JPS6036962A - 生物学的検査用微粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的検査用微粒子に関するものである。生
物学的検査の目的で各種の微粒子がしばしば用いられる
。若干の例をあげれば、マクロファージや好中球などの
貧食細胞の貧食能を酵母菌体・ポリスチレンラテックス
を用いて顕微鏡下に検査する方法、抗原または抗体で感
作した赤血球・ポリスチレンラテックスの凝集反応によ
り血清または尿中の特定成分を検出または定量する方法
、細胞表面のマーカーに特異的に結合する物質を表面に
有する赤血球またはポリマー微粒子と被検細胞とのロゼ
ツト形成を顕微鏡下に観察する方法などがある。

これらの生物学的検査に用いられる微粒子として、赤血
球、炭素微粒子、染料・顔料で着色された微粒子などが
観察に好都合なためしばしば利用される。また螢光標識
した微粒子の細胞付着を螢光顕微鏡で検査する方法、金
属を含有する微粒子で細胞を標識して電子顕微鏡で観察
する方法も知られている。

それに対して本発明者らは化学発光剤を含有する微粒子
が生物学的検査の目的に極めて有用であることを見出し
、本発明に到達した。すなわち本発明の内容は、生物学
的検査を目的として化学発光性物質を含有する直径０．
０３〜２０μｍの微粒子（以下化学発光性微粒子と称す
る）である。

本発明の化学発光性微粒子を使用すれば、後述するよう
に着色微粒子・螢光標識微粒子・金属標識微粒子などで
は不可能な生物学的検査を実施することができる。

次に実施態様を説明する。

微粒子としては生物由来または非生物由来の天然物およ
び人工物の各種のものが利用できるが、その直径は、０
．０３〜２０μｍの範囲に入るものが利用可能である。

その形状は球形でも非球形でもよいが、非球形の場合、
直径は便宜上最大径と最小形の和の１／２として取扱う
ことができる。また微粒子は着色していないことがのぞ
ましいが、発光の測定を実質上訪客しなければ着色して
いても差支えない。

とくに好ましい微粒子の材料は合成高分子化合物である
。例えばポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリア
クリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリ−ε−
カプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性
重合体群、あるいはポリアクリルアミド、ポリメタクリ
ルアミド、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコール、ポリ（２−オキシェｆ　／ｌ／アクリレート
）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（
２，３−ジオキシグロビルアクリレート）、ポリ（２，
ろ−ジオキシプロビルメタクリレート、ポリエチレング
リコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体群
、もしくは両方の性質を持つ共重合体群がある。

本発明に用いられる化学発光物質としては、例えばルミ
ノール、イノルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−
Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル
）−Ｎ−エチルイノルミノール、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルインルミノールヘミスクシンアミド、
ロフィン、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、ピロ
ガロール、ルシフェリン、インドール、リボフラビン、
チアジシ染料などを挙げることができる。

これらの化学発光剤を微粒子に含有させる方法としては
、化学的に結合させる方法と物理的に吸蔵させる方法の
いずれを用いてもよい。化学的に結合させる方法には共
有結合による方法とイオン結合による方法がある。共有
結合による場合、たとえば実施例１のように化学発光の
量子収率が遊離のルミノールよりも低下することがある
が、それでもなお使用目的に対して十分な発光能をもた
せることができる。Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エ
チルインルミノールのようにホルミル基と反応すべきア
ミン基が化学発光基と離れている発光剤の場合には共有
結合生成による発光効率の低下は小さい。

本発明による化学発光性微粒子の有用性は、例えば生物
学とくに細胞学の領域において示す゛ことができる。ヒ
トおよび動物の生体においては、生体防禦機構の一環と
して貧食細胞が体内に侵入した異物を捕捉処理している
が、その異物処理機能の一つに酸化による殺菌能がある
ことが知られている。本発明の化学発光性微粒子をマク
ロファージや顆粒球のような貧食細胞と体内または体外
で共存させると、貧食細胞が化学発光性微粒子に付着す
るかまたは貧食して酸化剤を作用させるため、微粒子が
発光する。この発光強度は貧食細胞の殺菌能の尺度とし
て極めて有用である。なお貧食細胞の殺菌能測定の目的
で使用する化学発光性微粒子としては、上述のように単
に、化学発光剤を含有させ・ただけのポリマー微粒子で
も使用可能であるが、微粒子表面に免疫グロブリンまた
は補体を結合゛させておけば、さらに有意義な測一定を
行うことができる。免疫グロブリンの微粒子表面への結
合はたとえば特開昭５６．−１４１５５９記載の方法に
、より、また、補体の微粒子表面への結合はたとえば特
開昭５７−１７５１２８記載の方・法により行うことが
できる。

化学発光性微粒子の別の利用法は標識免疫測定の標識剤
として使用することである。本発明者らは放射免疫測定
（ＲＩＡ）にかわる安全で安価でしかも操作が容易な高
感度測定法を開発すべく検討した結果、螢光免疫測定（
ＦＩＡ）の長所を生かした方法、すなわち標識免疫測定
法において螢光物質を結合したコロイド粒子を使用する
ことにより、生物学的に活性な物質を高感度で測定でき
る新規な測定法を見出し、先に出願した（特願昭５７−
２３１２０（Ｓ　）。すなわち先の出願は、検体溶液中
の生物学的に活性な被測定物質を標識免疫測定法により
測定する方法において、標識剤として螢光を発する直径
０．０３μｍ〜６μｍの微粒子を用いることを特徴とす
る生物学的に活性な物質の測定法である。

標識免疫測定法には代表的な方法としてサンドウィッチ
法および競争法がある。サンドウィッチ法とは、検体溶
液中の生物学的に活性な被測定物質と、被測定物質に特
異的に結合する結合のパートナ−を固定化した固相およ
び被測定物質に特異的に結合する性質がありかつ標識剤
で標識された物質とを反応させ、次いで液相に残存した
標識物質または、固相に結合した標識物質を測定するこ
とにより被′６＋１１定物質を測定する方法である。ま
た競争法とは、検体溶液中の生物学的に活性な被測定物
質、および標識剤で標識された既知量の被測定物質を、
被測定物質に特異的に結合する結合のパートナ−を固定
化した固相に反応させた後、液相に残存した標識物質又
は固相に結合した標識物質を測定することにより被測定
物質を測定する方法である。

標識免疫測定法に本発明の化学発光性微粒子を利用すれ
ば、被測定物質と特異的に反応しうる物質（以下、結合
性物質と称する）を、放射性同位元素や酵素または螢光
性試薬によって標識した標識物質を使用するかわりに、
化学発光物質を多数結合または含有さぜた粒径が００６
μｍ　−３μｍのコロイド粒子（以下発光コロイド粒子
と称す）で被測定物質もしくは結合性物質を標識した標
識物質（以下発光コロイド標識物質と称す）を使用する
ことができる。発光コロイド標識物質は、競争法では直
接、サンドウィッチ法では被測定物質を介して固相に結
合するが、適当な量の発光コロイド標識物質を用いれば
、被測定物質の量と、固相に結合するまたは液相に残存
する発光コロイド標識物質の量とに定量的な相関が生じ
る。コロイド粒子には多数の化学発光物質を結合または
含有さぜることか可能であり、従来のルミネッセンス免
疫測定のように結合性物質を単に化学発光性試薬で標識
するのに比較し、格段に発光強度をあげることができ、
そのために測定感度もはるかに向上できる。

発光コロイド粒子は測定の精度を出すうえで、分散性が
よくしかも均一な粒径、形状であることが好ましい。反
応効率の点から粒径は小さいほどよく、少くともブラウ
ン運動をおこす程度の粒径すなわち６μｍ以下であるこ
とが好ましい。しかし、あまシ粒径が小さくとも操作上
および測定上適当ではないので、粒径は０，０６μｍ〜
６μｍの範囲であることが適当であｐｌ特に０、１μｍ
〜１μｍの粒径が好ましい。

発光コロイドの発光量を測定するためには、触媒の共存
下に酸化剤を作用させ、光子計数方式によって測定する
。

酸化剤としては、たとえば過酸化水素、次亜塩素酸ナト
リウム、過硫酸アンモニウム、過ホウ酸すトリウム、ヨ
ウ素、過ヨウ素酸すトリウム、分子状酸素、過酸化カリ
ウム、過マンガン酸カリウムなどを挙げることができる
。触媒は一般に金属化合物で、たとえば、赤血塩、ヘモ
グロビン、ヘマチン、ヘミン、フェリチン、ホルフイリ
ン、塩化第一コバルト、酢酸銅、チトクロームＣなどを
はじめ、ニッケル、マンガン、クロムなどの塩類、錯塩
類および有機金属化合物を使用することができる。さら
にベルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素も使用
できる。

発光量の測定には、フォトンカウンター、シンチレーノ
ヨンカウンターなど発生した光子数を計測できる装置を
使用することがのぞましい。

次に実施例をあげる。

実施例１ （ルミノール結合粒子を使用したマウス腹腔マクロファ
ージの貧食能検査） （ルミノール結合粒子の調製） グリシジルメタクリレ−１・、２−ヒドロキシエチルメ
タクリレート、メタクリル酸およびトリエチレングリコ
ールジメタクリレートを６５：２０：１０：５のモル比
で混合した。

２４ｇの七ツマー混合液を７６ｇのプロピオン酸エチル
に溶解し、０．１３ｇの２，２′−アＩ＼゛ ゾビス（２，４−ジメチル−４−メトキシ≠しロニトリ
ル）を加え、窒素雰囲気下ヤ４０℃で６時間反応を行な
った。

沈殿した粒子（平均直径２μｍ）を０．３％の硫酸水中
で１０日間ろ０℃にて攪拌し、粒子中のエポキシ基の加
水分解をおこなった。

加水分解した粒子１０■をＮａｌ０．１０ｍｆを溶解さ
せた水１−に分散させた後Ｎ　ｐＨを４にして室温で１
時間反応させた。洗浄後粒子を１■のルミノールを溶解
した０、　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液に分散させ、室温で
２時間反応させた。

余剰のルミノールを洗浄によシ除去し、ルミノール結合
粒子を得た。

（マウス腹腔マクロファージの採取） 使用したマウスはＢａ１ｂＯのメスで、マクロファージ
採取５日前にフロイントの完全アジュバントをマウス腹
腔に注射しておいた。

マウス腹腔より細胞をとり出した後、ウシ新生児血清に
てあらかじめ被覆しておいたプラスチックシャーレに吸
着する細胞のみを集めマクロファージを得た。

得られたマクロファージは１０７コ／−となるようにウ
シ胎児血清を１０％含むイーグルのＭＥＭに分散させた
。

（マクロファージの食殺菌能の測定） 食殺菌能は化学発光の強度により測定した。

化学発光強度はＬＵＭＡＯ社のバイオカウンターＭ２Ｏ
１０によシ測定した。

Ｌｕｍａｃ専用プラスチックバイアルにマクロファージ
分散液１００μｔを入れて、あらかじめ６７℃にしてお
いた試料室に２分間おき、次に６×１０９コ／７！のル
ミノール結合粒子分散液１００μｔを加え、発光の測定
を開始した。

測定は１分おきにおこない、１回につき１０秒間の測定
をおこない、その値から、１分あたりの発光量をめた。

対照として：　（１）　２０μｇ／ｍｌのルミノール溶
液１００μｔをルミノール結合粒子のかわりに使用した
実験；（２）２０μｇ／ゴのルミノール溶液を１００μ
を加え、さらに１００μｇ／ｌｎｌのルミノールを結合
していない粒子の分散液を１００μｌ加えた実験；（３
）ルミノールを加えずに、ルミノールを結合していない
粒子分散液のみ加えた実験；を行なった。

以上の結果を第１図に示した。

実施例２ （ルミノール結合粒子を使用したマクロファージ活性化
度の測定） （補体結合ルミノール結合粒子の調製）ルミノール結合
粒子は実施例１と同様に調製した。水１ｔｎｌにルミノ
ール結合粒子１０Ｔｎｇを分散させマウスＴｇ０１００
μｇを加え、塩酸でｐＨ４，５にあわせなから１−工〃
レー６−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩１０■を添加していき４℃で一晩反応させた。

洗浄後新鮮マウス血清を加え、３７℃で１５分間攪拌し
、補体ルミノール結合粒子を調製した。

（マクロファージの採取） 実施例１と同様マウスを使用した。マクロファージを活
性化する目的でマクロファージ採取４日前にあらかじめ
マウス腹腔内にフロイント完全アジュバン）　２００μ
ｍ−またはチオグリコレート培地をＰＢＳに１０■／７
！となるように溶解させた溶液２００μｔを注射してお
いた。

マクロファージの分取は実施例１に準じて行なった。

（マクロファージの食殺菌能の測定） （１）活性化しないマウス；（２）チオグリコレートに
よシ活性化したマウス；（３）フロイント完全アジュバ
ントにより活性化したマウス−〇ろ種について各々のマ
クロファージの食殺菌能を補体ルミノール結合粒子によ
って検定した。検定法は実施例１に準じて行なった。

各々の結果を第２図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、各々実施例１および実施例２の
マクロファージの貧食能測定結果を示す。 １・・・ルミノール結合粒子を使用したもの２・・・ル
ミノール溶液と粒子分散液の混合液を使用したもの ６・・・ルミノール溶液のみを使用したもの４・・・粒
子のみを使用したもの ５・・・フロイント完全アジュバントにより活性化した
マクロファージをルミノール結合粒子により測定したも
の ６・・・チオグリコトドにより活性化したマクロファー
ジをルミノール結合粒子により測定したもの ７・・・活性化し々いマクロファージをルミノール結合
粒子により測定したもの 特許出願人　東　し　株　式　会　社 Ｂ！ｆ　閉（分） 第１図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）化学発光性物質を含有する直径０．０６〜２０μ
   ｍの生物学的検査用微粒子。