JPS6296499A - カルボキシル末端のｄ−アミノ酸置換基を有するカルシトニン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物学的な有効性を有するカルシトニン類似
体および生物学的に有効なカルシトニン類似体に変換す
ることのできるペプチドに関するものである。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点）カ
ルシトニンの構造と生物学的な有効性の相関関係の立証
は困難である。１個のアミノ酸置換体の組み合わせは、
しばしば生物学的な有効性に付加的な効果を生じなかっ
たが、おそらくこれは、ホルモンの代謝の特性に関する
情報が欠如していることに帰因する。自然に生ずるカル
シトニンの有効性には、生物学的有効性において概そ４
０倍の範囲で、暢広い変化がある。

全てのカルシトニンは、いくつかの共通な構造上の４１
１１共有する。各々のカルシトニンは、カルボキシル末
端（Ｃ−末漏）のプロリンアミドおよびアミノ　末端（
Ｎ−末端）の１番目と７番目との間のジスルフィド結合
環を有する５２個のアミノ酸から成る。例えば、サケ１
カルシトニンは下記の式で表わされる（　Ｎ１ａｌｌ、
　Ｈ９１）。

（１９６９年）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、ＵＳＡ第６４巻、第７７１ないし７７８頁）。

その他の天然のカルシトニンは、この配列とは相同の程
度が異なる（　Ｑｕｅｅｎｅｒ、　　８．Ｆ、およびＢ
ｅ１ｌ、　Ｎ、Ｈ（１９７５年）　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ第２４巻、ＷＪ５５５ないし５６７頁；　Ｌａｓｍｏ
ｌｅｓ、　Ｆ、ら（１９８５年）　ＦＥＢＳ　Ｌｅ　ｔ
　ｔ　、第１８０巻、第１１３すいし１１６頁）。３１
番目のＬ−トレオニン（２８，３几配置）は、ウナギ、
ヒツジ、ウシ、ブタおよびニワトリのカルシトニン中に
も現われる。同じ３１番目は、ヒト、ネズミのカルシト
ニン中、アミノ酸し−アラニンにより、そしてサケ２カ
ルシトニンおよびサケ３カルシトニ／中、Ｌ−バリンに
よシ占められている。ウナギのカルシトニンは、２６番
目でアミノ酸し−アスパラギン酸、２７番目でＬ−バリ
ンおよび２９番目でＬ−アラニンを有することにニジサ
ケ１カルシトニンと異なる。

ニワトリのカルシトニンは、２番目でアミノ酸し−アラ
ニン、３番目でＬ−セリン、２６番目でＬ−アスパラギ
ン酸、２７番目でも一ノくリンおよび２９番目でＬ−ア
ラニンを有することによ）サケ１カルシトニンと異なる
。

サケ２カルシトニンは、１５香目でＬ−アスパラギン酸
、２２番目でも一７エニルアラニン、２９番目でＬ−ア
ラニンおよび３１査目でＬ−パリンヲ有することに工勺
サケ１カルシトニンと異なる。サケ６カルシトニンは、
８番目でＬ−メチオニン、１５香目でＬ−アスパラギン
酸、２２番目でＬ−フェニルアラニン、２９番目でＬ−
アラニンおよび３１番目でも一バリン奮有することによ
りサケ１カルシトニンと異なる。

師乳類起源のカルシトニンは、下記比較光に示す様に、
サケ１カルシトニンとはさらに著しく異なる。１番目と
７番目との間のジスルフィド結合は、下記配列から、平
明のために省略する。

位置＝　　Ｌ　　ス　　互　　見　　互　　玄　　Ｌサ
ケＩ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓヒ　　ト　　ｐ　　　　　　
Ｇｌｙｘｔｔｇｐｐ不ズミ　／１／１１１Ｎ１１Ｎ ウ　　シ　　〃　　　　　Ｓｅｒ　　〃　　　　　〃　
　　　　Ｉ　　　　　Ｉ　　　　　Ｉブタｐ　　８ｅｒ
　ａ　　＃　　ｔｔ　　ｐ　　ｕヒツジ　ｐｓｅｒｔｔ
ｚｐｔｔｔｔ 位置：　　且　　ヱ　　皿　旦　旦　旦　旦サケ１Ｖａ
ｌ　　Ｌｅｕ　　Ｇｊｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｓ
ｅｒ　　ＧＪｎヒ　　ト　　Ｍｅｔ　　　ｔ　　　　　
　＃　　　　　Ｔｈｒ　　　Ｔｙｒ　　　Ｔｈｒ　　　
ｚネズミ　１１１１１１１１ ウ　　シ　　Ｖａｌ　　　ｙ　　　　　Ｓｅｒ　　　Ａ
ｊａ　　　＃　　　　　’ｌ’ｒｐ　　　Ｌｙｓブタｐ
　　ｚ　　ｐ　　ｙ　　Ｉ　　＃　　Ａｒｇヒツジ　ｚ
　　　ｔ　　　＃　　　＃　　　＃　　　＃　　　Ｌｙ
ｓ位置：　　且　　旦　　１乙　　１東　　−ぜ−　　
スジ　　Ａ１サケ１ＧＪｕ　　Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｌｅｕ　　ＧＪｎ　　Ｔｂｒヒ　　ト　　Ａｓ
ｐ　　　Ｐｈｅ　　　Ａｓｎ　　　ｙ　　　　　Ｐｈｅ
　　　Ｈｉｓ　　　＃ネズミ　ｚＬｅｕｚｚｚｓｔｔ ウ　　ｙ　　　ｙ　　　　　ｚ　　　　　ｚ　　　　　
Ａｓｎ　　　Ｔｙｒ　　　＃　　　　　ＡｒｇブタＡｓ
ｎ　ｔ　　＃　　ｔｔ　　Ｐｈｅ　＃　　＃ヒツジ　Ａ
ｓｐ＃ｔｔ　　　ｓ　　　Ｔｙｒ＃ｐ位ｔ：　　双　竺
　鼾−且　Ｌ　翌　社サケＩ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　
Ａｒｇ　　’１１．’ｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇ
ｊｙヒトＰｈｅ＃Ｇｊｎ＃ＡｊａＩＪｅ＃ ネズミ　ｔｔｐｔｔｚ８ｅｒｔｔｐ ウ　　シ　　ｐｔ　　　　　　８ｅｒ　　　ＧＪｙ　　
　Ｍｅｔ　　　（）Ｊｙ　　　Ｊ’ｈｅ　　　＃ブ　　
タ　　ｌ　　　　　＃　　　　　＃　　　　　＃　　　
　　Ｉ　　　　　Ｉ／　　　　　＃ヒツジ　Ｔｙｒｐｚ
ｙｙｔｔｔｔ 位ｗｔ：　　　翌　剋　シー　旦 ツーケＩ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ−
ＮＪ４２ヒトＶａｌｔｔＡ７Ｉａｎ ネズミ　〃　　　〃　　　Ｉ　　〃 ウ　　ン　　Ｐｒｏ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｂｒ　　　ｐ
ブタ１１１１ ヒツジ　／Ｆ　　　Ｉ　　　Ｉ　　　／１哺乳類起源の
カルシトニンと関連する鯰後のカルシトニンの増加した
有効性の原因となる構造上の特徴は、まだ完全には決定
されていない。

ヒトのカルシトニンにおいて、プロリン部分のＣ末端の
アミド基の除去は、１００％から［１，０６９６へと強
要な有効性の低′）分生ずる。プロリンアミド部分全体
の除去も丑だ１００％から［１１２％へと強Ｖ、な有効
性の低下を生ずる（　１４ｊｔｔｅｌ、　Ｗ。

ら（１９７ｉＳ年）　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ第５２合
、第２４６ないし２４８頁）。

合衆国特許第４，４６９，６５２号は、サケ１カルシト
ニンにおいて自然に生じている２４番ｌ」のアルギニン
のＤ−アルギニンへの置換では有効性が増加することを
示してｂる。一方、合衆国特許第４４１４，１４９号は
、８番目のも一バリンおよび２４番目のＬ−アルギニン
をそれぞれ８ｔｉ目全グリシンでおよび２４番目ｆＤ−
アルギニンで置換された場合のサケ１カルシトニンの有
効性が減少することを示してｈる。

（問題点全解決するための手段） ：　　　　　　本発明者は、合成サケ１カルシトニンお
よびその他のカルシトニンにおいて、Ｃ末端部分で１　
　　　　のＤ−アミノ酸置換が、公知のカルシトニンと
同様のタイプの生物学的有効性（例えば、血漿のカルシ
ウムレベルを低下させる）を有するカルシトニン類似体
を供給することを発見した。

この新規なペプチドにおいて、アミノ酸配列は３１番目
または５２番目またはその両方において少なくとも１個
のＤ−アミノ酸残基を含む。

新規なペプチドは、公知のカルシトニンに比較：　　　
　　した場合、すぐれた有効性および性質を有する。

結果として生物学的有効性を増加させるＤ−アミノ酸の
導入は、ペグテド類似体の増加した安定性および／″！
、たけ特定の構造上の特徴′ｆｔ有することをＤＪ能と
する。

カルシトニン類似体は、サケ、ウナギ、ニワトリ、ウシ
、ブタ、ヒツジ、ネズミまたはヒトのものであってよい
。好ましｌ：ｔ、Ｉ）−アミノ酸残基は３１番目１ケ所
である。好ましい１）−アミノ酸置換基は、Ｄ−アラニ
ン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、ｊ）−インロイシ／、
１）−七リン、Ｌ３−トレオニン、Ｉ）−アスパラギン
酸および１）−アスパラギンの残基である。好ましい類
似体は次式の置換サケ１カルントニンでアル。

（Ｊｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−ロＩｎ−（Ｊｌｕ
−Ｌｅｕ−４Ｉ７５−Ｌｙｓ−ＩＪｅｕ−Ｇｊｎ−Ｔｈ
　ｒ　−Ｔｙ　ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ　ｇ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ
　ｎ　−Ｔｈ　ｒ−Ｏｌｌｙ−Ｓｅ　ｒ−（式中、Ｘま
たはＹ″またけその両方は、独立に、Ｄ−アラニン、１
］−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシンｓ　Ｄ　
　ａＪＪｏ−イソロイシン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニ
ン、Ｄ　−ａｌｌｏ−トレオ二ｙ、Ｄ−７スバ、Ｆ　キ
ン酸、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グル
タミン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−メチオニンスルホキシド
、Ｄ〜メチオニンスルホン、Ｄ−７’ロリン、　Ｊ）−
ヒスチジン、Ｄ−７エニルアラニン、Ｄ−チロシン、Ｄ
−ヒドロキシプロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニンの
残基、または対応する通常存在するＬ−アミノ酸の残基
であって、ＸまたはＹの少くとも一方がＤ−アミノ酸残
基全表わす。）好ましいカルシトニン類似体は３１番目
がＤ−セリンであるカルシトニン、３１番目がＤ−トレ
オニンであるカルシトニンおよび３１番目がＤ−アスパ
ラギンであるカルシトニンである。

本発明の特に好ましいペプチドは、サケ１類似体であシ
、％１Ｃ３１査目がＤ−セリンであるサケ１カルシトニ
ン、３１−８月が１）−トレオニンであるサケ１カルシ
トニンおよび３１番目がＤ−アスパラギンであるサケ１
カルシトニンが好ましい。

カルシトニン類似体の合成は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ。

１（、、Ｈｏ（１９６３年）　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｓｏｃ、第８５巻、第２１４９ないし２１５４頁に
報告された逐次同相法に従っても良く、この技術は、上
記参照文献によシ本明細書に加入する。酸に小安定な第
三−ブチルオキシカルボニル（ｌ１ｏｃ　−）　基２一
時的なα位のアミノ基保藷のために使用しても良く、よ
り酸に安定な基をアミノ酸の側鎖の保護に使用しても良
い。アミノ酸訪導体を第１表に、そして略語全第２表に
記載した。ペプチド鎖のスチレンおよび１チジビニルベ
ンゼンのコポリマーマトリックスへの結合は、　Ｐｉｅ
ｔｔａ。

Ｐ、Ｇら（１９７０年）　Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ、第
６５０ないし６３１頁；　Ｈ，ｒｕｂｙ、　Ｖ、Ｊ、ら
（１９７７年）　Ｊ、　Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、第４２巻、第５５５２ないし３５５６頁：お
よびＴａｍ、　Ｊ、　Ｐら（１９８１年ン’Ｉ’ｅ　ｔ
　ｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、第２２巻、第２８３１な
いし２８５４　頁に報告されているように、ベンズヒド
リルアミンタイプの東ハンドル（ｈａｎｄｌｅ　）　’
　ｆ利用しても良く、この技術もまた上記参照文献によ
って木切＃１ｌｉＦに加入する。全てのアミノ酸は、特
定のアミノ酸に対しである変性を施して二重カップリン
グ法に従って挿入される。全ての反応において、アルギ
ニン、アスパラギンおよびグルタミンを除いて、第一の
カップリングは、ジクロロメタン中プレフォーム対称無
水物法（ｔｈｅｐｒｅｆｏｒｍｅｄ　ｓｙｍｍｅｔｒｉ
ｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　ｍｅｔｈｏｄ　）（Ｈａｇｅ
ｏｍａｉｅｒ、　Ｈ，およびＦｒａｎｋ、　Ｈｏ（１９
７２年）Ｈｏｐｐｅ　−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第５５３巻、第１９７５ないし
１９７６頁）を利用し、および第二のカップリングは、
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中プレフォームヒドロ
キシベンズトリ７ゾールエステル法（ｔｈｅ　ｐｒｅｆ
ｏｒｍｅｄ　ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｔｒｉａｚｏｌ
ｅ　ｅｓｔｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ　）　（Ｋｏｎｉｇ、　
Ｗ、およびＱｅｉｇｅｒ、几、（１９７０年）　Ｃｈｅ
ｍ、Ｂａｒ、第１０３巻、第７８８ないし７９８頁）を
利用する。Ｂｏｃ　−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ　）には、通常
のＤＣＣカップリング条件が、ラクタム形成の危険を減
少させるために使用される。第二のカップリングはＤＭ
Ｆ中活性ＨＯＢｔエステル法で行なわれる。ＨＯＣ−Ａ
ｓｎ　　およびＢＯｃ　−Ｇｌｎは、ニトリルおよびア
ミジン形成全減少させるためにＤＭＦ中ＨＯＢｔエステ
ルとして排他的にカップリングさせた（　ＩＶｉｏｊｓ
ｏｖ、　Ｓ。

ら（１９８０年）　Ｊ、　Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、第４５巻
１第５５５ないし５６０頁）。Ｎ−イプシロン−（２−
り００ベンジルオキシカルボニルンリジン、Ｌｙｓ　（
ＣｊＺ）は、酸による脱保護に対してベンジルオキシカ
ルボニル誘導体よりも安定であシ、分岐した側鎖には近
づかないから使用される（　Ｅｒにｋｓｏｎ、　Ｂ＋Ｗ
、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　ＲｏＢ。

（１９７２年）　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、
　第９５巻、第３７５７ないし３７６３頁）。Ｂｏｃ　
−Ａｓ　ｐ　−ＯＨのベーターシクロヘキシルエステル
（ｃＨｅｘ　）　ハ、酸によシ安定で、アスパルトイミ
ドの形成を最小限におさえるので使用される（　Ｔａｍ
、　Ｊ、　Ｐ。

（１９７９年）　Ｔｅｔｒａｈｅａｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、
第４０３５ないし４０５６頁ン。定量的々ニンヒドリ／
反応は各サイクルののちにカップリングの程度を測定す
るために合成全体をとおして通常使用される（　５ａｒ
ｉｎ、　Ｖ、　Ｋら（１９８１年）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ。

第１１７巻、＄１４７な１．ｔ−ｈシ１５７頁）。

第１表　６１番目での″丈ケ１カルシトニ／置換類似体
合成のだめのアミン＃Ｉ訪導体 ［Ｄ−８ｅｔ］サケ１カルシトニン 蛸　Ｉ／１　１　　へ　　へ　　へ　ヘ　へ　　０４　
　　へ＜＜＜＜＜＜　　　　＜　　　　に） −Ｆ　　　ｗ−Ｐ　　　の　　　へ　　　　　　哨　　
　　　　１第２表　略語（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ａｃｔａ第１３３巻第１ないし５頁（１９６７年
） Ｂｏａ　＝第三ブチルオキシカルボニル基Ｂｚｊ＝ベン
ジル基 Ｔｏｗ　＝　）クル基 Ｃ１＠Ｂｚｌ＝２．６−ジクｃｘ　ｏ　ヘｙジル基ＣＩ
−Ｚ　＝・Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル基０ｃ
Ｈｅｘ　＝　カンマーククロヘキシルエステル４−Ｍｅ
　−Ｂｚｊ　＝　４−メチルヘンシル基ＨＯＢｔ　＝Ｎ
−ヒドロキシベンズトリアゾールＤＩｇＡ＝ジイソプロ
ピルエチルアミンＤＣＣ＝ジシクロへキシルカルボジイ
ミドＤＭＦ　＝　Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドＣＭ　
＝カルボキシメチル基 ＴＦＡ＝）リフルオル酢酸 ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィーＭ几Ｃｕｎｉｔ
ｓ＝医学研究審議会（Ｍｅｄｉｃａｌ＆５ｅａｒｃｈ　
ＣｏｕｎｃＨ）単位標準Ｐｒｏ＝Ｌ−プロリル基 ８ｅｒ＝Ｌ−セリル基 ｏｔｙミグリシル基 Ｔｈｒ＝Ｌ−トレオニル基 Ａｓｎ　＝　Ｌ−アスパラギニル基 Ａｒｇ　＝　Ｌ−アルギニル基 Ｔｙｒ　＝　１ノーチロシル基 ＧＡ！ｎ　＝　Ｌ−グルタミニル基 Ｌｅｕ　＝　Ｌ−ロイシル基 Ｌｙｓ二Ｌ−リジル基 Ｈｉｓ＝Ｌ−ヒスチジル基 ＧＪｕ　＝　Ｌ−グルタミコ１基 Ｖａｎ　＝Ｌ−バリル基 Ｃｙｓ　＝　Ｌ　−’／ステイニル基 Ｄ−８ｅｒ＝Ｄ−セリル基 Ｄ−Ｔｈｒ　＝　Ｄ　−トレオニル基 Ｄ−Ａｓｎ＝Ｄ−アスバジギニル基 ペプチドの樹脂からの切断および全ての残っている保護
基の除去は、アニソールの存在下無水弗化水素で処理す
ることにより行なわれる（　Ｙａｍａｓｈｉｒｏ、　Ｄ
、およびＬｉ、　Ｃ９１−１，（１９７８年）Ｊ、　Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、第１００巻、第３１７４な
いし３１７９頁）。粗ペプチドは、１０チ酢酸水溶液で
洗浄することにより樹脂から分離される。凍結乾燥後、
残渣をジチオトレイトールで処理してよ（（Ｃ１ｅｌａ
ｎｄ、　Ｗ、　Ｗ、（１９６４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ第３巻、第４８０ないし４８２頁）、これはｐ　
Ｈ７，５の燐酸ナトリウム緩衝液中で行なう。カル７ト
ニンの１番目と７番月のシスティン残基の間の、分子内
ジスルフィド結合は、溶液を数倍に希釈することおよび
水溶液に７エリシアン化カリウムを添加することにより
形成され得る。この結果生成したペプチド溶液をＣＭ−
セファデックス、Ｃ−２５カラムに通し、そして同様の
燐酸緩衝液中、ゼロから０．３Ｍの塩化ナトリウムの直
線濃度勾配で溶出させることによシ濃縮する（　Ｌｉｖ
ｅ、　Ｄ、　Ｈら（１９７７年）　Ｊ、Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、第４２巻、第３５５６ないし３５６１頁；Ｍ
ｏｅ、　Ｇ、Ｒ，およびＫａｉｓｅｒ、　Ｅ、Ｔ、（１
９８５年）Ｂｉ　ｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ　第２４
巻、第１９７１ないし１９７６頁）。試料を最後にゲル
濾過によシ脱塩し、濃縮し、ＨＰＬＣにより分離をする
。

一方、３１査目および３２査目の少なくとも１ケ所にお
けるわ一アミノ酸置換は、サケ、ウノーギ、ニワトリ、
つ／、ブタ、ネズミ、ヒツジおよびヒトのカル７トニン
に行なっても良く、例として次の詳細な説明は、サケ１
カルントニ／に関するものである。サケ１カルシトニン
の３１＆月および３２査月でのわれ叱れの新しめ置換類
似体の式は下記の様に誓かれる。

（式中、 Ｘ　ハＤ　−７９ニン　Ｄ　　、＜リン、１）−ロイシ
ン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ａｌｌｏ−インロイシ／、
Ｄ−セリン、Ｄ−トＶオニン、ＩＪ−ａｌｌｏ−トレオ
ニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギｙ、Ｄ−／
ルタミン酸、Ｄ−グルタミン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−メ
チオニンスルホキシド、Ｄ−メチオニンスルホン、Ｄ−
プロリン、Ｄ−ヒドロキシプロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−
アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、または対応するＬ−アミ
ノ酸の残基を表わし、そして ＹはＤ−７”ロリン、Ｄ−ヒドロキシプロリン、Ｄ−フ
ェニルアラニン、Ｄ−チロシンまたは対応するＬ−アミ
ノ酸の残基を表わし、 ＸおよびＹの少なくとも一つはＤ−アミノ酸残基を表わ
す、） 上記式かられかるように、３２個のアミノ酸が含まれる
。この弐において、位置は通常の方法に従って番号がつ
けられ、鎖の−４のシスティンを１番目として始まり、
鎖のもう一方の端のプロリンアミドが５２査目で終わる
。説明の平明のため忙、この同じ番号システムを合成の
ティクル番号にもり１用し次。アミノ酸の組立ては、プ
ロリン部分にアミノ酸をカップリングさせることから成
るサイクル３１から始まシ、次に５０査目の残基に絖さ
、そして最後のアミノ酸１で続く。カルントニンの合成
に使用し得る保護されたアミノ酸妨導体は、第１表に記
載しである。グロリンで機能化される樹脂は、市販のも
のを利用できる。

前記した様な、３つのタイプのカップリング方法は反Ｊ
ｃａ物の性質によって使用される。第１表にアミノ酸の
位置、サイクル番号、カップリング方法のタイプ、分子
蓋およびサイクルのだめの反応物のｉｔ記載した。おの
おののカップリングの方法Ａ、ＢおよびＣの詳細は後記
する。

（実施例） 実施例１ ６１査目がＤ−セリンに置換された（〔Ｄ−８ｅｒ　月
サケ１カルシトニン、対称無水物法および活性エステル
法を使用する二重カップリング方法は、できるだけ完全
なカップリングを確実にするために使用される。下記の
方法は、アルギニン、アスパラギンおよびグルタミンを
除いた全てのアミノ酸に使用され得る。方法は、全体で
１　ｍ　ＭｏＪのグロリンで機能化したベンズヒドリル
タイプの樹脂２ｆ用に示している。

ｔ　樹脂をジクロロメタン、Ｃ１（、ＣＪ、で洗浄する
（３０ｄ、６Ｘ１分間）。

Ｚ　保護基Ｂｏｃの除去を、５０チＴｌＩ”ＡのＣＨ，
Ｃｊ。

溶液で処理しく３０ｄ、３×１分間）、そしてさらに５
０ｍ１で２０分間処理することによシ行う。

五　指薬を次にＣＨ，ＣＪ！洗浄（３０耐、６×１分間
）で除去する。

毛　残）の酸を５チＤＩｆｆＡのＣＨ２Ｃｌ溶液（３〇
−１２×２分間）で最終的に除去する。

＆　最後の洗浄を、カップリングが完遂する前に行なう
、ＣＨりＣｊｌ　（３０，ｗ／、　６　Ｘ　１分間）。

＆　樹脂３１１ｉ１ｉニンヒドリン試験用に取る。

７、　　ＣＨ２Ｃｌ２１０ｍに溶解した保護されたアミ
ノ酸（第１表に記載、８　ｍ　Ｍｏｊ　）をＣＨ，ｃｚ
。

３−中（Ｄ　ＤＣＣ（４ｍＭｏＪ、　８２３１１Ｆ　）
で処理する。１０分後、溶液ヶ濾過し、樹脂に加える。

沈殿をＣ１−１２ｃｌｚ　　１０　ｍｊで洗浄し、反応
槽に加え、次に室温で２時間振とりする。

ａ　樹脂ｆ　ＣＨ２Ｃ１ｚ　テ洗浄する（３０ｄ、４×
２分間）。

２　樹脂＠　ｓ　％　ＤＩＥＡノＣＨ，Ｃ１２溶液で洗
浄する（３０ｄ、２分曲）。

１α　樹脂をＣＨ，ＣＩ、で洗浄する（　３０　ｍｌ、
　４Ｘ２分間）。

１１、　　ニンヒドリン試験を行なう。

１２、　　樹脂をＤＭＦで洗浄する（３０．ｗ／、２Ｘ
２分間）。

１五〇℃（７）　ＤＭＦ　Ｚ　ｍｌ中ノＨＯＢｔ　　（
４ｍＭｏＪ、５４０１９　）　ｆ　ＣＨ２Ｃ１ｚ　３　
ｒｄ中（７）　ＤＣＣ（４ｍＭｏＪ、８２５ｑ）に混合
する。ＤＭＦ　６　ｄｌに溶解した保護されたアミノ酸
（第１表に記載、４　ｍＭｏＪｔ　）を次に加える。混
合物を０℃に１０分間保ち、そして次に樹脂に加える。

混合物を室温で２時間振とりする。

１４、樹脂を次Ｋ　ＤＭＦ　テ洗浄−ｊる（３０ｄ、２
×２分間）。

１５、　　樹脂ｋ　ＣｋｂＣｌｘ　”ｔ’洗浄すル（３
０ｄ、　４Ｘ１分間）。

１＆　樹脂を５チＤＩＥＡのＣＨ，Ｃｊ、溶液で洗浄す
る（３０ｍ、２分間〕。

１７−　樹脂をＣＨ２Ｃ１ｚで洗浄する（３０ｇ７．３
×１分間）。

１ａ　　ニンヒドリン試験を行なう。

カップリング方法Ｂ（アミノ酸アスパラギンおよびグル
タミンに使用される） １ないし６段階はカップリング方法人と同様である。

Ｚ　樹脂をＤＭＦ／ＣＨ＊ＣＪｍ　　溶液（１：２ｖ／
ｖ）　テ洗浄する（３０＋ｗｊ、２Ｘ２分間）。

＆　　Ｏｕ（ＤＤＭＰ／ＣＨ＊Ｃｊ！（１：　１　ｖ／
ｖ）　７ｒｘｌ中のＨＯＢｔ　（４ｍＭｏｊ、　５４０
　ｑ　）に、ｃｎ、ｃａ、　３　ａｔ中ＯＤＣＣ（４ｍ
Ｍｏｊ、８２５Ｉｌｖ）’（ｉ−加える。その混合物ｊ
ｃ　−次に　ＤＭ　Ｆ／ＣＨ＊　ＣＪ＊　６１１１　中
Ｏ保護されたアミノ酸（第１表に記載、４ｍＭｏＪ）を
加える。反応混合物を０℃において１０分後樹脂に加え
る。樹脂を次に室温で２時間振とりする。

９　樹脂ｆ　ＤＭｋ’／　ＣＨｌＣｊｌ　（ｊ　：　２
　ｖ／ｖ　）テ洗浄する（３０−１２Ｘ２分間）。

次に、カップリング方法Ａ［記載した８なめし１８段階
を続ける。

用される） １ないし６段階は、カップリング方法人と同様である。

ｌ　　ＣＨＩＣＪｌｌ　０ｍ中の保護されたアミノ酸（
第１表に記載、４ｍＭｏＪ）を樹脂に加える。

ＣＨ２Ｃｌ２３ｔｅｌ中のｌ）ＣＣ（４ｍｍｏＪ、８２
５ｗりを５分後樹脂に加える。反応混合物を室温で２時
間振とりする。

次に、カップリング方法人に記載した８な込し１８段階
を続ける。

実施例２ ＣＤ　−Ｔｂｒ”　〕サケ１カル７トニン：この類似体
の合成は、前に（Ｄ−８ｅｒ）ｔケ１カルシトニンで記
載したものと同様の方法に従う（第１表）。Ｂｏｃ　−
Ｄ−Ｔｏｒ　（Ｂｚｊ　）が、樹脂に結合したプロリン
残基にカップリングするサイクル３１において使用され
る。カップリング方法人が使用される。残基３０ないし
１の先行するカップリング反応は、（Ｄ−８ｅｔ）サケ
１カルシトニンで前に記載したものと同様である。

実施例３ ［Ｄ　−Ａｓｎ　　］サケ１カルシト＝　７　：　１Ｊ
ｏｃ　−Ｄ　−Ａｓｎがサイクル３１で使用され、そし
てカップリングＢが使用される。先行するカップリング
は、前に記載したものと同様である（第１表）。

各実施例において、１番目のシスティンの付加は固相合
成の完成を表わす。１３ｏｃ基は、カップリング方法人
の１ないし６段階により最後に除去される。樹脂ペプチ
ドを次に反志槽から移し、真空中で乾燥する。切断およ
び精製は下記の様に行なう。

乾床樹脂ペプチド（２２）およびアニソール２１を、ド
ライアイス−アセトン浴で冷却されたデフロ／反応槽に
入れ、そして弗化水素ガス１５耐を反応槽中で液化する
。

混合物全水浴中０℃で４５分間攪拌する。次に最初は水
アスピレータ−を使いそして後に高真空ポンプを使った
真空下で、弗化水素を蒸発させる。残渣を酢酸エテル５
ｘ３０ｄで粉末にし、そしてペプチドを１０チ酢酸水溶
液１００ｄで樹脂粒から抽出する。混合物を凍結乾燥し
乾燥物とする。

凍結乾燥したペプチドの試料１００〜を、ｐＨ７，５の
５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液５ｍＡ’中の過剰なジチ
オトレイトール（５ｍＭｏＪ）で室温で１時間処理する
。システィン残基１および７の間の分子内ジスルフィド
結合は、ペプチド溶液を同様の緩衝液中に１１まで希釈
することにより形成される。２０　ｍＭ　Ｋｇ　Ｆｅ　
（ＣＮ　）＠の溶液を、持続性の黄色が得られるまで攪
拌しながらゆっくりと加える。この結果生じた希釈ペプ
チド溶液をＣＭ−セファデックス、Ｃ−２Ｓカラムに通
し、そして次に同様の燐ｒ！！緩衝液を使用して、ゼロ
から［Ｌ３Ｍの塩化ナトリウムのｉｋ線濃度勾配で溶出
させることにより濃縮する。このカラムからの分画物は
、セファデックスＧ−１５カラムを使用して、α０３Ｍ
ｆｆ１Ｅ酸水溶液で溶出させ、脱塩しても良い。生物学
的な試験を行うための試料を、分析用ＨＰＬＣ（カラム
：アルテックス（Ａｌ　ｔｅｘ　）ＯＤＳ、５ミクロ７
、ｊＬ６Ｘ２５０　（Ｂ、流速１．５ｄ／分、ｐＨ５，
５の［１１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中３０ないし４５
チアセトニトリルの濃度勾配）で分離する。分離した試
料を、対照試料としてサケ１カルシトニンを使用して定
析しても良込。

ＨＰＬＣで分離した試料を％５．５Ｍ塩酸で加水分解し
、化学組成を確認するためにアミノ酸分析を行なう。

（発明の効果） 新規なポリペプチドは、ラットでの標準試験（Ｋｕｍｅ
ｒ、　Ｍ、Ａ−ら（１９６５年）　Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ第３３巻、第４６９１いし４７５）Ｊ）に
よシ示される様に、生物学的に有効であり、ナして血漿
中のカルシウムｆｉｋ低下させるために有用である。

しかしながら、われわれの発明のいくりかの実権態様の
みを、具体的に詳細に記述してきたが、多くの他の具体
的な実権態様が実施され、そして多くの変化が加えられ
る可能性がろることは、この分野で熟練した人々には明
白であり、これらすべては本発明の本質および特許請求
の範囲に含まれる。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）カルボキシル末端のプロリンアミドおよびアミノ
   末端の１番目と７番目との間にジスルフィド結合環を有
   する３２個のアミノ酸残基から成り、そして３１番目ま
   たは３２番目またはその両方にＤ−アミノ酸置換基を有
   する生物学的に有効なカルシトニン。
2. （２）Ｄ−アミノ酸置換基が、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリ
   ン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−セリン、Ｄ
   −トレオニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸
   、Ｄ−グルタミン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−メチオニンス
   ルホキシド、Ｄ−メチオニン　スルホン、Ｄ−プロリン
   、Ｄ−ヒドロキシ　プロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギ
   ニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−フェニルアラニンまたはＤ
   −チロシンの残基である特許請求の範囲第１項記載の化
   合物。
3. （３）カルシトニンが、３１番目にＤ−セリンを有する
   サケ１カルシトニンである特許請求の範囲第１項記載の
   化合物。
4. （４）カルシトニンが、３１番目にＤ−トレオニンを有
   するサケ１カルシトニンである特許請求の範囲第１項記
   載の化合物。
5. （５）カルシトニンが、３１番目にＤ−アスパラギンを
   有するサケ１カルシトニンである特許請求の範囲第１項
   記載の化合物。
6. （６）カルシトニンが、サケ、ウナギ、ニワトリ、ウシ
   、ブタ、ヒツジ、ネズミまたはヒトのカルシトニンであ
   る特許請求の範囲第１項記載の化合物。
7. （７）Ｄ−アミノ酸置換基が、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリ
   ン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−セリン、Ｄ
   −トレオニン、Ｄ−アスパラギン酸またはＤ−アスパラ
   ギンの残基である特許請求の範囲第１項記載の化合物。
8. （８）カルシトニンが、３１番目にＤ−セリンを有する
   カルシトニンである特許請求の範囲第１項記載の化合物
   。
9. （９）カルシトニンが、３１番目にＤ−トレオニンを有
   するカルシトニンである特許請求の範囲第１項記載の化
   合物。
10. （１０）カルシトニンが、３１番目にＤ−アスパラギン
    を有するカルシトニンである特許請求の範囲第１項記載
    の化合物。