JPS62164696A - ＨＴＬＶ−３ｇａｇ遺伝子の発現 - Google Patents
ＨＴＬＶ−３ｇａｇ遺伝子の発現Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の背頽
レト「１ウイルスＩ」Ｔ Ｌ Ｖ −Ｉ［［および本ウ
ィルス近縁の変異種ＬＡＶおよび△ＲＶは侵天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物体と考えられる（ Ｂａ
ｒｒ６−３ｉｎｏｕｓｓｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２
２０ 巻、８６８−８７１頁（１９８３年）；Ｌｅｖｙ
ら、５ｃｉｅｎｃｅ２２５巻、８４０−８４２頁（１９
８４年）；ＨＯｎｔａｇｎｉＯｒら、Ｉｔ、 Ｃ，Ｇ
ａ１ｌｏ 、Ｈ，Ｅｓ５ｃｘおよび［。 Ｇｒｏｓｓ編集Ｉ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ
／Ｌｙｍｐｈｏｍａ ＶｉｒｕｓＪ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｂｏｒ 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｂｏｒ にｆｉ究所突所、
３６３−３７０頁（１９８４年） ＨＰｏｐＯＶｉＣら
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４巻、４９７−５００頁（１９
８４年）：Ｇａ１ｌｏら、５ＣｉｅｎＣ０２２４巻、５
００−５０３頁（１９８４年）；５ｃｂｉｉｐｂａｃｈ
ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４巻、５０３−５０５頁（
１９８４年）〕。ＡＩＤＳとＨＴＬＶ−■に対する抗体
との間には強い関連性がある。さらに、リンパ腺症候群
患者の８５−９５％、ＡＩＤＳ流行地域の無症候性男性
同性愛者の多くの人がＨＴ Ｌ Ｖ −Ｉ［［に対する
抗体を血液中に保有しているＣ ５ｃｈｊｐｂａｃｈら
、前述、を参照〕。 ＨＴＬＶ−Ｉ［１の抗体は汚染した注射側による薬剤静
脈注射により本疾患にかかった患者や、静脈血液生成物
の投与を受けた血友病患者にも広く検出される。現時点
の予想ではおよそ１００万人のアメリカ人がこのウィル
スに感染しており、その中のおよそ１０％がこの致死性
疾患にかかつていると考えられる。 ＨＴＬＶ−ＩＩＩおよびその変異種の分子クローニング
およびＪ！ｉ 基配列分析にＪ：す、本ウィルスゲノム
は鳥類および哺乳類のレトロウィルスの構造特色の多く
ヲ示ｔ Ｃｌ１ａｔＵＯｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１
３巻、２７７−２８４頁（１９８５年） ： ５ａｎｃ
ｈｅｚ−Ｐａｓｃａｄｏｒら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
７ ｉ、４８／ｌ−／１９２頁（１９８５年） ； Ｍ
ａｉｎ−１１ｏｂｓｏｎら、Ｃｅ１ｌ ４０巻、９−
１７頁（１９８５年）およびＨ，Ｈｕｅｓｉｎｇら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１３巻、４５０−４５８頁（１９８５
年）参照）。即ち、本ウィルス遺伝子は全てのレトロウ
ィルスの特徴である３つの遺伝子＜ＱａＱ、Ｅ）０７お
よびｅｎｖ）を含有している。 それに加えて、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子は未だ機能がわ
かっていない２つの短い翻訳フレームを含有している。 ＡＩＤＳの効果的封じ込めは、ＨＴ Ｌ Ｖ −ＤＩに
接触あるいは感染した個人を判定Ｊるための感度が長く
迅速な方法およびウィルスの複製を阻害する療法剤の６
１発に依存している。ウィルス遺伝子の一つＱａＣＪは
ウィルス粒子の成熟期にたん自分解作用を受けて核たん
白となる前駆体をコードしている。ＤＮＡ配列および単
離したウィルス蛋白質の分析から、ＨＴＬＶ−１０ａＧ
前駆体は５６Ｋｄであり、およそ２４．１６および１４
Ｋｄの分子種にプロセスされると考えられる（ Ｒａｔ
ｎｃｒら、前述； ５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ
ら、前述： Ｗａｉｎ−１１ａｂｓｏｎら、前述；Ｊ３
よびＨｕｅｓｉｎｇら、前述）。このプロセスに関与す
るプロテアーゼはレトロウィルスゲノムにより］−ドさ
れる典型的なものである。この遺伝子は鳥類レトロウィ
ルスでは０８ｇ３Ｆｆ伝子の３′末端に、哺乳類レトロ
ウィルスではｐｏＩ遍伝子の５′末端に存在する（ Ｄ
ｉｃｋｓｏｎら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ （たん白質生
合成と集合）：”Ｒ，＾、 Ｗｅｉｓｓ 、 Ｎ、’Ｈ
。 ｒｅｉｃｈ 、 Ｉｌ、 Ｅ、 ｖａｒｍｕｓＪ３よび
Ｊ、 Ｈ，Ｃｏｆｆｌｎ編集”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ８
ｉｏｌｏｏｙ ｏｒ丁ｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ （ガ
ンウィルスの分子生物学） ” （ＣＣ０１ｄＳｐｒ
ｉｎ ｌ１ａｒｂｏｒ（Ｊ）突所；Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ、 Ｎ、 Ｙ、 ５１３−６４Ｚ
貞（１９８２年）の総説参照のこと〕。少なくちと哺乳
類しＩ・
ィルス近縁の変異種ＬＡＶおよび△ＲＶは侵天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物体と考えられる（ Ｂａ
ｒｒ６−３ｉｎｏｕｓｓｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２
２０ 巻、８６８−８７１頁（１９８３年）；Ｌｅｖｙ
ら、５ｃｉｅｎｃｅ２２５巻、８４０−８４２頁（１９
８４年）；ＨＯｎｔａｇｎｉＯｒら、Ｉｔ、 Ｃ，Ｇ
ａ１ｌｏ 、Ｈ，Ｅｓ５ｃｘおよび［。 Ｇｒｏｓｓ編集Ｉ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ
／Ｌｙｍｐｈｏｍａ ＶｉｒｕｓＪ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｂｏｒ 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｂｏｒ にｆｉ究所突所、
３６３−３７０頁（１９８４年） ＨＰｏｐＯＶｉＣら
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４巻、４９７−５００頁（１９
８４年）：Ｇａ１ｌｏら、５ＣｉｅｎＣ０２２４巻、５
００−５０３頁（１９８４年）；５ｃｂｉｉｐｂａｃｈ
ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４巻、５０３−５０５頁（
１９８４年）〕。ＡＩＤＳとＨＴＬＶ−■に対する抗体
との間には強い関連性がある。さらに、リンパ腺症候群
患者の８５−９５％、ＡＩＤＳ流行地域の無症候性男性
同性愛者の多くの人がＨＴ Ｌ Ｖ −Ｉ［［に対する
抗体を血液中に保有しているＣ ５ｃｈｊｐｂａｃｈら
、前述、を参照〕。 ＨＴＬＶ−Ｉ［１の抗体は汚染した注射側による薬剤静
脈注射により本疾患にかかった患者や、静脈血液生成物
の投与を受けた血友病患者にも広く検出される。現時点
の予想ではおよそ１００万人のアメリカ人がこのウィル
スに感染しており、その中のおよそ１０％がこの致死性
疾患にかかつていると考えられる。 ＨＴＬＶ−ＩＩＩおよびその変異種の分子クローニング
およびＪ！ｉ 基配列分析にＪ：す、本ウィルスゲノム
は鳥類および哺乳類のレトロウィルスの構造特色の多く
ヲ示ｔ Ｃｌ１ａｔＵＯｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１
３巻、２７７−２８４頁（１９８５年） ： ５ａｎｃ
ｈｅｚ−Ｐａｓｃａｄｏｒら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
７ ｉ、４８／ｌ−／１９２頁（１９８５年） ； Ｍ
ａｉｎ−１１ｏｂｓｏｎら、Ｃｅ１ｌ ４０巻、９−
１７頁（１９８５年）およびＨ，Ｈｕｅｓｉｎｇら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１３巻、４５０−４５８頁（１９８５
年）参照）。即ち、本ウィルス遺伝子は全てのレトロウ
ィルスの特徴である３つの遺伝子＜ＱａＱ、Ｅ）０７お
よびｅｎｖ）を含有している。 それに加えて、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子は未だ機能がわ
かっていない２つの短い翻訳フレームを含有している。 ＡＩＤＳの効果的封じ込めは、ＨＴ Ｌ Ｖ −ＤＩに
接触あるいは感染した個人を判定Ｊるための感度が長く
迅速な方法およびウィルスの複製を阻害する療法剤の６
１発に依存している。ウィルス遺伝子の一つＱａＣＪは
ウィルス粒子の成熟期にたん自分解作用を受けて核たん
白となる前駆体をコードしている。ＤＮＡ配列および単
離したウィルス蛋白質の分析から、ＨＴＬＶ−１０ａＧ
前駆体は５６Ｋｄであり、およそ２４．１６および１４
Ｋｄの分子種にプロセスされると考えられる（ Ｒａｔ
ｎｃｒら、前述； ５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ
ら、前述： Ｗａｉｎ−１１ａｂｓｏｎら、前述；Ｊ３
よびＨｕｅｓｉｎｇら、前述）。このプロセスに関与す
るプロテアーゼはレトロウィルスゲノムにより］−ドさ
れる典型的なものである。この遺伝子は鳥類レトロウィ
ルスでは０８ｇ３Ｆｆ伝子の３′末端に、哺乳類レトロ
ウィルスではｐｏＩ遍伝子の５′末端に存在する（ Ｄ
ｉｃｋｓｏｎら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ （たん白質生
合成と集合）：”Ｒ，＾、 Ｗｅｉｓｓ 、 Ｎ、’Ｈ
。 ｒｅｉｃｈ 、 Ｉｌ、 Ｅ、 ｖａｒｍｕｓＪ３よび
Ｊ、 Ｈ，Ｃｏｆｆｌｎ編集”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ８
ｉｏｌｏｏｙ ｏｒ丁ｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ （ガ
ンウィルスの分子生物学） ” （ＣＣ０１ｄＳｐｒ
ｉｎ ｌ１ａｒｂｏｒ（Ｊ）突所；Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ、 Ｎ、 Ｙ、 ５１３−６４Ｚ
貞（１９８２年）の総説参照のこと〕。少なくちと哺乳
類しＩ・
【」ウィルスの一種、モ［に−・ネズミ白血病
ウィルス（ＭｕＬＶ）では、このプロテアーゼは（Ｊａ
Ｑ−ｐｏｌの連続翻訳生成物である。本プロテアーゼを
阻害できる療法剤はウィルスの繁殖を阻止するであろう
。従ってｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ −■ゲノム上でこのプロ
テアーゼ領域を決定し、ｇａｇ道伝子前駆体の蛋白質分
解能を調べられる系をｆｄ発することが重要である。 １−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ−１ゲノムは既に分子りＵ−ニング
されている。（Ｓｈａｗら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２６巻
、１１６５−１１７１頁（１９８４年）〕。また、１４
−ｒ Ｌ Ｖ −１［［のプロウィルスゲノムの全ＯＮ
Ａ Ｉｕ基配列も決定されている（ＲａｔｌｌＯｒら
、＋ｉａ ３１ ：おにび５ａｎｃｈｃｚ−Ｐｅｓｃａ
ｄｏｒら、前述〕。 ＡＩＤＳの原因物質を決定するのが困難である一つの理
由は、種々のレトロウィルス抗原とＡＩＤＳ患者の血清
試料との反応性にある。例えば、ＡＩＤＳｔＭ？ｊ（７
）血清試料ハＨｒ Ｌ Ｖ−１ｄ３よびトＩＩＩの抗原
と反応することがわかっている（ＨＴＬＶ−Ｉ ：Ｅｓ
５ｅｘら、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ Ｃｅ１ｌ Ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ Ａｕｔｉｇｃｎｓ Ａｓ５ｏｃｉａｔ
ｅｄ ｗｉｔｈｔｌｕｍａｎ Ｔ−ｃａｌｌ Ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗ
ｉｔｈＡＩＤＳ（ＡＩＤＳ患台中の、ヒトＴ−細胞白血
病ウィルスに関連した細胞膜抗原に対する抗体） ”
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０巻、８５９−８６２頁（１９
８３年） ； ＨＴ Ｌ Ｖ −ｍ ： Ｓａｒｎｇ
ａｄｈａｒａｎら、“八ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅａ
ｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ Ｉｌｕｍａｎ Ｔ−Ｌｙ
ｎ＋ｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ！１ｅｔｒｏｖｉｒｕｓｃｓ
（ＨＴ Ｌ Ｖ −ｍ ） １ｎｔｈｅ Ｓｅｒｕｍ
ｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａ Ｉ Ｄ
Ｓ 。 （ＡＩＤＳ患者血清中の、ヒトＴ−型内リンパ性しトロ
ウィルス（ＨＴ Ｌ Ｖ−１＞に反応性の抗体） ’
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４巻、５０６−５０８頁（１９
８４年）〕。＋１Ｔ Ｌ Ｖの遺伝子産物は成人Ｔ−細
胞白面病患者からの血清中抗体と反応性のアル抗原性を
示した（Ｋｉｙｏｋａｗａら、”Ｅｎｖｅｌｏｐｅｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｌｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌ
ｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ：［ＸｐｒｅＳ
ＳｉＯｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ａｎｄ １ｔｓａｐｐｌｉｃａ口ｏｎ ｔｏ ５ｔｕｄ
ｉｅｓ ｏｆ ｃｎｖ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ
（ヒト丁−細胞白血病ウイルスの外被たん白：大賜菌で
の発現とｅｎｖｌｌ伝ｉ能の研究への応用）”、ＰＮＡ
Ｓ （ＬＪＳＡ）、８１０．６２０２−６２０６頁（１
９８４年）〕。成人ニー細胞白血病（Ａ Ｔ Ｌ ’）
と後天性免疫不全症候群（Ａ ＩＤＳ＞、！：はＨＴＬ
Ｖ−Ｉが’ｒ−細胞の悪性化を起す、即ら、■−細胞の
非制御繁殖を起ず点で異なる。ＡＩＤＳにおいては細胞
増殖ではなく、細胞死滅が起る。事実、１］Ｔ Ｌ Ｖ
−１［１のこの細胞病変の特徴は本病のし１〜ロウイ
ルスの特定原因を究極的に決定するのに重要であった。 即ち、ＡＩＤＳの原因物質は、ＡＩＤＳ患各から？ＩＩ
ＩＩＩＩＩシたΔ１０８に特有の細胞病変レトロウィル
スに感染した死滅ヒト新形成ニー細胞株（ＨＴ）を使用
して単離された。本ウィルスを用いた血清疫学的検査の
結果、ＡＩＤＳとＨＴ Ｌ Ｖ−Ｉｌｌ抗ＩＧｔニ対す
る抗体の存在とが完全に相関していることがわかった（
Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎら、前述（１９８４年）：
５ｃｈｊｉｐｂａｃｈら、前述〕。その上、リンパ腺症
候群のほとんど８５％の患者およびＡＩＤＳ流行地域の
無症候性男性同性愛者の多くの人が血液中にＨＴＬＶ−
ＩＩ［の抗体を有することもわかった。これらの事より
、１１ Ｔ Ｌ Ｖ −１［［がＡＩＤＳの起固体であ
ると言える。 ト１−９細胞株を用いたＡＩＤＳウィルスの培養に成功
するまではＡＩＤＳウィルスのＱａＱたん白質の単離、
特徴づけおよび合成はされていない。 これは主としてウィルスが細胞応性を示し、従ってウィ
ルスの単離ができなかったことに起因する（Ｈ，Ｐｏｐ
ＯＶｉＣら、前述〕。ひと度ウィルスの細胞毒性に抵抗
性を示すヒトＴ−細胞株が見つかったため、プロウィル
スＤＮＡの分子クローン化が出来たのである。 ヒト血液のＡＩＤＳ診断のための感度が高く迅速な方法
およびワクチンにＪ：るＡＩＤＳの予防の必要性は多大
である。現在用いられている全ての測定／試験法はｌ；
りに満らている。事実、Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｄｉｓｅ
ａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＣＤ Ｃ、疾患コントロー
ルセンター）は現在用いられている試験は血液単位のＨ
Ｔ Ｌ Ｖ −１［［に対する抗体をスクリーニングす
るためのみのらのであるとしている。ＣＤＣはさらに、
現在使用されているＥＬＩＳＡテス１−は危険性の高い
集団の一般的スクリーニングやＡＩＤＳの診断テストに
は使用できないと述べている（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇ
ｉｓｔｅｒ ５０巻（４８号）、９９０９頁、１９８
５年３月１２日）。誤りというのはＡＩＤＳの起固体に
特有の抗原性たん白質を用いていない点に起因する。従
来使用されている蛋白質はウィルスの溶解抽出物に由来
するものである。この抽出物はウィルスに感染したヒト
細胞、即ち、ウィルスを増殖するのに用いた細胞、がら
調製しているため抽出物はウィルス蛋白質のみでなくヒ
ト蛋白質も含イｉしている。従ってウィルス蛋白質の純
粋な抗原を調製するのは非常に困難である。使用した抗
体は偽陽性、偽陰性の結果を早り゛る（ Ｓ、 Ｂｕｄ
ｉａｎｓｋｙ、△ｌ ＤＳ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ 、
ｒａＩｓｃ Ｔｅ５ｔ Ｒｅ５ｕｌｔｓ Ｒａ１ｓｅ
ＤｏｕＭｓ （Ａ Ｉ Ｄ Ｓのスクリーニング、
誤った試験結果は疑問〉、Ｎａｔｕｒｅ ３１２巻、
５８３頁（１９８／Ｉ年）〕。 このような抽出蛋白質／ペプチドの使用により起る誤り
はＡＩＤＳ構体と結合させるのに非ＡＩＤＳ型蛋白質の
混在しない成分を用いることで防ぐことができる。実質
的に純粋なＡＩＤＳ０ａＧ−たん白質の成分を抗原とし
て用いることができる。 発明の要約 本発明にＪ：ると発明者らは組換え技術を用いることに
より１１丁ｍＶ−ＩＩＩｇａｇたん白質の前駆体の免疫
的活性部分おにびこのｇａ９たん白質に山来覆る天然型
蛋白分解前駆体の免疫的活性部分く以下１−Ｉ Ｔ Ｌ
Ｖ −１［１のｑａｏ−蛋白質生成物に免疫学的に同
等なポリペプチドとも叶ぶ）を製造した。さらに発明者
らは、これらの全てのたん白質を発現することのできる
種々の発現ベクターを用いてこれらのたん白質／ポリペ
プチドを発現することの出来る組換え微生物を構築した
。本発明による組換え技術により、ＱａＱの５６Ｋｄ蛋
白質前駆体のアミノ酸末端のＮ−末端コトンを除去し、
しかも天然のｇａｇたん白前駆体と同じ免疫活性を有す
ものを１１する。前駆体を上述の改変することにより、
そのたん自分前生成物である１４Ｋｄのυａｇ蛋白質ら
天然型１４Ｋｄ ＱａＱ蛋白質のアミノ酸末端で改変
している。しかしながら、この改変ｇａｇ蛋白質も天然
型と同じ免疫活性を右°する。本発明によるとまた、（
ＪａＱ蛋白質の天然前駆体と同じ免疫活性を有する新し
いｐ４８蛋白質が生産される。本発明による方法により
生産される１６Ｋｄのたん自分前生成物はＳｂａｗら（
前）ホ）により報告されている１６Ｋｄ ｇａｇ蛋白
質分解生成物とアミノ酸構造に変異がある。２４ Ｋｄ
の蛋白質分解生成物は天然に存在する２４Ｋｄ蛋白質分
解物と同じである。 本発明により生産される５５ｋｄ、２４．１６および１
４Ｋｄ ＱａＧたん白質は夫々対応１゛る天然のｇａ
ｇ蛋白質と同じ免疫活性を有する。これらは対応する天
然蛋白質と同じ抗体と反応する同じエピトープを有Ｊる
。同じエピトープを有する。 ２ｋＲ明によると、５６Ｋｄ（７）ＩＩＴＬＶ−ＩＩＩ
ａａＯ蛋白負Ｊ３よびそれに由来Ｊ°る分解蛋白質、１
１ち、それぞれ２４．１６および１４Ｋｄの蛋白質を生
産するために組換えＤＮＡ技術を利用して（Ｘる。本発
明の最初のステップでは、ＨＴＬＶ−！［［レトロウィ
ルスとして知られている遺伝子から１］Ｔ Ｌ Ｖ −
ＩＩのｐａｐたん白質をコードするＤＮＡ配列を含む部
分を単離し、この部ｊｋ ｈ’らトＩＴＬＶ−ＩＩＩの
ｇａｇたん白質をコードするＤＮＡ配列がこのＤＮＡ配
列を発現させることの出来るプロモーターと機能的に連
結した遺伝子を構築し、本遺伝子を発現ベクターまたは
プラスミドに挿入し、そのベクターまたはプラスミドを
適当な微生物、好ましくはＦｌｉ母細胞、に導入し、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩのｑａｑ蛋白質の活性部分を発現できる
微生物を作成】る。本発明によれば、組換え微生物は天
然ＱａＣＪたん白前駆体と免疫学的に同等な蛋白質を発
現するのみでなく、１）４駆休蛋白質で発現覆るたＩυ
自分解酵素により処即された蛋白質分子種す発現する。 本発明にはさらに、本発明による組換え微生物の変異に
より生成する５６．４８．２４．１６および１４に（１
蛋白質の配列のアミノ酸着換体をも包３する。これらの
たん白質の配列中のアミノｈす置換体は、それぞれ改変
を受
ウィルス（ＭｕＬＶ）では、このプロテアーゼは（Ｊａ
Ｑ−ｐｏｌの連続翻訳生成物である。本プロテアーゼを
阻害できる療法剤はウィルスの繁殖を阻止するであろう
。従ってｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ −■ゲノム上でこのプロ
テアーゼ領域を決定し、ｇａｇ道伝子前駆体の蛋白質分
解能を調べられる系をｆｄ発することが重要である。 １−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ−１ゲノムは既に分子りＵ−ニング
されている。（Ｓｈａｗら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２６巻
、１１６５−１１７１頁（１９８４年）〕。また、１４
−ｒ Ｌ Ｖ −１［［のプロウィルスゲノムの全ＯＮ
Ａ Ｉｕ基配列も決定されている（ＲａｔｌｌＯｒら
、＋ｉａ ３１ ：おにび５ａｎｃｈｃｚ−Ｐｅｓｃａ
ｄｏｒら、前述〕。 ＡＩＤＳの原因物質を決定するのが困難である一つの理
由は、種々のレトロウィルス抗原とＡＩＤＳ患者の血清
試料との反応性にある。例えば、ＡＩＤＳｔＭ？ｊ（７
）血清試料ハＨｒ Ｌ Ｖ−１ｄ３よびトＩＩＩの抗原
と反応することがわかっている（ＨＴＬＶ−Ｉ ：Ｅｓ
５ｅｘら、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ Ｃｅ１ｌ Ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ Ａｕｔｉｇｃｎｓ Ａｓ５ｏｃｉａｔ
ｅｄ ｗｉｔｈｔｌｕｍａｎ Ｔ−ｃａｌｌ Ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗ
ｉｔｈＡＩＤＳ（ＡＩＤＳ患台中の、ヒトＴ−細胞白血
病ウィルスに関連した細胞膜抗原に対する抗体） ”
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０巻、８５９−８６２頁（１９
８３年） ； ＨＴ Ｌ Ｖ −ｍ ： Ｓａｒｎｇ
ａｄｈａｒａｎら、“八ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅａ
ｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ Ｉｌｕｍａｎ Ｔ−Ｌｙ
ｎ＋ｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ！１ｅｔｒｏｖｉｒｕｓｃｓ
（ＨＴ Ｌ Ｖ −ｍ ） １ｎｔｈｅ Ｓｅｒｕｍ
ｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａ Ｉ Ｄ
Ｓ 。 （ＡＩＤＳ患者血清中の、ヒトＴ−型内リンパ性しトロ
ウィルス（ＨＴ Ｌ Ｖ−１＞に反応性の抗体） ’
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４巻、５０６−５０８頁（１９
８４年）〕。＋１Ｔ Ｌ Ｖの遺伝子産物は成人Ｔ−細
胞白面病患者からの血清中抗体と反応性のアル抗原性を
示した（Ｋｉｙｏｋａｗａら、”Ｅｎｖｅｌｏｐｅｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｌｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌ
ｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ：［ＸｐｒｅＳ
ＳｉＯｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ａｎｄ １ｔｓａｐｐｌｉｃａ口ｏｎ ｔｏ ５ｔｕｄ
ｉｅｓ ｏｆ ｃｎｖ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ
（ヒト丁−細胞白血病ウイルスの外被たん白：大賜菌で
の発現とｅｎｖｌｌ伝ｉ能の研究への応用）”、ＰＮＡ
Ｓ （ＬＪＳＡ）、８１０．６２０２−６２０６頁（１
９８４年）〕。成人ニー細胞白血病（Ａ Ｔ Ｌ ’）
と後天性免疫不全症候群（Ａ ＩＤＳ＞、！：はＨＴＬ
Ｖ−Ｉが’ｒ−細胞の悪性化を起す、即ら、■−細胞の
非制御繁殖を起ず点で異なる。ＡＩＤＳにおいては細胞
増殖ではなく、細胞死滅が起る。事実、１］Ｔ Ｌ Ｖ
−１［１のこの細胞病変の特徴は本病のし１〜ロウイ
ルスの特定原因を究極的に決定するのに重要であった。 即ち、ＡＩＤＳの原因物質は、ＡＩＤＳ患各から？ＩＩ
ＩＩＩＩＩシたΔ１０８に特有の細胞病変レトロウィル
スに感染した死滅ヒト新形成ニー細胞株（ＨＴ）を使用
して単離された。本ウィルスを用いた血清疫学的検査の
結果、ＡＩＤＳとＨＴ Ｌ Ｖ−Ｉｌｌ抗ＩＧｔニ対す
る抗体の存在とが完全に相関していることがわかった（
Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎら、前述（１９８４年）：
５ｃｈｊｉｐｂａｃｈら、前述〕。その上、リンパ腺症
候群のほとんど８５％の患者およびＡＩＤＳ流行地域の
無症候性男性同性愛者の多くの人が血液中にＨＴＬＶ−
ＩＩ［の抗体を有することもわかった。これらの事より
、１１ Ｔ Ｌ Ｖ −１［［がＡＩＤＳの起固体であ
ると言える。 ト１−９細胞株を用いたＡＩＤＳウィルスの培養に成功
するまではＡＩＤＳウィルスのＱａＱたん白質の単離、
特徴づけおよび合成はされていない。 これは主としてウィルスが細胞応性を示し、従ってウィ
ルスの単離ができなかったことに起因する（Ｈ，Ｐｏｐ
ＯＶｉＣら、前述〕。ひと度ウィルスの細胞毒性に抵抗
性を示すヒトＴ−細胞株が見つかったため、プロウィル
スＤＮＡの分子クローン化が出来たのである。 ヒト血液のＡＩＤＳ診断のための感度が高く迅速な方法
およびワクチンにＪ：るＡＩＤＳの予防の必要性は多大
である。現在用いられている全ての測定／試験法はｌ；
りに満らている。事実、Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｄｉｓｅ
ａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＣＤ Ｃ、疾患コントロー
ルセンター）は現在用いられている試験は血液単位のＨ
Ｔ Ｌ Ｖ −１［［に対する抗体をスクリーニングす
るためのみのらのであるとしている。ＣＤＣはさらに、
現在使用されているＥＬＩＳＡテス１−は危険性の高い
集団の一般的スクリーニングやＡＩＤＳの診断テストに
は使用できないと述べている（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇ
ｉｓｔｅｒ ５０巻（４８号）、９９０９頁、１９８
５年３月１２日）。誤りというのはＡＩＤＳの起固体に
特有の抗原性たん白質を用いていない点に起因する。従
来使用されている蛋白質はウィルスの溶解抽出物に由来
するものである。この抽出物はウィルスに感染したヒト
細胞、即ち、ウィルスを増殖するのに用いた細胞、がら
調製しているため抽出物はウィルス蛋白質のみでなくヒ
ト蛋白質も含イｉしている。従ってウィルス蛋白質の純
粋な抗原を調製するのは非常に困難である。使用した抗
体は偽陽性、偽陰性の結果を早り゛る（ Ｓ、 Ｂｕｄ
ｉａｎｓｋｙ、△ｌ ＤＳ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ 、
ｒａＩｓｃ Ｔｅ５ｔ Ｒｅ５ｕｌｔｓ Ｒａ１ｓｅ
ＤｏｕＭｓ （Ａ Ｉ Ｄ Ｓのスクリーニング、
誤った試験結果は疑問〉、Ｎａｔｕｒｅ ３１２巻、
５８３頁（１９８／Ｉ年）〕。 このような抽出蛋白質／ペプチドの使用により起る誤り
はＡＩＤＳ構体と結合させるのに非ＡＩＤＳ型蛋白質の
混在しない成分を用いることで防ぐことができる。実質
的に純粋なＡＩＤＳ０ａＧ−たん白質の成分を抗原とし
て用いることができる。 発明の要約 本発明にＪ：ると発明者らは組換え技術を用いることに
より１１丁ｍＶ−ＩＩＩｇａｇたん白質の前駆体の免疫
的活性部分おにびこのｇａ９たん白質に山来覆る天然型
蛋白分解前駆体の免疫的活性部分く以下１−Ｉ Ｔ Ｌ
Ｖ −１［１のｑａｏ−蛋白質生成物に免疫学的に同
等なポリペプチドとも叶ぶ）を製造した。さらに発明者
らは、これらの全てのたん白質を発現することのできる
種々の発現ベクターを用いてこれらのたん白質／ポリペ
プチドを発現することの出来る組換え微生物を構築した
。本発明による組換え技術により、ＱａＱの５６Ｋｄ蛋
白質前駆体のアミノ酸末端のＮ−末端コトンを除去し、
しかも天然のｇａｇたん白前駆体と同じ免疫活性を有す
ものを１１する。前駆体を上述の改変することにより、
そのたん自分前生成物である１４Ｋｄのυａｇ蛋白質ら
天然型１４Ｋｄ ＱａＱ蛋白質のアミノ酸末端で改変
している。しかしながら、この改変ｇａｇ蛋白質も天然
型と同じ免疫活性を右°する。本発明によるとまた、（
ＪａＱ蛋白質の天然前駆体と同じ免疫活性を有する新し
いｐ４８蛋白質が生産される。本発明による方法により
生産される１６Ｋｄのたん自分前生成物はＳｂａｗら（
前）ホ）により報告されている１６Ｋｄ ｇａｇ蛋白
質分解生成物とアミノ酸構造に変異がある。２４ Ｋｄ
の蛋白質分解生成物は天然に存在する２４Ｋｄ蛋白質分
解物と同じである。 本発明により生産される５５ｋｄ、２４．１６および１
４Ｋｄ ＱａＧたん白質は夫々対応１゛る天然のｇａ
ｇ蛋白質と同じ免疫活性を有する。これらは対応する天
然蛋白質と同じ抗体と反応する同じエピトープを有Ｊる
。同じエピトープを有する。 ２ｋＲ明によると、５６Ｋｄ（７）ＩＩＴＬＶ−ＩＩＩ
ａａＯ蛋白負Ｊ３よびそれに由来Ｊ°る分解蛋白質、１
１ち、それぞれ２４．１６および１４Ｋｄの蛋白質を生
産するために組換えＤＮＡ技術を利用して（Ｘる。本発
明の最初のステップでは、ＨＴＬＶ−！［［レトロウィ
ルスとして知られている遺伝子から１］Ｔ Ｌ Ｖ −
ＩＩのｐａｐたん白質をコードするＤＮＡ配列を含む部
分を単離し、この部ｊｋ ｈ’らトＩＴＬＶ−ＩＩＩの
ｇａｇたん白質をコードするＤＮＡ配列がこのＤＮＡ配
列を発現させることの出来るプロモーターと機能的に連
結した遺伝子を構築し、本遺伝子を発現ベクターまたは
プラスミドに挿入し、そのベクターまたはプラスミドを
適当な微生物、好ましくはＦｌｉ母細胞、に導入し、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩのｑａｑ蛋白質の活性部分を発現できる
微生物を作成】る。本発明によれば、組換え微生物は天
然ＱａＣＪたん白前駆体と免疫学的に同等な蛋白質を発
現するのみでなく、１）４駆休蛋白質で発現覆るたＩυ
自分解酵素により処即された蛋白質分子種す発現する。 本発明にはさらに、本発明による組換え微生物の変異に
より生成する５６．４８．２４．１６および１４に（１
蛋白質の配列のアミノ酸着換体をも包３する。これらの
たん白質の配列中のアミノｈす置換体は、それぞれ改変
を受
【）た基のたん白質と免疫学的に同等の改変たん白
質である。これらのアミノ酸置換体は文献の記載されて
おり（Ｈ。 ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ，Ｌ、 １ｌｉｌｌ、” Ｔ
ｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１：ん白質）″、＾ｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎａｗ Ｗｏｒｋ （１９７
９年）〕、特にＡ１頁の第６図に記載されて６する。 最も頻繁に見られるアミノ酸置換番よ、Ａｊ！ａ／Ｓｅ
ｒ、Ｖａ１／１７ｅ、Ａｓｐ／ＧＪ！ｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅ
ｒ、Ａ１ａ／Ｇ１＠、Ａｊ！ａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓ
ｎ、Ａｊ！ａ／Ｖａｎ！、Ｓｅｒ／ＧＪ！！、 Ｔｙｒ
／Ｐｈｅ。 Ａｊ！ａ／Ｐｒｏ、ＬＶＳ／Ａｒ０１ＡＳｒ：）／Ａ
Ｓ ｎ 、 Ｌ ｅ ＬＪ ／ Ｉ １ ｅ 、 Ｌ
ｅ Ｕ ／ Ｖ ａ Ｉｔ 。 Ａ１ ａ／ＧＡ ｕ、Ａｓ Ｏ／Ｇ１１およびそ。逆、
ある。 本発明はさらに、ヒト血液につ０てｇａｑ蛋白質および
その分解蛋白質に対する抗体の存在をテストする診斯法
に係わるものである。木兄ＩＩＩ１のこの点により、従
来のＡＩＤＳ血液テストの１１■題点を解決できる。Ａ
ＩＤＳウィルスを試験管内で検出する時の一つの問題点
は、ＡＩＤＳの起因物？１のみに出来していないたん白
質やペプチドを含まない成分を供給する点である。ｇａ
９蛋白質の活性部分またはその分解蛋白質を用いた成分
を使用することにより、従来のテストや測定の非特宍性
を解決できる。しかも、本発明ではヒト血液中の抗原を
検出および／または測定する方法をも提供する。 本発明のもう一つの態様は、組換えｇａｇ蛋白質もしく
はそれに由来する分解蛋白質を抗原として用い、ヒト検
体試料についてＡＩＤＳを検出できる抗体を提供するこ
とである。 本発明のもう一つの態様として、組換えＱａＱ蛋白質も
しくはそれに由来する分解蛋白質をＡＩＤＳウィルスに
対する保護免疫を誘発できるワクチンとして用いること
がある。投与方法、抗原品、投与回数などは個々に箕な
るが、他のウィルス感染に対する免疫法で用いられてい
る方法に準する。ワクチンは公知の方法によって調製で
きる。ワクチン成分は便宜的に、生理的に容認できる担
体物！１と混ぜられる。ワクチン成分はアジュバントあ
るいは他の免疫応答促進剤を含有できる。 さらに、ワクチン成分はＡＩＤＳに加えて他の疾患に対
する免疫を誘発する他の抗原を含むこともできる。 ヒト血液についてＡＩＤＳウィルスまたはＡＩＤＳウィ
ルスに対する抗体の存在をテストする方法は、本発明に
より提供される組換え９８ｇ蛋白質またはそれに由来す
る本発明により提供される分解蛋白質、或いは本発明の
これらのたん白質により誘導されるＡＩＤＳウィルスに
対する抗体を容器に含む適当なキットを用いて行なうこ
とができる。 図面の簡潔な記述 第１Δ図はＨＴＬＶ−１ウイルスの遺伝子クローンとし
て知られるλＨＸＢ−３の制限ｗ９素切断部位と、木遣
信子の０８ｇ領域を拡大して前駆体（ｐ５６）およびそ
の天然分解生成たん白質（ｐ２４、ｐ１６およびｐ１４
）、さらにその変異たん白（ｐ４８）を示す。 第１Ｂ図はＨＴＬＶ−ＩＩＩのｇａｇ−ｍ信子およびプ
ロモーターを含み、後にプラスミドにｈＦ入する遺伝子
の構築を示ず。 第２図はＤＹＥ７２／ＱａＱ１を含む酵母培養物から冑
られた抽出物の免疫プロット分析である。 カラム１は高りん酸培地中で培養した細胞から、カラｌ
ｘ ２はりん酸鼻含有培地で培養した細胞からのらので
ある。分子ａマーカーの分子量を数字で示しである。 第３図はＣＪａＱプラスミドｐＹＥ７２／ＱａＱ１を保
有する酵母細胞を３５８−メチオニン中の培４物の免疫
法でん抽出後ＳＤＳゲルオートラジＡグラフの経時的変
化である。カラム八かららＧはチェイス時間の変化を表
わす。カラム１」はｐＹＥ７２／ＦａＱ１を保有する酵
母細胞を３２ｐｏ４存在下で培養し、４５分後に集菌し
た抽出物の結果を示し、カラム■はカラムＧとｆ’；Ｉ
じ操作をｇａｇ遺伝子を持たないプラスミドを保有りる
酵母細胞につき行なった結果である。 第４図はｇａｇ遺伝子の各種変異により得られた酵母抽
出物の免疫ブに１ット分析である。免疫プロットは破砕
１−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ −ＩＩＩに対り゛るウリ１ニ抗体
（第４図へ）あるいはＡＩＤＳ患者の血清（第４図Ｂ）
に対して行なった。Ａ、Ｂ共、カラム１はＤＹＥ７２／
ＱａＱ１で誘導したｌｌＩＩＩ１からの抽出物、カラム
２はｐＹＥ７２／ＣＪａＱ２により誘導した細胞からの
抽出物、カラム３はｐＹＥ７２／ＱａＱ３により誘導し
た細胞抽出物の結果を示す。 第５図はλＨＸＢ３のＱａｏ／ｐｏ１重複領域のＤＮＡ
配列である。ｇａりのカルボキシル末端のコード領域お
よびｐＯｉのアミノ末端のコード領域を示す。他の９ａ
Ｑプ【コテアーゼと一致する領域［ｒｏｈら、Ｎａｔｕ
ｒｃ３１５巻、６９１頁（１９８５年）］を下線で示す
。ｐｏ１遺伝子がＢＣｊ！Ｉ充填によりシフトした翻訳
１ツクを矢印で示す。図中のピリオド（ｒ、Ｊ）は翻訳
終了部位を示す。 第６Ａ図はＤＹＥ７２／ｇａｑｌで誘導した酵母細胞抽
出物により調製した抗原を用いた免疫プロット分析を示
ず。各カラムは米国東海岸に住む異なるＡＩＤＳ患者か
らの血液試料である。 第６Ｂ図は第６−Ａ図同じもので米国西海岸の患者の試
料である。 第７図は本発明により生産される５６ＫｄＱａＱ蛋白質
前駆体を］−ドするＯ Ｎ Ａ Ｉ’ｉｉ！ ｕＪを示
す。 第８図は本発明により生産される５６Ｋｄｑａｇ蛋白質
前駆体のアミノ酸配列を示す。 第９図は本発明により生産される蛋白質分解２４ Ｋｄ
ＣＪ ａ ＣＪ ｍ白質ヲコードするＤＮＡ配ｕＪ
を示す。 第１０図は本発明により生産される２４ＫｄＩＣん自分
ＷＣＪａＣＪ蛋白質のアミノ酸配列を示寸。 第１１図は本発明により生産されるたん自分前１６Ｋｄ
（ＪａＣＪ蛋白質をコードするＤＮＡ配ダ配合１す
。 第１２図は本発明により生産される１６Ｋｄ／こＩυ自
分解ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列を承り。 第１３図は木、発明により生産される蛋白ｔ１分解１４
Ｋｄ ｇａＯ蛋白質をコードするＤ Ｎ Ａ Ｆｉｉ
ｌ！ ｕＪを、示す。 第１４図は本発明により生産される１４Ｋｄ蛋白質分解
ｇａり蛋白質のアミノ酸配列を示す。 第１５図は本発明によりｑ：産される４８Ｋｄ分解Ｑａ
ｆ；Ｊ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を示す。 第１６図は本発明により生産される４８Ｋｄたん自分解
ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列を示す。 本発明の詳細な記述 記載中用語は以下の定義による： ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、りん酸およびプ
リンまたはピリミジン塩基（含窒ヘテロ環）より成るＤ
ＮＡの単量体ユニット。塩基は糖部分とグリコシド炭素
（ペントースの第−ｉＡ素）を介して結合している。塩
基と糖の組合Ｕをヌクレオチドと呼ぶ。ヌクレオチドは
その塩基により性質が決まる。四つの塩基はアデノシン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（ｒＣＪ）
およびチミン（ｒＴＪ ）である。 ４：隣接するペントースの３′および ５′炭素の間のりん酸ジエステル結合により互いに連結
するヌクレオチドの一次配列。 コドン：ｍＲＮＡを通して個々のアミノ酸、翻訳開始シ
グナルまたは翻訳終了ジグプルをコードする３ヌクレオ
ヂド（トリブレット）のＤＮＡ配列。例えば、ヌクレオ
チドトリブレットＴＴへ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ１Ｃ
Ｔ△およびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（ｒＬｅｕＪ ）
をコードする。 ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳終了シグナル、ΔＴ
Ｇは翻訳開始シグナルである。 翻訳ワク： ｍ ＲＮＡのアミノ酸配列への翻訳の過程
でのコドンのグループ。ｖＡ訳中では適当な翻訳ワクが
保持されなくてはならない。例えば、配列ＧＣＴＧＧＴ
ＴＧｒＡ八Ｇは三種のＩＩ翻訳ワク翻訳され１！ｔ、夫
々１“シなったアミノ酸配列を示１”：ボリベプヂド：
隣接するアミノ酸のα−アミノＬ！どカルボ１シル！：
４の間のベブブド結合によりｎいに連結するアミノ酸の
一次配列。 ゲノム：細胞或いはウィルスの全ＤＮＡ。オペレーター
、プロモーターおよびリボゾーム結合配列、シャインー
ダルガーノ配列のような配列を含む相互作用配列はもと
より、特に物質ポリペプチドをコードする構造遺伝子を
含む。 １及１血ユニ鋳型或いはメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲ
ＮＡ）を介して特定ポリペプチドに特有のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列。 Ｌ￥：構造遺伝子からｍＲＮＡを生成する過程。 １１謂：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成する過程。 象コニ構造遺伝子がポリペプチドを生成するまでの過程
で、転写と翻訳の組合せである。 ム之λユ上：微生物の主染色体の一部ではない環状二重
鎖ＤＮＡ分子であり、特定の抗生物質に対する耐性の遺
伝子を含む。プラスミドが甲細胞生物に挿入されるとそ
の生物の性質がプラスミドＤＮＡの結果として変化、ま
たは転換する。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝ｒ
（Ｔｅｔｌｌ）を保有覆るプラスミドはテトラリイクリ
ン感受竹細胞を耐性なｉｌｌ胞に変換する。プラスミド
により変換した細胞を「形質転換株」と貯ぶ。 クローニングベクター：宿主細胞中で御製可能であり、
−個または数個の制限酵素部位を有し、その部位でＤＮ
Ａが切断されても必須な生物機能、例えば複製や外膜た
ん白金酸、の欠失、或いはプロモーターや結合部位の欠
失が起らず、形質転換細胞を確認するのに利用できるマ
ーカー、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリ
ン耐性、をイｉするプラスミド、ファージＤＮＡ或いは
他のＤＮＡ配列。クローニングベクターはよくベクター
と呼ばれる。 クローニングニ一つの微生物または一つの配列から微生
物またはＤＮＡ配列の集団を無性生殖で得ること。 組換えＤＮＡ分子または箱秤ＤＮＡ ：生絹外で末端同
志結合した責なるゲノムからのＤＮＡ断片より成る分子
で、ある宿主細胞に感染してその中に保持される能力を
有すもの。 ペプチドまたはたん白を定義するのに用いる命名はお通
の方法により、Ｎ−末端のアミノ基が左側に、Ｃ−末端
のカルボニ１シル基が右に記される。 ＡＪ！ａ、Ｖａｊ！、ｌｅｕ、＋１ｅ、３ｅｒ。 １−ｈｒｌｔ−ｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、 Ａｓｎ。 Ｇｊ！ｕＳＧ１ｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒＳ
Ｐｒｏ、Ｔｒｐおよび）（ｉｓより成る。 アミノ酸に責性体が存在する際には、記載しない限りＬ
−型を表わす。さらにアミノ酸を以下のアルファベット
文字によって命名している：Ａ＝アラニン；Ｄ＝アスパ
ラギンｌＮＮ−アスパラギン：Ｃ＝システィン；Ｅ−グ
ルタミン酸；Ｆ−フェニルアラニン；Ｇ＝ニブリシンＨ
＝ヒスチジン；１＝イソロイシン；に＝リジン：Ｌ＝ロ
イシン；Ｍ＝メチＡニン：Ｐ＝ニブロリンＱ−グルタミ
ン：Ｒ−アルギニン：Ｓ＝セリン：Ｔ＝スレオニン；Ｖ
−バリン；Ｗ−トリプトファン：Ｙ−チロシン。 本発明によると、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の
原因となる蛋白質を検索した結果、ＡＩＤＳウィルスの
プロウィルス遺伝子の配列を単離した。本発明によって
、ＡＩＤＳのｐ想される原因物質であるリンパ腺症関連
ウィルス（ＬＡＶ） 、Ａ ＩＤ５ｆｌｌ連レトロウイ
ルス（ＡＲＶ）およびヒトニー細胞白山病／リンパ腫／
向リンパ性ウィルス（Ｈす Ｌ Ｖ−１）が同じウィル
スの変異株であることをはじめて明らかにした。本発明
および特許請求の範囲の目的において、水引ｌｆｆ１中
ではＡＩＤＳを起重ウィルスをＨＴＬＶ−ＩＩＩウィル
スと叶ぶ。ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩＩウィルスはＡＩＤＳ
の原因物質として考えられている変異株、即ら、ＬＡＶ
おにびＡＲＶを包含するものである。 第１図に水型ようにｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ −ＩＩＩのゲ
ノム、即らλＩＩ Ｘ Ｂ −３、は知られており、Ｑ
ａ Ｑ−蛋白質、ｐｏｌ−蛋白質、５ｏｒ−蛋白質お
よび１ンベロープ（ｅｎｖ）−蛋白質をコードする領域
を含んでいる。ｇａｇ−蛋白質をコードするゲノム領域
は５．５ｋｂのＥｃｏＲＩ１ｇｉ片領域、もっと詳しく
はＧｌａＩからＢＣＪ！ Ｉまでの領域に存在する。 本発明による蛋白τ１を得る目的で、本発明においては
ＨＴ Ｌ Ｖ −１［［遺伝子を一個またはそれ以上の
ｆｌ、ＩＩ限解素で切断し、ＱａＱ蛋白質をコードする
遺伝子を含む断片を得た。得られる断１１をプロモータ
ーと連結してプロモーターがｇａｑ蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列と機能的に結合して存在する遺伝子を作成す
る。この結合の際に、後に宿主中で発現した時に蛋白質
のアミノ末端に改変が生じるようになる。次に、プロモ
ーターとトＩ Ｔ Ｌ Ｖ−ｍのｑａｑ蛋白質をコード
するＤＮＡ配列を有する遺伝子をプラスミド或いは適当
な宿主微生物中で複製可能な発現ベクターに挿入し、プ
ロモーターとＩ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ−ＩＩＩのｑａａ−蛋
白質をコードするＤＮＡ配列とを機能的に連結して保有
する。プラスミド或いは発現ベクターを作製する。 現在の技術では、本発明に適切な多くのプロモーター系
および適当な微生物宿主が入手可能である。また、Ｈ丁
ＬＶ＝Ｉ［ＩのＯａ Ｑ蛋白質を＝１−ドする遺伝子を
挿入することのできる各秤プラスミドらある。一般には
、宿主細胞と適合性のある種に由来する複製および調節
配列を有するプラスミド発現ベクターをその宿主と組合
せて用いる。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉはＥ、ｃｏｌｉ山来
の由来スミドｏ Ｂ Ｒ３２２を用いて形質転換するこ
とが多い。酵母を用いる場合、例えばＳ、ｃｃｒｃｖｉ
ｓｉａｅではｐＹＥ ７の、ようなプラスミドが通常利
用される。 本発明によれば、使用りる宿主およびプラスミドと適合
したどんなプロし一ターでも利用できる。 Ｅ、ｃｏｌｉでの組換えＤＮＡ構築に用いるプロモータ
ーとしては、Ｃｈａｎ（Ｊら、ＮａＬｕｒｃ２７５巻；
６１５頁（１９７８年）、板０ら、５ｃｉｅｎｃｅ 、
１９８巻：１０５６頁（１９７７年）に記載されてい
るβ−ラクタマー４４（ペニシリナーピ）およびラクト
ースプロモーター、Ａｕｄｃｒｓｃｎら、Ｈｏ１．Ｃｅ
１．Ｂｉｏｌ、３巻： ５６２−５６９頁（１９８３年
）に記載されているプロモーター系、およびＧＯｅｄｄ
（ｊ ｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｉｔｅｓ、
８巻：４０５７頁（１９８０イ１）おＪ：びＥＰＯＰＯ
３Ｈｏ、００３６７７６に記載されているトリプトファ
ンプロモーターなどがある。ＡＷＩの場合はＢｒｏａｃ
ｌｒらのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｏｎ ｏｒ Ｇｅｎｅ ［ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （１
９８３年）中、［８，Ｉｎｏｕｙｅ ｍ集、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｉ’ｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ、Ｙ ］
８３−１１７頁に総説されているＡＤＣｌ、ＧＡＬｌ、
ＧＡＬＩＯ１ｒ’ＨＯ５、ＰＧＫｌおよびＧＡＰＩなど
が用いられるが、これらに限定されるものではない。以
上に挙げたもオヂド配列も報告されていて関連技術に熟
練している名はそれらを機能的に連結して形質転換ベク
ター中で遺伝子と相互作用できるように作成することが
出来る［５ｉｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅ１ｌ、 ２Ｏｆｆ
、２６９頁（１９８０年）］。 二重鎖ＤＮＡをクロ−ニグするためには広い範囲の宿主
／クローニングベクターの組合ゼを用いる。例えば、有
用なりローニングベクターとは、例えばｐＢＲ３２２の
ようなＥ、ｃｏｌｉプラスミド、ファージＤＮＡ、ファ
ージＤＮＡを使用するよう改変したプラスミドのような
プラスミドとファージＤＮＡ組合せに由来するベクター
、他の発現調節配列或いは酵母プラスミドなど、染色体
ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡおよび合成りＮＡ配列より成る
。 有用な宿１としては微生物、動物ＩＩＯ胞、植物細胞等
が含まれる。中でも微生物および動物細胞が好ましく使
用される。好ましい微生物としては、Ｓ、 ｃｃｒｃｖ
ｉｓｉａｅのような１ｆｆｌおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｔｃａｒ。 ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ＩｕｓおよびＡｃｔ １ｖｏａｉ
ｙｃｃｓのようなバクテリアがある。上述のベクターお
よび宿↑は本発明で生物的に得られる遺伝子から蛋白質
を生産】るためにｂ利用される。勿論、全ての宿主／ベ
クターの組合せが同等に有効な訳ではない。宿主／ベク
ターの特定の組合せの選択は技術に熟練した者が本発明
の範囲から逸脱することなく原理に先りづき思ぢして行
なうらのである。 さらに、個々のクローニングベクターの中で二重鎖ＯＮ
への挿入部位として多くの１ｎ所を選択できる。それら
の部位は通常切断する制限酵素名で命名される。例えば
、ｐＢＲ３２２にＪ３いてＥ ＣＯＲＩ部位はアンピシ
リン耐性を］−ドする遺伝子のりぐ外側に（を置してい
る。いろいろな部位が多くの人によりその組換え体合成
設計に用いられてきている。その技術に熟練している者
にとってはいくつかの部位はよく精通している。勿論本
発ｒｇｌに有効なりローニングベクターは選択したＤＮ
Ａ断片を挿入するのに必ずしも制限酵素切断部位を有す
る必要はない。その代りにベクターと断片とを別の方法
で結合する。 ベクター或いはり０−ニングベクター、および特に組換
えＤＮＡ分子を作成するための選択したＤＮＡｌｌｉ片
挿入の部位は神々の因子により決定する。例えば、特定
の制限酵素の切断部位の数、発現しようとする蛋白７１
の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する目的蛋
白質の感受性、発現Ｊ−る蛋白質の、ｌｌ’ｊ製中分製
置分離困難細胞由来蛋白質による汚染、開始および終了
コドンのベクター配９１１中での相対的位置など発現の
特性、ａ３よびその他技術に熟練した者が理解する要因
などがある。ベクターと特定遺伝子挿入の位置の選択は
これらの要因のバランスにより決定されるもので各ケー
スににり全での選択が同等に有効な訳ではない。 ＯＮΔＮＡ配列ローニングベクターに挿入して組換えＤ
ＮＡを作成するため木兄１月で有用な公知の方法がいく
つかある。例えば、直接結合、合成リンカ−１制限酵素
およびポリメラーゼ連動外複反応と続く結合反応、また
はＤＮＡ！’ｌをＤＮＡポリメラーゼと適当な−Φ鎖鋳
型とで延長してからの結合反応などである。 勿論、クローニングベクターの選択部位に挿入するＤＮ
Ａ断片のヌクレオチド配列は目的のポリペプチド／蛋白
質に対する実際の構造遺伝子でないヌクレオブトを含む
事も、或いは目的蛋白質の全構造遺伝子の断片のみ含む
石もあるのはＦＪ！ Ｍされることである。どのような
りＮＡ配列が挿入されようども、形質転換宿主細胞がＡ
ＩＤＳＱａＱ−蛋白質に対する免疫活性を有する蛋白質
／ペプチドを生成すること、或いはＤＮＡＮＡ配列れ自
体がＡＩＤＳａａａ−蛋白１１に対する免疫活性を有す
ポリペプチド／蛋白質の生産に有用なりＮＡ配列を含有
するクローンを選択するハイブリダイゼーションプロー
ブとして有用であることのみが必要ぐある。 異秤遺伝子を含むり０−ニングベクターまたはベクター
を用いて宿主を形質転換し、宿主に組換えＤＮＡがコー
ド１゛る蛋白質またはその一部を発現させる。適当な宿
主の選択もその技術で叩解される多くの要因により支配
される。例えば、選んだベクターとの適合性、組換えプ
ラスミドによりコードされる蛋白質の毒性、目的蛋白質
の回収の容易さ、発現特性、生物安全性およびＩｆ費な
どが挙げられる。これらの要因のバランスがＩｆであり
、従って特定の組換えＤＮＡ分子に対して全ての宿主が
同じように有効ではない。 ｑａａｌｔ伝子の発信子行なうことのできる微生物が作
成されれば、本発明の工程はａａａ；ＩＩ伝信子発現ベ
クターの構築の性状や宿主の生育特例によりいろいろな
方法により実行できる。典型的には、宿主微生物を多聞
のＩＩＩＪｌｌを生産するのに都合の良い条件下で培養
する。多聞の細胞が蓄積したら、培地中の適当な誘導剤
または抑制剤が遺伝子配列中に存在するプロモーターを
介してコード配列の転写および翻訳を活性化する。組換
え細胞により生産される蛋白質はこの技術で周知の普通
の方法により溶菌抽出される。溶菌抽出の方法は使用す
る宿主に依存する。 本発明の好ましい実施態様では、ｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ
−ＩＩＩＱａＱ’ｌｌ伝子をりん酸培地信子は活性化さ
れないプロモーターを有Ｊる酵母発現ベクターに挿入す
る。そのようなプロモーター１；１Ｔｈｉｌｌ ら、Ｈ
ｏｌ。 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、３巻、５７０−５７９頁（１９８
３年）に記載されているＰ Ｈ０５より得られる。ｑａ
ｑ逍伝遺伝ｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ−１［１りｎ −ンλＨ
Ｘ Ｂ −３［Ｓｈａｗら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２６
巻、１１６５−１１７１頁（１９８４年）］からの５．
５ｋｂＥｃｏＲ１断片より得られる。これは第１−Ａ図
に示す１」丁Ｌ Ｖ −１［１ゲノムのＦｃ ｏ Ｒｒ
Ｉｇｉ片である。 第１−［３図にＰＨＯ５プロし一ターおよび第１Δ図の
ｇａｇ遺伝子断片を含有する雑種遺伝子の作成を図示す
る。酵母プロモーターＪ３よび翻訳開始部位は、抑ｉ！
＋ｌＩ型酸竹）Ａ°スファクーピの遺伝子、ＰＨＯ５、
に由来する５６０ｂｐの８８ｍＨＩからＡｈａＩＩＩま
での制限酵素断片上にある。制限ｈデ素ＡｈａＩＩＩｌ
は第１−８図からもわかるように、Ｐ Ｈ０５の二番目
のコドンの直ぐ後ろで平滑末端を作る。５．５ＫｄのＥ
Ｃ０ＲＩ断片中）ａ ａ ａ遺伝子をＰＨＯ５に由来す
る３ ａ ｍ Ｉ−Ｉ ＩからＡｈａｌｆｆまでの断片
から（９られるプロモーターと結合する。ＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩクローンからのＥｃｏＲＩｆＩｉ片はｑａａ全道伝
子信子びａａａ３ｍ伝子と異信子読みワクで重複してい
るｐｏＩｉ伝子の信子の部分を含ｌυでいる（ Ｒａｔ
ｕｅｒら、前述；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら
、前述： Ｍａｉｎ−１１０ｂｓＯｎら、前述：および
ＨｕＯ３ｉｎＱら、前述）、ＥｃｏＲＩ断片＠ｑａａ遺
伝子のアミノ末端の近くでＣｌａＩＩＪＪ所し、得られ
る５′の一本鎖をＤＮＡポリメラーゼの大断片で柊復し
てアルギニンのコドンで始まる平滑末端ＤＮＡ分子を作
成する。この末端をｒ’ Ｈ０５断片のＡｈａＩ［ｌ末
端と結合することにＪ、すＰ Ｈ０５のプロモーターと
最初の二つのコドンをｇａｑ遺伝子の１５コドンと融合
したことになる。 上述のようにして調製した融合遺伝子は次に酵母および
Ｅ、ｃｏｌｉの両方で複製可能なベクター、ｐＹＦ７ベ
クターに挿入する。この組換えプラスミドをｐＹＥ７２
／ｃｘａａｌと命名した。得られたプラスミドを用いて
酵母を形質転換した。 プロモーターをＱａＱ′Ｍ伝子に融信子るこの結合反応
を行なうにはいかなる周知の結合方払でも利用できる。 ＱａＱ遺伝子を発現する組換え微生物を創製するには、
例えば酵母のような微生物をプラスミドで形質転換する
周知の方法が利用できる。 ｐＹＥ７２１０ａＱ１と命名したプラスミド中のＰＨＯ
５プロモーターはりん酸非含石培地で培養することによ
り酵母細胞中で誘導され、細胞抽出物について破砕ウィ
ルスに対するウリギボリク０−ナル抗血清を用いた免疫
プロット分析によりＱａＱ−特異蛋白質の存在を調べた
結果が第２図のどおりである。第２図中でカラム１と記
しているのは高濃度りんＭ培地で培養した１）ＹＥ７２
／（３８ｍ１保右細胞、カラム２はｐＹＥ７２／ｇａｇ
１保有細胞をりん酸非含有培地中でＪ８差した細胞の結
果である。記載しである分子量は反応した蛋白質の大き
さを決定するのに用いた。第２図からもわかるように、
プロモーターが（ｊａＱ蛋白質を生産するよう活性化さ
れないりん酸含有培地中ではＱａＱ遺伝子は発現してい
ない。逆に同じ細胞をりん酸鼻含有培地で培養すると、
細胞抽出物中に９８ｇ蛋白質およびそれに由来する種々
の分解蛋白質に対応する免疫反応性の蛋白質が生産され
ている。 第２図のカラム２に見られるように、生産された主要免
疫反応性蛋白質はその大きさがウィルス粒子中で同定さ
れるｌ−ｌ Ｔ Ｌ Ｖ −ｍ ｐ２４ Ｇ ａ Ｑ
（５白質に相当し、公知のＤＮＡ配列からその大きさも
推定される。ｐｌ４およびｐ１６蛋白質で予想される大
きさの反応性分子種も検出される。およそ５６Ｋｄの大
きさの全ＱａＱ蛋白質に相当する大分子間蛋白質および
蛋白分解中間体のおよそ４０Ｋｄのいくつかの分子種も
生産されている。 組換えＨＴＬＶ−ｆｆｌａａｇ蛋白質が酵母中で実際に
蛋白分解プロセスを受けてウィルス特有の分解蛋白質を
生産するのかどうか調べるため、ＤＹＥ７２／ＱａＱ１
で形質転換した酵母の細胞抽出物から得た蛋白質で３３
５−メチオニンまたは３２ｐｏ４をもちいてパルス追跡
実験を行なった。 第３図はその結果を示し、それぞれのカラムは追跡時間
を表わす：Ａ）０分、Ｂ）２分、Ｃ）５分、Ｄ）１０分
、Ｅ）２０分、Ｆ）３０分、 Ｇ）４５分である。いず
れにしても５６Ｋｄの完全なＱａＣ）蛋白質の放射活性
が先ず検出される。第２図で見られたおよそ２５Ｋｄの
蛋白質も２４Ｋｄ蛋白質の前に検出されるため、その直
接の前駆体であろう。１６Ｋｄと考えられる移動を示す
蛋白質も検出される。Ｑａｇ逍伝子のｐ１４部位はメチ
オニンを含有しない。従って本蛋白質を検出できないと
いう事【よその山東が予想通りであることを支持する。 酵母で生産される組換えＱ ａ Ｑ蛋白質のりん酸化を
調（るためｐＹＥ７２／ｑａｇｌで形質転換した酵母細
胞を ＰＯ２を含む低りん酸培地で培養した。第３図の
カラムＨおよびＩがウサギＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体と免疫
沈殿した放射性蛋白質のゲル分析結果である。形質転換
酵母を用いたカラム１−１では５６Ｋｄ１４０Ｋｄ中間
体の一つ、２５Ｋｄ、２４Ｋｄおよび１６Ｋｄの分子棒
金てが放射性であった。高濃度ゲルで分析した時１４Ｋ
ｄバンドの位置に放射活性を検出できなかった。従って
ｐ２４ Ｊ３よびｐｌ ６ＱａＣＪ蛋白質は酵母中でり
ん酸化されると考えられる。形質転換しない酵母からは
カラムＩに示す通りＱａＱ蛋白質は検出されない。 第１Ａ図でわかるとおり、Ｑａ（ＪＭ伝信子コード領域
のカルボ４シル末端近くにＢＣＪＩ ＩＩ制限部位が存
在することにより、５．５ＫｄＥｃｏｔＬＴ断片中にあ
るｐ１６コード領域のおよそ半分およびほとんどのｐＯ
１遺伝子を除去することができる。 多くのレトロウィルスでＱａｇポリプロティンのカルボ
ニル末端部分および／またはｐＯ１逍伝遺伝アミノ末端
領域がプロセスのためのプロテアーゼをコードしている
ことがわかっている（例えばＤｉＣｋＳＯｎら、前述、
を参照のこと）。 組換え０８ｇ蛋白質からプロテアーゼを除去するために
ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムのＥＣ０ＲＩ所片からＢａＪＩ
ＩからＥＣｏＲＩ部分を除去した（第１Ｂ図参照）。ｇ
ａｇ遺伝子の除去した部分が大ぎい組換えＱａｇ蛋白質
を種々の成熟蛋白質種に変換するプロテアーゼをコード
していると考えられる。従って、遺伝子またはプラスミ
ドをＢＱＩｌｎで処理することにより第１Ｂ図のＢ ａ
ｍ ＨＩ −ＥｃｏＲＩ遺伝子を切断し、本遺伝子か
らＢＱｊ！ ［−ＥｃｏＲＩ断片を除去することが出来
る。発現プラスミドｐＹＥ７２／ｇａｏ１を用いる場合
にはＢａｍＨ工と１３０１Ｍで洞化することによりこの
プラスミドをｋｍ ’ＦＡできる。このＥＣ０ＲＩ断片
のＢ ａ ｍ ｌ−１１からＤａｌＴＩまでの部分が１
ｑられたら、使用とする微生物により適当なプラスミド
に挿入できる。この遺伝子断片をプラスミドに挿入する
にはこの断片に目的プラスミドに挿入できるＤＮＡ塩塁
を結合することが必要である。ｐＹＥ７を用いる場合に
は、Ｂ ａ ｍ ＨＩからＢａＩＩＩまでの断片とｐＢ
Ｒ３２２からの３７５ｂｐＢａｍＨＩ−ＩＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片を連結してｐＹＥ ７に挿入し、ｐＹＥ７２１０
ａａ２を構築する。 本発明のもう一つの実施態様としてｇａｇ遺伝子の他の
変異をｐＯ１遺伝子のｇａ９のすぐ下流のＢＣＩ工υ１
限部位に導入したｐＹＥ７２／ＱａＱ３がある。本′Ｒ
′ＡはＢｃオニ部位に４塩基を導入するもので、それに
より第５図に示すようにｐｏｌの読みワクにフレームシ
フ１−が起る。第５図にａａｏ遺伝子のカルボニル末端
コード領域およびｐＯｆｍ伝子のツード領域のアミノ末
端を示す。この図の中で他のＱａＱブロテアーピと相同
性のある部分に下線を施しである。ＢＣｊ！Ｉ部位のｍ
塁挿入により出来た読みワクを矢印で記した。 ピリオドは翻訳終了部位を示す。ｔ＝ｉ挿入により起っ
たフレームシフトによりａａａｆｆｉ白質を蛋白分解す
るプロテアーゼの生産を不活化する。 完全な組換えｇａｇ道伝子信子び切断ａａａｉ伝から生
成する産物を第４図に示す。第４図のカラム１はｐＹＥ
７２／Ｑａｇ１により誘導した細胞の抽出物からの免疫
プロットである。第４図のカラム２はｐＹＥ７２／ａａ
ａ２で誘導した細胞抽出物の免疫プロットであり、カラ
ム３はｐＹＥ７２／（Ｊａ（Ｊａにより誘導した細胞抽
出物の免疫プロットである。明らかなとおり、ｐＹＥ７
２／Ｑ ａ Ｑ １および３は大蛋白質ｐ５６を生産す
る。 ｐＹＥ７２／ｇａｇ３では免疫反応性を示ず主要蛋白質
バンドはおよそ５６Ｋｄであり、ｐＹＥ７２／Ｑａｇ１
で誘導した細胞で見られる予想前駆体と同じ移動度を示
した。しかし、変異の結果、この組換えＱａｇ前駆体の
プロセシングが阻止されているしのと思われる。削除変
異ではｐＹＥ７２１０ａｑ１で誘導した細胞で見られる
蛋白質と比較してｐ２４蛋白質のｖｄが少ない。５６Ｋ
ｄ生成物および低分子秤に加えて、フレームシフ１〜変
異ではおよそ６０Ｋｄのバンドが検出される。この大き
さはＢＣＩＴ挿入の結果１１成されるｇａＣ１／ｐＯｌ
融合生成物が第５図に示す翻訳終了で出来たものと一致
する。 ＡＩＤＳ血清のスクリーニング 抗ＨＴＬＶ−１抗体はＡＩＤｓｆｆｉ者の９０％以上に
検出されるため、微生物により合成したｑａａ遺伝子生
成子生成物ような抗体を検出するための診断用道具とし
て使用できる。本分析のためには第６Ａ図および第６Ｂ
図に見られるように、ｐＹＥ７２１０ａａｌで誘導した
醇母ＩｏＩｌｌからの全細胞蛋白質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ
で分画し、ウェスタンブロッティング法を用いてニドＯ
セルロースフィルターに移す。転写した蛋白質を含有す
るフィルターを１０００倍希釈したヒト血清と反応させ
、抗原−抗体複合体の生成はフィルターを１２５−沃素
標識の５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプ
ロティン八とインキへベートした後、オートラジオグラ
フィーにより検出する。ＡＩＤＳ症候ｍｌからの血清を
用いると５６Ｋｄ１２４Ｋｄ、１６Ｋｄおよび１４Ｋｄ
？５白質に対する抗体の反応に対応した顕著なバンドが
必ず観察される。東部海岸の患者からの１１個の血清試
料の分析結果の一例が第６Ａ図に、西部海岸の患者から
の１１試料の同様な結果が第６Ｂ図に示しである。陰性
対照（示してないが）としては正常と］・血液を用いた
。健康人からの血清では反応は全く観察されなかった。 従って、組換えａａｑ遺伝子産物は、ＩＤｓ関連の抗体
を検出する診断試薬として利用できると考えられる。本
発明の組換えｇａｑ遺伝子産物は蛋白質分子の大部分を
包含するものであって分子の保存された部分および変化
した部分の両方を含むものである。ＨＴＬＶ−ＩＩＩお
よびＡＲＶ−２の配列の間には違いがあるにも拘らず、
本発明によるバクテリアにより生成した組換えＱａＱ蛋
白質産物は米国の両側に位置する所からのＡＩＤＳ患者
血清両方に反応する。試験したＡＩＤＳｔＪｔ者血清（
米国東海岸からの１１名、カリフォルニアからの１１名
を含む２２人の試Ｆｌ ＞の１００％が高い反応性を示
した。この事は分子中に保存されているエピトープが存
在し、それに対して免疫系が抗体反応をのせることが出
来るという事の強い証拠である。ヒト免疫系はｇａｇ蛋
白質分子の保存性エピトープに対してＡｌ０８ｔｌ！ｌ
？ｌｒ血清の反応性により免疫応答を示しているのであ
ろう。 これらの発見に基づいて、後天性免疫不全症候群（Ａｌ
ｌ）Ｓ）についての血液検索の実施に際して本発明にＪ
：るＡＩ ＤＳＩＩ換え９８ｇ蛋白質生成物が利用でき
るという事を提言できる。本発明の蛋白質産物を利用し
てヒト血液についてＡＩＤＳウィルスに対する抗体の存
在を検索できる。本方法も他の方法も容易に限定される
。本発明の前述およびその他の目的、特徴および利点は
以下に示す本発明の好ましい実施態様の例から明かであ
る。 実施例中の［、ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１株はＣａ５ａ
ｄａｂａｎらにより、Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 １３
８巻、１７９−２０７頁＜１９８０年）に記載されてい
るものと同じである。非メチル化ＤＮＡＷＡ’！！に用
いたＥ、ｃｏｌｉ ＧＭ １１９株はＡｒｒａｊらニ
ヨＰ）Ｊ。 Ｂａｃｔ、 １５３３．５６２−５６３頁（１９８３年
）中に記載されているものである。Ｅ、ｃｏｌｉ Ｍ
Ｃ１０６１株および０Ｍ１１９株はＡｎ＋ｅｒｉｃａ
ｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
（Ａ Ｔ ＣＣ＞に１９８５年１１月２６日付けでそれ
ぞれ寄託番号ＡＴＣＣ５３３３８および△ＴＣＣ５３３
３９として寄：［されている。実施例５で使用Ｊ８酵母
発現プラスミドｐＹＥ ７は参考文献として引用したヨ
ーロッパ特許出Ｊｉ’ｉＮｏ、 ０１２４８２４ （７
）実／Ｊ！ＭＪ５にヒ第６図に記載されているものと同
じである。使用した酵母はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２
ＯＢ −１２（△ＴＣ０２０６２６）である。ＷＪ母
の形質転換は旧ｎｎｅｎらによりＰｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 、 ＬＪＳＡ、 ７５巻、１９２
９−１９３４頁（１９７８年）に記載されているとおり
行なった。プロモーター作成に利用したＰ Ｈ０５Ｍ転
子はＡｎｄｅｒｓｅｎらによりＨｏ１．Ｃｅ１ｌＢｉｏ
１３ｉ、５６２−５６９′ｒＡ（１９８３年）に記載さ
れているプラスミドｐＡＰ２０から調製した。使用した
λＩ−Ｉ Ｘ Ｂ −３は５ｈａＷらにより５ｃｉｅｎ
ｃ０２２６巻、１１６５−１１７１頁（１９８４年）に
記載されている通りである。 実施例１ ｐＹＦ７２／ｇａｑ１のｆｆ１Ｍ 制限酵素およびＤＮＡ修飾醇索は供給元の指示通りに使
用した。制限酵素による消化は全て３７℃で１時間、０
．５−１．０単位の酵素を用い、５０１８ ＮａＣｌ
、１０ｍＨトリス塩酸、１１７．４．１０ｍ１４ Ｍ
ＱＣＪ！ 、１１Ｍジチオスライト−ル（ＤＴＴ）中
で行なった。ＰＨＯ５プロモーターおよび翻訳開始領域
を有する５６０ｂｐのＢａｍＨＩからＡｈａｌ［Ｉまで
の断片はプラスミドｐＡＰ２０から得られ、ａａｏ／ｐ
ｏｊ！領域を含有するＣｌａＩからＥＣ０ＲＩまでの断
片はλト３のＣｌａＩ−３より得られた。５．５ｋｂの
ＥＣ０ＲＩ断片はｐＢＲ３２２にサブクローンされ、Ｅ
、ｃｏｌｉ ＧＭ １１９で増幅させた。ＣｌａＩ−
ＥｃｏＲＩ断片のＣｊ！ａＩ５’末端は４種ノテオキシ
リボヌクレＡヂド５０μＭの存在下、Ｅ、ｃｏｌｉＤ
Ｎ Ａボリメラーゼエのフレナラ断片５ユニットを用い
１６℃２時間、上述の制限酵素消化で用いたと同じ緩衝
液中で埋める。 およそ等量のＢａｍＨＩ−Ａｈａｌ［［ＰＨＯ５断片と
Ｃｌ！ａＩ（充１ｉ ） Ｅ ＣＯＲＩ Ｑ ａ Ｑ
／ｐ０１断片とを１．０単位のＴ ４． Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼで１６℃１６時間、５０ｆｆｌＨトリス塩酸、
ｒｌＨ７，８，１０ｍＨＶＩＯＣ！ 、２０ｍＨＤＴＴ
。 １ ｎ＋Ｈｄ Ａ Ｔ Ｐ中で処理する。生成物をＢａ
ｍＨＩおよび［ＥＣ０ＲＴで切断し、ＰＨＯ５−ｇａ（
ｊ／ｐ０１融合体を予めＢ ａ ｍ ＨＩとＥＣ０ＲＩ
で切断したｐＹＥ ７にライゲーションにより挿入する
。得られた発現プラスミドをｐＹＥ７２／ａａａ１で命
名する。 実施例２ ｐＹＥ７２１０ａａ２の調製 ＱａＱのカルボキシル末端部分およびｐＯｌの全てを除
去した欠失を０ＹＥ７２／ＱａにＪ１を３ ａ ｍ Ｈ
ＩおよびＢＱＪ ＩＩにより消化し、ＰＨＯ５−ｏａｑ
断片を中麺することにより性成した。 これをｐ［［３２２からの３７５ｂｌ）ＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片とＢｇｊ！ ＩＩ部位で、ＢＱＩ ＩＩと
Ｑ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉの５′末端が同一であることに
より結合した。この断片をｐＹＥ ７に挿入してＤＹＥ
７２／にＩ ａ Ｑ ２を１きノだ。 実施例３ ｐＹＥ７２／ＣＪａＱ３の調製 ｑａａのすぐ”Ｆ流のｐｏＩ遺伝子信子）Ｂｃｌ１部位
に伯の変異を導入した。ＢＣｊ！ Ｉはメブル化ＤＮＡ
を切断しないため、ｐＹＥ７２／ＱａＱ１を［、ｃｏｌ
ｉ ＧＭ １１９に導入し、それからＤＮＡを調製し
てＢＣ１■で切断した。５′末端を上述のとおりフレナ
ラ断片で二重鎖とし、平滑末端ライゲージコンによりプ
ラスミドを１２１ｙ：Ｉシた。ｉ９られたＢｃｌ Ｉ部
位４ｂｌ）ＧＡＴＣ挿入を有するプラスミドをｐＹＥ７
２／ＣＪａｇ３と命名しＩζ。 酵母菌株Ｓ、ｃｃｒｅｖｉｓｉａｃ２０ Ｂ −１２の
ｇａｑ発現プラスミド含有株および挿入遺伝子を持たな
いベクター含有株を別々にｙ ＣＡ Ｄ Ｊａ地中で生
ｎし、ＫｒａｍｅｒらによりＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ ＳＡ、８１巻、３６７−３７０
頁（１９８４年）に記載されるようにりん酸鼻含有培地
で誘導した。りん酸鼻含有培地に移してからおよそ６時
間後に細胞を遠心分離により集め、ブ七う−ピ６０００
（Ｔ、Ｋａｎｅｋｏ、に、に１ｔａｎ＋Ｕｒａ 、およ
びＹ、 ＹａｌｌｌａｌｌｌＯｔＯ，八ｇｒ。 ８ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、 ３７ サ、２２９５頁（１９７
３年））によりスフエロプラスとを調製し、集めたスフ
ェロプラストは通常−２０℃に保存して分析に供した。 蛋白質の精製にはスフェロプラストの代りに全細胞を集
めて凍結した。 実施例５ 絹換えｏａＱ蛋白質生成物の精製 均一な組換えｑａｑ蛋白質またはその蛋白質分解生成物
は以下の方法で精製できる。誘々ＷＩＮ櫂胞を標ｒｌ（
の物理的方法で破砕づる。即ら、フレンチプレスを通す
またはＢｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ （ビーズビータ−）
、Ｄｙｎａ−ＩＩＩ＜ダイナミル）或いはｅｒａｕｎ
ｌｌｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ （ブラウンホ七ジナイＩ
Ｊ”−）のような撹拌機の中でガラス粒子と速く撹拌Ｊ
るなどである。上記いずれの場合でｔ）細胞ベーストを
およそ２倍音ω（＃Ｉ胞ペーストに対して）の５ＱｍＨ
りん酸ブトリ・クム（Ｎａ３［）０４）緩衝液ｐＨ７，
４に再懸濁する。ガラス粒子による破砕の場合には等容
品の０．５＃ガラスピーズを加える。 破砕はフレンチプレスを２０．０ＯＯｐ、ｓ、ｉで３回
通ηか、或いは撹拌機の製造元の指示するようにして完
了する。細胞破砕は顕鎖により追跡できる。 細胞破砕に続いてｍ胞残渣（およびガラス粒子）を６０
０Ｘ９１０分間の遠心分子１ｆｉ２回で除去する。 続＜１２，０ＯＯＸり、２０分間の遠心分離によりミト
コンドリアを除去する。次に蛋白質を１００．０ＯＯＸ
ｇ１０５間の遠心分離によりペレット（ミクロゾーム画
分）と上ｉｌｌ液（可溶性画分）とに分画する。ＣＪａ
Ｑ蛋白質がミクロゾーム画分にある場合には精製の前に
各種イＡ°ン竹Ｊ３よび／または非イオン竹界面活性剤
或いは尿素或いはグアニジン塩酸のＪ、うな不活化剤に
よる可溶化が必要である。 標へ１的クロマトグラフイ一手法によりざらにｌ１１製
を行なうことができる。グル濾過、イＡン交換クロマト
グラフィー、および／またはアフイニデイクロマトグラ
フイーによる分画にいろいろな担体が利用できる。ｇａ
ｇ蛋白質は核酸に結合するので一小鎖ＤＮＡセルロース
アフイニアイクロマトグラフイーが０用であろう。 最後の精製ステップとして逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（Ｉ」Ｐ Ｌ Ｃ）が使用できる。 ＨＰ Ｌ、 Ｃステップにより前駆体ｇａｇ蛋白質＋＋
３ Ｊ：びそれに由来する天然型分解蛋白質を実質１０
０％の純度で得られる。また前駆体ＱａＱ蛋白質および
天然型分解蛋白質に対するｑａｑポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を利用したモノクローナル抗体アフ
イニテイクロマトグラフイーカラムもｌ（Ｐ Ｌ Ｃの
代りに使うことができると考えられる。 上述の精製工程により以下の生成物が得られる。 第８図に示す構造を有する５６Ｋｄ蛋白質。 第１０図に示す構造を有す２４Ｋｄ蛋白質。 第１２図に示す構造を有す１６Ｋｄ蛋白質。 第１４図に示ず構造を有する１４Ｋｄ蛋白質。 第１６図に示す構造を有す４８Ｋｄ蛋白質。 第２図、第３図、第４図、第６Ａ図および第６Ｂ図の免
疫プロット分析には、スフェロプラストベレット（およ
そ１０８個の細胞）を等量の２倍１５ Ｈｆ１１−ａｅ
ｍｍ Ｉ ｉ緩衝液（Ｌａｃｎｍｌｉ、 ” Ｃｌｅａ
ｖａｇｅ ｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ Ｄｕｒｉｎ（ｌ ｔｈｅ Ａｓ５ｅｎ＋ｂｌ
ｙ ｏｆｔｈｅ １ｌｃａｄ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ ４ ” 、Ｎａｔｕｒｅ２
２７巻、６Ｂ−６８５頁、１９７０年）に再けん濁する
ことによりｌｌｌ１Ｉ胞を溶菌し、９５℃５分間インキ
ュベートする。細胞残渣を遠心分離により沈澱し、透明
な抽出液を５Ｏ８−ＰＡＧＥ分析にか番ノる。ウェスタ
ンプロット分析にはアクリルアミドゲルの蛋白質を０．
１μｍのニトロセルロースＷ；！ （５ｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒおよび５（ｈｕｃｌｌ ）に１２．５ｍＨトリス、
９５ｍＮグリシン、２０％メタノール、０．０１％ＳＤ
Ｓ中ｐＨ７，５，５０Ｖで１６時間電気プロットを行な
う。プロットの処理はＴｏｗｂ ｉ ｎらにより“Ｅｌ
ｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏ
ｒＰｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａ
ｍｉｄｅ Ｇｅ１ｓ ｔ。 Ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ５ｈｅｅｔ ： Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ５Ｏ１ｅ＾ｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ” 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、 ＬＩＳＡ１７６巻、４３５０−４３５４頁（１９
７９年）中に記載されている方法を用いて行なった。ヒ
ト血清の処理には、プロットを抗体緩衝液（０，５ＭＮ
ａＣ１，１％ＢＳＡおよび０．０５％ｒｗｅｅｎ ２０
含右の２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液、ｐ１１７．５
）で１０００１８に希釈したヒ１〜血清と２〜６時間イ
ンキュベー１・する。次にプロットを０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ ２０含有のりん酸緩衝塩溶液で２回洗滌し、続い
てさらに１時間１２５−Ｉ−標識の５ｔａｐｌ＋ｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｃｕｓ△蛋白質とインキュベート
する。次にブロワｉ−をＰ Ｂ Ｓ −１’ｗａｃｎ
２０状衝液で２回洗滌し、乾燥侵オートラジオグラフィ
ー分析する。 実施例７ 細胞の標識 第３図に示ケパルスチェース免疫沈澱のために細胞を３
５ｓ−メブＡニンパルスブＴ−スまたは３２ρ０４にＪ
：り次の／Ｊ法で標識した。 Ｓ−メチＡニンにＪ、る
バルスブエースには５００ｍＣｉの３５３−メチオニン
を生ｎ培地に添加した。各時間経過１１２７）細胞を集
めて溶菌し、つ１ツギ抗体を用いて免疫沈澱してから溶
菌抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィー分析を行なう。チェースの時間は次のとおりである
。Ａ）０分、Ｂ）２分、Ｃ）５分、口）１０分、Ｅ）２
０分、［）３０分、Ｇ）４５分。カラムト１および■に
示す３２ＰＯ４−標識には、ｌｒｒ＋Ｃ＋の ＰＯ４を
培地、３２ に添加した。標識は３０℃で３０分間行ない、細胞を集
菌して溶菌抽出物について上述と同様に免疫沈澱処理を
した。抽出物は１）ＹＥ７２／ＱａＱ１（Ｈ）を含む細
胞からのものとｇａｑ３１１仏子を含まない同じような
プラスミドを含有する細胞（１）からのものである。 実施例８ ＡＩＤＳ診断テスト 本発明による組換え前駆体ｇａＯ蛋白！１およびイれに
由来する天然型分解蛋白質がＡ［ＤＳ関連抗体検出のた
めの診断試薬として使用できることは明らかである。ま
たこの技術を知る者には組換えｇａｇ前駆蛋白７１また
は蛋白分解生成物に対するポリクローナル或はモノクロ
−フル抗体を用いたＡＩＤＳの診断測定によりヒト血液
中のＡＩＤＳウィルスの存在を検出できることも明らか
である。一つの実施態様として、血液試料中の抗原物質
、こ）ではＡＩＤＳウィルス、が既知品の標識抗原、こ
の場合は標識したＡＩＤＳ組換えｇａｇ前駆蛋白質また
はそれに由来する分解蛋白質、と限られた抗体結合部位
に対して競合する競合免疫アッセイが利用される。即ち
、抗体に結合した標識抗原の＃ｄは試料中の抗原量に反
比例する。 もう一つの実施態様としては、抗原結合抗体と複合体形
成する標識ＡＩＤＳＱａＱ抗体が血液試料中抗原（ＡＩ
ＤＳウィルス）のｈｌと比例している免疫測定法がある
。血液中のＡＩ［）Ｓウィルス存在を判定Ｊるｆ１５車
なプラス−マイナス測定では固体支持体について標識抗
体の自照を検出する。またもう一つの実施態様としては
、組換え前駆体ＡＩＤＳＱａｇ蛋白質またはそれに由来
する天然型分解蛋白質に対するモノクローン抗体を免疫
測定に使用する。イのようなモノクローン抗体は文献で
よく知られるｌｉ法、特にＭｉｌｓｔｃｉｎおよびにｏ
ｈｌｅｒによりＮａｔｕｒｅ２５６ Ｗ、４９５−４９
７１ｆｆ（１９７５年）に報告されている手法により調
製される。本測定に用いる抗原はＩＩ換えｑａｑ前駆体
蛋白質またはそれに由来する分解蛋白質の純品或いはそ
れらの混合物である。 免疫測定法（よ以下の通りである。測定は二連で行ない
、アガロースに固定した１００μｍの抗体懸濁液を１０
０μｌの血清および１００μｍの可溶性 Ｉ−標識抗
体と混合する。１５分から２４時間の間の決まった時間
混合する。インキュベーション時間終了後アガロース粒
子を！ａＩＦｉ液を加えて洗い、遠心分離する。洗滌液
を吸引により除去した後、残ったアガロース粒子につい
て結合した１２５■−ｅＡ識抗体を測定覆る。複合体の
各測定値を対照値と比較する。
質である。これらのアミノ酸置換体は文献の記載されて
おり（Ｈ。 ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ，Ｌ、 １ｌｉｌｌ、” Ｔ
ｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１：ん白質）″、＾ｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎａｗ Ｗｏｒｋ （１９７
９年）〕、特にＡ１頁の第６図に記載されて６する。 最も頻繁に見られるアミノ酸置換番よ、Ａｊ！ａ／Ｓｅ
ｒ、Ｖａ１／１７ｅ、Ａｓｐ／ＧＪ！ｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅ
ｒ、Ａ１ａ／Ｇ１＠、Ａｊ！ａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓ
ｎ、Ａｊ！ａ／Ｖａｎ！、Ｓｅｒ／ＧＪ！！、 Ｔｙｒ
／Ｐｈｅ。 Ａｊ！ａ／Ｐｒｏ、ＬＶＳ／Ａｒ０１ＡＳｒ：）／Ａ
Ｓ ｎ 、 Ｌ ｅ ＬＪ ／ Ｉ １ ｅ 、 Ｌ
ｅ Ｕ ／ Ｖ ａ Ｉｔ 。 Ａ１ ａ／ＧＡ ｕ、Ａｓ Ｏ／Ｇ１１およびそ。逆、
ある。 本発明はさらに、ヒト血液につ０てｇａｑ蛋白質および
その分解蛋白質に対する抗体の存在をテストする診斯法
に係わるものである。木兄ＩＩＩ１のこの点により、従
来のＡＩＤＳ血液テストの１１■題点を解決できる。Ａ
ＩＤＳウィルスを試験管内で検出する時の一つの問題点
は、ＡＩＤＳの起因物？１のみに出来していないたん白
質やペプチドを含まない成分を供給する点である。ｇａ
９蛋白質の活性部分またはその分解蛋白質を用いた成分
を使用することにより、従来のテストや測定の非特宍性
を解決できる。しかも、本発明ではヒト血液中の抗原を
検出および／または測定する方法をも提供する。 本発明のもう一つの態様は、組換えｇａｇ蛋白質もしく
はそれに由来する分解蛋白質を抗原として用い、ヒト検
体試料についてＡＩＤＳを検出できる抗体を提供するこ
とである。 本発明のもう一つの態様として、組換えＱａＱ蛋白質も
しくはそれに由来する分解蛋白質をＡＩＤＳウィルスに
対する保護免疫を誘発できるワクチンとして用いること
がある。投与方法、抗原品、投与回数などは個々に箕な
るが、他のウィルス感染に対する免疫法で用いられてい
る方法に準する。ワクチンは公知の方法によって調製で
きる。ワクチン成分は便宜的に、生理的に容認できる担
体物！１と混ぜられる。ワクチン成分はアジュバントあ
るいは他の免疫応答促進剤を含有できる。 さらに、ワクチン成分はＡＩＤＳに加えて他の疾患に対
する免疫を誘発する他の抗原を含むこともできる。 ヒト血液についてＡＩＤＳウィルスまたはＡＩＤＳウィ
ルスに対する抗体の存在をテストする方法は、本発明に
より提供される組換え９８ｇ蛋白質またはそれに由来す
る本発明により提供される分解蛋白質、或いは本発明の
これらのたん白質により誘導されるＡＩＤＳウィルスに
対する抗体を容器に含む適当なキットを用いて行なうこ
とができる。 図面の簡潔な記述 第１Δ図はＨＴＬＶ−１ウイルスの遺伝子クローンとし
て知られるλＨＸＢ−３の制限ｗ９素切断部位と、木遣
信子の０８ｇ領域を拡大して前駆体（ｐ５６）およびそ
の天然分解生成たん白質（ｐ２４、ｐ１６およびｐ１４
）、さらにその変異たん白（ｐ４８）を示す。 第１Ｂ図はＨＴＬＶ−ＩＩＩのｇａｇ−ｍ信子およびプ
ロモーターを含み、後にプラスミドにｈＦ入する遺伝子
の構築を示ず。 第２図はＤＹＥ７２／ＱａＱ１を含む酵母培養物から冑
られた抽出物の免疫プロット分析である。 カラム１は高りん酸培地中で培養した細胞から、カラｌ
ｘ ２はりん酸鼻含有培地で培養した細胞からのらので
ある。分子ａマーカーの分子量を数字で示しである。 第３図はＣＪａＱプラスミドｐＹＥ７２／ＱａＱ１を保
有する酵母細胞を３５８−メチオニン中の培４物の免疫
法でん抽出後ＳＤＳゲルオートラジＡグラフの経時的変
化である。カラム八かららＧはチェイス時間の変化を表
わす。カラム１」はｐＹＥ７２／ＦａＱ１を保有する酵
母細胞を３２ｐｏ４存在下で培養し、４５分後に集菌し
た抽出物の結果を示し、カラム■はカラムＧとｆ’；Ｉ
じ操作をｇａｇ遺伝子を持たないプラスミドを保有りる
酵母細胞につき行なった結果である。 第４図はｇａｇ遺伝子の各種変異により得られた酵母抽
出物の免疫ブに１ット分析である。免疫プロットは破砕
１−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ −ＩＩＩに対り゛るウリ１ニ抗体
（第４図へ）あるいはＡＩＤＳ患者の血清（第４図Ｂ）
に対して行なった。Ａ、Ｂ共、カラム１はＤＹＥ７２／
ＱａＱ１で誘導したｌｌＩＩＩ１からの抽出物、カラム
２はｐＹＥ７２／ＣＪａＱ２により誘導した細胞からの
抽出物、カラム３はｐＹＥ７２／ＱａＱ３により誘導し
た細胞抽出物の結果を示す。 第５図はλＨＸＢ３のＱａｏ／ｐｏ１重複領域のＤＮＡ
配列である。ｇａりのカルボキシル末端のコード領域お
よびｐＯｉのアミノ末端のコード領域を示す。他の９ａ
Ｑプ【コテアーゼと一致する領域［ｒｏｈら、Ｎａｔｕ
ｒｃ３１５巻、６９１頁（１９８５年）］を下線で示す
。ｐｏ１遺伝子がＢＣｊ！Ｉ充填によりシフトした翻訳
１ツクを矢印で示す。図中のピリオド（ｒ、Ｊ）は翻訳
終了部位を示す。 第６Ａ図はＤＹＥ７２／ｇａｑｌで誘導した酵母細胞抽
出物により調製した抗原を用いた免疫プロット分析を示
ず。各カラムは米国東海岸に住む異なるＡＩＤＳ患者か
らの血液試料である。 第６Ｂ図は第６−Ａ図同じもので米国西海岸の患者の試
料である。 第７図は本発明により生産される５６ＫｄＱａＱ蛋白質
前駆体を］−ドするＯ Ｎ Ａ Ｉ’ｉｉ！ ｕＪを示
す。 第８図は本発明により生産される５６Ｋｄｑａｇ蛋白質
前駆体のアミノ酸配列を示す。 第９図は本発明により生産される蛋白質分解２４ Ｋｄ
ＣＪ ａ ＣＪ ｍ白質ヲコードするＤＮＡ配ｕＪ
を示す。 第１０図は本発明により生産される２４ＫｄＩＣん自分
ＷＣＪａＣＪ蛋白質のアミノ酸配列を示寸。 第１１図は本発明により生産されるたん自分前１６Ｋｄ
（ＪａＣＪ蛋白質をコードするＤＮＡ配ダ配合１す
。 第１２図は本発明により生産される１６Ｋｄ／こＩυ自
分解ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列を承り。 第１３図は木、発明により生産される蛋白ｔ１分解１４
Ｋｄ ｇａＯ蛋白質をコードするＤ Ｎ Ａ Ｆｉｉ
ｌ！ ｕＪを、示す。 第１４図は本発明により生産される１４Ｋｄ蛋白質分解
ｇａり蛋白質のアミノ酸配列を示す。 第１５図は本発明によりｑ：産される４８Ｋｄ分解Ｑａ
ｆ；Ｊ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を示す。 第１６図は本発明により生産される４８Ｋｄたん自分解
ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列を示す。 本発明の詳細な記述 記載中用語は以下の定義による： ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、りん酸およびプ
リンまたはピリミジン塩基（含窒ヘテロ環）より成るＤ
ＮＡの単量体ユニット。塩基は糖部分とグリコシド炭素
（ペントースの第−ｉＡ素）を介して結合している。塩
基と糖の組合Ｕをヌクレオチドと呼ぶ。ヌクレオチドは
その塩基により性質が決まる。四つの塩基はアデノシン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（ｒＣＪ）
およびチミン（ｒＴＪ ）である。 ４：隣接するペントースの３′および ５′炭素の間のりん酸ジエステル結合により互いに連結
するヌクレオチドの一次配列。 コドン：ｍＲＮＡを通して個々のアミノ酸、翻訳開始シ
グナルまたは翻訳終了ジグプルをコードする３ヌクレオ
ヂド（トリブレット）のＤＮＡ配列。例えば、ヌクレオ
チドトリブレットＴＴへ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ１Ｃ
Ｔ△およびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（ｒＬｅｕＪ ）
をコードする。 ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳終了シグナル、ΔＴ
Ｇは翻訳開始シグナルである。 翻訳ワク： ｍ ＲＮＡのアミノ酸配列への翻訳の過程
でのコドンのグループ。ｖＡ訳中では適当な翻訳ワクが
保持されなくてはならない。例えば、配列ＧＣＴＧＧＴ
ＴＧｒＡ八Ｇは三種のＩＩ翻訳ワク翻訳され１！ｔ、夫
々１“シなったアミノ酸配列を示１”：ボリベプヂド：
隣接するアミノ酸のα−アミノＬ！どカルボ１シル！：
４の間のベブブド結合によりｎいに連結するアミノ酸の
一次配列。 ゲノム：細胞或いはウィルスの全ＤＮＡ。オペレーター
、プロモーターおよびリボゾーム結合配列、シャインー
ダルガーノ配列のような配列を含む相互作用配列はもと
より、特に物質ポリペプチドをコードする構造遺伝子を
含む。 １及１血ユニ鋳型或いはメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲ
ＮＡ）を介して特定ポリペプチドに特有のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列。 Ｌ￥：構造遺伝子からｍＲＮＡを生成する過程。 １１謂：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成する過程。 象コニ構造遺伝子がポリペプチドを生成するまでの過程
で、転写と翻訳の組合せである。 ム之λユ上：微生物の主染色体の一部ではない環状二重
鎖ＤＮＡ分子であり、特定の抗生物質に対する耐性の遺
伝子を含む。プラスミドが甲細胞生物に挿入されるとそ
の生物の性質がプラスミドＤＮＡの結果として変化、ま
たは転換する。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝ｒ
（Ｔｅｔｌｌ）を保有覆るプラスミドはテトラリイクリ
ン感受竹細胞を耐性なｉｌｌ胞に変換する。プラスミド
により変換した細胞を「形質転換株」と貯ぶ。 クローニングベクター：宿主細胞中で御製可能であり、
−個または数個の制限酵素部位を有し、その部位でＤＮ
Ａが切断されても必須な生物機能、例えば複製や外膜た
ん白金酸、の欠失、或いはプロモーターや結合部位の欠
失が起らず、形質転換細胞を確認するのに利用できるマ
ーカー、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリ
ン耐性、をイｉするプラスミド、ファージＤＮＡ或いは
他のＤＮＡ配列。クローニングベクターはよくベクター
と呼ばれる。 クローニングニ一つの微生物または一つの配列から微生
物またはＤＮＡ配列の集団を無性生殖で得ること。 組換えＤＮＡ分子または箱秤ＤＮＡ ：生絹外で末端同
志結合した責なるゲノムからのＤＮＡ断片より成る分子
で、ある宿主細胞に感染してその中に保持される能力を
有すもの。 ペプチドまたはたん白を定義するのに用いる命名はお通
の方法により、Ｎ−末端のアミノ基が左側に、Ｃ−末端
のカルボニ１シル基が右に記される。 ＡＪ！ａ、Ｖａｊ！、ｌｅｕ、＋１ｅ、３ｅｒ。 １−ｈｒｌｔ−ｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、 Ａｓｎ。 Ｇｊ！ｕＳＧ１ｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒＳ
Ｐｒｏ、Ｔｒｐおよび）（ｉｓより成る。 アミノ酸に責性体が存在する際には、記載しない限りＬ
−型を表わす。さらにアミノ酸を以下のアルファベット
文字によって命名している：Ａ＝アラニン；Ｄ＝アスパ
ラギンｌＮＮ−アスパラギン：Ｃ＝システィン；Ｅ−グ
ルタミン酸；Ｆ−フェニルアラニン；Ｇ＝ニブリシンＨ
＝ヒスチジン；１＝イソロイシン；に＝リジン：Ｌ＝ロ
イシン；Ｍ＝メチＡニン：Ｐ＝ニブロリンＱ−グルタミ
ン：Ｒ−アルギニン：Ｓ＝セリン：Ｔ＝スレオニン；Ｖ
−バリン；Ｗ−トリプトファン：Ｙ−チロシン。 本発明によると、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の
原因となる蛋白質を検索した結果、ＡＩＤＳウィルスの
プロウィルス遺伝子の配列を単離した。本発明によって
、ＡＩＤＳのｐ想される原因物質であるリンパ腺症関連
ウィルス（ＬＡＶ） 、Ａ ＩＤ５ｆｌｌ連レトロウイ
ルス（ＡＲＶ）およびヒトニー細胞白山病／リンパ腫／
向リンパ性ウィルス（Ｈす Ｌ Ｖ−１）が同じウィル
スの変異株であることをはじめて明らかにした。本発明
および特許請求の範囲の目的において、水引ｌｆｆ１中
ではＡＩＤＳを起重ウィルスをＨＴＬＶ−ＩＩＩウィル
スと叶ぶ。ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩＩウィルスはＡＩＤＳ
の原因物質として考えられている変異株、即ら、ＬＡＶ
おにびＡＲＶを包含するものである。 第１図に水型ようにｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ −ＩＩＩのゲ
ノム、即らλＩＩ Ｘ Ｂ −３、は知られており、Ｑ
ａ Ｑ−蛋白質、ｐｏｌ−蛋白質、５ｏｒ−蛋白質お
よび１ンベロープ（ｅｎｖ）−蛋白質をコードする領域
を含んでいる。ｇａｇ−蛋白質をコードするゲノム領域
は５．５ｋｂのＥｃｏＲＩ１ｇｉ片領域、もっと詳しく
はＧｌａＩからＢＣＪ！ Ｉまでの領域に存在する。 本発明による蛋白τ１を得る目的で、本発明においては
ＨＴ Ｌ Ｖ −１［［遺伝子を一個またはそれ以上の
ｆｌ、ＩＩ限解素で切断し、ＱａＱ蛋白質をコードする
遺伝子を含む断片を得た。得られる断１１をプロモータ
ーと連結してプロモーターがｇａｑ蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列と機能的に結合して存在する遺伝子を作成す
る。この結合の際に、後に宿主中で発現した時に蛋白質
のアミノ末端に改変が生じるようになる。次に、プロモ
ーターとトＩ Ｔ Ｌ Ｖ−ｍのｑａｑ蛋白質をコード
するＤＮＡ配列を有する遺伝子をプラスミド或いは適当
な宿主微生物中で複製可能な発現ベクターに挿入し、プ
ロモーターとＩ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ−ＩＩＩのｑａａ−蛋
白質をコードするＤＮＡ配列とを機能的に連結して保有
する。プラスミド或いは発現ベクターを作製する。 現在の技術では、本発明に適切な多くのプロモーター系
および適当な微生物宿主が入手可能である。また、Ｈ丁
ＬＶ＝Ｉ［ＩのＯａ Ｑ蛋白質を＝１−ドする遺伝子を
挿入することのできる各秤プラスミドらある。一般には
、宿主細胞と適合性のある種に由来する複製および調節
配列を有するプラスミド発現ベクターをその宿主と組合
せて用いる。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉはＥ、ｃｏｌｉ山来
の由来スミドｏ Ｂ Ｒ３２２を用いて形質転換するこ
とが多い。酵母を用いる場合、例えばＳ、ｃｃｒｃｖｉ
ｓｉａｅではｐＹＥ ７の、ようなプラスミドが通常利
用される。 本発明によれば、使用りる宿主およびプラスミドと適合
したどんなプロし一ターでも利用できる。 Ｅ、ｃｏｌｉでの組換えＤＮＡ構築に用いるプロモータ
ーとしては、Ｃｈａｎ（Ｊら、ＮａＬｕｒｃ２７５巻；
６１５頁（１９７８年）、板０ら、５ｃｉｅｎｃｅ 、
１９８巻：１０５６頁（１９７７年）に記載されてい
るβ−ラクタマー４４（ペニシリナーピ）およびラクト
ースプロモーター、Ａｕｄｃｒｓｃｎら、Ｈｏ１．Ｃｅ
１．Ｂｉｏｌ、３巻： ５６２−５６９頁（１９８３年
）に記載されているプロモーター系、およびＧＯｅｄｄ
（ｊ ｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｉｔｅｓ、
８巻：４０５７頁（１９８０イ１）おＪ：びＥＰＯＰＯ
３Ｈｏ、００３６７７６に記載されているトリプトファ
ンプロモーターなどがある。ＡＷＩの場合はＢｒｏａｃ
ｌｒらのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｏｎ ｏｒ Ｇｅｎｅ ［ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （１
９８３年）中、［８，Ｉｎｏｕｙｅ ｍ集、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｉ’ｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ、Ｙ ］
８３−１１７頁に総説されているＡＤＣｌ、ＧＡＬｌ、
ＧＡＬＩＯ１ｒ’ＨＯ５、ＰＧＫｌおよびＧＡＰＩなど
が用いられるが、これらに限定されるものではない。以
上に挙げたもオヂド配列も報告されていて関連技術に熟
練している名はそれらを機能的に連結して形質転換ベク
ター中で遺伝子と相互作用できるように作成することが
出来る［５ｉｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅ１ｌ、 ２Ｏｆｆ
、２６９頁（１９８０年）］。 二重鎖ＤＮＡをクロ−ニグするためには広い範囲の宿主
／クローニングベクターの組合ゼを用いる。例えば、有
用なりローニングベクターとは、例えばｐＢＲ３２２の
ようなＥ、ｃｏｌｉプラスミド、ファージＤＮＡ、ファ
ージＤＮＡを使用するよう改変したプラスミドのような
プラスミドとファージＤＮＡ組合せに由来するベクター
、他の発現調節配列或いは酵母プラスミドなど、染色体
ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡおよび合成りＮＡ配列より成る
。 有用な宿１としては微生物、動物ＩＩＯ胞、植物細胞等
が含まれる。中でも微生物および動物細胞が好ましく使
用される。好ましい微生物としては、Ｓ、 ｃｃｒｃｖ
ｉｓｉａｅのような１ｆｆｌおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｔｃａｒ。 ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ＩｕｓおよびＡｃｔ １ｖｏａｉ
ｙｃｃｓのようなバクテリアがある。上述のベクターお
よび宿↑は本発明で生物的に得られる遺伝子から蛋白質
を生産】るためにｂ利用される。勿論、全ての宿主／ベ
クターの組合せが同等に有効な訳ではない。宿主／ベク
ターの特定の組合せの選択は技術に熟練した者が本発明
の範囲から逸脱することなく原理に先りづき思ぢして行
なうらのである。 さらに、個々のクローニングベクターの中で二重鎖ＯＮ
への挿入部位として多くの１ｎ所を選択できる。それら
の部位は通常切断する制限酵素名で命名される。例えば
、ｐＢＲ３２２にＪ３いてＥ ＣＯＲＩ部位はアンピシ
リン耐性を］−ドする遺伝子のりぐ外側に（を置してい
る。いろいろな部位が多くの人によりその組換え体合成
設計に用いられてきている。その技術に熟練している者
にとってはいくつかの部位はよく精通している。勿論本
発ｒｇｌに有効なりローニングベクターは選択したＤＮ
Ａ断片を挿入するのに必ずしも制限酵素切断部位を有す
る必要はない。その代りにベクターと断片とを別の方法
で結合する。 ベクター或いはり０−ニングベクター、および特に組換
えＤＮＡ分子を作成するための選択したＤＮＡｌｌｉ片
挿入の部位は神々の因子により決定する。例えば、特定
の制限酵素の切断部位の数、発現しようとする蛋白７１
の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する目的蛋
白質の感受性、発現Ｊ−る蛋白質の、ｌｌ’ｊ製中分製
置分離困難細胞由来蛋白質による汚染、開始および終了
コドンのベクター配９１１中での相対的位置など発現の
特性、ａ３よびその他技術に熟練した者が理解する要因
などがある。ベクターと特定遺伝子挿入の位置の選択は
これらの要因のバランスにより決定されるもので各ケー
スににり全での選択が同等に有効な訳ではない。 ＯＮΔＮＡ配列ローニングベクターに挿入して組換えＤ
ＮＡを作成するため木兄１月で有用な公知の方法がいく
つかある。例えば、直接結合、合成リンカ−１制限酵素
およびポリメラーゼ連動外複反応と続く結合反応、また
はＤＮＡ！’ｌをＤＮＡポリメラーゼと適当な−Φ鎖鋳
型とで延長してからの結合反応などである。 勿論、クローニングベクターの選択部位に挿入するＤＮ
Ａ断片のヌクレオチド配列は目的のポリペプチド／蛋白
質に対する実際の構造遺伝子でないヌクレオブトを含む
事も、或いは目的蛋白質の全構造遺伝子の断片のみ含む
石もあるのはＦＪ！ Ｍされることである。どのような
りＮＡ配列が挿入されようども、形質転換宿主細胞がＡ
ＩＤＳＱａＱ−蛋白質に対する免疫活性を有する蛋白質
／ペプチドを生成すること、或いはＤＮＡＮＡ配列れ自
体がＡＩＤＳａａａ−蛋白１１に対する免疫活性を有す
ポリペプチド／蛋白質の生産に有用なりＮＡ配列を含有
するクローンを選択するハイブリダイゼーションプロー
ブとして有用であることのみが必要ぐある。 異秤遺伝子を含むり０−ニングベクターまたはベクター
を用いて宿主を形質転換し、宿主に組換えＤＮＡがコー
ド１゛る蛋白質またはその一部を発現させる。適当な宿
主の選択もその技術で叩解される多くの要因により支配
される。例えば、選んだベクターとの適合性、組換えプ
ラスミドによりコードされる蛋白質の毒性、目的蛋白質
の回収の容易さ、発現特性、生物安全性およびＩｆ費な
どが挙げられる。これらの要因のバランスがＩｆであり
、従って特定の組換えＤＮＡ分子に対して全ての宿主が
同じように有効ではない。 ｑａａｌｔ伝子の発信子行なうことのできる微生物が作
成されれば、本発明の工程はａａａ；ＩＩ伝信子発現ベ
クターの構築の性状や宿主の生育特例によりいろいろな
方法により実行できる。典型的には、宿主微生物を多聞
のＩＩＩＪｌｌを生産するのに都合の良い条件下で培養
する。多聞の細胞が蓄積したら、培地中の適当な誘導剤
または抑制剤が遺伝子配列中に存在するプロモーターを
介してコード配列の転写および翻訳を活性化する。組換
え細胞により生産される蛋白質はこの技術で周知の普通
の方法により溶菌抽出される。溶菌抽出の方法は使用す
る宿主に依存する。 本発明の好ましい実施態様では、ｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ
−ＩＩＩＱａＱ’ｌｌ伝子をりん酸培地信子は活性化さ
れないプロモーターを有Ｊる酵母発現ベクターに挿入す
る。そのようなプロモーター１；１Ｔｈｉｌｌ ら、Ｈ
ｏｌ。 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、３巻、５７０−５７９頁（１９８
３年）に記載されているＰ Ｈ０５より得られる。ｑａ
ｑ逍伝遺伝ｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ−１［１りｎ −ンλＨ
Ｘ Ｂ −３［Ｓｈａｗら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２６
巻、１１６５−１１７１頁（１９８４年）］からの５．
５ｋｂＥｃｏＲ１断片より得られる。これは第１−Ａ図
に示す１」丁Ｌ Ｖ −１［１ゲノムのＦｃ ｏ Ｒｒ
Ｉｇｉ片である。 第１−［３図にＰＨＯ５プロし一ターおよび第１Δ図の
ｇａｇ遺伝子断片を含有する雑種遺伝子の作成を図示す
る。酵母プロモーターＪ３よび翻訳開始部位は、抑ｉ！
＋ｌＩ型酸竹）Ａ°スファクーピの遺伝子、ＰＨＯ５、
に由来する５６０ｂｐの８８ｍＨＩからＡｈａＩＩＩま
での制限酵素断片上にある。制限ｈデ素ＡｈａＩＩＩｌ
は第１−８図からもわかるように、Ｐ Ｈ０５の二番目
のコドンの直ぐ後ろで平滑末端を作る。５．５ＫｄのＥ
Ｃ０ＲＩ断片中）ａ ａ ａ遺伝子をＰＨＯ５に由来す
る３ ａ ｍ Ｉ−Ｉ ＩからＡｈａｌｆｆまでの断片
から（９られるプロモーターと結合する。ＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩクローンからのＥｃｏＲＩｆＩｉ片はｑａａ全道伝
子信子びａａａ３ｍ伝子と異信子読みワクで重複してい
るｐｏＩｉ伝子の信子の部分を含ｌυでいる（ Ｒａｔ
ｕｅｒら、前述；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら
、前述： Ｍａｉｎ−１１０ｂｓＯｎら、前述：および
ＨｕＯ３ｉｎＱら、前述）、ＥｃｏＲＩ断片＠ｑａａ遺
伝子のアミノ末端の近くでＣｌａＩＩＪＪ所し、得られ
る５′の一本鎖をＤＮＡポリメラーゼの大断片で柊復し
てアルギニンのコドンで始まる平滑末端ＤＮＡ分子を作
成する。この末端をｒ’ Ｈ０５断片のＡｈａＩ［ｌ末
端と結合することにＪ、すＰ Ｈ０５のプロモーターと
最初の二つのコドンをｇａｑ遺伝子の１５コドンと融合
したことになる。 上述のようにして調製した融合遺伝子は次に酵母および
Ｅ、ｃｏｌｉの両方で複製可能なベクター、ｐＹＦ７ベ
クターに挿入する。この組換えプラスミドをｐＹＥ７２
／ｃｘａａｌと命名した。得られたプラスミドを用いて
酵母を形質転換した。 プロモーターをＱａＱ′Ｍ伝子に融信子るこの結合反応
を行なうにはいかなる周知の結合方払でも利用できる。 ＱａＱ遺伝子を発現する組換え微生物を創製するには、
例えば酵母のような微生物をプラスミドで形質転換する
周知の方法が利用できる。 ｐＹＥ７２１０ａＱ１と命名したプラスミド中のＰＨＯ
５プロモーターはりん酸非含石培地で培養することによ
り酵母細胞中で誘導され、細胞抽出物について破砕ウィ
ルスに対するウリギボリク０−ナル抗血清を用いた免疫
プロット分析によりＱａＱ−特異蛋白質の存在を調べた
結果が第２図のどおりである。第２図中でカラム１と記
しているのは高濃度りんＭ培地で培養した１）ＹＥ７２
／（３８ｍ１保右細胞、カラム２はｐＹＥ７２／ｇａｇ
１保有細胞をりん酸非含有培地中でＪ８差した細胞の結
果である。記載しである分子量は反応した蛋白質の大き
さを決定するのに用いた。第２図からもわかるように、
プロモーターが（ｊａＱ蛋白質を生産するよう活性化さ
れないりん酸含有培地中ではＱａＱ遺伝子は発現してい
ない。逆に同じ細胞をりん酸鼻含有培地で培養すると、
細胞抽出物中に９８ｇ蛋白質およびそれに由来する種々
の分解蛋白質に対応する免疫反応性の蛋白質が生産され
ている。 第２図のカラム２に見られるように、生産された主要免
疫反応性蛋白質はその大きさがウィルス粒子中で同定さ
れるｌ−ｌ Ｔ Ｌ Ｖ −ｍ ｐ２４ Ｇ ａ Ｑ
（５白質に相当し、公知のＤＮＡ配列からその大きさも
推定される。ｐｌ４およびｐ１６蛋白質で予想される大
きさの反応性分子種も検出される。およそ５６Ｋｄの大
きさの全ＱａＱ蛋白質に相当する大分子間蛋白質および
蛋白分解中間体のおよそ４０Ｋｄのいくつかの分子種も
生産されている。 組換えＨＴＬＶ−ｆｆｌａａｇ蛋白質が酵母中で実際に
蛋白分解プロセスを受けてウィルス特有の分解蛋白質を
生産するのかどうか調べるため、ＤＹＥ７２／ＱａＱ１
で形質転換した酵母の細胞抽出物から得た蛋白質で３３
５−メチオニンまたは３２ｐｏ４をもちいてパルス追跡
実験を行なった。 第３図はその結果を示し、それぞれのカラムは追跡時間
を表わす：Ａ）０分、Ｂ）２分、Ｃ）５分、Ｄ）１０分
、Ｅ）２０分、Ｆ）３０分、 Ｇ）４５分である。いず
れにしても５６Ｋｄの完全なＱａＣ）蛋白質の放射活性
が先ず検出される。第２図で見られたおよそ２５Ｋｄの
蛋白質も２４Ｋｄ蛋白質の前に検出されるため、その直
接の前駆体であろう。１６Ｋｄと考えられる移動を示す
蛋白質も検出される。Ｑａｇ逍伝子のｐ１４部位はメチ
オニンを含有しない。従って本蛋白質を検出できないと
いう事【よその山東が予想通りであることを支持する。 酵母で生産される組換えＱ ａ Ｑ蛋白質のりん酸化を
調（るためｐＹＥ７２／ｑａｇｌで形質転換した酵母細
胞を ＰＯ２を含む低りん酸培地で培養した。第３図の
カラムＨおよびＩがウサギＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体と免疫
沈殿した放射性蛋白質のゲル分析結果である。形質転換
酵母を用いたカラム１−１では５６Ｋｄ１４０Ｋｄ中間
体の一つ、２５Ｋｄ、２４Ｋｄおよび１６Ｋｄの分子棒
金てが放射性であった。高濃度ゲルで分析した時１４Ｋ
ｄバンドの位置に放射活性を検出できなかった。従って
ｐ２４ Ｊ３よびｐｌ ６ＱａＣＪ蛋白質は酵母中でり
ん酸化されると考えられる。形質転換しない酵母からは
カラムＩに示す通りＱａＱ蛋白質は検出されない。 第１Ａ図でわかるとおり、Ｑａ（ＪＭ伝信子コード領域
のカルボ４シル末端近くにＢＣＪＩ ＩＩ制限部位が存
在することにより、５．５ＫｄＥｃｏｔＬＴ断片中にあ
るｐ１６コード領域のおよそ半分およびほとんどのｐＯ
１遺伝子を除去することができる。 多くのレトロウィルスでＱａｇポリプロティンのカルボ
ニル末端部分および／またはｐＯ１逍伝遺伝アミノ末端
領域がプロセスのためのプロテアーゼをコードしている
ことがわかっている（例えばＤｉＣｋＳＯｎら、前述、
を参照のこと）。 組換え０８ｇ蛋白質からプロテアーゼを除去するために
ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムのＥＣ０ＲＩ所片からＢａＪＩ
ＩからＥＣｏＲＩ部分を除去した（第１Ｂ図参照）。ｇ
ａｇ遺伝子の除去した部分が大ぎい組換えＱａｇ蛋白質
を種々の成熟蛋白質種に変換するプロテアーゼをコード
していると考えられる。従って、遺伝子またはプラスミ
ドをＢＱＩｌｎで処理することにより第１Ｂ図のＢ ａ
ｍ ＨＩ −ＥｃｏＲＩ遺伝子を切断し、本遺伝子か
らＢＱｊ！ ［−ＥｃｏＲＩ断片を除去することが出来
る。発現プラスミドｐＹＥ７２／ｇａｏ１を用いる場合
にはＢａｍＨ工と１３０１Ｍで洞化することによりこの
プラスミドをｋｍ ’ＦＡできる。このＥＣ０ＲＩ断片
のＢ ａ ｍ ｌ−１１からＤａｌＴＩまでの部分が１
ｑられたら、使用とする微生物により適当なプラスミド
に挿入できる。この遺伝子断片をプラスミドに挿入する
にはこの断片に目的プラスミドに挿入できるＤＮＡ塩塁
を結合することが必要である。ｐＹＥ７を用いる場合に
は、Ｂ ａ ｍ ＨＩからＢａＩＩＩまでの断片とｐＢ
Ｒ３２２からの３７５ｂｐＢａｍＨＩ−ＩＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片を連結してｐＹＥ ７に挿入し、ｐＹＥ７２１０
ａａ２を構築する。 本発明のもう一つの実施態様としてｇａｇ遺伝子の他の
変異をｐＯ１遺伝子のｇａ９のすぐ下流のＢＣＩ工υ１
限部位に導入したｐＹＥ７２／ＱａＱ３がある。本′Ｒ
′ＡはＢｃオニ部位に４塩基を導入するもので、それに
より第５図に示すようにｐｏｌの読みワクにフレームシ
フ１−が起る。第５図にａａｏ遺伝子のカルボニル末端
コード領域およびｐＯｆｍ伝子のツード領域のアミノ末
端を示す。この図の中で他のＱａＱブロテアーピと相同
性のある部分に下線を施しである。ＢＣｊ！Ｉ部位のｍ
塁挿入により出来た読みワクを矢印で記した。 ピリオドは翻訳終了部位を示す。ｔ＝ｉ挿入により起っ
たフレームシフトによりａａａｆｆｉ白質を蛋白分解す
るプロテアーゼの生産を不活化する。 完全な組換えｇａｇ道伝子信子び切断ａａａｉ伝から生
成する産物を第４図に示す。第４図のカラム１はｐＹＥ
７２／Ｑａｇ１により誘導した細胞の抽出物からの免疫
プロットである。第４図のカラム２はｐＹＥ７２／ａａ
ａ２で誘導した細胞抽出物の免疫プロットであり、カラ
ム３はｐＹＥ７２／（Ｊａ（Ｊａにより誘導した細胞抽
出物の免疫プロットである。明らかなとおり、ｐＹＥ７
２／Ｑ ａ Ｑ １および３は大蛋白質ｐ５６を生産す
る。 ｐＹＥ７２／ｇａｇ３では免疫反応性を示ず主要蛋白質
バンドはおよそ５６Ｋｄであり、ｐＹＥ７２／Ｑａｇ１
で誘導した細胞で見られる予想前駆体と同じ移動度を示
した。しかし、変異の結果、この組換えＱａｇ前駆体の
プロセシングが阻止されているしのと思われる。削除変
異ではｐＹＥ７２１０ａｑ１で誘導した細胞で見られる
蛋白質と比較してｐ２４蛋白質のｖｄが少ない。５６Ｋ
ｄ生成物および低分子秤に加えて、フレームシフ１〜変
異ではおよそ６０Ｋｄのバンドが検出される。この大き
さはＢＣＩＴ挿入の結果１１成されるｇａＣ１／ｐＯｌ
融合生成物が第５図に示す翻訳終了で出来たものと一致
する。 ＡＩＤＳ血清のスクリーニング 抗ＨＴＬＶ−１抗体はＡＩＤｓｆｆｉ者の９０％以上に
検出されるため、微生物により合成したｑａａ遺伝子生
成子生成物ような抗体を検出するための診断用道具とし
て使用できる。本分析のためには第６Ａ図および第６Ｂ
図に見られるように、ｐＹＥ７２１０ａａｌで誘導した
醇母ＩｏＩｌｌからの全細胞蛋白質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ
で分画し、ウェスタンブロッティング法を用いてニドＯ
セルロースフィルターに移す。転写した蛋白質を含有す
るフィルターを１０００倍希釈したヒト血清と反応させ
、抗原−抗体複合体の生成はフィルターを１２５−沃素
標識の５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプ
ロティン八とインキへベートした後、オートラジオグラ
フィーにより検出する。ＡＩＤＳ症候ｍｌからの血清を
用いると５６Ｋｄ１２４Ｋｄ、１６Ｋｄおよび１４Ｋｄ
？５白質に対する抗体の反応に対応した顕著なバンドが
必ず観察される。東部海岸の患者からの１１個の血清試
料の分析結果の一例が第６Ａ図に、西部海岸の患者から
の１１試料の同様な結果が第６Ｂ図に示しである。陰性
対照（示してないが）としては正常と］・血液を用いた
。健康人からの血清では反応は全く観察されなかった。 従って、組換えａａｑ遺伝子産物は、ＩＤｓ関連の抗体
を検出する診断試薬として利用できると考えられる。本
発明の組換えｇａｑ遺伝子産物は蛋白質分子の大部分を
包含するものであって分子の保存された部分および変化
した部分の両方を含むものである。ＨＴＬＶ−ＩＩＩお
よびＡＲＶ−２の配列の間には違いがあるにも拘らず、
本発明によるバクテリアにより生成した組換えＱａＱ蛋
白質産物は米国の両側に位置する所からのＡＩＤＳ患者
血清両方に反応する。試験したＡＩＤＳｔＪｔ者血清（
米国東海岸からの１１名、カリフォルニアからの１１名
を含む２２人の試Ｆｌ ＞の１００％が高い反応性を示
した。この事は分子中に保存されているエピトープが存
在し、それに対して免疫系が抗体反応をのせることが出
来るという事の強い証拠である。ヒト免疫系はｇａｇ蛋
白質分子の保存性エピトープに対してＡｌ０８ｔｌ！ｌ
？ｌｒ血清の反応性により免疫応答を示しているのであ
ろう。 これらの発見に基づいて、後天性免疫不全症候群（Ａｌ
ｌ）Ｓ）についての血液検索の実施に際して本発明にＪ
：るＡＩ ＤＳＩＩ換え９８ｇ蛋白質生成物が利用でき
るという事を提言できる。本発明の蛋白質産物を利用し
てヒト血液についてＡＩＤＳウィルスに対する抗体の存
在を検索できる。本方法も他の方法も容易に限定される
。本発明の前述およびその他の目的、特徴および利点は
以下に示す本発明の好ましい実施態様の例から明かであ
る。 実施例中の［、ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１株はＣａ５ａ
ｄａｂａｎらにより、Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 １３
８巻、１７９−２０７頁＜１９８０年）に記載されてい
るものと同じである。非メチル化ＤＮＡＷＡ’！！に用
いたＥ、ｃｏｌｉ ＧＭ １１９株はＡｒｒａｊらニ
ヨＰ）Ｊ。 Ｂａｃｔ、 １５３３．５６２−５６３頁（１９８３年
）中に記載されているものである。Ｅ、ｃｏｌｉ Ｍ
Ｃ１０６１株および０Ｍ１１９株はＡｎ＋ｅｒｉｃａ
ｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
（Ａ Ｔ ＣＣ＞に１９８５年１１月２６日付けでそれ
ぞれ寄託番号ＡＴＣＣ５３３３８および△ＴＣＣ５３３
３９として寄：［されている。実施例５で使用Ｊ８酵母
発現プラスミドｐＹＥ ７は参考文献として引用したヨ
ーロッパ特許出Ｊｉ’ｉＮｏ、 ０１２４８２４ （７
）実／Ｊ！ＭＪ５にヒ第６図に記載されているものと同
じである。使用した酵母はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２
ＯＢ −１２（△ＴＣ０２０６２６）である。ＷＪ母
の形質転換は旧ｎｎｅｎらによりＰｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 、 ＬＪＳＡ、 ７５巻、１９２
９−１９３４頁（１９７８年）に記載されているとおり
行なった。プロモーター作成に利用したＰ Ｈ０５Ｍ転
子はＡｎｄｅｒｓｅｎらによりＨｏ１．Ｃｅ１ｌＢｉｏ
１３ｉ、５６２−５６９′ｒＡ（１９８３年）に記載さ
れているプラスミドｐＡＰ２０から調製した。使用した
λＩ−Ｉ Ｘ Ｂ −３は５ｈａＷらにより５ｃｉｅｎ
ｃ０２２６巻、１１６５−１１７１頁（１９８４年）に
記載されている通りである。 実施例１ ｐＹＦ７２／ｇａｑ１のｆｆ１Ｍ 制限酵素およびＤＮＡ修飾醇索は供給元の指示通りに使
用した。制限酵素による消化は全て３７℃で１時間、０
．５−１．０単位の酵素を用い、５０１８ ＮａＣｌ
、１０ｍＨトリス塩酸、１１７．４．１０ｍ１４ Ｍ
ＱＣＪ！ 、１１Ｍジチオスライト−ル（ＤＴＴ）中
で行なった。ＰＨＯ５プロモーターおよび翻訳開始領域
を有する５６０ｂｐのＢａｍＨＩからＡｈａｌ［Ｉまで
の断片はプラスミドｐＡＰ２０から得られ、ａａｏ／ｐ
ｏｊ！領域を含有するＣｌａＩからＥＣ０ＲＩまでの断
片はλト３のＣｌａＩ−３より得られた。５．５ｋｂの
ＥＣ０ＲＩ断片はｐＢＲ３２２にサブクローンされ、Ｅ
、ｃｏｌｉ ＧＭ １１９で増幅させた。ＣｌａＩ−
ＥｃｏＲＩ断片のＣｊ！ａＩ５’末端は４種ノテオキシ
リボヌクレＡヂド５０μＭの存在下、Ｅ、ｃｏｌｉＤ
Ｎ Ａボリメラーゼエのフレナラ断片５ユニットを用い
１６℃２時間、上述の制限酵素消化で用いたと同じ緩衝
液中で埋める。 およそ等量のＢａｍＨＩ−Ａｈａｌ［［ＰＨＯ５断片と
Ｃｌ！ａＩ（充１ｉ ） Ｅ ＣＯＲＩ Ｑ ａ Ｑ
／ｐ０１断片とを１．０単位のＴ ４． Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼで１６℃１６時間、５０ｆｆｌＨトリス塩酸、
ｒｌＨ７，８，１０ｍＨＶＩＯＣ！ 、２０ｍＨＤＴＴ
。 １ ｎ＋Ｈｄ Ａ Ｔ Ｐ中で処理する。生成物をＢａ
ｍＨＩおよび［ＥＣ０ＲＴで切断し、ＰＨＯ５−ｇａ（
ｊ／ｐ０１融合体を予めＢ ａ ｍ ＨＩとＥＣ０ＲＩ
で切断したｐＹＥ ７にライゲーションにより挿入する
。得られた発現プラスミドをｐＹＥ７２／ａａａ１で命
名する。 実施例２ ｐＹＥ７２１０ａａ２の調製 ＱａＱのカルボキシル末端部分およびｐＯｌの全てを除
去した欠失を０ＹＥ７２／ＱａにＪ１を３ ａ ｍ Ｈ
ＩおよびＢＱＪ ＩＩにより消化し、ＰＨＯ５−ｏａｑ
断片を中麺することにより性成した。 これをｐ［［３２２からの３７５ｂｌ）ＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片とＢｇｊ！ ＩＩ部位で、ＢＱＩ ＩＩと
Ｑ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉの５′末端が同一であることに
より結合した。この断片をｐＹＥ ７に挿入してＤＹＥ
７２／にＩ ａ Ｑ ２を１きノだ。 実施例３ ｐＹＥ７２／ＣＪａＱ３の調製 ｑａａのすぐ”Ｆ流のｐｏＩ遺伝子信子）Ｂｃｌ１部位
に伯の変異を導入した。ＢＣｊ！ Ｉはメブル化ＤＮＡ
を切断しないため、ｐＹＥ７２／ＱａＱ１を［、ｃｏｌ
ｉ ＧＭ １１９に導入し、それからＤＮＡを調製し
てＢＣ１■で切断した。５′末端を上述のとおりフレナ
ラ断片で二重鎖とし、平滑末端ライゲージコンによりプ
ラスミドを１２１ｙ：Ｉシた。ｉ９られたＢｃｌ Ｉ部
位４ｂｌ）ＧＡＴＣ挿入を有するプラスミドをｐＹＥ７
２／ＣＪａｇ３と命名しＩζ。 酵母菌株Ｓ、ｃｃｒｅｖｉｓｉａｃ２０ Ｂ −１２の
ｇａｑ発現プラスミド含有株および挿入遺伝子を持たな
いベクター含有株を別々にｙ ＣＡ Ｄ Ｊａ地中で生
ｎし、ＫｒａｍｅｒらによりＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ ＳＡ、８１巻、３６７−３７０
頁（１９８４年）に記載されるようにりん酸鼻含有培地
で誘導した。りん酸鼻含有培地に移してからおよそ６時
間後に細胞を遠心分離により集め、ブ七う−ピ６０００
（Ｔ、Ｋａｎｅｋｏ、に、に１ｔａｎ＋Ｕｒａ 、およ
びＹ、 ＹａｌｌｌａｌｌｌＯｔＯ，八ｇｒ。 ８ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、 ３７ サ、２２９５頁（１９７
３年））によりスフエロプラスとを調製し、集めたスフ
ェロプラストは通常−２０℃に保存して分析に供した。 蛋白質の精製にはスフェロプラストの代りに全細胞を集
めて凍結した。 実施例５ 絹換えｏａＱ蛋白質生成物の精製 均一な組換えｑａｑ蛋白質またはその蛋白質分解生成物
は以下の方法で精製できる。誘々ＷＩＮ櫂胞を標ｒｌ（
の物理的方法で破砕づる。即ら、フレンチプレスを通す
またはＢｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ （ビーズビータ−）
、Ｄｙｎａ−ＩＩＩ＜ダイナミル）或いはｅｒａｕｎ
ｌｌｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ （ブラウンホ七ジナイＩ
Ｊ”−）のような撹拌機の中でガラス粒子と速く撹拌Ｊ
るなどである。上記いずれの場合でｔ）細胞ベーストを
およそ２倍音ω（＃Ｉ胞ペーストに対して）の５ＱｍＨ
りん酸ブトリ・クム（Ｎａ３［）０４）緩衝液ｐＨ７，
４に再懸濁する。ガラス粒子による破砕の場合には等容
品の０．５＃ガラスピーズを加える。 破砕はフレンチプレスを２０．０ＯＯｐ、ｓ、ｉで３回
通ηか、或いは撹拌機の製造元の指示するようにして完
了する。細胞破砕は顕鎖により追跡できる。 細胞破砕に続いてｍ胞残渣（およびガラス粒子）を６０
０Ｘ９１０分間の遠心分子１ｆｉ２回で除去する。 続＜１２，０ＯＯＸり、２０分間の遠心分離によりミト
コンドリアを除去する。次に蛋白質を１００．０ＯＯＸ
ｇ１０５間の遠心分離によりペレット（ミクロゾーム画
分）と上ｉｌｌ液（可溶性画分）とに分画する。ＣＪａ
Ｑ蛋白質がミクロゾーム画分にある場合には精製の前に
各種イＡ°ン竹Ｊ３よび／または非イオン竹界面活性剤
或いは尿素或いはグアニジン塩酸のＪ、うな不活化剤に
よる可溶化が必要である。 標へ１的クロマトグラフイ一手法によりざらにｌ１１製
を行なうことができる。グル濾過、イＡン交換クロマト
グラフィー、および／またはアフイニデイクロマトグラ
フイーによる分画にいろいろな担体が利用できる。ｇａ
ｇ蛋白質は核酸に結合するので一小鎖ＤＮＡセルロース
アフイニアイクロマトグラフイーが０用であろう。 最後の精製ステップとして逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（Ｉ」Ｐ Ｌ Ｃ）が使用できる。 ＨＰ Ｌ、 Ｃステップにより前駆体ｇａｇ蛋白質＋＋
３ Ｊ：びそれに由来する天然型分解蛋白質を実質１０
０％の純度で得られる。また前駆体ＱａＱ蛋白質および
天然型分解蛋白質に対するｑａｑポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を利用したモノクローナル抗体アフ
イニテイクロマトグラフイーカラムもｌ（Ｐ Ｌ Ｃの
代りに使うことができると考えられる。 上述の精製工程により以下の生成物が得られる。 第８図に示す構造を有する５６Ｋｄ蛋白質。 第１０図に示す構造を有す２４Ｋｄ蛋白質。 第１２図に示す構造を有す１６Ｋｄ蛋白質。 第１４図に示ず構造を有する１４Ｋｄ蛋白質。 第１６図に示す構造を有す４８Ｋｄ蛋白質。 第２図、第３図、第４図、第６Ａ図および第６Ｂ図の免
疫プロット分析には、スフェロプラストベレット（およ
そ１０８個の細胞）を等量の２倍１５ Ｈｆ１１−ａｅ
ｍｍ Ｉ ｉ緩衝液（Ｌａｃｎｍｌｉ、 ” Ｃｌｅａ
ｖａｇｅ ｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ Ｄｕｒｉｎ（ｌ ｔｈｅ Ａｓ５ｅｎ＋ｂｌ
ｙ ｏｆｔｈｅ １ｌｃａｄ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ ４ ” 、Ｎａｔｕｒｅ２
２７巻、６Ｂ−６８５頁、１９７０年）に再けん濁する
ことによりｌｌｌ１Ｉ胞を溶菌し、９５℃５分間インキ
ュベートする。細胞残渣を遠心分離により沈澱し、透明
な抽出液を５Ｏ８−ＰＡＧＥ分析にか番ノる。ウェスタ
ンプロット分析にはアクリルアミドゲルの蛋白質を０．
１μｍのニトロセルロースＷ；！ （５ｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒおよび５（ｈｕｃｌｌ ）に１２．５ｍＨトリス、
９５ｍＮグリシン、２０％メタノール、０．０１％ＳＤ
Ｓ中ｐＨ７，５，５０Ｖで１６時間電気プロットを行な
う。プロットの処理はＴｏｗｂ ｉ ｎらにより“Ｅｌ
ｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏ
ｒＰｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａ
ｍｉｄｅ Ｇｅ１ｓ ｔ。 Ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ５ｈｅｅｔ ： Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ５Ｏ１ｅ＾ｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ” 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、 ＬＩＳＡ１７６巻、４３５０−４３５４頁（１９
７９年）中に記載されている方法を用いて行なった。ヒ
ト血清の処理には、プロットを抗体緩衝液（０，５ＭＮ
ａＣ１，１％ＢＳＡおよび０．０５％ｒｗｅｅｎ ２０
含右の２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液、ｐ１１７．５
）で１０００１８に希釈したヒ１〜血清と２〜６時間イ
ンキュベー１・する。次にプロットを０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ ２０含有のりん酸緩衝塩溶液で２回洗滌し、続い
てさらに１時間１２５−Ｉ−標識の５ｔａｐｌ＋ｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｃｕｓ△蛋白質とインキュベート
する。次にブロワｉ−をＰ Ｂ Ｓ −１’ｗａｃｎ
２０状衝液で２回洗滌し、乾燥侵オートラジオグラフィ
ー分析する。 実施例７ 細胞の標識 第３図に示ケパルスチェース免疫沈澱のために細胞を３
５ｓ−メブＡニンパルスブＴ−スまたは３２ρ０４にＪ
：り次の／Ｊ法で標識した。 Ｓ−メチＡニンにＪ、る
バルスブエースには５００ｍＣｉの３５３−メチオニン
を生ｎ培地に添加した。各時間経過１１２７）細胞を集
めて溶菌し、つ１ツギ抗体を用いて免疫沈澱してから溶
菌抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィー分析を行なう。チェースの時間は次のとおりである
。Ａ）０分、Ｂ）２分、Ｃ）５分、口）１０分、Ｅ）２
０分、［）３０分、Ｇ）４５分。カラムト１および■に
示す３２ＰＯ４−標識には、ｌｒｒ＋Ｃ＋の ＰＯ４を
培地、３２ に添加した。標識は３０℃で３０分間行ない、細胞を集
菌して溶菌抽出物について上述と同様に免疫沈澱処理を
した。抽出物は１）ＹＥ７２／ＱａＱ１（Ｈ）を含む細
胞からのものとｇａｑ３１１仏子を含まない同じような
プラスミドを含有する細胞（１）からのものである。 実施例８ ＡＩＤＳ診断テスト 本発明による組換え前駆体ｇａＯ蛋白！１およびイれに
由来する天然型分解蛋白質がＡ［ＤＳ関連抗体検出のた
めの診断試薬として使用できることは明らかである。ま
たこの技術を知る者には組換えｇａｇ前駆蛋白７１また
は蛋白分解生成物に対するポリクローナル或はモノクロ
−フル抗体を用いたＡＩＤＳの診断測定によりヒト血液
中のＡＩＤＳウィルスの存在を検出できることも明らか
である。一つの実施態様として、血液試料中の抗原物質
、こ）ではＡＩＤＳウィルス、が既知品の標識抗原、こ
の場合は標識したＡＩＤＳ組換えｇａｇ前駆蛋白質また
はそれに由来する分解蛋白質、と限られた抗体結合部位
に対して競合する競合免疫アッセイが利用される。即ち
、抗体に結合した標識抗原の＃ｄは試料中の抗原量に反
比例する。 もう一つの実施態様としては、抗原結合抗体と複合体形
成する標識ＡＩＤＳＱａＱ抗体が血液試料中抗原（ＡＩ
ＤＳウィルス）のｈｌと比例している免疫測定法がある
。血液中のＡＩ［）Ｓウィルス存在を判定Ｊるｆ１５車
なプラス−マイナス測定では固体支持体について標識抗
体の自照を検出する。またもう一つの実施態様としては
、組換え前駆体ＡＩＤＳＱａｇ蛋白質またはそれに由来
する天然型分解蛋白質に対するモノクローン抗体を免疫
測定に使用する。イのようなモノクローン抗体は文献で
よく知られるｌｉ法、特にＭｉｌｓｔｃｉｎおよびにｏ
ｈｌｅｒによりＮａｔｕｒｅ２５６ Ｗ、４９５−４９
７１ｆｆ（１９７５年）に報告されている手法により調
製される。本測定に用いる抗原はＩＩ換えｑａｑ前駆体
蛋白質またはそれに由来する分解蛋白質の純品或いはそ
れらの混合物である。 免疫測定法（よ以下の通りである。測定は二連で行ない
、アガロースに固定した１００μｍの抗体懸濁液を１０
０μｌの血清および１００μｍの可溶性 Ｉ−標識抗
体と混合する。１５分から２４時間の間の決まった時間
混合する。インキュベーション時間終了後アガロース粒
子を！ａＩＦｉ液を加えて洗い、遠心分離する。洗滌液
を吸引により除去した後、残ったアガロース粒子につい
て結合した１２５■−ｅＡ識抗体を測定覆る。複合体の
各測定値を対照値と比較する。
第１Δ図はλＨＸＢ−Ｉ Ｘ Ｂ −３クローンの制限
酵素切断部位およびｇａｇ領域の模式図である。第１Ｂ
図はＱａＱ遺伝子の構築を示す模式図である。第２図は
ｐＹＥ７２／ｇａｏｌにより生成する蛋白質の免疫プロ
ット分析を示す電気泳動図である。 第３図はｐＹＥ７２／ａａａｌにより生成する蛋白質の
経時変化を示す電気泳動図である。第４図はｑａｃｌ！
伝子の食信子よる生成蛋白質の免疫プロット分析を示す
電気泳動図である。第５図はλＨＸＢ−３のｇａｇ／ｐ
０１重複領域（７）ＤＮＡ配列を示す模式図である。第
６１よび６Ｂ図はｐＹＥ７２／ｇａｇ１生成蛋白質を抗
原としたＡｌｌ’）Ｓ患省の！ｉ１１液の免疫プロット
分析を示す電気泳動図である。第７図は５６Ｋｄ Ｏ
ａＱ蛋白質前駆体をコードするＩ） Ｎ Ａ配列を示す
模式図である。第８図は５６Ｋｄ ｇａｇ前駆体蛋白
質のアミノ酸配列を示す模式図である。第９図は２ ／
Ｉ Ｋｄｇａｇ分解蛋白質をコードするＤＮＡ配列を水
型模式図である。第１０図は２４Ｋｄｇａり分解？Ｊｉ
白質のアミノ酸配列を示す模式図である。第１１図は１
６Ｋｄｑ；ｉｇ分解蛋白′（１をコードするＤＮＡ配列
を示す模式図である。第１２図は１（５Ｋｄ ｇａｐ
分解蛋白質のアミノ酸配列を示す模式図である。第１３
図は１４Ｋｄｇａｇ分解蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を示す模式図である。第１４図は１４Ｋｄ ｇａｇ分
解蛋白質のアミノ酸配列を示ず模式図である。第１５図
は４８ＫｄＯａｇ分Ｍ蛋分質蛋白質ドするＤＮＡ配列を
示す模式図である。第１６図は４８Ｋｄ ｇａｇ分解
蛋白質のアミノ酸配列を示す模式図である。
酵素切断部位およびｇａｇ領域の模式図である。第１Ｂ
図はＱａＱ遺伝子の構築を示す模式図である。第２図は
ｐＹＥ７２／ｇａｏｌにより生成する蛋白質の免疫プロ
ット分析を示す電気泳動図である。 第３図はｐＹＥ７２／ａａａｌにより生成する蛋白質の
経時変化を示す電気泳動図である。第４図はｑａｃｌ！
伝子の食信子よる生成蛋白質の免疫プロット分析を示す
電気泳動図である。第５図はλＨＸＢ−３のｇａｇ／ｐ
０１重複領域（７）ＤＮＡ配列を示す模式図である。第
６１よび６Ｂ図はｐＹＥ７２／ｇａｇ１生成蛋白質を抗
原としたＡｌｌ’）Ｓ患省の！ｉ１１液の免疫プロット
分析を示す電気泳動図である。第７図は５６Ｋｄ Ｏ
ａＱ蛋白質前駆体をコードするＩ） Ｎ Ａ配列を示す
模式図である。第８図は５６Ｋｄ ｇａｇ前駆体蛋白
質のアミノ酸配列を示す模式図である。第９図は２ ／
Ｉ Ｋｄｇａｇ分解蛋白質をコードするＤＮＡ配列を水
型模式図である。第１０図は２４Ｋｄｇａり分解？Ｊｉ
白質のアミノ酸配列を示す模式図である。第１１図は１
６Ｋｄｑ；ｉｇ分解蛋白′（１をコードするＤＮＡ配列
を示す模式図である。第１２図は１（５Ｋｄ ｇａｐ
分解蛋白質のアミノ酸配列を示す模式図である。第１３
図は１４Ｋｄｇａｇ分解蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を示す模式図である。第１４図は１４Ｋｄ ｇａｇ分
解蛋白質のアミノ酸配列を示ず模式図である。第１５図
は４８ＫｄＯａｇ分Ｍ蛋分質蛋白質ドするＤＮＡ配列を
示す模式図である。第１６図は４８Ｋｄ ｇａｇ分解
蛋白質のアミノ酸配列を示す模式図である。
Claims (47)
- （１）第８図または第１６図に示されるアミノ酸配列を
有するＨＴＬＶ−IIIのｇａｇ蛋白質生成物、或いはそ
の１４Ｋｄ、１６Ｋｄまたは２４Ｋｄの蛋白質分解ポリ
ペプチド断片、もしくは該ポリペプチドを産生する組換
え宿主細胞の変異により起る該ポリペプチドのアミノ酸
置換体である上記いずれかのポリペプチドに関連したポ
リペプチド、と免疫学的に同等なポリペプチド。 - （２）以下のアミノ酸配列を有す５６Ｋｄ前駆体である
特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】 - （３）以下のアミノ酸配列を有する１４Ｋｄの蛋白質分
解断片である特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
。 【アミノ酸配列があります】 - （４）以下のアミノ酸配列を有する４８Ｋｄの蛋白質分
解断片である特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
。 【アミノ酸配列があります】 - （５）以下のアミノ酸配列を有する１６Ｋｄの蛋白質分
解断片である特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
。 【アミノ酸配列があります】 - （６）以下のアミノ酸配列を有する２４Ｋｄの蛋白質分
解断片である特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
。 【アミノ酸配列があります】 - （７）酵母細胞中で発現したＨＴＬＶ−IIIのｇａｇ−
たん白質生成物と免疫学的に同等なポリペプチド。 - （８）特許請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記
載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、該ＤＮＡ
配列を発現できるプロモーターと機能的に連結して有す
る遺伝子部分を含む遺伝子。 - （９）遺伝子部分がλＨＸＢ−３ゲノムの ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ切断断片である特許請求の範囲第
８項記載の遺伝子。 - （１０）プロモーターがＰＨＯ５のＢａｍＨＩ−Ａｈａ
III切断断片である特許請求の範囲第９項記載の遺伝子
。 - （１１）遺伝子部分がλＨＸＢ−３ゲノムのＣｌａＩー
ＥｃｏＲＩ断片のうちのＣｌａＩ−ＢｇｌIII切断断片
である特許請求の範囲第８項記載の遺伝子。 - （１２）プロモーターがＰＨＯ５のＢａｍＨＩ−Ａｈａ
III切断断片である特許請求の範囲第１１項記載の遺伝
子。 - （１３）遺伝子部分がλＨＸＢ−３のＣｌａＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ切断断片であり、該ＣｌａＩ− ＥｃｏＲＩ断片のＢｃｌＩ部位がＧＡＴＣの塩基配列で
うめてある特許請求の範囲第８項記載の遺伝子。 - （１４）プロモーターがＰＨＯ５のＢａｍＨＩ−Ａｈａ
III切断断片である特許請求の範囲第１３項記載の遺伝
子。 - （１５）ＨＴＬＶ−IIIのｇａｇ−たん白質生成物と免
疫学的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
、そのＤＮＡ配列を酵母細胞中で発現させることが出来
るプロモーターと機能的に連結して有する遺伝子部分を
含有する遺伝子。 - （１６）特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
発現させることの出来るプロモーターと機能的に連結し
て該ＤＮＡ配列を有する遺伝子部分を含み、該ポリペプ
チドを発現させることが出来る組換え発現ベクター。 - （１７）遺伝子部分がλＨＸＢ−３ゲノムのＣｌａＩ−
ＥｃｏＲＩ切断断片である特許請求の範囲第１６項記載
のベクター。 - （１８）プロモーターがＰＨＯ５のＢａｍＨＩ−Ａｈａ
III切断断片である特許請求の範囲第１７項記載のベク
ター。 - （１９）遺伝子部分がλＨＸＢ−３ゲノムのＣｌａＩ−
ＥｃｏＲＩ断片の中のＣｌａＩ−ＢｇｌII切断断片であ
る特許請求の範囲第１６項記載のベクター。 - （２０）プロモーターがＰＨＯ５のＢａｍＨＩ−Ａｈａ
III切断断片である特許請求の範囲第１９項記載のベク
ター。 - （２１）遺伝子部分がλＨＸＢ−３のＣｌａＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ切断断片であり、該ＣｌａＩ− ＥｃｏＲＩ断片のＢｃｌＩ部位がＧＡＴＣの塩基配列で
うめてある特許請求の範囲第１６項記載のベクター。 - （２２）プロモーターがＰＨＯ５のＢａｍＨＩ−Ａｈａ
III切断断片である特許請求の範囲第２１項記載のベク
ター。 - （２３）ｐＹＥ７２／ｇａｇ１である特許請求の範囲第
１８項記載のベクター。 - （２４）ｐＹＥ７２／ｇａｇ２である特許請求の範囲第
２０項記載のベクター。 - （２５）ｐＹＥ７２／ｇａｇ３である特許請求の範囲第
２２項記載のベクター。 - （２６）ＨＴＬＶ−IIIのｇａｇ−たん白質生成物に免
疫学的に同等なポリペプチドを酵母で発現させることが
出来、ＨＴＬＶ−IIIｇａｇ−たん白質をコードするＤ
ＮＡ配列を、該ＤＮＡ配列の発現を可能にするプロモー
ターと機能的に連結して有する遺伝子部分を含む組換え
発現ベクター。 - （２７）特許請求の範囲第１６項から第２５項のいずれ
か一つに記載のベクターを持つ形質転換細胞。 - （２８）酵母細胞である特許請求の範囲第２７項記載の
形質転換細胞。 - （２９）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サツカロミセス・
セレビシエ）細胞である特許請求の範囲第２８項記載の
形質転換細胞。 - （３０）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サツカロミセス・
セレビシエ）２０Ｂ−１２である特許請求の範囲第２９
項記載の形質転換細胞。 - （３１）特許請求の範囲第２６項記載のベクターを保有
する形質転換酵母細胞。 - （３２）ワクチンの成分としての特許請求の範囲第１項
から第７項までのいずれか一つに記載のポリペプチド。 - （３３）抗原としての特許請求の範囲第１項から第７項
までのいずれか一つに記載のポリペプチド。 - （３４）特許請求の範囲第１６項から第２５項までのい
ずれか一つに記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換
し、該宿主細胞を培養して蛋白質生成物を発現させ、該
蛋白質生成物を抽出して単離することより成る特許請求
の範囲第１項から第６項までのいずれか一つに記載のポ
リペプチドを生産する方法。 - （３５）宿主細胞が酵母細胞である特許請求の範囲第３
４項記載の方法。 - （３６）酵母細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サツカ
ロミセス・セレビシエ）細胞である特許請求の範囲第３
５項記載の方法。 - （３７）特許請求の範囲第２６項記載の発現ベクターで
酵母細胞を形質転換し、その酵母細胞を培養してたん白
質生成物を発現させ、該たん白質生成物を抽出して単離
することより成るＨＴＬＶ−IIIのｇａｇ−たん白質生
成物と免疫学的に同等なポリペプチドの生産方法。 - （３８）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドを含有する組成物もしくは
その混合物とヒト血液資料とを混合し、該たん白質また
はその天然たん白分解物のいずれか、或いはそれらの混
合物が血液資料中に存在するＡＩＤＳ抗体と結合するか
どうかを調べることより成る、ヒト血液におけるＡＩＤ
Ｓのウィルス性起因物質に対する抗体の存在の試験方法
。 - （３９）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドおよび生理的に容認できる
担体を含むワクチン。 - （４０）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドに対して形成した抗体。 - （４１）モノクロナール抗体である特許請求の範囲第４
０項記載の抗体。 - （４２）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドを保護免疫ワクチンの調製
へ利用すること。 - （４３）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドをＡＩＤＳウィルスに対す
る抗体の調製に利用すること。 - （４４）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドをヒト血液のＡＩＤＳウィ
ルス存在有無試験に利用すること。 - （４５）特許請求の範囲第３４項から第３７項までのい
ずれか一つに記載の方法により調整された、特許請求の
範囲第１項から第７項までのいずれか一つに記載のポリ
ペプチド。 - （４６）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドを容器に含有するＡＩＤＳ
ウィルスに対する抗体の測定試験キット。 - （４７）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
か一つに記載のポリペプチドにより形成したＡＩＤＳウ
ィルスに対する抗体を容器に含むＡＩＤＳウィルス測定
用の試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81664586A | 1986-01-06 | 1986-01-06 | |
| US816645 | 1986-01-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62164696A true JPS62164696A (ja) | 1987-07-21 |
Family
ID=25221244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62000334A Pending JPS62164696A (ja) | 1986-01-06 | 1987-01-05 | ＨＴＬＶ−３ｇａｇ遺伝子の発現 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0230222A1 (ja) |
| JP (1) | JPS62164696A (ja) |
| AU (1) | AU6713287A (ja) |
| DK (1) | DK3687A (ja) |
| NO (1) | NO870027L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01148183A (ja) * | 1987-12-04 | 1989-06-09 | Hiroshi Shibuta | 組み換えワクチニアウイルス |
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| FR2625100A2 (fr) * | 1986-03-13 | 1989-06-30 | Lurhuma Zirimwabagabo | Utilisation d'antigenes pour la preparation de vaccins, proteine rendue immunogene et composition pharmaceutique la comportant |
| US5075211A (en) * | 1986-03-26 | 1991-12-24 | Genetic Systems Corporation | Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease |
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- 1987-01-05 EP EP87100064A patent/EP0230222A1/en not_active Withdrawn
- 1987-01-05 JP JP62000334A patent/JPS62164696A/ja active Pending
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