍ）投与）
を受は念動物では、抗分裂処置の４８時間後、白血球が
約３０チ減少することが確認できる。３匹のウサギがい
て一匹はＰ３＋Ｐ４の混合物（！量比１：１）２■の皮
下投与、−匹は同じ用量を腹腔内投与を受は−、３匹目
はメソトレキサートしか投与されない（実験の対照）。

Ｐ３＋Ｐ４ｉ投与され九二匹のウサギは、５〜７日間で
実際上正常な白血球の数を回復したが、実験の対照のウ
サギは約１５日後にやっと正常にもどった０ この同じウサギがメソトレキサートの二度目の投与を受
け（ウサギ−匹当り５５■、１．Ｖ、（静脈内）投与）
、これを第５図では０日で表わされる。

２日後、−匹はＰ３＋Ｐ４（重量比１／１．５　）　５
■を腹腔内投与され、−匹は同じ用量を皮下投与され、
三匹目は（前回実験と同じ実験の対照）はメントレキサ
ートしか投与されなかった。第５図には１日おきに２０
日間続けて、採取された血液中の白血球の数の分析結果
が示されている。

第５図ではメントレキサート注射後経過した日数を横座
標に関数として、縦座標に白血球の数をとっである。メ
ントレキサートの作用が三匹のウサギにあって、著しい
白血球数低下で確認される（実験の対照二曲線１）もの
の、実験の対照としての三匹目のウサギに比べれば、皮
下投与（曲線２）あるいは腹腔内投与で事前にＰｓ＋Ｐ
４に投与され次他の二匹の方が低下は少ない。

二度目に静脈内投与でＰ３＋Ｐ、を投与されたウサギ（
曲線３）にあっては、白血球の数は４８時間で正常にも
どり、急速に安定する前の２４ないし４８時間では増加
する。皮下投与によって１’ｓ＋Ｐａｅ投与されたウサ
ギでは、白血球の数の増大を示す曲線２が、６日目に極
大に達し、やがいレベルにあり動物は結局観察の期間内
で、正常な数を回復することができなかった。

上述のような投与をうけたウサギの赤血球の数は変化し
ない。

実施例２〜４において各種変性剤を用いて得られたＲＮ
Ａフラグメントについての薬理学研究の結果によると白
血球についての活性及び血小板形成についての活性につ
いて見ると、実施例１の生成物Ｐ３及びＰ４の単独投与
にしても、なんらかの比率での混合投与の場合でも、実
施例２〜４の各生成物との間には、特に差異がなかった
。

実施例２〜４の各生成物の一用量を静脈内投与で、連続
的強力に免疫抑制されたウサギ（白血球数低下６０〜７
０％）に投与すると、２４〜４８時間で正常な白血球数
を回復できる。血小板数は、これらのＲＮＡフラグメン
トの作用で実験の対照動物の血小板数と比較すると５０
〜１００％増大する。第６図はエンドキサン（６５Ｔｖ
日）を連続投与され実施例１〜４のいずれかによって得
られたＲＮＡ−断片を周期的に投与されたウサギにおけ
る一定の実験期間（２０〜３０日）の結果を表わす。

第６図において、横座標には、ウサギが毎日エンドキサ
ン６５■を投与された実験日数をとっである。矢印Ａで
示された時間において、ウサギは静脈内投与によりＲＮ
Ａフラグメント２■を投与された。第６図の曲線のうち
のひとつは縦座標に、白血球数をとり、別の曲線は縦座
標に血小板数をとっている。

筋肉内Ｃｌ０Ｍ、）、静脈内（工、■、）、皮下（Ｓ、
Ｃ，）　、真皮内（Ｉ、Ｄ、）及び経口等あらゆる投与
経路で、活性ＲＮＡフラグメントヲ注射することができ
る。

反応時間は、選択された投与経路により、及び生成物の
用量によって変化する。エンドキサンを投与されていな
いウサギにおいては、血液の組成は正常であるが、静脈
内投与でＲＮＡフラグメントを投与しても、白血球の数
は変らない。もし、生成物の投与量を大にすると、白血
球数は増大するが２４時間以内で正常にもどる。

白血球数低下や血小板減少を伴う各種化学的物理的薬品
（エンドキサン、メントレキサート、チオテーノ４また
は放射）の作用あるいは遺伝的な欠陥さえも、この観点
から見ると、上述の各種ＲＮＡフラグメントを用いるこ
とによって治療できる。匍小板形成に与える作用は、白
血球に与える作用よりも緩慢であるが、漸進的な十分な
回復をもたらす。病院での試験で十分にこの点は証明さ
れている。

毒物学： 滅菌生理水中に溶解した実施例１及び実施列２〜４の生
成物Ｐ３及びＰ４が静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投
与、皮下投与、経口投与等によって、マウス及びウサギ
に投与された。マウスに対して一回の投与で１〜５■、
ウサギに対しては４〜２５．９の用量で、数日間投与な
繰返しても、１５日間以内ではこれら生成物のいかなる
毒性も現われなかった〇 用ｉをかなり増加させて経口投与しても、毒性は現われ
なかった。

繭形学的研究において、本発明にかかる生成物を、妊娠
中のメスのマウスに投与し次が、第一世代にも、それに
続く世代にも、悪影響はまったくないことが証明された
。

この二うに、本発明にかかる生成物は動物に対してまっ
たく無害である。

治療上の適用； 本発明にかかる生成物の病院試験において、白血球減少
症あるいは血小板の欠乏の際、他の血液組成を変えずに
、白血球及び血小板数を正常にもどす目的で人間に投与
できることが証明された。、各種白血球間の均衡回復が
もたらされた。

これら生成物は水溶性であるから生理食塩水として非経
口投与できるし、水薬、錠剤、ピルその池の通常の形態
で経口投与することも可能である。

用量は、治療する病気の性質によって１０〜２０■の間
で変動するが、本発明にかかる調剤上の組成にあっては
、有効生成物として本発明にかかる生成物の少くとも一
種類を単位用量２〜１００ηで適当な調剤上の賦形剤と
調合される。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリリ？ヌクレオチドの溶離曲線を示すグラフ
、第２図はＲＮＡフラグメントの泳動距離と２６０ｎｍ
における吸収塵との関係を示すグラフ、第３図ないし第
６図は本発明によって製造される薬品の効果を示すグラ
フ。 川 （ｑ　　　）　　　　　勺 ｃ＞ｃｂ。 ＣＹｌ　　　　〜　　Ｎ 寸 （’ｌ”）　　　ＣＸＪ　　　　ｚ　　　　　ｃ）ｃ３
　　　　　　　　　（：）　　　　　　　　　ｏ　　　
　　　　５５　　　　　　　　　偽　　　　　　　　　
０　　　　　　　　ｑＮ　　　　　　　　−（笥

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物から抽出された（Ｇ＋Ａ）／（Ｃ＋Ｕ）比
   が１．０ないし２．５のリボソームリボ核酸をリボヌク
   レアーゼまたは化学剤で変性することを特徴とするポリ
   リボヌクレオチドの製造方法。
2. （２）微生物が大腸菌Ｔ３０００である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）変性を化学剤としてのアルカリ金属塩基によって
   おこなうことを特徴とする特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の方法。
4. （４）塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム溶
   液である特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム溶液を反
   応混合物中に０．１Ｎの濃度で用い、この混合物を３６
   ℃で３０分間保温培養し、ついで０．１Ｎ塩酸等容量で
   直ちに中和し、かくして得られた溶液を蒸留水で１６時
   間透析し、非透析性分画を収集し凍結真空乾燥すること
   を特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）パンクレアチン・リボヌクレアーゼの作用によっ
   て変性をおこなうことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の方法。
7. （７）赤パンカビ溶滓から抽出したリボヌクレアーゼの
   作用によって変性をおこなうことを特徴とする特許請求
   の範囲第１項ないし第２項記載の方法。
8. （８）リボソーム・リボ核酸とリボヌクレアーゼの混合
   物を３６℃で２０〜３０分間保温培養した後、フェノー
   ル、ついでクロロホルムを添加し反応を停止させ、添加
   の度に水相を分離し、その水相を最終的に蒸留水によっ
   て透析し、非透析性分画を採取し、それを凍結真空乾燥
   させることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第２項
   、第６項または第７項記載の方法。