JPS60184393A - アラニンの製造法 - Google Patents
アラニンの製造法Info
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- JPS60184393A JPS60184393A JP4014184A JP4014184A JPS60184393A JP S60184393 A JPS60184393 A JP S60184393A JP 4014184 A JP4014184 A JP 4014184A JP 4014184 A JP4014184 A JP 4014184A JP S60184393 A JPS60184393 A JP S60184393A
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- Japan
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- alanine
- dehydrogenase
- dna
- lactic acid
- adh
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は有用なアミノ酸であるアラニンを安価な乳酸よ
り製造する方法に関する。
り製造する方法に関する。
アラニンの構造法は化学的合成法９発酵法、アスノ臂う
ギン酸よシ酵素的に脱炭酸する方法等、いくつかの方法
が知られているがより安価で簡単な手法の開発が望まれ
ている。
ギン酸よシ酵素的に脱炭酸する方法等、いくつかの方法
が知られているがより安価で簡単な手法の開発が望まれ
ている。
本発明者等は酵素を用い安価な原料からアラニンを得る
方法を種々研究した結果、乳酸、アンモニア供与体及び
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと
略す。）を含有する水性媒体中で乳酸脱水素酵素（以下
ＬＤＨと略す。）及びＬ−アラニン脱水素酵素（以下Ａ
ＤＨと略す。）を共役させることにより、該水性媒体中
にアラニンが効率よく生成・蓄積せしめることを見い出
し、本発明を完成した。
方法を種々研究した結果、乳酸、アンモニア供与体及び
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと
略す。）を含有する水性媒体中で乳酸脱水素酵素（以下
ＬＤＨと略す。）及びＬ−アラニン脱水素酵素（以下Ａ
ＤＨと略す。）を共役させることにより、該水性媒体中
にアラニンが効率よく生成・蓄積せしめることを見い出
し、本発明を完成した。
即ち、両酵素共にＮＡＤを補酵素とするが下式（１）に
示すようにＬＤＨによりＮＡＤはＮＡＤＨとなシ乳酸は
ピルビン酸に変換され、次いでアンモニア供与体、例え
ばＮＨ４，の存在下でＡＤＨによりＮＡＤＨはＮＡＤに
酸化され、同時にピルビン酸はアラニンに変換される。
示すようにＬＤＨによりＮＡＤはＮＡＤＨとなシ乳酸は
ピルビン酸に変換され、次いでアンモニア供与体、例え
ばＮＨ４，の存在下でＡＤＨによりＮＡＤＨはＮＡＤに
酸化され、同時にピルビン酸はアラニンに変換される。
式（１）
式ＣＩ）に示したよりなＮＡＤを共役する系を用いるこ
とにより効率良く乳酸からアラニンを生産することがで
きる。本反応を行うにはＮＡＤＨは反応の開始時に添加
するだけでよく、かつＮＡＤＨの添加量は小量で良い。
とにより効率良く乳酸からアラニンを生産することがで
きる。本反応を行うにはＮＡＤＨは反応の開始時に添加
するだけでよく、かつＮＡＤＨの添加量は小量で良い。
アンモニア供与体としてはアンモニア又はアンモニウム
塩が使用できる。
塩が使用できる。
本発明で使用するＬＤＨ及びＡＤＨは動物、植物又は微
生物起源のいずれから得られたもので良いが、微生物起
源のものがよシ安価である。微生物起源のＬＤＨ及びＡ
ＤＨを使用すると式（１）の反応により安価にアラニン
を製造することができる。しかし、ＬＤＨとＡＤＨを同
時に高活性に生成する微生物は無いために各々の酵素を
高活性に生成する微生物を各々単独で培養しなければな
らない。
生物起源のいずれから得られたもので良いが、微生物起
源のものがよシ安価である。微生物起源のＬＤＨ及びＡ
ＤＨを使用すると式（１）の反応により安価にアラニン
を製造することができる。しかし、ＬＤＨとＡＤＨを同
時に高活性に生成する微生物は無いために各々の酵素を
高活性に生成する微生物を各々単独で培養しなければな
らない。
この点に関し、更に鋭意検討を加えた結果、ＬＤＨ生産
能を有し、ベクターＤＮＡとＡＤＨをコードする遺伝子
とが連結されているＤＮＡを有し、かつＡＤＨ生産能を
有する微生物を造成することに成功１〜た。
能を有し、ベクターＤＮＡとＡＤＨをコードする遺伝子
とが連結されているＤＮＡを有し、かつＡＤＨ生産能を
有する微生物を造成することに成功１〜た。
すなわち、高活性のＡＤＨを有するバチルスステアロサ
ーモフィラスＩＦＯ１２５５０の染色体ＤＮＡよυＡＤ
Ｉ（遺伝子を取り出し、高活性ＬＤＨな有するエシェリ
ヒア・コリＣ６００株に組み込みＡＤＴ（とＬＤＨ活生
の高いエシェリヒア・コ！Ｊ Ｃ６００ＰＩＣＲ３及び
３０１菌を得た。
ーモフィラスＩＦＯ１２５５０の染色体ＤＮＡよυＡＤ
Ｉ（遺伝子を取り出し、高活性ＬＤＨな有するエシェリ
ヒア・コリＣ６００株に組み込みＡＤＴ（とＬＤＨ活生
の高いエシェリヒア・コ！Ｊ Ｃ６００ＰＩＣＲ３及び
３０１菌を得た。
遺伝子供４菌であるバチルス・ステアロサーモフィラス
ＩＦＯ１２５５０よシ染色体ＤＮＡを抽出する方法は例
えばＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ８９ １０６５（１９６
５）に記載されている様な通常の方法で行なうことが出
来る。
ＩＦＯ１２５５０よシ染色体ＤＮＡを抽出する方法は例
えばＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ８９ １０６５（１９６
５）に記載されている様な通常の方法で行なうことが出
来る。
ベクターＤＮＡとしては微生物の菌体内で自己増殖でき
るものであればどの様なものでも良くその１つとしてＰ
ＢＲ３２２がある。染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡは
それぞれ制限エンドニュクレアーゼを用いて切断する、
制限エンドニュクレアーゼは用いるベクターＤＮＡによ
り適宜選択するのが良い。
るものであればどの様なものでも良くその１つとしてＰ
ＢＲ３２２がある。染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡは
それぞれ制限エンドニュクレアーゼを用いて切断する、
制限エンドニュクレアーゼは用いるベクターＤＮＡによ
り適宜選択するのが良い。
又、染色体ＤＮＡについては制限エンドニューフレアー
ゼにより切断が部分的に起る様に反応条件を調節すれば
多くの種類の制限エンドニューフレアーゼが使用出来る
。かくして得られた染色体ＤＮＡ断片と切断されたベク
ターＤＮＡを連結せしめる方法はりガーゼを用いる通常
の方法が使用出来る。この様にして得られた染色体ＤＮ
Ａ断片とベクターＤＮＡが連結し７’ｃ ＤＮＡの受容
菌はＬＤＨ活性の高い菌株であれば何でも良い。
ゼにより切断が部分的に起る様に反応条件を調節すれば
多くの種類の制限エンドニューフレアーゼが使用出来る
。かくして得られた染色体ＤＮＡ断片と切断されたベク
ターＤＮＡを連結せしめる方法はりガーゼを用いる通常
の方法が使用出来る。この様にして得られた染色体ＤＮ
Ａ断片とベクターＤＮＡが連結し７’ｃ ＤＮＡの受容
菌はＬＤＨ活性の高い菌株であれば何でも良い。
受容菌への導入は例えばＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ ５３
１５９（１９７０）に記載されている様な通常の形質転
換法が使用出来る。形質転換株の内ＡＤＨ遺伝子を含む
形質転換株を選ぶにはベクターＤＮＡのマーカ（５） −の性質とＡＤＨ活性を指標として選択すれば良い。
１５９（１９７０）に記載されている様な通常の形質転
換法が使用出来る。形質転換株の内ＡＤＨ遺伝子を含む
形質転換株を選ぶにはベクターＤＮＡのマーカ（５） −の性質とＡＤＨ活性を指標として選択すれば良い。
この様な操作によりＬＤＩ（、ＡＤＨ活性を高く有する
菌株を造成することができる。以下に具体的にＡＤＨ活
性を高く有する菌株の造成手法について説明する。
菌株を造成することができる。以下に具体的にＡＤＨ活
性を高く有する菌株の造成手法について説明する。
１）染色体ＤＮＡの調製
バチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２５５０を
１１の「Ｂａｃｔ−ｐｅｎａｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈ Ｊ
（商品名Ｄｉ ｒ ｃ。
１１の「Ｂａｃｔ−ｐｅｎａｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈ Ｊ
（商品名Ｄｉ ｒ ｃ。
製）中、４５℃で約２時間、振盪培養を行ない対数増殖
期の菌体を集菌後、通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ ８９ 、１０６５（１９６５）など）によ
り染色体ＤＮＡを抽出精製し２．６１ｎ９を採取。
期の菌体を集菌後、通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ ８９ 、１０６５（１９６５）など）によ
り染色体ＤＮＡを抽出精製し２．６１ｎ９を採取。
２）染色体ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへの挿入少なく
ともＡＤＨ遺伝子を含む遺伝子領域をクローニングする
為、そのベクターとなる自己増殖性ＤＮＡとしてアンピ
シリン耐性プラスミドＰＢＲ３２２を用いた。
ともＡＤＨ遺伝子を含む遺伝子領域をクローニングする
為、そのベクターとなる自己増殖性ＤＮＡとしてアンピ
シリン耐性プラスミドＰＢＲ３２２を用いた。
１）で得たＤＮＡ １０μｇとベクターＤＮＡ ５μＩ
をそれぞれとシ、制限エンドニュクレアーゼの一程であ
る−ａｌ−１を３７℃で１時間作用させてＤＮＡ鎖（６
） を切断した。６５℃、１０分熱処理後両反応液を混合し
ＡＴＰ 、及びジチオスライトール存在下。
をそれぞれとシ、制限エンドニュクレアーゼの一程であ
る−ａｌ−１を３７℃で１時間作用させてＤＮＡ鎖（６
） を切断した。６５℃、１０分熱処理後両反応液を混合し
ＡＴＰ 、及びジチオスライトール存在下。
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用いて１０℃。
２４時間、 ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。
３） ＡＤＨ遺伝子を担ったグラスミドによる形質転換
ＬＤＨ活性の高いエシェリヒア・コリＣ６００ヲコンビ
テントな状態（ＤＮＡの取込み能を有する状態）とする
にはＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ ５３１５９（１９７０）の
記載に従い細胞を調製した。
ＬＤＨ活性の高いエシェリヒア・コリＣ６００ヲコンビ
テントな状態（ＤＮＡの取込み能を有する状態）とする
にはＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ ５３１５９（１９７０）の
記載に従い細胞を調製した。
このコンピテントな細胞懸濁液に２）で得たベクターＤ
ＮＡとＡＤＨをコードする遺伝子とが連結したＤＮＡを
含むＤＮＡの溶解液を加え水冷下３０分保ち、直ちに４
２℃、２分間、ヒートショックを与えた。
ＮＡとＡＤＨをコードする遺伝子とが連結したＤＮＡを
含むＤＮＡの溶解液を加え水冷下３０分保ち、直ちに４
２℃、２分間、ヒートショックを与えた。
次にこの細胞懸濁液の一定量を取り新たな培地（１チト
リプトン、０．５酵母エキス、０．５％食塩。
リプトン、０．５酵母エキス、０．５％食塩。
０．０５％硫酸マグネシウム７水塩、ｐＨ７，２）に接
種し、３７℃、１時間振盪培養を行ない形質転換を完了
させた。
種し、３７℃、１時間振盪培養を行ない形質転換を完了
させた。
培養液をアンピシリン５０μｍ７７ｍ１を含む寒天１．
５％を加えた前記培地上に塗布し、３７℃に保温した。
５％を加えた前記培地上に塗布し、３７℃に保温した。
１〜２日後、培地上に出現した２１０ケのコロニーを釣
菌し各クローンをそれぞれ純化し、ＡＤＨ活性を発現し
た株ＰＩＣＲ−３ＡＪ １２１３２ＦＥＲＭ Ｐ−７４
７４−を選択した。この菌株中に存在するプラズミッド
ＰＩＣＲ−３はＩＩＫペースペアーであった。
菌し各クローンをそれぞれ純化し、ＡＤＨ活性を発現し
た株ＰＩＣＲ−３ＡＪ １２１３２ＦＥＲＭ Ｐ−７４
７４−を選択した。この菌株中に存在するプラズミッド
ＰＩＣＲ−３はＩＩＫペースペアーであった。
次にＰＩＣＲ−３株を用い組み換えグラスミドの小型化
を図った。すなわちＰＩＣＲ−３株中に存在するグラス
ミドＰＩＣＲ−３を制限酵素Ｈ１ｎｄ Ｍで完全に分解
後再度ＰＢＲ３２２プラスミドに接続せしめ組み換えグ
ラスミドＰＩＣＲ−３０１を得た。本ゾラズミドＰＩＣ
Ｒ−３０１は８にベースペアーであった。
を図った。すなわちＰＩＣＲ−３株中に存在するグラス
ミドＰＩＣＲ−３を制限酵素Ｈ１ｎｄ Ｍで完全に分解
後再度ＰＢＲ３２２プラスミドに接続せしめ組み換えグ
ラスミドＰＩＣＲ−３０１を得た。本ゾラズミドＰＩＣ
Ｒ−３０１は８にベースペアーであった。
該グラスミドを３）と同様の処理によりエセリヒヤコリ
Ｃ６００に導入しエセリヒヤコリＰＩＣＲ−３０１、Ａ
Ｊ １２１３３ ＦＥＲＭ Ｐ−’；＃’７タを得た。
Ｃ６００に導入しエセリヒヤコリＰＩＣＲ−３０１、Ａ
Ｊ １２１３３ ＦＥＲＭ Ｐ−’；＃’７タを得た。
さてこの様にして得られた菌株及び元株の培養は通常の
細菌培養法、即ち培地としては炭素源。
細菌培養法、即ち培地としては炭素源。
窒素源無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン
等の有機微量金属を含むもので良い。炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、テキストリン等、乳酸等の有
機酸、窒素源としてはペグトン、イーストエキス、アン
モニア及びその塩等が使用出来る。
等の有機微量金属を含むもので良い。炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、テキストリン等、乳酸等の有
機酸、窒素源としてはペグトン、イーストエキス、アン
モニア及びその塩等が使用出来る。
培養は好気的条件で−、温度を適宜調節してＬＤＨ、Ａ
ＤＨの活性が最大になるまで行なう。
ＤＨの活性が最大になるまで行なう。
酵素反応に用いるには培養した菌体をそのままでも良い
し、集菌し洗浄後が一ルミル、フレンチプレス、又は超
音波破砕装置等で破砕した細胞抽出液でも良い又、硫安
分画、限外シ過、グル濾過。
し、集菌し洗浄後が一ルミル、フレンチプレス、又は超
音波破砕装置等で破砕した細胞抽出液でも良い又、硫安
分画、限外シ過、グル濾過。
イオン交換クロマトグラフィ等で精製した標品も用いる
ことができる◎更に、ＬＤＨ、ＡＤＨ両酵素又は含有菌
体又は破砕物を固定化したものも用いることができる。
ことができる◎更に、ＬＤＨ、ＡＤＨ両酵素又は含有菌
体又は破砕物を固定化したものも用いることができる。
乳酸よりアラニンの変換には造成した菌株を用いて乳酸
を含む培地で２４〜１２０時間培養するか菌体又は酵素
標品にＮＡＤ 、乳酸及びアンモニア供与体を含む水性
媒体をｐＨ４，０〜１０．０望ましくは７．０〜８．０
に保ちつつ２０℃〜８０℃、望ましくは３０℃〜５０℃
で反応することによりアラニンを生成させることが出来
る。
を含む培地で２４〜１２０時間培養するか菌体又は酵素
標品にＮＡＤ 、乳酸及びアンモニア供与体を含む水性
媒体をｐＨ４，０〜１０．０望ましくは７．０〜８．０
に保ちつつ２０℃〜８０℃、望ましくは３０℃〜５０℃
で反応することによりアラニンを生成させることが出来
る。
（９）
本反応に使用する酵素は酵素源にもよるがほとんどの微
生物及びその抽出粗酵素にはアラニンラセマーゼの混在
があ）、生成したＬ−アラニンがラセミ化するのでＤＬ
−アラニンになる。
生物及びその抽出粗酵素にはアラニンラセマーゼの混在
があ）、生成したＬ−アラニンがラセミ化するのでＤＬ
−アラニンになる。
Ｌ−アラニンを得るには下記の処理を行なえば良い。即
ち、アラニンラセマーゼの除去法はイオン交換クロマト
グラフィー等で分離、除去する方法も可能であるが、よ
シ簡単な方法として５０℃〜８０℃で５分〜６０分で熱
処理することによりアラニンラセマーゼが実質的に失活
するので容易にＬ−アラニンを製造することができる。
ち、アラニンラセマーゼの除去法はイオン交換クロマト
グラフィー等で分離、除去する方法も可能であるが、よ
シ簡単な方法として５０℃〜８０℃で５分〜６０分で熱
処理することによりアラニンラセマーゼが実質的に失活
するので容易にＬ−アラニンを製造することができる。
ＬＤＨ、ＡＤＨ活性及びアラニンの定量法は次のように
して行った。
して行った。
ＬＤＨ活性は５ｔｏｌｚｅｎｂａｃｈ、 Ｆ （１９６
６） Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９
２７８ 記載の方法に従った。
６） Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９
２７８ 記載の方法に従った。
ＡＤＨ活性は左右田健次、大島敏久（１９７６）生化学
実鹸講座１１上１９３記載の方 法に従った。
実鹸講座１１上１９３記載の方 法に従った。
アラニンの定量はＤＬ−アラニンは通常のアミノ（１０
） 酸分折機により定量、Ｄ、Ｌの分別定 量はＰ、Ｅ、ＨｓＩｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２０４１２
２６ （１９７９）記載の高速液体クロマトグラフィを
用いる方法に従っ た。
） 酸分折機により定量、Ｄ、Ｌの分別定 量はＰ、Ｅ、ＨｓＩｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２０４１２
２６ （１９７９）記載の高速液体クロマトグラフィを
用いる方法に従っ た。
水性媒体中に蓄積したアラニンはイオン交換樹脂又は晶
析法など通常の方法により採取することができる。
析法など通常の方法により採取することができる。
以下に実施例をあげてさらに詳細に説明する。
実施例−１゜
市販されているＬＤＨ（ウサギ筋肉由来など）０．５６
ユニツ） 、 ＡＤＨ（バチルス、サブチリス由来など
）０．４２ユニツト、乳酸アンモニウム３０ｍＭ 、
ＮＡＤ １．２５ ｍＭ 、 ｐＨ８，０リン酸緩衝液
０．１Ｍを４０℃２時間反応させたところ２８ ｍＭの
Ｌ−アラニンが生成した。
ユニツ） 、 ＡＤＨ（バチルス、サブチリス由来など
）０．４２ユニツト、乳酸アンモニウム３０ｍＭ 、
ＮＡＤ １．２５ ｍＭ 、 ｐＨ８，０リン酸緩衝液
０．１Ｍを４０℃２時間反応させたところ２８ ｍＭの
Ｌ−アラニンが生成した。
実施例−２゜
乳酸ソーダ０．５％、硫酸アンモニウム０．５％。
リン酸−カリウム０．３％、リン酸二カリウム０．１優
、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、イーストエキス
）ラフ）ｏ、ｏｉ％、Ｌ−スレオニン２０″チ、Ｌ−ロ
イシン１０７９％、を含む−１７，２の培地を５００＋
ｎｌ肩付フラスコに１００ｍ１づつ分注し１１５℃、１
０分間オートクレーブ殺菌する。別にグルコース０．１
％、に７’）ン１．Ｏ％、イーストエキス０．５％、食
塩０．５％に寒天１．５チを加え１２０℃、１０分オー
トクレーブ殺菌した寒天斜面培地にエツシェリヒア、コ
ＩＪ Ｃ６００ＰＩＣＲ−３及びＰＩＣＲ−３０１を３
０℃１夜培養し、その１白金耳を前記液体培地に接種し
て３０℃、４８時間振盪培養（１２０回転）した結果、
ＰＩＣＲ−３株は０．２７１１／ｄｌＰＩＣＲ−３０１
株は０．３６１１／ｄｌのＤＬ−アラニンを蓄積した。
、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、イーストエキス
）ラフ）ｏ、ｏｉ％、Ｌ−スレオニン２０″チ、Ｌ−ロ
イシン１０７９％、を含む−１７，２の培地を５００＋
ｎｌ肩付フラスコに１００ｍ１づつ分注し１１５℃、１
０分間オートクレーブ殺菌する。別にグルコース０．１
％、に７’）ン１．Ｏ％、イーストエキス０．５％、食
塩０．５％に寒天１．５チを加え１２０℃、１０分オー
トクレーブ殺菌した寒天斜面培地にエツシェリヒア、コ
ＩＪ Ｃ６００ＰＩＣＲ−３及びＰＩＣＲ−３０１を３
０℃１夜培養し、その１白金耳を前記液体培地に接種し
て３０℃、４８時間振盪培養（１２０回転）した結果、
ＰＩＣＲ−３株は０．２７１１／ｄｌＰＩＣＲ−３０１
株は０．３６１１／ｄｌのＤＬ−アラニンを蓄積した。
実施例−３゜
グルコース０．１％、ペプトン１．０％、イーストエキ
ストラクト０．５％、食塩０．５％を苛性ソーダーでｐ
Ｈ７，０と１５００＋＋ｔＡ’肩付クラス：Ｉ ヘ１０
０ ｍｌｌづつ分注し１２０℃−１０分オートクレーブ
殺菌した培地へ同培地の寒天斜面培地で３０℃−夜培養
し九ＰＩＣＲ−３０１株の１白金耳を接種し３０℃。
ストラクト０．５％、食塩０．５％を苛性ソーダーでｐ
Ｈ７，０と１５００＋＋ｔＡ’肩付クラス：Ｉ ヘ１０
０ ｍｌｌづつ分注し１２０℃−１０分オートクレーブ
殺菌した培地へ同培地の寒天斜面培地で３０℃−夜培養
し九ＰＩＣＲ−３０１株の１白金耳を接種し３０℃。
２４時間振盪培養する。培養後５０００回転１０分遠心
集菌し、０．１ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ８，０で２回洗浄
する０次に同緩衝液に懸濁し水冷下１０ＫＣ。
集菌し、０．１ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ８，０で２回洗浄
する０次に同緩衝液に懸濁し水冷下１０ＫＣ。
３分超音波破砕する、破砕液を１ｏｏｏｏ回転１０分遠
心分離し上清を粗酵素液とする。
心分離し上清を粗酵素液とする。
次に粗酵素液を蛋白として３０１ｎｆｌ、乳酸アンモニ
ウム１００ ｍＭ 、 ＮＡＤ ２ ｍＭ 、 ｐＨ８
，０リン酸緩衝液０．１Ｍを４０℃、１５時間反応させ
た結果、８５ ｍＭのＤＬ−アラニンが生成した。
ウム１００ ｍＭ 、 ＮＡＤ ２ ｍＭ 、 ｐＨ８
，０リン酸緩衝液０．１Ｍを４０℃、１５時間反応させ
た結果、８５ ｍＭのＤＬ−アラニンが生成した。
実施例−４゜
実施例−１の条件中ＡＤＨをＰＩＣＲ−３０１粗酵素の
７０℃、３０分熱処理物０，４２ユニ、トに替え、４０
℃、２時間反応させた結果２８ ｍＭのアラニンが生成
した。とれをＰ、Ｅ Ｉ（ａｒｅ等の方法によ月囃液体
クロマトグラフィで分析した結果２７．６ ｍＭがＬ−
アラニンであった。
７０℃、３０分熱処理物０，４２ユニ、トに替え、４０
℃、２時間反応させた結果２８ ｍＭのアラニンが生成
した。とれをＰ、Ｅ Ｉ（ａｒｅ等の方法によ月囃液体
クロマトグラフィで分析した結果２７．６ ｍＭがＬ−
アラニンであった。
実施例−５゜
実施例−３と同様調製したＰＩＣＲ−３０１菌体Ｉｇを
脱イオン水４ ｍｌに懸濁し、氷冷した後アクリルアミ
ド７５０■とメチレンビスアクリルアミド（１３） ４５■を加え溶解させ窒素ガスを通じて酸素を追い出し
た後、過硫酸アンモニウム３．５■及び獄′−ジメチル
アミノプロピオニトリル８μｌを加えて水冷下に静置し
た。１時間後生成した菌体含有ダルを５０メツシユの金
網で裏ごしし、生理食塩水で洗浄し、ダル固定化物を調
製した。
脱イオン水４ ｍｌに懸濁し、氷冷した後アクリルアミ
ド７５０■とメチレンビスアクリルアミド（１３） ４５■を加え溶解させ窒素ガスを通じて酸素を追い出し
た後、過硫酸アンモニウム３．５■及び獄′−ジメチル
アミノプロピオニトリル８μｌを加えて水冷下に静置し
た。１時間後生成した菌体含有ダルを５０メツシユの金
網で裏ごしし、生理食塩水で洗浄し、ダル固定化物を調
製した。
この固定化物を乳酸アンモニウム１００ ｍＭ 。
ＮＡＤ ２ ｍＭ 、 ｐＨ８，０、リン酸緩衝液０．
１Ｍ中に懸濁し、４０℃、２４時間反応させた結果８０
ｍＭのＤＬ−アラニンが生成した。
１Ｍ中に懸濁し、４０℃、２４時間反応させた結果８０
ｍＭのＤＬ−アラニンが生成した。
出 願 人 味の素株式会社
（１４）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）乳酸、アンモニア供与体及びニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを含有する水性媒体中で乳酸脱水素酵
素及びＬ−アラニン脱水素酵素を共役させ、該水性媒体
中にアラニンを生成・蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とするアラニンの製造法。 ２）乳酸脱水素酵素及びＬ−アラニン脱水素酵素が乳酸
脱水素酵素生産能を有し、ベクターＤＮＡとＬ−アラニ
ン脱水素酵素をコードする遺伝子とが連結されているＤ
ＮＡを有し、かつＬ−アラニン脱水素酵素生産能を有す
る微生物によって生産されたものである特許請求の範囲
第１項記載のアラニンの製造法。 ３）微生物がアラニンラセマーゼ活性を実質的に失活す
る程度に加熱されたものである特許請求の範囲第２項記
載のアラニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4014184A JPS60184393A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | アラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4014184A JPS60184393A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | アラニンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60184393A true JPS60184393A (ja) | 1985-09-19 |
Family
ID=12572496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4014184A Pending JPS60184393A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | アラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60184393A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992005268A1 (fr) * | 1990-09-20 | 1992-04-02 | Nippon Steel Corporation | PROCEDE DE PRODUCTION DE L-β-HALOALANINE |
| US5116748A (en) * | 1988-09-27 | 1992-05-26 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Process for the production of l-alanine dehydrogenase from 78-3 ferm bp-2517 |
| EP0603865A2 (en) * | 1992-12-22 | 1994-06-29 | Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for producing alanine |
| CN110305823A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-10-08 | 江南大学 | 采用乳酸生产l-丙氨酸的方法及菌株 |
| CN115724756A (zh) * | 2021-08-27 | 2023-03-03 | 北京大学 | 一种通过降解聚乳酸制备丙氨酸的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5138489A (ja) * | 1974-09-24 | 1976-03-31 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Hatsukohonyoruarufua aranin no seizoho |
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
-
1984
- 1984-03-02 JP JP4014184A patent/JPS60184393A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5138489A (ja) * | 1974-09-24 | 1976-03-31 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Hatsukohonyoruarufua aranin no seizoho |
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| EP0603865A3 (en) * | 1992-12-22 | 1995-06-28 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for the production of alanines. |
| US5559016A (en) * | 1992-12-22 | 1996-09-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing alanine |
| CN110305823A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-10-08 | 江南大学 | 采用乳酸生产l-丙氨酸的方法及菌株 |
| CN110305823B (zh) * | 2018-11-16 | 2021-05-04 | 江南大学 | 采用乳酸生产l-丙氨酸的方法及菌株 |
| CN115724756A (zh) * | 2021-08-27 | 2023-03-03 | 北京大学 | 一种通过降解聚乳酸制备丙氨酸的方法 |
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