JPS6248376A

JPS6248376A - 細胞の培養法

Info

Publication number: JPS6248376A
Application number: JP60186140A
Authority: JP
Inventors: Ryuichiro Hata; 畑　隆一郎
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 1985-08-23
Publication date: 1987-03-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、結合組織の細胞の培養法に関する。

従来の技術生体における代謝調節機構の解明に、組織培養法を用い
た研究が盛んになってきている。ヒトを含む霊長類ある
いはモルモット以外の動物は、自らの体内でアスコルビ
ン酸を合成でき、その合成部位は肝臓あるいは腎臓であ
る。これらの臓器の組織の培養には、アスコルビン酸を
添加する必要はないが、これら以外の臓器の培養におい
ては、アスコルビン酸を別途添加する必要がある。

発明が解決しようとする問題点アスコルビン酸は古くから抗壊血病因子、ビタミンＣと
して生体に必須の因子であることが知られているが、こ
のアスコルビン酸には種々の作用があることが知られて
いる［ビタミンＣとかぜ、インフルエンザ、ポーリング
著、村田晃訳、共立出版、１９７７、アナルス・オブ・
ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ
（Ａ　ｎｎａｌｓｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｒ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ）２
５８．１９７５］が、なかでも生体のタンパク質の３０
％を占めるコラーゲンの合成の鍵となるプロリン水酸化
酵素のコファクターであることが明確にされている［プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
ィッ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏ
ｆ　　ｔｈｅ　　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　　
ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ　　ｏｒ　　ｔｈｅ　　Ｕｎ
ｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　　ｏｆＡｍｅｒｉｃａ）（以下
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、と略称することも
ある。）ｉ止、　　３３５（１９６５）］。

近年、生体における代謝調節機構の解明に組織培養法を
用いた研究が盛んになってきている。最近、アスコルビ
ン酸は上記の酵素のコファクター（ｃｏｆａｃｔｏｒ）
としてだけでなく、細胞に対して種々の作用があること
が示唆されてきている。例えば、ホルモン作用の発現の
増強（１）”、線維芽細胞（２゜３）”、平滑筋細胞（
４）”、軟骨細胞（５）１の分化機能の発現における作
用である。

”　（１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

７３．１８３（＋９７６）（２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　Ｕ、Ｓ、Ａ。

Ｌ±、４４５３（１９７７）（３）ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダ
ーマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＩ　ｎＶｅｓｔ
ｉｇａｔｉｖｅ　　Ｄａｒｍｏｔｏｌｏｇｙ）、　７９
　。

（４）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ　ｏ
ｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ
）、　９２　。

（５）セル（Ｃｅｌｌ）、３０．　２１５（１９８２）
しかしながら、上記した肝臓および腎臓以外の臓器の組
織の培養には、アスコルビン酸を添加しなければならな
いが、アスコルビン酸は、組数培養の条件（例、温度３
７℃、溶液状態）では非常に不安定でありかつ高濃度で
は逆に細胞毒性があるので、該組織培養にあたっては、
アスコルビン酸を連続的に添加しなければならない。そ
のため、上述した線維芽細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞な
どの結合組織の培養細胞に対するアスコルビン酸の増殖
９分化９代謝等の研究を進め、さらにこれらの細胞の産
生ずる種々の有用物質［例えばインターフェロン（ＩＦ
Ｎ）−β、ウロキナーゼ等］の産生に有利な条件を作り
出す上において、培地中で安定なアスコルビン酸誘導体
の開発が望まれてきた。

問題点を解決するための手段上記の事情に鑑み、本発明者は、結合組織の細胞を培養
することにより増殖させる方法について種々検討したと
ころ、培地中に、アスコルビン酸に代えてアスコルビン
酸リン酸エステルを添加すると、該アスコルビン酸リン
酸エステルは培地中において安定であり、しかも、有効
な細胞増殖促進効果を育することを見い出した。

本発明者は、これらの知見に基づいてさらに鋭意研究し
た結果、本発明を完成した。

本発明は、結合組織の細胞を培地に培養し該細胞を増殖
させる方法において、アスコルビン酸リン酸エステルを
培地中に添加することを特徴とする結合組織の細胞の培
養法である。

本発明方法において用いられる結合組織の細胞としては
、たとえば線推芽細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、内皮細
胞などが挙げられる。該線維芽細胞としては、たとえば
ヒト皮膚線椎芽細胞、ヒト線維芽細胞、ラット皮膚線椎
芽細胞、鶏胚社線椎芽細胞などが挙げられる。該平滑筋
細胞としては、たとえばヒト動脈平滑筋細胞、ラット動
脈平滑筋細胞などが挙げられる。該軟骨細胞としては、
たとえばラット管端軟骨細胞、鶏胚骨端軟骨細胞などが
挙げられる。該内皮細胞としては、たとえばウシ動脈内
皮細胞、ウシ脳内皮細胞などが挙げられる。

本発明方法において用いられる培地としては、結合組織
の細胞の培養に用いられるものであれば、いずれでもよ
く、特に限定されるものではない。

該培地の例としては、たとえば、ダルベコズ・モディフ
ァイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メゾ
イム（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ）などが有利に用いられる。かか
る培地にはたとえば動物血清、抗生物質などを添加する
のが好ましい。動物血清としては、たとえば牛胎児血清
が好ましく、通常的０．１〜５０％（Ｖ／Ｖ）、好まし
くは約２〜２０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加する。該
抗生物質としては、例えばカナマインン、ベニンリン、
ストレプトマイシンなどが挙げられ、これらを通常的０
．０５〜１ｍｇ／威の濃度となるように加える。

本発明方法において培地に添加されるアスコルビン酸リ
ン酸エステルとしては、たとえばＬ−アスコルビン酸−
２−リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−３−リン酸
エステルなどが挙げられる。

なかでも、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルが
好ましい。

該アスコルビン酸リン酸エステルは、塩の形のものでも
よい。該塩としては、たとえばアルカリ金属塩（例、ナ
トリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例
、カルシウム塩、マグネシウム塩等）などが挙げられる
。

本発明の方法においては、アスコルビン酸リン酸エステ
ルは、培養の初期に培地に添加してもよく、培養の中期
でもよく、また、培養が定常状態となった後に添加して
もよい。なかでも、培養が定常状態となった後に添加す
るのが好ましい。

培地に添加されるアスコルビン酸リン酸エステルの量と
しては、培地中の１度として、約０．Ｏｌないし０．４
ｍＭとなる量、さらに好ましくは約０．０５ないし０．
２ｍＭとなる量である。添加は原則として１度でよいが
、培養日数いかんによって適宜添加回数をふやしてもよ
い。なかでも、約３〜４日毎に培地交換を行なう際に培
地に約０．１ｍＭのアスコルビン酸リン酸エステルを添
加するのが好ましい。

培養の温度、培地のｐＨ１培養時間等の培養条件は、培
養される結合組織の細胞の性質により、適宜選択される
が、培養温度としては、たとえば約３０〜４０°Ｃ３さ
らに好ましくは約３５〜３８℃で行なわれる。培地のｐ
Ｈとしては、たとえば約１）Ｈ６，５〜８、さらに好ま
しくは約７〜７．４が挙げられる。培養時間としては、
たとえば約ｌＯ時間〜１カ月、さらに目的に応じて約２
〜７日間である。

アスコルビン酸リン酸エステルが添加された後、約４８
時間以上培養するのが、培養増殖促進効果をもたらすた
めに、好ましい。

培養の方法としては、静置培養、マイクロキャリヤーを
用いた培養法、ホローファイバーを用いた培養法などが
用いられる。なかでも、増殖促進効果をもたらすために
は、静置培養法で充分である。

バイオプシーによりとり出した皮膚細胞の培養は、アウ
トグロース法（細切した組織を培養皿にはりつけ、培地
を加え、線維芽細胞の運動性により自然に培養皿の中で
広がって増殖する方法。）で増殖させてもよい。

細胞の増殖の程度を測る方法としては、細胞数を血球計
数盤などを用いて直接側る方法や、細胞数の代わりにＤ
ＮＡ含有量を測る方法などが挙げられる。また、間接的
にＲＮＡや蛋白合成などの代謝活性を測る方法も挙げら
れる。特に、線維芽細胞において、プロリンの蛋白質へ
のとりこみ活性は、コラーゲン合成と相関性がみられる
ので、プロリンの蛋白質へのとりこみ活性を測定するこ
とにより、該細胞の分化の程度を推察することができる
。

このように、本発明方法を行なうことにより、結合組織
の細胞の増殖を促進させることができる。

また、本発明の方法を採用すると、結合組織の細胞中の
ＤＮＡｍが向上する。さらに、該細胞中のタンパク質合
成が促進される。

このように、本発明方法を用いると、結合組織の細胞を
効率良く増殖させることができる。

さらに、本発明においては、Ｌ−アスコルビン酸の安定
な誘導体であるし一アスコルビン酸リン酸エステルを用
いることにより、培養細胞、とりわけ各種の結合組繊細
胞の培養による増殖１分化。

代謝等の基礎実験がはるかに有利に進められるだけでな
く、例えばこれら結合組繊細胞の増殖促進効果により、
これらの細胞が産生ずる有用物質を安定した形で生産す
ることを促進することができる。

実施例以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例１Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステル（以下、ｒＡ
ｓ−２−ＰＪと略称することもある。）またはＬ−アス
コルビン酸ナトリウム（以下、ｒ’ＡｓＮａＪと略称す
ることもある。）添加培地を用いる培養によるヒト皮膚
線維芽細胞の増殖促進および分化促進作用：（１）、初代培養とその継代：成人前腕より無菌的に約１０ｍｍ’の皮膚をメスで切り
とり、抗生物質（２５０μＱのファンギゾン。

５０ｍｇ／Ｑのジヒドロストレプトマイシンおよび５０
ｍｇ／ｆ２のペニシリンＧ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ
−０）で洗浄後、カミソリで１ｍｍ”角に細切し培養皿
に入れ、１０分間乾燥させた後、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎
児血清（Ｆｅ２）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−１０）を
加え、３７℃で炭酸ガスふ卵器中で培養し、２〜３日毎
に培養交換を行い、培養皿一杯にまで増殖させた（初代
培＃）。以後、培養液を除き、細胞を洗浄後、トリプシ
ン液を用いて細胞培養皿からはく離させ、適当に希釈し
、新たな培養液を加えて細胞を播種する操作を繰り返し
た（細胞継代）。以下においては、集団倍加数が１０〜
３０回に至ったものを用いた。

（２）、ＡｓＮａまたはＡｓ−２−Ｐ添加培地における
細胞増殖促進− 上記（１）で得られた細胞を直径６ｃｍのシャーレ（フ
ァルコン社製、米国）に播種し、定常状態になるまで培
養を続けた。この時点を培養０日とし、０日と４日後に
ＤＭＥＭ−１０に培地交換を行い、その後、（ｉ）無添
加群、（ｉｉ）０，１．２，３．４日後に最終濃度が０
．１ｍＭとなるように１０ｍＭのＡｓＮａ液（ＤＭＥＭ
−０に溶かしたもの）を加えた群、（ｉｉｉ）０日と４
日に最終濃度が０．１ｍＭとなるようにｌ０ｍＭのＡｓ
−２−ＰのＤＭＥＭ−０溶液を加えた群、の各々につい
て培養を行ない、５日目に培養液を除去し、その後、０
．１％（Ｖ／Ｗ）トリプシン溶液を加え３７℃、２０分
間処理した。その後、ＤＭＥＭ−１０（５Ｍｌ）を加え
て、ピペッティング操作により細胞を分散し、血球計算
盤を用いて細胞数を測定した。結果を表１に示す。表１
から明らかな如く、Ａｓ−２−Ｐの添加により、ヒト皮
膚線維芽細胞数は、非添加の場合に比し、著しく増加し
ていることが分かる。

表Ｉ　　ＡｓＮａ、Ａｓ−２−Ｐ添加培地におけるヒト
皮膚線維芽細胞数の増加（３）、ＡｓＮａまたはＡｓ−２−Ｐ添加培地における
ＤＮＡ合成促進：上記（２）と同様の方法で（２）と同様に３群に分けて
培養を行なった。５日目に培養液を除去し、１０％（Ｗ
／Ｖ））リクロル酢酸（ＴＣＡ）溶液ｌ蔵を用いて培養
皿から細胞を回収し、遠心分離操作を行なった。得られ
た沈殿を懸濁、遠心を繰り返すことにより１０％（Ｗ／
Ｖ）ＴＣＡ溶液で３回洗浄した後、０．２Ｎ−ＮａＯＨ
溶液に溶かした後、害虫のＩＭ−過塩素溶液を加えて３
０分間、７０°Ｃに加熱することによりＤＮＡを抽出し
た。ＤＮＡ量はノアミノ安息香酸を用いた蛍光法で測定
した。

その結果、表２に示したように０．１ｍＭのＡｓ−２−
Ｐ添加によりヒト皮膚線維芽細胞のＤＮＡｌ１（重量）
は非添加群に比べ著しく増加していることが分かる。

表２　ＡｓＮａまたはＡｓ−２−Ｐ添加培地におけるヒ
ト皮膚線維芽細胞のＤＮＡ量の増加（３）、ＡｓＮａまたはＡｓ−２−Ｐ添加培地中でのタ
ンパク質合成の促進：上記（２）と同様の方法で培養し、（２）と同様に３群
に分けて培養する方法において、最後の２４時間は、２
０μＣｉのＬ−［２，３−３８］−プロリン（Ｎｅｗ　
　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ社製、米国）を含
む２産のＤＭＥＭ−１０培地で培養した。培養後、ラバ
ーポリスマンを用いて細胞を培養面からかき取り、培養
液を併せてガラス試験管に移し、１００’Ｃ，１０分間
煮沸することにより、タンパク質分解酵素を失活させた
。その後、０．０５Ｍ−酢酸に対して２日間透析した透
析内液を０．５％タンニン酸を含む１０％（Ｗ／Ｖ）Ｔ
ＣＡ溶液を用いて沈殿させ、沈殿に含まれる放射活性を
測定し、２４時間当たりのタンパク質合成活性とした。

その結果、表３に示したように、０．１ｍＭのＡｓ−２
−Ｐ添加によりヒト皮膚線維芽細胞のタンパク質合成活
性は非添加群と比べ増加し、この効果は、ＡｓＮａを５
日間毎日添加した場合と比べ、はるかに著しいことがわ
かった。

表３　　ＡｓＮａまたはＡｓ−２−Ｐ添加培地によるヒ
ト皮膚線維芽細胞のタンパク質合成の促進発明の効果本発明方法によると、結合組織の細胞の培養に際し、ア
スコルビン酸リン酸エステルを培地に添加することによ
り、該細胞の増殖を促進させることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

結合組織の細胞を培地に培養し該細胞を増殖させる方法
において、アスコルビン酸リン酸エステルを培地中に添
加することを特徴とする結合組織の細胞の培養法。