JPS62149625A - 生理活性物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｕ産業上の利用分野］ 本発明は、迫伝子組換え技術を利用した生理活性物質の
製造方法に関する。さらに詳しくは、ヒ１へ腎由来株化
細胞に組換えベクターを挿入し形質転換体を得、さらに
当該形質転換細胞から生理活性物質を製造する方法に関
する。

［従来技術］ 遺伝子組換え技術によって目的の生理活性物質を生産す
る宿主としては、当初大賜菌を中心に研究が進められ、
さらに酵母、枯草菌等の微生物が、その培養の簡便さ及
び宿主−ベクター系の研究の進展等から繁用されティた
。（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　Ｖ、。

Ｉｔａｋｕｒａ、　　Ｋ、、　　ａｔ　　ａｌ、　　Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｍａｔｈ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、八、、　７６、１０６　（１９７９）および
ＮａＱａｔａ、　Ｓ、。

Ｔａ１ｒａ、　Ｓ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ
、　Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、　２８４゜１３１６　（１９
８０）参照〕。

しかし、近年高分子糖蛋白質を天然型に近い形で、しか
も可溶な型で遺伝子組換え技術による物質生産をおこな
うために宿主として、動物細胞を用いる発現系に焦点が
移っている。

厄知の動物細胞としては、 ＣＨｏ　−Ｋ　＋ （チ１１イニーズハムスター卵巣細胞：八ＴＣＣＣＣＬ
６１） ＢＨＫ　　（新生仔ハムスター腎細胞：ＡＴＣＣＣＣＬ
ｌｏ） ＣＯ３−７ （ＣＶ−１０ｒｉｏｉｎ　、　ＳＶ−４０細胞：八ＴＣ
ＣＣＲＬ１６５１） ＶｅｒＯ（アフリカミドリザル腎細胞：ＡＴＣＣＣＣＬ
　−８１） 等がある。

［解決しようとする問題点］ しかしＣＨＯ−に＋のような旧知動物細胞を宿主として
使用した場合には、培養のために牛血清が必要であり、
さらに産生された一重鎖プロウロキナーゼ（以下ｐｒｏ
−ＵＫと言う）のような生理活性物質は、変性を受け、
２本鎖化したりする。

又、生理活性物質の産生ｍも十分ではなく、夾雑する動
物蛋白質も問題となる。

そこで本発明者らは、宿主として使う受容細胞について
種々検討し、ヒト由来細胞特にヒト腎由来株化細胞を選
択することによって、これらの欠点が克服されることを
見出し、本発明を完成した。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は生理活性物質をコードするＤＮＡ配列を組み込
んだベクターを用いて形質転換されたヒト腎由来株化細
胞を、培養することを特徴とする生理活性物質の製造方
法に関する。

本発明で使用されるヒト腎由来株化細胞は、例えばヒト
胎児腎より得たＰｒｉｍａｒｙ　ＣＬＩｌｔｌｌｒｅ又
はｄｉｐｌｏｉｄ　ｃｅｌｌを入手し、これを継代培養
して株化したものが例示される。細胞は、より好ましく
は、生理活性物質産生性のものが使われ、ｐｒｏ　−Ｕ
Ｋを産生ずるためにはｐｒｏ　−ＵＫ産生細胞を使うこ
とがより好適である。細胞は、２〜２０ｘ　１０４Ｃａ
ｌ１３／−の数で植え込み、３日間はど培養を続け、細
胞数が植え込み数の約３〜６倍になった時点でトリプシ
ン−ＥＤＴＡｆｌ液を添加し、細胞を回収して得たもの
が好適に使われる。

Ｉ胞培養用の培地としては、例えばｗａｙｍｏｕｔｈの
培地、Ｄｕｌｂｃｃｃｏ’ｓ　１ｏｄｉｆｉｅｄ　Ｈ［
Ｈ培地などの無血清培地、好ましくは、ヒト血清アルブ
ミンを適迅（０，０５〜０．２　ｗ／ｖ％）添加した無
血清培地、低濃度（０，０５〜０．２ｗ／ｖ％）の血清
を添加した培地を用いて培養する。培地にはその他ラク
トアルブミン氷解物、トランスフェリン、各種アミノ酸
、各種脂肪酸、インシュリン等のホルモンなどを添加し
てもよい。

この培地中には空気（Ａｉｒ　９５％、ＣＯ２５％）を
適宜導入（流速＝１０〜５００　ｄ１分）することが好
ましく、温度は２０〜３７℃が好ましい。培養液は２〜
３日程度ごとに、交換する。

かくして株化されたヒト腎由来細胞は、宿主として用い
られ、生理活性物質発現用ベクターをこの宿主細胞の核
内に挿入することによって形質転換がおこなわれる。

生理活性物質発現用ベクターは、発現系遺伝子として例
えば５Ｖ−４０に由来する１ンハンサー、初期プロモー
ター、ポリアゾニレ−ジョンシグナル及び有用な生理活
性物質をコードする遺伝子から構成される。又他の動物
ウィルスや動物細胞に由来するプロモーターなども使用
できる。

形質転換は、シャーレに約５〜７　Ｘ　１０５　ｃｅｌ
　ｌ５１０成／　１００　ｍｄｉｓｈの割合で宿主細胞
を調製し、これに生理活性物質発現用ベクターをＤＮＡ
ｆｆ１として２〜４μり加える。ＤＮＡを宿主細胞にと
りこませた後、培養を行い形質転換細胞の選別をおこな
った。選別された細胞は、好ましくは、！＆！紺状・粒
状の細胞が付着可能な培養用担体によって増殖される。

担体は、より好ましくは、プラスに荷電処理されたガラ
ス、ダクロン、テヘロン、ナイロン、オルロン等が例示
される。この担体は、通常培地に対して、０．００１〜
０．５ｇ／Ｉｌ−＃＋３、好ましくは０．０１〜０．２
０９／ｃＩＸ３稈度の密僚で培養器に充填する。

かくして、培地中に生理活性物質が産生きれる。

培地からの産生物の回収は、例えば、当該培地を遠心分
離、減圧濃縮、塩析分画、ゲルー過、濃縮、イオン交換
クロマトグラフィー、アフイニディークロマトグラフィ
ー等を、適宜組み合わせることによって行なわれる。

例えばｐｒｏ−ＵＫは次のごとき方法によって回収され
る。すなわち、まず培地を遠心分離し、上清を回収する
。この回収液をイオン交換クロマトグラフィーにより部
分精製する。担体としては、弱酸性陽イオン交換体が最
適であり、例えばＣＭ−交換体、あるいはＤｕｏｌｉｔ
ｅ等が例示される。担体をｐ１１４．５〜６，５、より
好ましくはｐＨ５〜６に調製した後、回収液を展開して
担体に吸着させる。

上記の緩衝液で洗浄した後に、ｐＨ７，５〜９．５、よ
り好ましくはｐｌ＋８〜９の緩衝液で本チモゲンを溶出
する。緩衝液としては、リン酸緩衝液等が例示される。

さらに、この溶出液をアフィニティークロマトグラフィ
ーにより高度精製する。アフイニティ力ラムの担体に結
合されるリガンドとしてはポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体のどちらを用いてもよい。

［効　果］ 本発明によって提供されるヒト腎由来株化細胞を遺伝子
組換え技術の宿主として用いることを特徴とする生理活
性物質の製造方法は、無面清培地又は低濃度血清培地中
での遺伝子組換え細胞系による生理活性物質の高生産を
可能とし、しかも産生物の変性をもたらさないため、高
分子の糖蛋白質の生産系として、より産業目的に合致し
た技術を提供するものである。本発明によって、生産が
期待される生理活性物質としては、好ましくは、ｔＰ△
、ウロキナーゼ、ｐｒｏ−ＵＫ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ等
が例示される。

［実施例］ 以下に本発明を具体的に説明するために、ｐｒ。

−ＵＫを代表例として開示する。しかし、本発明はこれ
らに限定されるものではない。

（１）ｍＲＮＡの単離・精製 ■使用細胞 ウロキナーゼを産生ずるヒト腎由来株化細胞から全ＲＮ
Ａを抽出するため、まずこの細胞を５％ＦＣ３を含むダ
ルベツコのＭＥＭ培地中で培養した後、培地を１％ＦＣ
８を含むダルベツコのＭＥＭ培地に変換し、さらに１０
〜１５時間の培養を行った。この時期の１ＩｌｌＪ１１
２〜５ｘ１０９個をトリプシン処理によって集め、全Ｒ
ＮＡを抽出した。

０ｍＲＮＡの回収 特開昭５８−１４８８９９　（出願人　株式会社ミドリ
十字）において開示された方法を用い、アフリカッメガ
エル卵母細胞へのインジェクションによりウロキナーゼ
の活性がみられた１９〜２０ｓの大きさのｍＲＮＡを精
製した。

（２）一本鎖ｃＤＮＡの合成 ｃＤ　Ｎ　Ａの合成は、主としてＨａｒｕｉｎ、　Ｐ、
　Ｗ、　ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、
　　２５３．２４８３−２４９５　（１９７８）及びＨ
ａｎｉａｔｉＳ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　１９８２．の報告を基に行った。

■　表１に示した反応混合液に６５℃、５分間加熱後氷
上にて急冷したウロキナーゼｍＲＮＡを２０μ９加え、
エツベンドルフチューブ内でよく混ぜた後、氷上にｔｌ
ｉ置した。

（以下余白） 表　　　１ ■　４６°Ｃ１１０分〜１２分の反応により、一本鎖目
のｃＤＮＡの合成を行った。

■　この反応混合液に０．５　ＨＥＤＴＡ　（ｐＨ１８
，０）、２０μｇを加えることにより反応を終了させた
。

■　反応混合液に等１ｆｉ（２００μｆＪ）のフェノー
ル／クロロホルム溶液を加え、ポルテックスにて攪拌後
、１０．ＯＯＯｒｐｍ　、３分間の遠心を行い、その上
層（水層）を分取した。下層のフェノール層にはさらに
等量のセファデックスＧ−１００緩衝液（１０ｍＨトリ
スー１−ＩＣｆＪｐＨ８，ｏ、　　１ｍＨＥＤＴＡ　、
　１００ｍＨＮａ　Ｃ，Ｇ　）を加え、再度抽出を行っ
た。両者の水層を混合し、この反応液に８０％グリセリ
ンを６０μρ加えた。

■　セファデックスＧ−１００カラムに反応混合液をア
プライし、Ｇ−ｉｏｏｇｍ？ｌＷで溶出した。

溶出液は１フラクション５滴ずつ分画した。

■　各フラクションをチェレンコフ　カウントで測定し
、放射活性のピーク部分を集めた。

■　１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、１０μび
のｔＲＮＡ、２容のエタノールを添加し、−８０℃で２
０分冷却した。

■　遠心（１５，ＯＯｒｐｍ、１０分）にて沈澱を集め
、これを減圧上乾燥した。

■　沈澱を３００μＮの０．１Ｎ　　ＮａＯＨ溶液に溶
解し、７０℃、２０分間インキュベートした後水冷した
。

■　１Ｎ　　ＨＣＪ）溶液（約３０μｆＪ）を添加して
中和した。中和後、２μρをサンプリングしてその放射
活性を測定した。

■　１０μ３のｔＲＮＡを添加し、エタノール沈澱を行
った。遠心後沈澱を集め、これを減圧下で乾燥した。

■　かくして一本鎖ｃＤＮＡの合成が完成した。

一本鎖ｃＤＮＡの合成重は、一本鎖ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ
ハイブリッドをＱ　−１００カラムクロマトグラフイー
によって回収し、これをアルカリ熱処理してｍＲＮＡを
分解除去した侵求めた。その結果、３６５μ９のウロキ
ナーゼ一本鎖ｃＤＮＡを得た。

（３）二本鎖目のＤＮＡの合成 二本鎖目のＤＮＡの合成は、まずＤＮＡポリメラーゼＩ
でＤＮＡ合成し、その後逆転写酵素を用い、ＤＮＡ鎖の
延長を行った。

■　一本鎖ＣＤＮＡ　１００μｍを２×反応混合液（表
２）で懸濁した。

表　　　２ ■　６０℃で２分間インキュベートした後、遠心（１５
，０００ｒｐｍ、２．５分）し、上清を取った。

■　沈澱に５０μρの水を加え、■の操作を繰り返し、
両者の上清を混合した。

■　ＤＮＡポリメラーゼＩ　クレノーフラグメント５０
ｕｎｉｔＳを添加し、全量を２００μρとした。

■　１５℃で一夜インキユベートした。

■　０．２８　Ｅ＾■＾（ｐＨ８，Ｏ）溶液を２０μｇ
添加して反応を停止した後、等容（２２０μｇ）のフェ
ノール／クロロホルム溶液を加え、混合し遠心した。上
層を分取し、フェノール庖を２２０μ、ＱのＴＥ緩衝液
（１０ｎ＋Ｈトリス−１」Ｃ９０１１８，０、１ｍＨ［
ＤＴＡ）で再抽出した。

■　両者の水層を集め、８０％グリセリンを６０μρ添
加した。

■　セファデックスＱ　−１００カラムにアプライし、
Ｇ　−１００緩衝液で溶出した。溶出液は、１フラクシ
ョン５滴ずつ分画した。

■　各フラクションをチーエレンコツカウントで測定し
、放射活性のピーク部分を集めた。この液２μρを１０
７！のＡＣ８Ｉ［に混ぜ、放射活性を測定し、残りの液
に５μ３のｔＲＮＡ、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液を添加し、エタノール沈澱を行った。

■　遠心（Ｔ５，００Ｏｒｐｍ　、　１０分）ニテ沈澱
を集め、これを減圧下で乾燥し、ｄｓｃＤＮＡを得た。

ｄｓｃＤＮＡの収量は、５．３μ９であった。

以下逆転写酵素を用いた三木鎖目ＤＮＡの合成延長を行
った。

（４）逆転写酵素を用いた三木鎖目ＤＮＡの合成延長 ■　得られたｄｓｃＤＮＡを２０μｇの水に溶かし、更
に表３の反応混合液３０μｍを加え、両石を混合した。

（以下余白） 表　　　３ ■　この混合液を４２℃で６０分間インキュベートした
。

■　０．２Ｈ［ＤＴＡ　（ｐｌ＋８．ｏ）溶液を５μρ
加え、反応を終了させた。

■　等ｍ（５５μｆＪ）のフェノール／クロロホルム溶
液を加え、除蛋白を行った。

■　これ以後ポリメラーゼ■を用いたｄｓｃＤ、ＮＡの
合成と同様（（３）の■〜■〕の操作を行い、次の５ｈ
Ｃｎｋ、　Ｔ、　Ｅ、等に準じたＳ１ヌクレアーゼによ
る一本鎖ＤＮＡ部分の消化処理（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７２工９８９
　（１９７５）参照〕へと進んだ。

（５）３１ヌクレアーゼによる一本鎖ＤＮＡ部分の消化 ■　ｄｓｃＤＮＡを１００μρの８１ヌクレアーゼ用緩
衝液（０，３Ｍ　　Ｎａ　Ｃ４！　、　３０ｍｔ（酢酸
ナトリウム（ｉｔ／１．５）、３ｎ＋ＨＺｎ　ＣｆＪ２
　）に懸濁し、３７℃、３０分間の保温にて完全にｄｓ
　ｃＤＮＡを溶かした竣、０５ユニツトの８１ヌクレア
ーゼ（Ｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａ１社製）を添加し
た。

■　３７℃、３０分間の反応後、さらに２ユニツトのＳ
１ヌクレアーゼを加え、ざらに１５分間反応させた。

■　０．２）Ｉ　ＥＤＴ八（ＤＨ８，Ｏ）溶液を２０μ
β加え反応を停止し、さらに１２０μ９のフェノール／
クロロホルム溶液を加え、除蛋白を行った。

■　フェノール層をＴＥ緩衝液を用い再抽出した後、両
者の水層を混合し、エタノール沈澱を行い、ｄｓｃＤＮ
Ａを得た。

（６）　ｄｓ　ｃＤ　Ｎ　Ａのショ糖密度勾配遠心処理
１！７られたｄｓｃＤＮＡを次いでショ糖密度勾配遠心
（３８，０００ｒｐＩｌｌ、　４℃）にかけて分子■の
大きな両分だ４ノを集めた。第１図に・シロキナーピｄ
ｓ　ｃＤＮＡ　（（図中Ｏ−Ｏで表示した）の超遠心沈
陪パターンを示した。同時にマーカーとして、グロビン
ｄｓｃＤＮＡ（図中ムームで表示した）の沈降パターン
も示した。フラクション６〜１５の大きなｃＤＮＡ画分
を集め、これをラージｄｓ　ｃＤＮＡとした。このラー
ジｄｓ　ＣＤ　Ｎ　Ａ　ｔＪＪは７２２ｎ（＋であった
。

（７）　ｄｓ　ｃＤ　Ｎ　Ａへのポリ（Ｃ）テイルので
」加つロキナーぎｄｓｃＤＮＡの大きさは平均１，５０
０ｂｐｒあるど想定し、Ｎｅ１ｓｏｎ　ａｎｄ　ＢｒＬ
Ｉｔｌａ（］（ＨＯｔｈＯｄＳｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
、　ｅａ　　４１−５０．１９７９）の方法に準じてＣ
−テイル反応を行った。Ｃ−テイル反応は、ｄｓｃＤＮ
Ａの３’ＯＨ末端に、１５〜２０個のポリ（Ｃ）テイル
が付加されるのが理想である。本研究では、５ユニット
のクーミ犬ルトランスフ１ラーゼを用い、３７℃にて反
応を行った。その結果、約２０個のＣ−テイルが付加し
た。

別に調製した大腸菌プラスミドｌ）Ｂ　Ｒ３２２のＰＳ
ｔＩ部位に同様に約１５個のポリ（Ｇ　）テイルを付加
した。さらにこれら両者を等モル混合し、高いイオン強
度下で７０℃から３７℃へ緩やかな冷却によりアニーリ
ングを行った。

（８）トランスフォーメーション ７二−’）’、ｙグしたＤＮＡをＬ（３ｄｅｒｂｅｎ（
］　ａｎｄＣｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｒｉｏｌ、　
１１９　１０７２〜１０７４　（１９７４）の方法に準
じて大腸菌８８１株に導入しトランスフォーメーション
を行い、約７０，０ＯＯｆｉｌ；ｌのテトラサイクリン
耐性株が得られた。得られたトランスフォーマン１〜の
アンピシリン感受性をレプリカ法で調べた。その結果、
全トランスフォーマントの９０％以上、約６０．０００
コロニーが、ｃＤＮ八が挿入されたと考えられるＡＤ、
ＴＣ’を示した。

（９）ウロキナーゼ遺伝子のクローニングウロキナーゼ
ｃＤＮＡをクローニングするため、公知の尿高分子量型
ウロキナーゼのアミノ酸配列（Ｇｊｉｎｚｌｅｒ　ａｔ
　ａｌ、、　　ｌｌ０ＤＦ）Ｏ５ｅｙｌｅｒ’ｓ　ｌ　
ＰｈｙｓｉｏｌＣｈｅｍ、　　３６３　１１５６〜１１
６５　（１９８２）、　５ｔＱｆｆｅｕＳ　ｅｔａｌ、
　　ｌ１ｏｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ’ｓ　１．　　Ｐｔ＋
ｙｓｉｏｌ　　Ｃｈｅｍ、　　３６３゜１０４３−１０
５８．１９８２）に基づいてオリゴデオキシリボヌクレ
オチドを合成し、これをハイブリダイゼーションプロー
ブとしてトランスフォーマン１−のスクリーニングを行
った。

■　合成オリゴデオギシリボヌクレオチドブローブ プローブとして用いた１４−塩基の合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチド混合物（以下プローブと呼ぶ）は、日
本ゼオン社より購入した。

表４は、用いたプローブの塩基配列とこれに対応するウ
ロキナーゼのアミノ酸配列を示している。

用いたプローブは人尿高分子吊型ウロキナーゼＢ鎖のア
ミノ酸７３〜７７に対応する。又、表４から明らかな様
にプローブは８種のオリゴヌクレオチドの混合物である
。

（以下余白） 表　　　４ ヒトウロキナーゼｃＤＮＡの１ｌｉｆｆｉ用のオリゴヌ
クレオチドプローブ プローブ アミノ酸　　　　７３　７４　７５　７６　７７配　　
列　　　　　ＮｌＩ２　−　Ｇｌｕ　　−Ｍｅｔ　　−
Ｌｙｓ　　−Ｐｈｅ　　−Ｇｌｕ　−ＣＯＯＨ Ｇ　　　　　　ＧＵ コドン５’−ＧＡＡ−ＡＩＩＧ−ＡＡＡ−ＵＵｃ−ＧＡ
Ａ　−３’ ４−ｍａｒ Ｔ　　　　　　ＴＧ 混合物　　　３’　　−ＣＴｏ−ＴＡＣ−ＦＴ。−ＡＡ
Ａ−ＣＴ−５’ （注）中段にはアミノ酸配列に対応するｍＲＮＡの可能
な全配列を示す。下段は、このｍＲＮＡに相補的なプロ
ーブＤＮＡの塩基配列を示す。

なＩ３、プローブのアミノ酸７７（Ｇｌｕ）コドンのう
ら、第三塩基はプローブＤＮＡに含まれていない。

■　５′末端を３２Ｐでラベルしたプローブの［ｊ（→
　プローブ５′−末端の３２Ｐラベルプローブは５’　
−ＯＨとして合成されているので〔γ−３２Ｐ〕△ＴＰ
（アマ−ジャム、ＰＢ１０２１８）と、Ｉ４−ポリヌク
レオチドキナーゼとで５′末端を３２Ｐでラベルした。

ラベル条件は、３２Ｐ−ＡＴＰと５′−引」末端のモル
比を５：１として以下の様な反応系で行った。

反応液 プローブＤＮＡ　　　６〜ａｏｐｍｏ＋　５　’　　−
Ｏ１ｌ末端※１１０×キナービ緩衝液　　　　　　　　
２μｐＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ　　１μ、Ｏ※
２　〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ　　５’　−ＯＨ末端のＸｍ
０Ｉ Ｈ２Ｏ総組２０μρとする倒 反応は３７℃で６０〜１２０分間行う。反応終了後、１
μρの０．５ＨＥＤＴ＾溶液（ｐＨ８，０）、３５μρ
の１Ｍ塩化ナトリｆクム（１０ｍＭトリス−ＨＣ，０、
ｐＨ７，２，１ｍＨＥＤＴ＾溶液中）および１０．Ｊｌ
ｌ！の１１ｎ９／１ｒｄｌｔＲＮＡ溶液を加えて終示３
５μｇとし、７０℃、３分間の熱処理でポリヌクレオチ
ドキ±−ゼを失活させて反応を終了させた。

（０）　　３”Ｐ−ラベル化プローブの精製ω項で調製
した反応混合物をＮＡＣ３−５２のミニ−カラム（ＢＲ
Ｌ）にかけて、３２Ｐ−ラベル化プローブを精製した。

この様にして精製したプローブＤＮＡの比活性は約１．
ＯＯｘ１０９ｃｐ　／μｇＤＮＡである。

■　コロニーハイブリダイゼーション 前記作成したプローブを用い、ＨａｎｉａｔｉＳ　ａｔ
ａｔ、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ、　
　八　しａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｈａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　１９８２の方法に準じてコロニーハイブ
リダイゼーションを行い、ウロキナーゼｃＤＮＡのスク
リーニングを行った。

前記的７０，０００個の１−ランスフォーマントのうち
約１０．０００個について、〔γ−３２Ｐ〕でラベルし
た合成プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行った結果、比較的強くハイブリダイズしていると
思われる６５コロニーを選出した。これらの６５コロニ
ーをフィルターに再度固定し、同一のプローブを用いて
再スクリーニングを行った結果、４つのコロニーがプロ
ーブＤＮＡと殉めて強くハイブリダイズした。この様に
して選出された４コロニーについて、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌ＋７の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　八ｃｉｄ　Ｒｅ
ｓ、、ヱ、　１５１３．１９７９）に準じてプラスミド
ＤＮＡ　（各々をｐＵＫｌ、２．３及び４と命名）を調
製し、ｃＤＮへの大きざを判定した。ｐｔＪＫｌは４コ
ロニー中最大のｃＤ　Ｎ　Ａを有し、約１，９００ｂｐ
であった。ｐＬＪ　Ｋ　３及び４はこれより小さく、そ
れぞれ約１，３００ｂｐと約１，１５０ｂｐであった。

又、ｐＵ　Ｋ　２は最小のｃＤ　Ｎ　Ａで約１７０ｂｐ
であった。

（１０）制限酵素地図の作成 前項で選択した４個のコロニーが保持する各プラスミド
のうち、ｃＤＮＡの大きなｐＵ　Ｋ　１　。

ｐＵ　Ｋ　３及びｐＵ　Ｋ　４の３つのプラスミドＤＮ
Ａに含まれるｃＤ　Ｎ　Ａの制限酵素地図を作成し比較
検討した。

使用した制限酵素は、ＡＣＣＩ、ＡＩｕ■、　Ａｖａ■
。

ＡｖａＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢＣＩＩ、Ｂ（ＩＩＩ、Ｂ９
１ｆｆ。

ＢｓｔＥＩＩ、Ｃ１ａ１．ＥｃｏＲＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、
　　　’１１−１ａｅ、　　ｌ−１ｉｎＣＩＩ、　　Ｈ
ｉｎｄ　Ｉ［［、Ｋｐｎｌ、　　ＮｃｏＩ。

ＭｌｕＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕｌＩ、ＲｓｕＩ、５ａｃＩ
。

５ａｌＩ、５ａｕ９６Ｉ、５ｃａＩ、ＳｍａＩ、５ｔｕ
Ｉ。

ＸｂａＩ、ＸｈｏＩであり、反応時に使用した各制限酵
素の緩衝液を表５に示した。

なお、△ｖａ■はＲ８ａ■緩衝液、５ａＣＩはＫ　ｐｎ
Ｍ衝液、３ｔｕＩ、３ａｌ及びＸｈＯＩはＢａｍＨＩ緩
衝液、ＮＣ０Ｉ及びＳＣａ■は８ｇｌｌ緩衝液、そして
ＭＩＬＩＩハＨｉｎｄＩ［［Ｉ＠液を使用した。

（以下余白） 表　　　５ まず、各プラスミドを種々の制限酵素で切り、次に各制
限酵素部位の距離を求めた。各プラスミドをＥＣ０ＲＩ
で切断づると、Ｉ］ＵＫ１とｆｌｔＪＫ４Ｃは全く同じ
大きさの断片（４２０ｂｐ　）が見られ、またＢａ１ｌ
ｌＨＴとＥＣ０ＲＩ及びＢａ１ｌｌＨＩとｐｓｔ工の２
重消化を行うと、ｐ　ＵＫＩとｐＵＫ３に全く同じ大き
さの断片が見られた。そこでＩ）ＵＫＩとｐＵ　Ｋ　４
においてはＥＣｏＲＩ部位を重ねて、またｐＵＫｌとｐ
Ｕ　Ｋ　３においてはＢａｌｌｌＨｌ部位を基準にとっ
て、池の制限酵素部位を調べていくと、ｐＬＩＫｌとｐ
ＬＩ　Ｋ　３及びＩ）ＬＩ　Ｋ　４のｃＤ　Ｎ　Ａ上の
制限酵素部位の位置が一致したく第２図〉。

これらの結果から、ｐＵＫｌ、１）ＵＫ３及びｐＬＪ　
Ｋ　４に挿入されているｃＤＮ△は制限酵素地図からみ
て同一のものであると考えられる。そこでｐＵＫｌおよ
びｐＵ　Ｋ　４の一部のＤＮＡ塩基配列を決定し、アミ
ノ酸配列を検討した。その結果、その配列は公知の尿温
分子ｍ型ウロキナーゼのアミノ酸配列と一致した。

（１１）ウロキナーゼＣＤＮＡの塩基配列の決定前項に
よってプラスミドがウロキナーゼｃＤＮ△を合むことが
確認できたので、次にＨａｘａｍ　−Ｇｉｌｂｅｒｔ　
　＜マ’ｙ”ｊム−キルｔ＜−Ｈ法（ｐｒＯｃ、　　８
３口、　＾ｃａｄ、　　ｓｅｔ、　　ＵＳＡ　　７４　
　５６０〜．　１９７７）を用いてｃＤＮ△塩基配列及
びアミノ酸配列を決定した（配列工）。得られたｃＤＮ
Ａ塩基配列から考えられる可能なアミノ酸配列を既知の
人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列と比較した結果、次項
で詳細に記）ホする様にこれらのｃＤＮ△が２０アミノ
酸から成るシグナルペプチドを含む総計４３１個のアミ
ノ酸から成るｐｒｅｐｒｏ−ウロキナーゼをコードする
、ｃＤ　Ｎ　Ａであることが明らかとなった。

（１２）ウロキナーゼのアミノ酸配列 （ａ）　　ｃＤＮ△が真にウロキナーゼｃＤ　Ｎ　Ａで
あるか盃かの判定ｔよ、１７られた塩基配列からアミノ
酸配列を求めて（配列Ｔ）、これを既知の人尿つ［］−
１ナーゼのアミノ酸配列と照合することで打つＩこ　。

下記配列（ＩＦ　＞は人尿高分子吊型・クロキナーゼの
Ａ−及び１３−　ＫＮの仝アミノ酸配列を示している。

４１１！　　　　　　　ｙ Ｎ）？−〇（Ｌ）ｃｏΦ　０ＩＬｃ％ｌ−嘘−シーフェ
ンシングによって得られたｃｌ）ＮΔ塩基配列を人尿ウ
ロキナーゼのアミノ酸配列〔配列（■）〕と比較した結
果、Ｉ）ＵＫｌ及び４はいずれもウロキナーゼ前駆体ｃ
ＤＮＡの一部を含んでいることが明らかとなった。

下記配列（ＩＩ［）は、個々のフラグメントのシーフェ
ンシングの結果に基づいて作製したウロキナーゼアミノ
酸配列をコードするｃＤＮΔの５′−末端から３′−ノ
ンコーディング　リージョンまでの全塩基配列を示して
いる。

（以下余白） （ｂ）以下本発明によって得られたウロキナーゼアミノ
酸配列をコードするＣＤ　Ｎ　Ａの構造について述べる
。

←）　５′−ノンコーディング　リージョンとシグナル
シーフェンス 配列（Ｉ）及び（Ｉ［［）から明らかなように、蛋白合
成の開始コドンであるＡＴＧ（Ｍｅｔ）の上流には、少
なくとも７９ｂａｓｅｓから成る５′−ノンコーディン
グ　リージョンがある。又、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）から始ま
る最初の２０アミノ酸は、人尿つＤキナーゼのアミノ酸
配列〔配列（■）〕には見られないことから、ウロキナ
ーゼ分子の細胞外への分泌に必要なジグノールペプチド
であると判明した。

更に、２１番目のアミノ酸、３ｅｒに始まるアミノ酸配
列は、人尿ウロキナーゼの八−鎖のアミノ酸配列に一致
した。

このことから、今回得られたｃＤＮＡは、２０アミノ酸
から成るシグナルペプチドを有するウロキナーゼ前駆体
（ｐｒｃｐｒｏ−Ｕｒｏｋ　ｔ　ｎａｓｅ、以下ｐｒｅ
　−ＬＪＫと略す）をコードするｃＤＮＡ（ｐｒｅ−Ｕ
ＫｃＤ　Ｎ　Ａ　）であることが明らかである。

（０）　　ウロキナーゼ前駆体の開裂部位人尿ウロキナ
ーゼは、八−及びＢ−鎖の二本鎖であるが、これは当初
ｐｒｏ−ＵＫとして合成されたウロキナーゼ前駆体分子
が細胞外へ分泌された後、プロテアーゼなどの作用によ
って２次的に二本鎖へ開裂するものと考えられる。１）
ＵＫＩのｃＤ　Ｎ　Ａのシーフェンシングによりこのこ
とが確かめられた。

配列（Ｉｔ）において、人尿ウロキナーゼのＡ鎖のカル
ボキシル末端のアミノ酸配列（配列（Ｉｆ）の１５７５
７番目ミノ酸であるＰｈｅ）に続いてＬｙｓが存在し、
更にＢ−鎖のアミン末端である１ｌｅ−１１ｅ−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｇ　Ｉｙ−・・・のアミノ酸配列が認められる。

このことは、人尿ウロキナーゼが当初はＩＶＳを介して
八−及びＢ−鎖の結合した一重鎖ウロキナーゼ（ｓｉｎ
ｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　ｐｒｏ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）と
して合成され、Ａ　ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌ　ｙｓ−［１ｅ−
Ｉ　ｌｅ部部間開裂ること、開裂に際してＬｙｓは欠失
することを示している。

ぐ→　カルボキシル末端とＣＤＮＡの３′−ノンコーデ
ィング　リージョン 配列（Ｉ）及び（ＩＩＩ）には本発明より（９たＣ［）
ＮＡの５′　−ノンコーディング　リージョン、コーデ
ィング　リージョン及び３′−ノンコーディング　リー
ジョンの一部を示している。配列（Ｉ）及び（ＩＩＩ）
に示すように、この塩基配列ではＧｌｙ−１ｅｕ−Ａ　
ｌａ−１ｅｕといった人尿高分子吊型ウロキナーゼＢ−
鎖のカルボキシル末端に一致するアミノ酸配列が読み取
られ、その下流に蛋白合成終止コドンであるＴＧ△が存
在する。従って、人尿、高分子量型ウロキナーゼのカル
ボキシル末端と本発明によって１９られたそれは同一で
、プロセシングにより欠失されるようなポリペプチドは
存在しないと考えられた。

一方、３′−ノンコーディング　リージョンは制限酵素
地図から考えて、長大と思われる。３′−ノンコーデイ
ング　リージョンについてはそのごく一部しかシーフェ
ンシングを行っていないが、現在得られている３′−ノ
ンコーディング　リージョンは約８５０ｂｐである。し
かし、この中には真核生物のｍＲＮＡの３′−末端に特
徴的なｐｏｌｙ（八）配列が含まれていないことから、
３′　−ノンコーディング　リージョンはもつと長大で
あると考えられる。

（１３）ウロキナーゼ全コーディング　リージョンを含
むシラスミドの作成 ｐＵ　Ｋ　１およびＤＵ　Ｋ　４を制限酵素ＨｉｎｄＩ
Ｉ［。

ＢｏｌＩＩｒ消化した。Ｈｉｎｄ［［［及びＢ（＋ＩＩ
Ｉによる消化は３７℃、１〜２時間行った。Ｉ）ＵＫｌ
からは約５．３ｋｂの断片を単離し、一方、ｐＵ　Ｋ　
４からは約１．２ｋｂの断片を単離した。次にＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼ反応緩衝液（６６ｍＭ　トリス−ＨＱｊ　
　１）Ｈ７，６，６６ＩｎＨＭ（］　Ｃ（Ｊ　２　、１
０ｍＨジチオスレイトール、　０．５ｍＨＡＴＰ）と１
０ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ中で前記の断片を２
０℃で２時間反応させＩｉｇａＨｏｎＬ、、た。以上の
工程は第３図に示した。第３図に於イテ、ＥはＥｃｏＲ
Ｉを、ＨはＨｉｎｄｌ［［を、ＢはＢａｍＨＩを表す。

（１４）ヒト腎由来株化細胞におけるウロキナーゼの産
生 （ａ）細胞における発現用ベクターの作製原料プラスミ
ドとして、Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ（Ｈｏｌ
ｃｃ、　ａｎｄ　ｃｅｌｌ、　Ｂｉｏｌ、、　３．２８
０−２８９　（１９８３））によって創作されたｐｃＤ
Ｖｌ及びｐＬｌ（第４図）を用いて、ｐｓＶ−０１（第
５図）を作成した。

１）ＣＤＶ　１　トｔ）　Ｌ　１　ハ、ｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡと５Ｖ４０ＤＮＡとのハイブリッドプラスミドであ
り、ＰＬ、　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａｌｓ　（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ１社より入手した。

これらプラスミドへのつＵキナーゼをコードするＣＤＮ
Ａの挿入を容易にするため、ｐｃｏ　ｖ　ｉのＨｉｎｄ
　Ｉｌｌ　−Ｋ　ｐｎ１部位にｐＬｌのＨｉｎｄＩＩ［
−ｐｓｔ■断片を挿入しｐｓ　Ｖ　−Ｇ　＋を作製した
。

すなわち、ｐＬ１４μびを表５の反応条件でｐｓｔ■で
消化後、突出する３′−末端をＴ４−Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏ
ｌｙｍｃｒａｓｅで削ってｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　　（平
滑末端）に変更した。その際の反応は反応混合液（ｐＬ
　１４μ’ｊ　１１０ｘ　Ｔ４　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
　ｂｕｙｅｒ　８　ｕｎ　、２ｍＨｄＮＴＰｓ　Ｂ’ａ
　４．０μｕ　、　　ｄＨ２０７６ｕｆＪ　）を６５℃
、３分間、加熱後急冷した後、Ｔ　４　ＤＮＡ　ｐｏｌ
ｙｍｃｒａｓｅ４　ｕρ　（ＩＯＵ）を加え、終迅８０
μＮとし、３７℃で５分間反応させた。反応終了後０．
２５ＨＥＤＴ＾（１）Ｈ８，Ｏ）８μｍトｄＨ２０８０
μｎ　ヲ加え、７１／−ル処理を１回行った後、水層を
回収した。エタノール沈澱で、ＤＮＡを回収し、減圧乾
燥して、ＫｐｎＩ　　１ｉｎｋｅｒ　ｌｉｇａｔｉｏｎ
に供した。ｌｌｔａｔｉｏｎ反応は、反応混合液（ｄｒ
ｉｅｄ　ＤＮＡ４μ９．５′−ＰＫｐｎＩ　　１ｉｎｋ
ｅｒ　２．ｃｚｎ　　（２μｓ　＞　、１０ｘｌｉｃ＋
ａｓｅｂｕｙｅｒ　２．ＯｕＪ　　ｄＨ２０）　１８μ
、Ｉｌを６５℃、３分間加熱後徐冷し、Ｔ４　ＤＮＡ　
　Ｉｉｇａｓｅ　２μｇ（５Ｕ）を加えて、１６℃で一
夜反応させた。反応終了ＩＫｐｎＩ、ついでｌ−１ｉｎ
ｄＩ［［による消化を行い、５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけて約６００ｂｌ）　（７
）　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉｊｆｉ片を回収した。

一方、ｌ−１ｉｎｄ［［とｌ１ｎｒでｏｃＤ　Ｖ　１を
消化し、１％Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｔで、約２．７ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を調製し、そのうち１１００ｎを前記ｐ
Ｌ１由来の約６００ｂｐ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片と１ｉＧａｔ
ｉｏｎシた。ｌｉｇａＮｏｎ反応は、反応混合液（ｐＬ
１断片ＤＮΔ１５０ｎｇ、ｐｃＤ　Ｖ　１断片ＤＤＮＡ
１００ｎ　、１０ＸＴ４　ＤＮＡｌｉｇａｓｅ　ｂｕｙ
ｅｒ　１．０　μ４１ｄＨ２０８μｆＪ）にＴ４−　Ｄ
　Ｎ　Ａ　１ｉａａｓｅ２　ｔｌｆＪ　（５，６Ｕ　）
　ヲ加工、１６℃で−夜反応させた。反応液の　／２ｆ
ｆｉを用いて大腸菌１１８１０１の形質転換を行った。

１ｑられた形質転換体のうち１２コロニーを用いてプラ
スミドＤＮＡを調製し、各種制限酵素で消化して調べた
ところ、いずれも目的のプラスミドをを含んでいる事が
わかったので、そのうち１株からプラスミドＤＮＡを入
場調製してＰＳＶ−Ｇ＋とじ、その制限酵素地図の作製
（第５図）、ならびに５ａｌＩ−ＢｃｌＩ断片のＤＮＡ
塩基配列を求めた〔下記配列（ＩＶ　）参照〕。この結
果、得られたｐｓ　Ｖ　−Ｇ　＋は、ｔｌｎＩ部位をク
ローニング部位として上流に５Ｖ−４０ＤＮＡのｅａｒ
ｌｙ　ｃｎｈａｎｃｅｒ／　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｌｅ
ｍｅｎｔおよび１ａｔｅ　５’　−ｓｐｌｉｃｉｎｇｊ
ｕｎｃｔｉｏｎが、下流には１ａｔｅ　ｐｏｌｙ（Ａ）
ｓｉｇｎａｌがそれぞれ配列し、動物細胞中での機能的
なｍＲＮ　Ａの合成に関与する諸要素が欠失なく配列さ
れていると判定できた。

（ｂ）ベクターへのウロキナーゼｃＤＮＡ配列の挿入 （１３）で得た１）ＵＫ３３をｐｓｔ■で部分消化し、
１．７にｂｐ断片を単離してｐＳ　Ｖ　−Ｇ　＋に挿入
した。

１．７ｋｂｐ断片の単離は、反応混合液（１）ＬＪ　Ｋ
　３３１０μ９．１０ｘ　ＰｓｔＩ　　ｂｕｆｆｅｒ　
５０．ｃｚρ、Ｐｓｔ１１０μｎ　１（６０１Ｊ）、ｄ
Ｈｚ　Ｏヲ加工てｌｌｆｆ１５００μｊ！　）　ヲ、３
７℃に保ち、反応開始後、１０分、１５分および２０分
で、それぞれ約１６０μｇサンプリングし、６５℃、５
分間加熱処理後、それぞれの、反応液を混合して、１％
アガロースゲルにて電気泳動にかけ、１．７Ｋｂ１１断
片を約１０μ９回収した。回収された約１７にｂｐのう
ち約５μ９を用い、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ処理で切
断末端をｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　　（平滑末端）ニかえＫ
　ｐｎ　■ｌ　１ｎｋａｒをｌｉｇａｔｉｏｎＬ、、た
。そのｔ資Ｋｐｎ工で消化したｐｓ　Ｖ　−Ｇ　＋と＋
　ｉｇａｔｉｏｎＬ　ｒ、大腸菌ト１３１０１を形質転
換して、ｐＳＶ−Ｇｌ　−ｐｒｅ　Ｕ　Ｋ　（第６図）
をｌた。

ｐｓ　Ｖ　−Ｇ　＋　−ｐｒｅＵ　Ｋは、第７図に示す
様に、５Ｖ−４０のｎ＋ＲＮＡ転写調節域の下流ニｐｒ
ｅ−ｔＪＫｃ　ＤＮＡの５’　−ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ
　ｒｅｏｉｏｎ。

ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、　ｃｏｄｉｎｇ　ｒ
ｅｇｉｏｎ及び３′−ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉ
ｏｎが挿入されており、ヒト腎由来株化Ｉｌｌ胞などの
適当な受容細胞へＤＮＡを導入することテヒト−ｐｒＯ
−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅの産生を行いうる。

（Ｃ）　Ｄｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｈａ
ｒｋｅｒを含むプラスミドＤＮＡの調製 上記ｐｓ　Ｖ　−Ｇ　＋を用いて培養細胞を形質転換す
る際のＤｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｈａｒ
ｋｅｒとして用いるプラスミドであるＤＳＶ−Ｇｌ　−
Ｎｅｏ’　Ｇ、ｔ、以下の様にして作製した。

Ｔｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子がクローニングさ
れティるプラスミドＩ）Ｎ　Ｅ　Ｏ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ
。

Ｐ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒａ、　Ｊ、Ｈｏ１ｃ
ｃ、　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔ、、　　１．
　３２７−３４１　　（１９８２））　　（ＰＬ−Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ１社）をＢａｍＨＩとｔ−１ｉｎｄＩ
［［で消化後、ネオマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡは４　　
ｄＮＴＰｓ存在下でｃ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　−ｐｏｌ
ｙｍｃｒａｓｅ　Ｉ、　ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）で切断末端を平滑
末端に変更した後にＴ４−　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌｉｇａｓｅ
による反応でその末端に前述の様にしてＫ　ＤｎＩ　ｌ
１ｎｋｃｒを付加した。

ＫｐｎＩ　ｌ１ｎｋｃｒ　＋ｔｇａｔｉｏｎ後、Ｋｐｎ
Ｉ　　６ＵでＤＮＡ断片を完全に消化し、１ｉｎｋｅｒ
の付加された目的の約１．５ｋｂネオマイシン耐性遺伝
子を回収した。

回収したＤＮＡｌｌｉ片は、そのうち１５ｎ（ｌを前述
の様にしてＫｐｎＩで切断した。５Ｖ−Ｇ＋　２０ｎｇ
とｌ　ｉｇａｔｅＬ、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換して
目的のプラスミドｐｓｖ−Ｇ＋　−Ｎｅｏ　　を得た（
第６図）。

（ｄ）受容量ｍ　（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｅｌｌ）の
調製受容細胞として、ヒト胎児腎より得たｐｒｉｌａｒ
ｙｃｕｌｔｕｒｅを継代培養して得られたヒト腎由来株
化細胞を用いた。ＤＮＡのトランスフェクションに用い
る細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ処理で細胞を集めた後培
養液（５％ＦＣ８を含むダルベツコのＭＥＭ培地）に懸
濁し、ファルコン＃　３００３（１００＃１ｌ１１　）
培養シャーレに７　Ｘ　１０５　ｃｅｌｌｓ　／　１０
ｍ／　１１００ａシヤーレでうえ込んだ。２４時間５％
Ｃ○２−９５％ａｉｒのＣ０２−１ｎｃｕｂａｔｏｒで
培ａ後、形質転換に用いた。この条件下では、受容細胞
として用いるヒト腎由来株化細胞のウロキナーゼ産生量
は、２６．５１１／ｒｄ、／ｄａＶ　　（５例平均）で
ある（表６）。

（ｅ）形質転換 長円等の方法（蛋白質核酸・ｗ９素、２Ｂ　（１４）　
。

１５６９〜１５８１．１９８３）に準じて調製したプラ
スミドＤＮＡ　（１）ＳＶ−Ｇ＋−ＰｒａＵＫ及びｐｓ
　Ｖ　−Ｇ＋−Ｎｅｏ（混合比率は＋ＯＯ：１））をＤ
ＮＡ酊として２〜４μｇ／−およびｃａｒｒｉｅｒ　Ｄ
ＮＡとしてＳａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　
（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を２０１１ｇ／ＩＩ
Ｉ！含有するＤＮＡ−Ｃａ　ＰＯ４ｍ小沈澱液を（ｄ）
で調製したシャーレあたり１１Ｉｔｉずつ加えた。シャ
ーレを十字に動かして静置し、ＤＮＡ−Ｑａ　ＰＯ４微
小沈澱を細胞に吸着させた慢、再び１ｎｃｕｂａｔｏｒ
で培養を開始した。６〜９時間時間項培地交換い、さら
に４８時間以上培養して、形質転換細胞の選別を行った
。

（ｆ）形質転換細胞の選別 ウロキナーゼ遺伝子は、自身では５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ
ではないため、真核細胞において、Ｇ　−４１８耐性を
与えるＴｎ５山来のネオマイシン耐性遺伝子をｄｏｍｉ
ｎａｎｔ　５ｅｌｅｃＮｏｎ　ｍａｒｋｅｒとして用い
（前述のｐｓ　Ｖ　−Ｇ　＋　−Ｎ　（！Ｏ）　５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ等の方法（Ｊ、　ＭＯＩＣＩＣ，ａｎｄ　Ａ
ｔ１１１ｔｉｅｄ　ｃｅｎｅｔ、、　Ｌ　３２７−３４
１゜１９ｆ３２　）に準じてｍ胞をＧ−４１８含有培地
（４００μグ／ｒｄ）で培養することによってトランス
フェクションしたｓｕｉの選別を行った。なお、Ｇ　−
４１８はＧｉｂｃｏ社！！（ＧｅｌｌＱｔｉＣｉｎ■）
を用いた。

４日おきに培地を交換し、Ｇ　−４１８耐性コロニーを
生育させ、１４日目に５０コロニー　（Ｃｏ１ｏｎｉｅ
ｓ）を１７だ。これらの形質転換細胞を５％ＦＯ８を含
むダルベツコのＭＥＭ培地で生育させ、順次選別を行っ
てウロキナーゼの産生■の高いと思われる細胞株を２株
選び、これらの細胞株の培養上清を用いて、ウロキナー
ゼｃＤＮＡのトランスフェクションによるウロキナーゼ
産生けの増加について検討するとともに、合成・分泌さ
れるヒト−ＵｒＯｋｌｎａＳ６の性状についても検討し
た。

表　　　６ １１ＫＧ　　２７（ｎ＝５　）　　３０（ｎ＝５　）Ｗ
Ｓ５２−１１５９（ｎ＝３）　　５８（ｎ＝３）ＷＳ５
２−０８３７　（ｎ＝３　）　　５０（ｎ＝３　）１−
Ｉ　Ｋ　Ｇ　：受容量胞として用いたヒト腎由来株化細
胞 ＷＳ３２−１１．　ＷＳ３２へ０８、形質転換細胞株活
性の測定は、７　ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ　／１（７／２
５ｒｍ２ｆｌａｓｋ　Ｔニー細胞を植え込んだ後、３日
培養して、培地を５ｄのｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｈｅ
ｄｉｕｍに交換、２４ｈｒ培俄後上漬のウロキナーゼ活
性（ＩＵ＃Ｉ２／ｄａＶ）を測定した。又、細胞あたり
のウロキナーゼ産生ｆｆ１（１０／ｃａｌｌ／ｄａｙ）
は、２４ｈｒあたりのウロキナーぜ産生吊と、この間の
平均細胞数から求めた。

（０）ヒ１〜腎由来株化細胞によって合成されるヒト−
Ｕｒｏｋｉｎａｓｅの性状 形７￥転換細胞株について、培地中に分泌されるヒ１〜
−１１ｒｏｋｉｎａｓｅの性状を調べた。

はじめに、ヒト−ウロキナーゼの産生ｖｎを求めた。、
２５ｃｍ２の培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ＃　３０１３
）に７Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ　／　１０ｍｅ／　Ｎａ５
ｋで細胞を植え込み、３日ｊ８養後ｃｏｎｌ’　Ｉｕｅ
ｎｔとなった時点で培地を１％ＦＣ８を含むダルベツコ
ＭＥＭ培地（ＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅＭｅｄｉｕｍ）　
５ｄ／ｆｔａｓｋに交換する。２４時間培養後、その上
清中のＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ＡＣｊｉＶａｔＯｒ活
性を測定した（表６）。

人尿高分子ＵｒＯｋｉｎａＳ（！をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
としたフィブリン平板法（アストラップら＾ｒｃｈ、　
Ｂｉｏｃｈｃｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　４０，３４６−３５１　（１９５
２））による活性測定の結果、形質転換株のウロキナー
ゼ産生番は表６に示した様に形質転換前の産生伍に比し
て２倍以上増加していることがｉ認された。しかも、こ
れらの活性は、抗ヒト−１１ｒｏｋｉｎａｓｃ抗体で特
異的に中和された。

次にこれらのクローンの産生ずるヒト−Ｕｒｏｋｉｎａ
ｓｃの分子ωを以下の様にして測定した。

Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍで２４時間培養
した培養上清を１２．５％ＳＯ３−ＰＡＧＥにＪこり泳
！ＩＩＩＪ後、蛋白ｂａｎｄを２５ｍＨトリスー１９２
ｉＨｇｌｙｃｉｎ　（ｐＨ８，３）／２０％ｍｅｔｈａ
ｎｏｌ中で電気泳％Ｊ＋的にｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｅ　ｆｉｌｔｅｒに吸着させ、ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ　（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　７６　
４３５０〜．１９７９．）を行った。

Ｆｉｌｔｅｒは、その後３％ｇｅｌａＮｎを含む２０ｍ
Ｍ　トリスートＩＣｆＪ（ｐＨ７，５）１５００ｍＨＮ
ａ　Ｃ！！中室温、６０分で旧ｏｃｋ　Ｌ／た後、−次
抗体としてヒトーＵｒｏｋｉｎａｓｅ抗原ｃｏｌｕｍｎ
Ｊ５よびｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＳｅｐｈａｒｏｓａ　ＣＬ
−４Ｂカラム（ファルマシア社）で精製した抗ヒト−Ｕ
ｒｏｋｉｎａｓｅ　Ｒａｂｂｉｔ　　Ｉ　ｏ　Ｇを用い
る間接法で、ｌ−Ｉ　ＲＰ　（Ｈｏｒｓｅ−Ｒａｄｉｓ
ｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ヲ用イｌコｉｍｍｕｎｏ　
−８，Ｏｌｏ　ａｓｓａｙ　５ｙｓｔｅｌＩ（Ｂｉｏ　
−Ｒａｄ社製）によりヒト−Ｕｒｏｋｉｎａｓｃのｂａ
ｎｄを特異的に染色した。

２−メルカプトエタノールによる還元処理を行った試料
を用いた場合、本細胞の培養上清では、分子ｆ５５４　
Ｋのｂａｎｄのみ認められた。この５４にのバンドはｒ
ｅｆｅｒｅｎｃｅとして、同時に泳動したヒト天然型一
本鎖ｐｒｏ−ＵＫ（ヒト胎児腎細胞の培養上清）と分子
量的にも抗ヒト−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　Ｉ　ｇＧに対す
る反応性においても一致し、区別できなかった（第８図
参照）。これらの結果は、形質転換細胞では、元来本細
胞が有しているウロキナーゼ遺伝子以外に、ＤＮＡトラ
ンスフェクションによって導入されたヒト−ウロキナー
ゼｃＤＮＡが発現し当該天然型と同様に糖鎖が付加され
た分子量５４にの一本鎖のｐｒｏ−Ｕ　Ｋの産生１ｎが
増大したことを示していると考えられた。

（こで、次にＣｏｎ＾−３ｅｐｈａｒｏｓｃ　４Ｂ１（
〕７’／Ｌ／？シア社製）によるｃｏｌｕｍｎ−ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを行って、両クローンによって
合成・分泌されるヒｌ−−１１ｒｏｋｉｎａｓｃの糖鎖
の有無を調べた。

クローンをｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるまでｌし、ダルベ
ツコのＰＢＳ（＋）にラスイ社製〉で２回洗う。その後
ＰＢＳ　（＋）に対して透析したＦｅ２を１％含むＮｅ
ｔ旧ｏｎｉｎｅ　ｆｒｅｅのダルベツコのＭＥＭ培地５
ｄ中で２００μｃｉ／−の〔３５Ｓ〕−Ｈｅｔｈｉｏｎ
ｉｎｅとともに２０時間培養した。

〔３５Ｓ〕でラベルされた培養液は５ｄの抗−ヒト−Ｕ
ｒｏｋｉｎａｓｃのモノクローナル抗体カラムにアプラ
イした。カラムを０．０４ＨＨａ　−ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅｂｕｆｆｅｒ（ｐｔ１８．ｏ）　／　０．０３　ＨＮ
ａＣ，Ｉ）で充分洗浄した後、ｃ＋Ｉｙｃｉｎｅ　−１
１ＨＩ　　（ｐＨ２，５）で溶出し、３５ｓでラベルさ
れたヒト−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅを回収した。溶出した３
５ｓでラベルされたヒト−ｕｒｏｋ＋ｎａｓｅは１Ｍト
リスで中和後、２０ｍＭ　Ｎａ　−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
　ｂｕｙｅｒ　ｐＨ７，４／１５０ｍＨＮａ　ＣＮに対
して透析し、同ｂｕｆｆｅｒｔ’平衡化したＣｏｎ　Ａ
　−５ｃｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（ファルマシア）カラ
ムにアプライした。

ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、０．１ＨＭｅｔｈｙｌ　−
ａ　−Ｄ　−Ｈａｎｎｏｓｉｄｅを含むＮａ−ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７，４）で溶出した
。その結果、抗ヒト−ＵｒＯｋｉｎａＳ（！モノクロー
ナル抗体カラムで溶出された放射活性のうら殆どがＣｏ
ｎ＾−５ｅｐｈａｒｏｓｃ　ニ吸着１）、Ｈｅｔｈｌ／
ｌ　−α−Ｄ　−Ｈａｎｎｏｓｉｄｅで特異的に溶出さ
れた。

以上の結束は、ヒト腎由来株化ｌＩＤｌ１１に導入した
ヒト−ｐｒｏ　−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　　ｃＤ　Ｎ△が
正、贋に転写され、天然型と同等の分子♀及びモノクロ
ーナル抗体に対する反応性を有する糖蛋白として合成・
分泌される事を示していると同時に、ヒト腎由来株化細
胞が、ＤＮＡトランスフェクションによる形質転換を行
う際の受容細胞として好適な細胞株であることを示して
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図　ｃＤＮＡの超遠心沈降パターン。 第２図　１）Ｕ　Ｋ　１　、　　ｐｕ　Ｋ　３　、　　
ｐｕ　Ｋ　４中に挿入されている各ｃＤ　Ｎ　Ａの制限
酵素地図。 第３図　ｐＵＫｌとｐＵ　Ｋ　４のＩｉｇａｔｉｏｎ　
（リゲーション）の７０−シート。Ｅは ＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉｎｄＩ［を、Ｂは３ａｍｌ−Ｉ
Ｉを表わす。 第４図　ｐｃＤＶ＋とｐＬ＋とのｌｉｇａｔｉｏｎ　（
リゲーション）フローシート。 第５図　ｐＳ　Ｖ　＋　−Ｇ　＋制限酵素地図。 第６図　Ｉｔｓ　Ｖ　＋　−Ｇ　−ｐｒｅＵ　Ｋ及びｐ
ｓ　Ｖ　−Ｇ＋　−Ｎｅｏの制限酵素地図。 第７図　１）ＳＶ＋　−Ｇ＋　−１ｕｒｅ　ＵＫのｐｒ
ｅＵＫ・　ｃＤＮΔ近刀の構造 Ｎ　Ｃ：　ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎａ　ｒｅａｉｏｎＳ　Ｓ
　：　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅＳ　Ｊ　：　ｓ
ｐｌｉｃｉｎｇ　ｊｕｎｃ口Ｏｎ第８図　培養上清中の
ウロキナーぜの分子多測定のためのＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂ
ｌｏｔｌｉｎｇ０特許出願人　株式会社　ミドリ十字 第　　１　　図 ドソア　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　］？Ｖ：’　ト久第　　３　　図 ｉＩ５図 １１６　　図 ５Ｖ−４０Ａ砿） 第　　７　　図 （迅に ＠８ｒ！！Ｊ 手続補正書 昭和６１年７月２５日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト由来の生理活性物質をコードするＤＮＡ配列
   を組み込んだベクターを用いて形質転換されたヒト腎由
   来株化細胞を培養することを特徴とする生理活性物質の
   製造方法。
2. （２）生理活性物質が、ｔＰＡ、ウロキナーゼ、一本鎖
   プロウロキナーゼから選ばれるプラスミノゲンアクティ
   ベーターである特許請求の範囲第１項記載の製造方法。