JPS62265567A - 血液型判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

商−業上の利用分野 本発明はＡｌ３０式血液型判定における、いわゆる［ウ
ラ試験」による血液型判定方法に関する。さらに詳しく
は、ヒト由来の赤血球から得られた赤血球ゴーストを染
色することにより調製した、染色赤血球ゴーストからな
る試薬を用いたＡｌ３０式の血液型判定方法に関する。 従来の技術 Ａ　Ｉ３０式血液型の判定は、被験赤血球上の型抗原を
目早血清を用いて検出する「オモテ試験」と、被験血清
中の抗Ａ、抗Ｂ凝集素を標準商法を用いて検出する「ウ
ラ試験ｊの両方を用いて判定するのが常法である。この
場合「ウラ試験」に必要なＡ型及びＢ型の赤血球は、血
液型の明瞭な人から採取し）゛ニリ、あるいは高価なＡ
型、Ｂ型の市販赤血球′１を萌本１、ｗ人１□ン・ｔ、
のＬ４Ｊ目Ｉｌｌ　　アい乙−１ノ）１１　ム゛ノバら
、これらの方法ではいずれも生きた赤血球を使用するた
め有効期間が３〜・１週間と極めて短期間であること、
またコストら高いこと等、問題点が多く、このことが、
「ウラ試験」の完全な実施を妨げる原因にらなっている
。 また赤血球を用いてウラ試験を行なう場合、Ａ型赤血球
、Ｂ型光血球はともに赤色であり、これらの区別が非常
に困難で誤操作を招く危険がある。 このような欠点を有する現在の赤血球試薬に代わる乙の
として血液型物質を種々の担体に担持させる試みら提案
されている。例えばＡ型、またはＢ型物質を直接ラテッ
クスに担持させたもの（萩原淳嘉、総合臨床上↓、４４
５（１９６５））、酵母菌体に担持させたしの（実繁幸
男、第２７回日本輸血学会要旨集）、また本発明者らが
先に提案したゼオライト粒子に型物質を担持させたもの
（特開昭６０−４０９５８号公報）などがある。これら
は血液型物質を担体に物理的吸着法により担持させたし
のであるが、本発明者らは、さらにラテックス表面に血
液型物質を化学結合により担持さ仕た血液型物質感作ラ
テツクスについてら既に提案しｌ−（特願昭６ｌ−０１
９１３４）。 発明か解決しようとする問題点 しかしながら、これらの従来の血液型物質感作担体は、
血液型物質を粒子表面に担持させる過程で自己凝集を起
こすという根本的な欠点を有する。 すら不）し担体表面に担持された血液型物質が、他の事
、°ξ−ｒ−に対して乙吸着または結合を生ずるため、
血、（！１．型物質を介した粒子同士の架橋が起こりや
すい。その結果、自己凝集が発生しやすくなるという欠
点を有している。 また、物理的吸着により血液型物質を担持させたしのは
、型物質の解離が起こりやすく、その結果、被験血清に
対する凝集力価か低くなる場合がある。。 一方、化学的結合で血液型物質を担持させる場合は、用
いろカップリング剤により血液型物質の型活性の低下を
招くことが多い。 また、一般的に血液型物質感作担体は未感作の担体と比
べ、その表面のＺ　Ｅ　Ｔ　Ａ電位が低下しているため
、保存安定性、粒子の分散性について乙問題点が多く、
未だ満足すべきものは得られていない。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、前記従来試薬の問題点を解決して被験血
清中の抗Ａ、抗Ｂ凝集素を簡便に検出でき、かつ安定で
安価な血液型判定方法を開発すべく鋭き研究を行なった
結果、ヒト由来の染色赤血球ゴーストが抗Ａあるいは抗
Ｂ凝集素と特異的に凝集し、しかも凝集像が鮮明である
ことを見出し、本発明を完成ずろに至った。 ずなわら、本発明は、ヒト由来の赤血球から得た染色赤
血球ゴーストを被験血清に加え、凝集を判定することを
特徴とする血液型判定方法を提供する乙のである。 一般にヒト赤血球はその内容物として、ヘモグ〔Ｊヒン
、酵素蛋白質等を含んでいるが、これを低張液、例えば
Ｉ）Ｈ８の５ｍＭリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
１３ｕｒｒｃｒ、　　以下ＰＩ３と略す）に浸漬：ｌ−
Ｘ　、、ｌ−、、＝−誘ＩＴ’　１．＝　、ｔ　４　Ｙ
　光１１１１５Ｊ２　ＣＩ’）　内宮ａｘ　カｌＩＦ　
由−４−る、いわゆる「バースト」という現象を生ずる
。 かかる内容物の流出した後の細胞膜を「ゴースト」と呼
び、Ａ型の赤血球から得られたものはＡ型の、Ｈ３型の
赤１［ｌ［球から得られたしのはＨ３型の抗原性を白゛
する。 従来このようにして得られた赤血球ゴーストは、ゴース
ト自体についての形状や（１■造白身に関する研究（Ｍ
、Ｓ　　ブルドウナヤら粁、チトロンヤ（Ｍ。 Ｓ、　ｌ１ｒｕｄｎａｙａ　　ａｔ、　ａｌ、、　Ｔｓ
ｉｔｏｌｏｇｉｙａ）、２Ｇ（２）、Ｐ２Ｓ５−１８７
、（１９８４））、およびゴーストの膜電位や性質を蛍
光染料により推定する研究（Ｓ、Ｈ３フラドキーら著、
ジャーナル・オブ・フィジオロキー（Ｓ、ｎ、　ｌ１ｌ
ａｄｋｙ　　ｅｔ、　ａｔ、。 Ｊ　　、　　ｐｔｌｙｓｉｏｌ）、　ン４−」Σ−」ジ
ー（２）、　Ｉフ　１００−１ｏｔ　　、（１９７６）
）に用いた例、あるいは赤血球ゴーストを蛍光色素によ
り染色して、カリウムなどのイ１１モ機イオンの細胞膜
の透過性の研究（１”、Ｊ　　Ｕ　　ノモンズ杵、ジャ
ーナル・才ブ・フィンロノー（１’　、　、１　。 １１、　　Ｓｉｍｏｎｓ、　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　）
、　　２８８　、　■フ　ｌ＋　　８　１　−５（）７
、（１９７９））ｉこ用いｆ二側かめる。 しかしながら、染色赤血球ゴーストを臨床試薬、就中、
血液型物質として血液型判定に用いた例は未だ存在しな
い。 これに対し、本発明者らは、赤血球ゴーストが血液型物
質としての活性を保持しており、しかもこれを染色して
ら十分な活性が保持されるという知見を得、前記「ウラ
試験」に用いる血液型判定用試薬として使用すべく、鋭
意検討を行なった結果、本発明に到達したものである。 以下に本発明の詳細な説明する。 本発明判定方法に用いられる染色赤血球ゴーストを得る
には、赤血球のバーストの前後いずれで染色を行なって
しよい。 赤血球ゴーストを得た後に染色を行なう場合は、先ず、
赤血球ゴーストを製造する。用いろヒト赤血球は血液型
の明瞭な人から採取し、赤血球のＡ型またはＢ型の抗原
性を高めるため、ブロメリン処理を行なう。ブロメリン
処理は等張液、例えば食塩０．８５％を含むｐＨ５、５
の５０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆ
ｆｅｒ　５ｅｌｉｎｅ、以下ＰＢＳと略４゛）にブロメ
リンを溶解し、これに赤血球を分散さＵ゛室温１時間反
応させる。ついで、得られた液を遠心分離して、赤血球
を沈澱として分離し、生理食塩水を加えて、十分に洗浄
を行なう。 このようにして得られた清浄な赤血球を適当な低張液、
例えばｐｕｓの５ｍＭｒ’［３に分散させた後、１：１
び遠心分離して赤血球ゴーストを単離する。 この際、分取したゴーストを酊１８の５１ＭＰｒ３でｊ
；＜洗浄し、赤血球の内容物を除去ずろことが貯蔵安定
性を高める上で非常に重要である。 次にこの赤血球ゴーストを染色する。赤血球ゴーストの
染色は、例えば、ｐＨ５〜ＩＯに調整した生理食塩水、
蒸留水、あるいは、緩衝液中、５〜５０℃で１〜２４時
間、静置、あるいはゆるやかに造拌ずろことにより行な
う。通常、赤血球ゴーストの濃度は０．０１〜５０％（
Ｗ／Ｖ）、染料ｅｌ、ｆは０．００１−１０％（Ｗ／Ｖ
）で行なうのが好まし□い。得られた染色ゴーストは蒸
留水らしくは緩衝液でよく洗浄して染色赤血球ゴースト
を得ろ。 染色に用いられる染料としては、直接染料、酸性染料、
塩基性染料、反応染料、食用色素などが挙げられるが染
色操作の前に熱処理、アルカリ処理、酸処理などの前処
理が必要なものは、赤血球ゴーストの破壊や、血液型抗
原性の低下を招く危険があるので好ましくなく、ｐｉ−
１５〜ｌＯ１染色温度５〜５０℃で赤血球ゴーストに何
らの前処理を加えろことなく使用できろ染料か好ましい
。 本発明において好適に用いられる染料としては、一般的
に組織、細胞の染色や臨床検査に用いられろもの、また
食品、医薬品、化粧品に用いられるものがいずれら好適
に用いうるが、例えばグイニルブルー、　クロラゾール
ブル−３Ｂ、　　ベンゾブルー３１．　　ダイアニルブ
ルー１１３０．　　ニスートラルレッド、　ナフトアミ
ンブルー３ＢＸ、　　ベンゾアミンブルー３Ｂ、　アジ
イミンブルー３［３゜ナイアガラブル−３Ｂ、　　ピロ
ールブルー、バイクルニューレッド、　グイアミンフェ
ストスカーレット、　スーダンＧ１インディアンインク
、　トリパンレッド、　トリパンブルー、　シンナバー
ルスカーレット、　ブリリアントコンゴ−６１ヘシッン
ブリリアントパープル、バイタルニューオレンジ、コン
ゴ−ブルー３Ｂ、　　ジャナスグリーンＩ（、メヂルバ
イオレット、エオシン、エリスロシン、メチレンブルー
、　カルミン、　アザＡ１エバン曵ブルー、コマシブル
ー、　３−フェニルアゾ−２，６−ジアミツピリジン、
アゾプリンＳ、インジゴカルミン、インドシアニングリ
ーン、フェノールスルポンフタレイン、　スルフ十ブロ
モフクレインソディウム、ノイクレアファーストレッド
、４−ヒドロキシアゾベンゼン−２′−カルボキシリッ
クアシド、　アミドブラック１０Ｂ。 ウラニン、　アマランス、　ローズベンガル、　アンド
レッド、　タートラジン、　ブリリアントブルー、　リ
アクティブオレンジＩ４、リアクティブブルー２、ダイ
レクトフェストイエロー１］ｃ１ダイレソトロドイレン
レッドＢ１　クリソフェニン（：などを挙げることがで
きる。 染色の操作の前らしくは後、または染色操作と同１１ｊ
１にンール化を行なってもよい。ンール化、すなわし赤
血球ゴーストを生理食塩水や、食塩０゜８５％を含む適
当な緩衝液中でインキュベートすると元の状態に修復さ
れ、また染色と同時にシール化を行なえば、染料をゴー
スト内に封入することが可能である。 また、染色操作は、赤血球のバースト前に行なってもよ
い。すなわち、先ず赤血球を染色し、得られた染色赤血
球を前記の適当な低張液、例えばｐＩ−ｒｓの５ｍＭＰ
Ｂに分散させることにより赤血球をバーストさけ、染色
赤血球ゴーストを得てもよい。このゴーストはＩ）Ｉ−
１８の５ｍＭＰＢでよく洗浄した後、固定化してらよい
し、シール化してもよい。 さらに、赤血球ゴーストは公知の固定化剤を用いて固定
化処理を行なってもよい。この操作ら染色の前らしくは
後、どちらでも行なうことができる。またシール化、固
定化を行なってから染色してもよい。染色してからシー
ル化し、固定化を行なってもよい。また染色の前にシー
ル化し、染色した後、固定化して０よい。シール化、固
定化操作を加えることによって染色赤血球ゴーストの溝
造を安定化さＵろことができる。 本発明方法に用いられる赤血球ゴーストの固定化剤は、
特に限定されろらのではなく、組織、細胞の固定化剤と
して用いられている乙のであれば、いかなるものら使用
し得る。 かかる固定化剤としては、例えば、グルタルアルデヒド
、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、ピルヒックア
ルデヒドなとのアルデヒド類、トルエン−２，４−ジイ
ソシアネイト、フェニルエチルイソシアネイト、フェニ
ルエチルイソヂオシアネｒト、ヘキザメヂレンジイソシ
アネイト、ジフェニルメタンジイソシアネイトなどのイ
ソンアネイト類の池にタンニン酸、オスミウム酸、塩化
クロム、過酸化水素などが挙げられる。 固定化に用いられる固定化剤の量はその種類によって異
なるが通常、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度のら
のを用いるのが好ましい。 次に前記の方法により染色赤血球ゴーストを得ろ場合の
うち、まず赤血球ゴーストを得て、これを染色し、シー
ル化した後、固定化して染色赤血球ゴーストを得る場合
についてさらに具体的に述べる。 赤血球ゴーストの染色はｐＨ５〜ｌＯに調整した蒸留水
、あるいは、緩衝液中で５〜５０°Ｃで１〜２１１時間
、静置、あるいはゆるやかに攪拌することにより行なう
。通常赤血球ゴーストの濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／
Ｖ）、染料濃度０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）で行なう
のが好ましい。得ら杵た染色ゴーストは蒸留水らしくは
緩衝液でよく洗浄し、染色赤血球ゴーストを得る。つい
で、得られた染色赤血球ゴーストを食塩を０．８５％含
む、ｐＨ８（７〜９）の１）　１３　Ｓ中に分散し、３
０〜４５°Ｃで１時間〜５時間放置してシール化を行な
う。 シール化された染色赤血球ゴーストはその後、固定化剤
を０．１〜５％（Ｗ／Ｖ）含むｐＨ７〜９のＩ）Ｂｓ中
に分散し、５〜４０℃で３０分〜１０時間インキュベー
トすることにより固定化を行なう。 固定化した染色赤血球ゴーストは、ｐｉ−１７〜９の適
当な緩衝液で十分に洗浄し保ｑする。 区（Ｉ：、はｌ）［３、Ｐ　［Ｉ　Ｓ　、またはトリス
（ヒドロキノメチル）アミツメクン−塩酸緩衝Ｋｉ（以
下゛、トリス緩衝液と略ず）中に分散させ保ｒｊずろ。 上記懸濁液中には、染色赤血球ゴーストの自然凝集を防
くため、通常、免疫学的に不活性な化合物、例えば′１
血清アルブミン（以下、ＬＩ　Ｓ　Ａと略す。）を０゜
０１〜１％（Ｗ／Ｖ）を加え、懸濁液の安定化をはかり
、防腐剤として窒化ナトリウム、（ＮａＮ＊）を０．０
１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）を添加する。このようにして保
存された染色赤血球ゴーストは、１年以」−にわたり安
定である。 かくして得られた染色赤血球ゴーストを被検面？＋’ｒ
に加え、・疑集を判定することにより面液型を判定４゛
ろ。 ｆ、１１定、去としては、例えばスライドを去をＩＩ＋
い、＋ｍ清中の抗Ａ１抗Ｂ凝集素を容易に判定し得る。 ４−なイー畳５スライドガラス板上の２ケ所に肢験血清
を各１．山滴下する。一方の彼験商清に＋ｊｉｉ記Ａ型
染色赤血球ゴーストを、他方にＢ型染色糸１１１Ｌ球ゴ
ーストを−・定量、ｖｉ下し、ゆるやかに攪ｎ’　ｌる
。凝集Ｄ有無を判定することにより、数分以内に容易に
血液型を判定することができろ。 及奪鯉 次に本発明方法を製造例及び実施例によってさらに詳細
に説明する。以下において、特にことわらない限り濃度
は（Ｗ／Ｖ）を色味する。また反応に用いた水はすべて
蒸留水である。 製造例！ （イ）Ａ型光血球ゴーストの調製 ヒトＡ型赤血球２３ａＱを生理食塩水で十分に洗浄し、
ブロメリン０．５％を含む５０ｍＭＰ＋３Ｓ（ｐＨ５，
５）２３ｘ（を加える。これを２４℃テ３０分間インキ
エベイトし、Ａ型抗原の活性を高めた。 ついで生理食塩水で十分に洗浄し、４℃の５ｍ〜ＩＰＨ
（ｐｔｌ　８）７００Ｈに分散し、４℃、２０，０００
Ｇで１５分間遠心分離し、上清と沈澱の底にある赤い部
分とを取り除き、赤血球ゴーストを得た。 これを４℃の５ｍＭ　ＰＩ３（ｐＨ８）に分散させ、遠
心分離を行なった。十分に洗浄して、最後に５ｍＭ　Ｐ
　Ｂ　（ｐｉ−１８）にゴーストを分散し、０．４％Ａ
型赤血球ゴースト分散液４５１Ｑを得た。 にｒ）　　染色Ａ型赤血球ゴーストの調製ブリリアント
ブルー（キシダ化学製）を５ｍＭ１’　１１　（ｐｌｔ
　８　）に溶解し、これに前記（イ）により得られｆこ
Ａ型赤＋Ｉｕ球ゴーストを分散さＵ゛た。 この時、各成分の濃度は混合液全体に対して、ブリリア
ントブルー１％、Ａ型赤血球ゴースト０゜０８％となる
ようにした。その後、２３℃で１時間ゆるやかに攪拌を
続は染色を行なった後、遠心分離を行なってゴーストを
分取した。 次に、５ｍＭ　ＰＨ（１）Ｈ８）で十分に洗浄し、最後
に５　ｍＭ　ｆ’　Ｉ）　（ｐＨ８）中に分散して０．
４％の染色Ａ型赤血球ゴーストを得た。これに抗Ａ血清
を加えると凝集反応を起こしたが、抗Ｂ血清では凝集は
認められなかった。 製造例２ （イ）Ａ型赤血球固定化ゴーストの調製グルタルアルデ
ヒドを５ｍＭ　ＰＩ’３（ｐＨ８）に溶解し、これに製
造例１（イ）にて得られたＡ型光血球ゴーストを分散さ
せた。 この時、各成分の濃度はグルタルアルデヒド１％、Ａ型
光血液ゴースト０．０８％とした。ついで、２３℃で１
時間放置し、固定化を行なった後、遠心分離によりゴー
ストを分取して、５ｍＭＰ［３（ｐ’ｌｌ　８　）で十
分に洗浄し、Ａ型赤血球固定化ゴーストを得た。 （ロ）染色Ａ型赤血球固定化ゴーストの調製トルイジン
ブルー（クロマ社製）を５ｍＭｒ’ｌ３（ｐＨ８）に溶
解し、これに前記（イ）により得られたＡ型光血液固定
化ゴーストを分散さＵ゛た。この時各成分の濃度はゴー
スト０．０８％、トルイジンブルー０．５％となるよう
にしｆこ。その後、２３℃で２時間ゆるやかに攪拌を続
けて染色を行ない、ついで遠心分離を行なってゴースト
を分取した。 さらに５　ｍＭ　Ｐ　＋３　（ｐＬＩ　８　）で十分に
洗浄後、最後に５　ｍＭ　Ｐ　Ｂ（１）ＩＩ　８　）中
に分散して、０．４％の染色Ａ型赤血球ゴーストを得た
。これに抗Ａ血清を加えろと凝集反応を起こしたが、抗
Ｂ血清では凝集は認めら札なかっｆこ。 製造例３ （、ｆ）染色Ａ型赤面球ゴーストのＪ、１製メチレンブ
ルー（１へル化学薬品（株）製）を５ＩＩＩＭｆ）、＋
１　（ｐＨ８）に溶解し、これに製造例１（イ）により
得ｌ二Δ型赤面球ゴーストを分Ｉ牧しｌ二。 この時各成分の濃度はメチレンブルー０．５％１、へ欅
１赤血球ゴース１．０　、０８％となるよ・ｊにした。 −Ｊいで、２；３°Ｃで１時間ゆるやかに攪「１！を続
：すて染色を行なった後、遠心分離によりゴーストを分
取し、５　ｍＭ　Ｐ　１３　（１）ＩＩ　８　）で十分
に洗浄して染色Ａ　Ｊｌ′！赤血球ゴーストを得た。 （

【！］染色Ａ型赤穐球固定化ゴーストの調製タルタル
アルデヒドを５　ｍＭ　Ｐ　Ｉ）　（ｐＨ８）に溶解し
、これに前記（イ）により得られた染色ＡノＴ！赤血球
ゴーストを分散さＵ゛た。この時の各成分の濃度は、グ
ルクルアルデヒド１％、ゴースト００８％とした。その
後４３℃で１時間１戊置し、固定化を行なった後、遠心
分離を行ζいゴーストをイ・ｒ取しノニ。次にうＩＩＩ
Ｍ　Ｐ　ｊ（、（ｐＨ８）で１−分に、先浄し、！＋’
＞後に５　ｍＭ　Ｐ　Ｉ（（ｐｔｌ　８　）中に分散し
て０．Ｉ’％’、ａ＞色ｌ＼°町°１赤１０【球固定化
ゴーストを得ｌ二、二１−にｂ’ｔ：Ａ血清を加えると
凝集反応を起こしたが、抗Ｂ血清では凝集は認められな
かった。 製造例４ （イ）　Ａ型光商法シールドゴーストの調製製造例１（
イ）で得られたＡ型光血球ゴーストを５　ｍＭ　Ｐ　１
１　Ｓ　（ｐＨ８）に分散させ、３７℃で１時間インキ
ュベートし、ゴーストのシール化を行なった。この時の
Ａ型光商法ゴーストの濃度は０．０１％となるようにし
た。シール化したゴーストを遠心分離により分取し、５
　ｍＭ　Ｐ　ＩＩＳ　（１）ＩＩ　８　）を加え濃度０
．４％のＡ型赤血球シールドゴーストを得ｊ二。 （ロ）染色Ａ型光血球ンールドゴーストの調製ブリリア
ントブルーを５ｍ〜Ｉ　ＰＩＩＳ（＋）１１８）に溶解
し、ごれに１１１１記（イ）により得られたＡ型光血球
ゴーストを分１牧させた。 この時各成分の濃度は、ブリリアントブルー１％、Ａ型
光血球ンールドゴースト０．０８％となるようにした。 その後２３℃で１時間ゆるやかに攪拌を続け、染色を行
なった後遠心分離を行なってゴーストを得た。次に５　
ｍＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ８）中に分散して、０４％の
染色Ａ型光商法ノールトゴーストを得た。 これに抗Ａ血清を加えると凝集反応を起こしたか抗！】
血清では凝集か認められなかった。 製造例５ グルグルアルデヒドを５　ｍ！ｖｌ　Ｐ　Ｈ３Ｓ　（ｐ
ｔｌ　８　）に溶解し、これに前記製造例４（ロ）にて
得られた染色ｌ＼型型面血球シールドゴースト分散さけ
た。この時各成分の濃度はグルタルアルデヒド１％、染
色Ａ型光血球ソールドゴースト０．０８％となるように
した。その後２３℃で１時間放置し、固定化を行なった
後、遠心分離によりゴーストを分取した。次に５ｍＭ　
ＰＢＳ（＋）＋１８）で十分に洗浄し、最後に５ｍＭ　
ＰＩ３５（１）Ｈ８）中に分散して０．４％染色Ａ型赤
血球固定化シールドゴーストを得た。 ご（ｔに抗Ａ血清を加えると凝集反応を起こしたが抗１
３血清では凝集は認められなかった。 ？Ｊ造例６ （イ）Ａ型光血球固定化ゴースト グルタルアルデヒドを５　ｍＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ８
）に溶解し、これに前記製造例４（イ）にて得られたＡ
型光商法ンールドゴーストを分散した。この時各成分の
濃度はグルタルアルデヒド１％、Ａ型赤血球シールドゴ
ースト０．０８％となるようにした。 その後２３℃で１時間放置し、固定化を行ない遠心分離
によりゴースト（固定化シールドゴースト）を分取した
。 （ロ）染色Ａ型光血球固定化ゴースト 前記（イ）にて得られたゴーストを５ｍＭＰ［３Ｓ（ｐ
ｔｌ　８　）で十分に洗浄し、コマシブリリアントブル
ーＧ−２５０（半ル化学薬品（昧）製）を５ｍＭＰＩＩ
　Ｓ　（ｐｔｌ　８　）に溶解した溶液に分散させた。 この時３成分の濃度はコマシブリリアントブルーＧ−２
５０１％、ゴースト０．０８％となるようにした。その
後２３℃で１時間放置して染色を行ない、遠心分離によ
りゴーストを分取した。次に５ｍＭ　ｌ’　１３　Ｓ　
（１）１１８　）で十分に洗浄後、最後に５ｍＭ１）　
Ｈ３５（ｐＨ−＋　８　）中に分散して、０４％染色Ａ
型赤血球固定化ノールドゴーストを得た。これに抗Ａ　
１ｆｌＬ　ｉｆ’？を加えると凝集反応を起こしたが抗
Ｂ血清では１疑集は認められなかっ１こ。 製造例７ 製ＪＷ例１（ロ）で得られた染色Ａ型光血球ゴーストを
５ｍＭ　　Ｐ［Ｈ５（１）Ｉ−１８）に分散し、３７℃
で１時間インキュベートして、ゴーストのシール化を行
な−ｆこ。この時染色Ａ型光商法ゴーストの濃度は０．
０１％となるようにした。シール化したゴーストを遠心
分離により分取し、５ｍＭＰ１３Ｓ（ｐｔｌ　８　）に
分散し濃度０．４％の染色Ａ型光血球ンールトゴースト
を得た。これに抗Ａ血清を加えろと凝集したが抗Ｂ血清
では凝集は認められなかった。 製造例８ グルタルアルデヒドを５　ｍ？ｖｌ　Ｐ　ｉ３Ｓ　（ｐ
Ｈ−＋　８　）に溶解し、これに製造例７で得られた染
色赤血球ノールトゴーストを分散した。この時各成分の
濃度（ユタルタルアルデヒド１％、染色、〜型染色光血
球ノールドゴースト０．０８％となるよう１こしｆ二。 その後２３°Ｃて１時間放置し、固定化を行ζい、遠心
分離によりゴーストを分取した。次に５ｆｆ１ＭＰ　Ｂ
　Ｓ　（ｐＨ８）で十分洗浄後これを５ｍＭＰｒ３Ｓ（
ｐＨ８）中に分散し、０．４％染色Ａ型赤血球固定化シ
ールドゴーストを得た。これに抗Ａ血清を加えると凝集
したが抗Ｂ血清では凝集は認められなかった。 製造例９ ブリリアントブルーを５ｍＭ　Ｐ［３Ｓ（ｐＨ８）に溶
解し、これに製造例１（イ）で得られたＡ型光商法ゴー
ストを分散さけた。 この時各成分の濃度は、ブリリアントブルー１％、Ａ型
光血球ゴースト０．０８％となるようにした。その後、
３７℃で１時間放置し、シール化と染色とを同時に行な
った後、遠心分離によりゴーストを分取した。次に５ｍ
Ｍ　ＰＩ３５（ｐＩ−１８）で十分に洗浄し、最後に５
ｍＭ　ＰＢＳ（ｐｌ−１８）中に分散して０．４％染色
Ａ型赤血球シールドゴーストを得た。これに抗Ａ血清を
加えると凝集反応を起こしたが、抗Ｂ血清では凝集は認
められなかった。 製造例１０ タルタルアルデヒドを５ｍＭｒコＢ　Ｓ　（ｐｔ＋　８
　）に溶解し、これに前記製造例９て得られた染色Ａ型
光血球ンールドゴーストを分散しｌこ。この時谷成分９
ノ濃度はグルタルアルデヒド１％、染色Ａ型光血球ノー
ルドゴースト０．０８％となるようにした。１その後２
３°Ｃで１時間放置し、遠心分離によりゴーストを分取
した。これに５　ｍＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐｔｔ８）を加
えて十分に洗浄し、最終的に５１Ｍ　ＰＢＳ　（ｐａｌ
　８　）中に分１牧し、Ｑ、／１％１％染型赤血球固定
化ンールドゴーストをｆＯだ。これに抗Ａ血清を加えろ
と凝集を起こしたか、抗Ｂ血清では凝集は認められなか
った。 製造例１１ （イ）Ｂ型光血球ゴーストの調製 ヒ＋−ｎ型赤血球２５ｍＱを生理食塩水で十分に洗浄し
ブロメリン０．５％を含む５０　ｍＭ　Ｆ’　Ｂ　Ｓ　
（ｐｌ−１５，５）２５ｏ２を加えろ。これを製造例巨
イ）と同様に処理し、０１，１％Ｂ型赤型光ゴースト分
散液５０晃９を得た。 （ロ）染色Ｂ型光血球ゴーストの調製 タートラジン（早耳化学薬品（味）製）を５ｍＭＰｒ３
（ＰＩ１８）に溶解し、これに前記（イ）により得られ
たＢ型光血球ゴーストを分散さけた。 この時各成分の濃度は混合液全体に対して、タートラジ
ン２％、Ｂ型光血球ゴースト０．０８％となるようにし
た。その後２４℃で１時間ゆるやかに攪拌を続は染色を
行なった後、遠心分離によりゴーストを分取した。次に
５　ｍＭ　Ｐ　Ｈ（１）ｔｌ　Ｂ　）で十分に洗浄し、
最後に５　ｍＭ　Ｐ　１１　（ｐｌ−ｔ　８　）中に分
散して、０．４％の染色Ｂ型光血球ゴーストを得た。こ
れに抗ｎ１ｆｕ清を加えろと凝集反応を起こしたか、抗
Ａ血清では凝集は認められなかった。 製造例１２ （イ）１１型赤面球固定化ゴーストの調製前記製造例１
２（イ）にて得られたＢ型光血球ゴース］−を製造例２
（イ）のＡ型赤血球ゴーストの場合と同様に固定化処理
してＢ型光ｌｒＩ′１球固定化ゴーストを得ｒ二。 （ｒ＋）？ｈｒｂ１１刀ｋ１７＋ｒｎＴ：Ｑ＠者了イレ
１’−７に／７”＋１：１．Ｉ？ｌＩｉタードラノンを
５ｍＭ　Ｐｒ３（ｐＩ［８）に溶解し、これにｎＱ記（
イ）にて得られた■３３型赤血固定化ゴーストを分散−
Ｑｔ　ｄ゛た。この時各成分の濃度はゴースｌ−０，０
８％、クートラノン２％となるようにした。その後、前
１定製造例２（Ｃ７）と同様に処理して染色を行ない、
０４％の染色１３型赤血球ゴーストを得た。 これにｂＴ、　Ｂ　Ｌｆｌｌ　ｔ＋’ｔを加えると凝集
反応を起こしｒ二か、抗Ａ　１ｌｉｌ清では凝集は認め
られなかったっ製Ｊ告例１３ （イ）　　［３型赤ぼ■球ンールドゴーストのｊＡｌ製
製造例＋１（イ）で得られた１３′！Ｊ、赤血球ゴース
トを用いた以外、製造例４（イ）と同様に７−ル化処理
を行ない８度０，４％の１３型赤血球ノール）・ゴー　
ス　１・　をｉリノこ。 ｆ：ｏ）　　染色Ｂ型光血球ノールドゴーストのＪＡＩ
製プロ７オンイエＣ１−ＭＸ−４Ｒ（セルハ′ｆＬ装）
を５　ｍ’ｘｌ　Ｐ　＋３５　（ｐａｌ８　）に溶解し
、これに１ｉｉｊ記（イ）にて得られた１３　！ｌ；ｌ
！赤Ｉｆｌ１球ノールトゴーストを／、バクぢＵｌ、・
為この時各１戊分の濃度はプロ７才ノイエヮ−、２％、
Ｂ型光血球ンールドゴースト、０．０８％となるように
した。その後前記製造例１１　（ロ）と同様に処理して
染色を行ない、０．１１％染色Ｂ型赤血球シールドゴー
ストを得た。 これに抗Ｂ血清を加えると凝集反応を起こしたが、抗Ａ
血清では凝集が認められなかった。 製造例１４ 前記製造例＋３（ロ）にて得られた染色Ｂ型光血球シー
ルドゴーストを用いた以外、製造例５と同様の処理して
染色、固定化を行ない、０．４％染色Ｂ型赤＋Ｉｕ球固
定化ソールドゴーストを得た。 これに抗１３面清を加えろと凝集反応を起こしたが抗Ａ
血清では凝集は認められなかった。 製造例１５ 製造例ＩＩＣ口）で得られた染色Ｂ型光商法ゴーストを
用いた以外、製造例７と同様のシール化処理を行ない、
濃度０．４％の染色Ｂ型光血球ノールドゴーストを得た
。 これにｔｉＴ、Ｂ［ｆｌＬ清を加えろと凝集したか、抗
Ａ血清では凝集は認められなかった。 製造例１６ ナフトールエ（７−Ｓ　（大和化工製）を５　ｍＭ　Ｐ
　１３Ｓ　（ｐＨ８）に溶解し、これに製造例１１（イ
）で得られた１３型赤ｌ（１【球ゴーストを分散させた
。この時、各成分の濃度はナフトールエロー８２％、Ｉ
３型型光球ゴースト０１０８％となるようにした。その
後、１１「１記製造例９と同様に処理（同時ソール化、
染色）して０．４％染色Ｂ型赤ばｌ【球ンールドゴース
！・を得た。 これに抗Ｂ血ｌＩ７を加えると凝集反応を起こしたが抗
Ａ血清では凝集は認められなかった。 製造例１７ 前記製造例１６で得られた染色Ｂ型光血球ンールドゴー
ストを用た以外、製造例ＩＯと同様の固定化処理を行な
い、０．４％染色１３型赤血球固定化ノールドゴースト
を得た。 これに抗Ｂ血清を加えると凝集を起こしｆこが抗Ａ血清
では凝集は認められなかった。 製造例１８ ヒトＡ型赤血球！０λＱを生理的食塩水で十分に洗浄し
、ブロメリン０．５％を含む５０ｍＭＰＢＳ　（ｐＨ５
，５）　Ｉ　Ｏｍ（ｌを加え、２４℃で３０分間インキ
ュベートし、Ａ型抗原の活性を高めた。 ついで生理的食塩水で十分洗浄した後、コマシブリリア
ントブルーＧ−２５０（牛丼化学薬品（株）製）０５％
を含む５ｍＭ　ＰＢＳ（ｐＨ８）に分散さｔ）３７°Ｃ
で１時間インキュベイトした。ついでこの染色赤血球を
生理食塩水で十分に洗浄し、４℃の５ｍＭ　ＰＩ３５（
１）ｔ１８）４００ａ（！に分散することによりバース
トさせた。ついで、４℃、２０．０００Ｇで１５分間遠
心分離し、染色赤血球ゴーストを得た。これをｌピＣの
５　ｍＷＩ　　Ｐ　１３　（ｐＨ８）に分散させて遠心
分離を行ない十分に洗浄し、最後に５　ｍＭ　Ｐ　ｌ　
（ｐｌ＋　８　）Ｌ：染色ゴーストを分散さｕ・０゜・
１％染色Ａ型赤１［１［球ゴースト２５！ＩＱを得た。 これに抗Ａ　１１１１清を加えろと凝集反応を起こした
が、抗Ｉ〕血清で（よ凝集は認められなか１ｆコ。 製）吉例Ｉ９ グルタルアルデヒドを５　ｍＭ　Ｐ　Ｂ（ｐｌｆ　８　
）に溶Ａ型赤血球ゴーストを分散した。この時各成分の
濃度はグルタルアルデヒド１％、ゴースト０．０８％と
なるようにした。その後、２４６Ｃで１時間放置し固定
化を行ない、遠心分離によりゴーストを分取した。次に
５　ｍＭ　Ｐ　１３　（ｐＨ８）で十分に洗浄し、最後
に５ｍＭ　ＰＢ（ｐｌ−１８）に染色ゴーストを分散さ
Ｕ・、０．４％染色Δ型固定化ゴーストを得ノニ。 こイ１に抗Ａ血清を加えると、凝集反応を起こしたか抗
［３血清では凝集は認められなかった。 製造例２０ 製造例１８で得られた染色Ａ型光商法ゴーストをＩＩ＋
いた以外、製造例７と同様のシール化処理を行ない、濃
度０．４％の染色Ａ型シールドゴーストを得た。 これに抗Ａ血清を加えると凝集反応を起こしたが抗【１
血清では凝集が認められなかった。 実施例１（スライド法による面液、’、Ｆｌ＋判定）＋
ｉｉｊ記製造例１Ｏで得られｊ二染色７〜型光血球固定
化ノールドゴースｌ−及び製造例１７て得られた染色Ｂ
型赤血球固定化シールドゴーストを用いてスライド法に
より血液型の判定を行なった。 以下、実施方法及び結果を示す。スライドガラス板上の
２ケ所に被験血清を１滴ずつ滴下し、次いで、一方に染
色Ａ型赤血球固定化シールドゴーストを、他方に染色Ｂ
型赤血球固定化シールドゴーストを１滴ずつ滴下する。 数分間ゆるやかに攪拌した後、凝集の有無を判定した。 このようにして被験血清２５例について得られた結果を
第１表に示す。第１表中、＋は凝集を生じたもの、−は
凝集が生じなかったことを示す。 第１表より明らかなごとく、本発明で得られた染色Ａ型
光商法ンールドゴーストによるウラ試験の結果は、オモ
テ試験の結果と完全に一致した。 さらに、製造例１〜９および１８〜２０で得られた染色
Ａ型赤血球ゴースト、並びに製造例ＩＩ〜１６で得られ
た染色Ｂ型赤血球ゴーストを各種組合わせて、前記と同
様スライド法による各種血清の血液型の判定を行なった
結果、何れの組合わせの場合らオモテ試験と一致した結
果が得られた。 発明の効果 本発明方法にて用いろ染色赤血球ゴーストは、ヒト由来
の赤血球ゴーストを染色することにより調製された試薬
であり、従来の血液型物質をラテックスなどの担体に担
持させて調製した血液型物質担持粒子が有する非特異的
凝集の発生、及び血液型物質の解離といった欠点が極め
て少ない。また本発明の染色赤血球ゴーストは、被験血
清に対して非常に高い凝集力価を示す。さらに、現在ウ
ラ試験に用いられているヒト赤血球と比較すると、ヒト
赤血球の有効期間は３〜４週間であるに対し、本発明に
て用いられろ染色赤血球ゴーストの有効期間は１年以上
であり、その間安定した保存が可能である。しノこかっ
て、本発明方法においては、確実かつ安定した血液型判
定結果が安価に得られる。 さらに、赤血球を用いろ場合は、溶血現象を生ずるため
使用向ｉｉに十分な洗浄を行なう必要があるのに対し、
本発明方法では、染色赤面味ゴーストに対してそのよう
な操作を行なう必要が全くない。またヒトの赤血球を用
いる場合、Ａ型赤血球、１げ°１赤血球はい４“°れ乙
回し赤色であり、区別がつかず判定時に誤操作を招く可
能性かあるのに対し、本発明方法では、使用する染色赤
血球ゴーストをＩＩＩ　Ｌ　１だ染料の色によりＡ型試
薬とＢ型試薬とに区別し得るため、１τ（操作を防＋Ｌ
Ｌで判定の安全性を高めることかできる等、本発明の染
色赤血球ゴースＩ・による血液型？Ｉｌ定方決方法来の
方法に比べて（変れた点が多い。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト由来の赤血球から得た染色赤血球ゴーストを
   被験血清に加え、凝集を判定することを特徴とする血液
   型判定方法。
2. （２）染色赤血球ゴーストが、赤血球を染色した後にバ
   ーストを行なって得た赤血球ゴーストである前記第（１
   ）項の方法。
3. （３）染色赤血球ゴーストが、赤血球ゴーストをシール
   化及び／または固定化を行なった後に染色して得たもの
   である前記第（１）項の方法。
4. （４）染色赤血球ゴーストが、赤血球ゴーストを染色し
   た後にシール化及び／または固定化を行なって得たもの
   である前記第（１）項の方法。
5. （５）染色赤血球ゴーストが、赤血球ゴーストを染色す
   ると同時にシール化を行なって得たものである前記第（
   １）項の方法。
6. （６）染色赤血球ゴーストが、赤血球ゴーストをシール
   化すると同時に、またはシール化した後染色し、その後
   固定化したものである前記第（１）項の方法。