JPS60155195A - 新規合成ペプチド、その製法及びそれを含む医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特にコレラド士シンのサブユニットＡとすづ
ユニツｌ−Ｂとの相互作用部位を再現するアミノ酸の配
列を含む新規ペプチドに関する。

例えば、ジエイ・ホルムジレッ（Ｊ、　ＨＯＬＭＧＲＥ
Ｎ）著、ネイチｐ　−（ＮＡＴＵＲＥ　）、２９２，３
０．１９８１年７月２戸、４１３〜４１７に記載される
ように、コレラによる漿液性下痢は、これを阻止しない
１・ＩＩ！す、脱水症、代謝性アシド−シス、更には死
亡に至ることになるが、これは、じプリオ・コレラエ（
Ｖｉｂｒ４ｂ　ｔｈｏｌｔｒａｅ　）により分泌された
クレラト士シンｖｃｍ因するものである。コレラド士シ
ンの作用機構はよく知られている。即ち、コレラド士シ
ンは粘膜細胞に存在するレセプターに何着し、腸のアデ
ニルシクラーゼ活性、即ち、小腸の細胞内に存在する環
状Ａ　Ａｆ　Ｐレベルを増大させる作用を刺激する。こ
のため、高度の水の消耗並びに腸の絨毛性及び陰窩細胞
による塩素の活発な分泌の刺激による塩化ナトリウムの
吸収の阻止に基き、下痢及び体液の消失が生じるもので
ある。

また、例えば、アール・ニー・フィンケルスタイ、、　
（Ｒ，Ａ、、　ＦＩＮＫＥＬＳＴＥＩＮ）、エム・ケー
・ジル（Ａｆ、に、　ＬＡＲＵＥ　）及びジエイ・ジエ
イ・Ｄスパルト（／、　Ｊ、ＬＯ５ＰＡＬＬＵＴＯ）に
ょるＩＮＦＥＣＴ。

ＩＭＭＵＮ、　、　６　、　（９７２、戸９３４から知
られるように、コレラド士シンは、５つの同一のユニッ
トを含むサブユニットＢ及びサブユニットＡなる２つの
ポリペづチドフラグメントからなる蛋白質である。

上記ジエイ・ホルムジレンにより詔められているように
、コレラド士シンの有毒な作用は次の事項により表わす
ことができる。即ち、ト十シンのサブユニットＢが、十
二指腸の腸嚢胞の膜のＧ＆１しｔブタ−に付着し、次い
でアデニルシクラーぜの非可逆的活性化に基く環状ＡＭ
Ｐレベルが増大する（ディー・エム・ジル（Ｄ、Ｍ、　
ＧＩＬＬ）、ＡＤＶ。

ＣＹＣＬＩＣＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　ＲＥＳ、、　８．
　１９７７、戸８５参照）。以上より、コレラの症候は
サブユニットＡが細胞内に導入されることにより生じる
と予測される。

このりづユニットＡは、］レラト士シシ（ＣＴ）から、
ジスルフィド結合の還元により同一ではないサブユニッ
トα及びγを得て分別した場合に、疎水性を示す。ダブ
リュー・エイチ・ジエイ・ワード（Ｆ、Ｉｆ、　／、所
’ＡＲＤ　）及びニス・パン・ヘゴニップ、：、（Ｓ、
　ＶＡＮ　ＨＥＹＮＩＮＧＥＮ）　により報告されたＢ
ＩＯＣＨＥＭ、　Ｊ、　、　１９９．　Ｉ　９８　＋、
戸、４５７　によると、上記α−フラグメントは疎水性
領域を有さず、一方γ−フラグメントは親水性と親和性
を併せ持つ性質を有し、上記疎水性領域はインタクトの
サブユニットＡ中に穂され？Ｉるとされている。

また、α−フラグメントが細胞膜を透過するのは、伝導
性の（ｃｏｎｄｕｅｔｉｔｒｔ　）　フラグメントｒに
起因すると考えられる。よって、本発明者は、上記サブ
ユニットＡ１即ちコレラド士シンの生理活性の原因とな
るアミノ酸配列の構造に興味を持ったのである。

加えて、イー・シー・スパイサー（Ｅ、Ｋ。

５ＰＩＣＥＲ）、Ｊプリュー・エイチ・カバナラ（Ｗ。

Ｈ，ＫＡＶＡＮＡＵＧＨ）　、タラリュー、ニス、ダラ
ス（Ｆ、　Ｓ、　ＤＡＬＬＡＳ　）、ニスーファルコウ
ｃｓ。

ＦＡＬＫＯＷ’）　、Ｊ　フリュー・エイチ・コーニッ
しスベルク（Ｗ、Ｉｆ、　ＫＯＮＩＧＳＢＥＲＧ　）及
びディー、イー・シエイファ−（Ｄ、Ｅ、５ＣＩｆＡＦ
ＥＲ）により報告されたプ０シーディングズ・才プ・ザ
・ナショナル・アカデ三イ・才づ・サイエンス・オプ・
ザ、　ニー　、ニス−ニー　（ＰＲＯＣｏＮＡＴＬ、Ａ
ＣＡＤ、ＳＣＩ。

Ｕ−５−Ａ、　）、７８．　１９８１年１月、）、５０
−５４並びｖｃ４づ’ＪＬ−−ニス・り５　ス（Ｆ、Ｓ
、ＤＡＬＬＡＳ　）及びニス・ファル］つ（Ｓ、　ＦＡ
ＬＫ（Ｗ）によるネイチヤー（ＮｙｔｒｌＪｎＥ）、　
２８８．４．　Ｉ　９８０？１２月１戸、４９９〜５０
１によると、コレラド士シン’ＣＴ）と感染性胃腸炎（
ｔｙａｓｔｒａ　−ｔｎｔｔｒｉｌｔｓ　）を起こす熱
不安定性のニジエリしア−ｍｌす（Ｅｓ　ｔｈｅｒｉｔ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ　）のエンテ０ト士シシ（Ｌ　Ｔ　）
との−次構造には類似性が存在する。

即ち、コレラド士シシＣＴとニジエリしア°コリの熱不
安定性ト十シシＬＴは、その機能、構造及び免疫学的見
地からみて類似の腸毒素である。両者は共に、膵の蛋白
のＮＡＤ−依存性ＡＩ）Ｐ−リ　“ホモル化の触媒作用
を果すことにより、腸の上皮細胞中の珊状ＡＭｐレベル
を上昇させる。また、両者は２つの異なるサブユニット
、即ち、酵素活性を有し且つアデニルシクラーゼの活性
化成分であるサブユニットＡと膜の成分を認識し、ホ〇
ト十シンをターゲットの細胞に付着させ、上記＋ｊプユ
ニットＡをその基質に接近（）ｕｘｔａ戸Ｏ５／）させ
るサブユニットＢからなる。更に、とれまでの知見によ
ると、コレラド士シンのサブユニットＢの膜のしｔブタ
−とエシェリヒア・コリ　ト牛シンのそれとは類似して
いるが同一ではなく、また、七ノシア０シルガングリオ
シド（、％ｆｌが上記ＣＴのしｔブタ−であって、おそ
らく上記ＬＴのレセづターの一部を構成しているとされ
ている。シー・エル・ｆレス（ＣＬ　ＧＹＬＥＳ）及び
ディー・ニー−６−ｊ　ム（Ｄ、Ａ、’　ＥＡＲＮＵＭ
　）　Ｋ　ｊ　ルＩＮＦＥＣＴ。

Ｄｉｓ、、　Ｉ　２０．戸４１９〜４２６（１９７８）
によれば、ＬＴとＣＴとは免疫学的に類似しておシ、こ
れらサブユニットＡとサブユニットＢは共通の抗原決定
基を有する〔ジエイ・ディー・クレメンッ（Ｊ。

ｊ）、ＣＬＥＭＥＮＴＳ　）及びアール・ニー・フィシ
ケルスタイ：、（ＲｏＡ、Ｆｌ；Ｍ、、に’Ｅ１．Ｓコ
Ｔ、ＥＩ３．）、ｒｕｐＥｃｒ、　Ｉｈｏｔｖｙ、、２
＋、ｐＩ０３６−１０３９（１９７８）　′参照〕。Ｌ
ＴとＣＴのサブユニットＢの一次榴造１吐、すでに決定
されており、同様のアミノ酸配列を有することが示され
ている。上記したスバイサーら及びダラスらの研究によ
れば、ＣＴとＬＴのｔｊ′ｊユニットＡ　ｅｌ互間にお
いても、−次構造及び免疫学的特性の点で類似点が存在
し、これら２つの１ｊプユニツトのアミノ酸配列は、現
在のところ、一部が鮮明されているにすぎないが、ダフ
イー（ＤＵＦＦＹ）　及ｕ５　イ（、Ｌ　Ａ　Ｉ　）　
ノ研究（ＢＩＯＣＩＩＥ、Ｉｆ。

ＥＩＯＰＩＩＹＳ、ＲＥＳ、Ｃ０ＭＭ、、９＋、＋９７
９．／）＋００５　）によれば、ＣＴのサブユニットＡ
は、分子量２９５００であって、このうちα鎮が２４０
００であシ、γ鎮が５５００であることも知られている
。該ｒ＠のアミノ酸組成は知られており、４６のアミノ
酸を含む。このうち１１個のアミノ酸はＬＴのγ鎖と共
通である。

ｃｒのサブユニットＡとサブユニットＢとの相互作用部
位が、γ鎖、より詳しく紘、γ鎖のＮ−末端から＠１０
〜２４番のアミノ酸に対応する配列内に局在化している
との仮説に基き、且つ、ＬＴとｃ寞ｚｃｒとの機能上、
構造上及び免疫学上の類似性に基き、本発明者は、上記
第１０〜２４誉の配列を有するポリペプチドを合成すれ
ば、］コレラび感染性胃腸炎の双方に対し有効な薬剤が
得られるのではないかと考えた。

即ち、本発明は、Ｅ、　Ｃｏ１１のＬＴト＋シシのγ鎖
と共通の、コレラド士シンのサブユニットＡのγ鎖の少
なくとも１０個のアミノ酸を再現するペプチドを提供す
るものである。換言すれば、本発明は、動物に注射する
ことによシ、（単独で、或は例えば牛血清アルプ三ン等
の蛋白質の如きイムノゲシ分子と共に）、上記共通の配
列又はその均等物を認識する抗体を誘発し得るペプチド
を提供するものである。ここに上記均等物を含めたのは
、成る種のアミノ酸を他のアミノ酸で置き換えても２次
構造はほとんど変化しないことが知られているからであ
る。

好ましくは、本発明は、コレラド牛シンのサブユニット
Ａのγ鎖の１０−２４の配列を再現し、肚つ、ニジエリ
しア・コリのト十シンのサブユニットＡのγ鎖と共通の
５個のアミノ酸を有し、少なくともコレラ、好ましくは
コレラ及び感染性胃腸炎の双方に対する保護剤、よシ詳
しくはワクチンとして使用し得るペンタデカペプチドを
提供しようとするものである。本発明では、該ペンタデ
カペプチドは、化学合成又は他の方法、例えば上記アミ
ノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を含むベクターで
形質転換された細菌を用いる方法等によシ製造される。

本発明は、ニジエリしア・コリのＬＴト＋シシのｒｆＲ
と共通である、コレラド士シンのサブユニットＡのγ鎖
の少なくとも５個のアミノ酸を再現したことを特徴とす
るペプチドに係るものである。

本発明の好ましい実施態様によれば、コレラド牛シンの
サブユニットＡのγ鎖の第１Ｏ〜２４番の配列に対応し
、且つ、ニジエリしア・コリの熱不安定性ト牛シ：ＪＬ
ＴのサブユニットＡのγ鎖と共通の１１のアミノ酸のう
ちの５つのアミノ酸を有する次の式（１） ％式％ で表わされることを特徴とする合成ペンタデカペプチド
を提供する。

チョウ（ＣＨＯＵ’）　及びファスマッ（ＦＡＳＭＡＮ
　）によりなされたＣＴのサブユニットＡのγ鎖のニ次
構造の研究（ＡＤＶＡＮＣＥＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬ
□４７．１９７Ｂ、戸４５）によれば、らせん構造を有
する２つの領域、即ち第５位と第１２位との間に位置す
る第１の領域及び第１５位と第２４位との間に位置する
第２の領域が存在する。これら２つの領域は親水性であ
シ〔ホップ（１ｔｏｐｐ）とウッズ（Ｆｆ’００ＤＳ）
の方法（プロシーディンクズ・才づ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・才プ・サイエンス・オプ・ザ・１−・ニス
・ニー、７８．＋９８１゜戸３８２４）による。）、Ｌ
Ｔと共通のアミノ酸を有する配列の一部を表わす。

本発明は、コレラド士シンのサブユニットＡのγ鎖及び
ニジエリしア・コリのＬＴト＋シシのγ鎖に共通の１１
のアミノ酸のうちの少なくとも５個のアミノ酸を含有す
る上記ペプチドの製造法をも提供する。この製造法によ
れば、該ペプチドは、そのＣ−末端から出発し、構成ア
ミノ酸を順次結合させて段階的にペプチド鎖を構築する
ことにより合成される。

本発明製造法の好ましい実施態様によれは、前記式（１
）のペンタデカペプチドは、Ｃ−末端即ちバリンから出
発し、該ペプチドを構成するアミノ酸を順次結合させて
段階的にぺづチド鎖を構築することによシ合成される。

本発明の製造法は、好ましくは、適当なカッブリ：・グ
剤の存在下、同相中で行なわれる。

ｔた、本発明製造法の好ましい実施態様においては、上
記固相での合成を、好ましくはり０ロメチル化樹脂又は
フェノール樹脂等の樹脂から構成された固体支持体を用
いて行なう。

本発明ｗ造法の他の好ましい実施態様によれば、目的と
するペプチド鎖を得るべく順次結合されたアミノ酸のα
−アミン官能基は、ｔ−ブト士ジカルボニル基（Ｂｅｔ
　）により一時的に保護される。

本発明製造法の更に他の好ましい実施態様によれば、目
的とするペプチド鎖を得るべく順次結合されたアミノ酸
の側鎖官能基は、合成終了までベンジル基によシ保設さ
れる。

上記実施態様においては、好ましくは、アスパラ千ン酸
及びジルタミ：Ｊ酸のカルボ＋シル基がべ、７ジルエス
テル基によ沙保護される。

上記実施態様においては、好ましくは、ｔリンの水酸基
かへ：Ｊジルエーテル基によシ保論される。

上記実施態様の他の好ましい態様においては。

リジシのε−アミンが力′シボベンジル１士シ基（ＣＢ
Ｚ）によシ保護される。

本発明製造法の好ましい実施態様によれば、ぺづチド鎮
の段階的構築に用いられるカッブリジグ剤がジシクＯへ
＋ジルカルボシイ三Ｆと１−しド０士シベンソトリアジ
ールとの等℃ル混合物を、本発明製造法の他の好ましい
実施態様によれば、順次結合されるアミノ酸のα−アミ
ン官能基の保護基Ｂａｔは、酸加水分解により脱離され
る。

本発明製造法の更に他の好ましい実ＩＭ態様によれば、
目的のぺづチド鎖を形成すべく順次結合されるアミノ酸
の側鎖官能基の保護基は、例えば液状フッ酸等の強酸の
作用により、合成終了後に脱離され、同時にＣ−末端官
能基が遊離される。

本発明製造法の他の好ましい実施態様によれば、保護基
を脱離して得られる遊離のペプチドは、分子ふるいの少
なくとも１つのカラムを通過させ、次いで高性能液体り
Ｏマドタラフィーによシ精製される。

本発明は、更に、前記式（１）の合成ペンタデカペプチ
ドを含有することを特徴とする非経口的、皮下、皮肉又
は経口的に投与され得る血清及びワクチンから選ばれた
コレラ及び／又は感染性胃腸炎に対する保護剤乃至予防
剤を提供するものである。

本発明保護剤乃至予防剤は、好ましくは、前記式（１）
の合成ペンタデカペプチドを、コレラド士シンのサブユ
ニットＢ及び／又はニジエリしア・］コリト牛シンのサ
ブユニットＢと共に含有する。

本発明は、更に、有効成分とＬ７て本発明のペプチド、
好ましくは前記式（１）のぺ′シタデカペプチドを含有
することを特徴とするアデニルシクラーゼ−環状ＡＭＰ
系の活性化に関連する疾病の治療用新規薬剤を提供する
。

更に、本発明によれば、前記合成ペプチドは、コレラ及
び／又は胃腸炎の診断剤として使用できる。

好ましくは、前記合成ぺづチドを含有する診断剤は、血
清によシ構成される。

本発明では、前記本発明の合成ペプチドから得られた血
清が、毒素原性のニジエリしア・コリ（感染性胃腸炎を
惹起）の診断剤として使用される。

更に本発明では、感染性胃腸炎を惹起する微生物の診断
剤として有用な血清は、本発明の合成べづラドで処置さ
れたうさぎ（ｒａｂｂｉｔ　）　から得られる血清から
構成される。

本発明により得られる血清は、胃腸炎を惹起する微生物
の存否を判定する試験のための診断剤として使用できる
・該試験においては、該診断剤を生物学的媒質（ゲ０−
ス、汚染されていると考えられる患者からの便、尿又は
血液又は汚染された水）と、適当な時間、通常１６〜２
４時間、好ましくは１８時間接触させ、その後抗原−抗
体沈降線が出現すると該微生物が存在することが判る。

この診断試験は、感度の高いものである。なぜなら、患
者中に少量保持される病原性微生物を微量含有するだけ
の生物学的媒質から、該微生物を検出することができる
からである。加えて、該試験は短時間で行なうことがで
きる。なぜなら、病原性微生物の存在を示す抗原−抗体
沈降線を生じさせるには平均で１８時間程度おればよい
からである。これに対し、従来は、毒−Ｘ原性ニジエリ
し度の時間を要し、しかも本発明の診断試験に比し、非
常に高価である。

本発明の診断試験を行なうために、適量の本発明ぺづラ
ドと、参照標準として適量の本発明の抗−ぺづラド抗体
とを備えており、該参照標準は好ましくは前記第１０〜
２４番のペプチドに対する抗体の適量から構成されてい
る使用容易な診断士ットが本発明によシ提供される。

本発明の式（１）のへ：／タデカｆＪＸプチドの合成を
以下に詳述するが、これは例示であって本発明をこれに
限定するものではない。

好ましい実施態様の説明 用いた合成法は、アール・じ−・メリフィールド（Ｒ，
Ｂ＋ＭＥＲＲＩＦ　ＩＥＬＤ　）　（Ｊ　＋ｌ１ｍｅｒ
、　Ｃ’ｈｅｍ　。

ＳＲ（、，８５，＋９６３．／＞２１４９）の方法に由
来するペプチド固相合成法である。

ぺづチＦ鎖の構築は、Ｃ−末端（本実施例の場合バリン
）から始め、逐次法に従い順次アミノ酸を固定すること
によシ行なった。

出発物質は、１．５ｇのり００メチル化樹脂（Ｉｆ当シ
の容量が１．３４三リイクイバレントの「バイオじ一ズ
５−Ｘ［Ｊ（バイオ−ラド（Ｂ　Ｉ　Ｏ−ＲＡＤ）社製
）、粒度２００〜４００メツシユ〕であシ、該樹脂上に
バリンをＢｏｃ−バリンの形で固定して、０．４６　ｍ
Ｍ／９のバリン−置換樹脂１．８５Ｆ。

即ち！、８５ｆ当り０．６９　ｍＭ　（ＧＩＳＩＮ　−
ＩＦ　ス）　）の該置換樹脂を得た。引き続くアミノ酸
のカップリンク反応は、過剰量、好ましくは置換に関し
て２倍量、即ち、 Ｂ”−７Ｅ）（ａ；１．４ｍＭ カップリング剤： しドロ士シベンリトリアソール：ｌ、４ｍＭジシク０へ
＋ジルカルボシイ三ド：ｌ、４ｍＡｆを用いて、メチリ
ンク０ライド及び／又はジメチルホルムアミド溶媒中で
行なった。

アミノ酸のα−ア三）官能基は、該アミノ酸を固定する
ときに、Ｂｅｔ　基で一時的に保勲する。

一方、側鎖官能基は、酸官能基の場合ベンジルエステル
基として、アルコール官能基の場合ベンジルエーテル基
として、及びリジンのεアミンはカルボベンジルオ十シ
基によシ各々保副した。

カップリング及び脱保護は、ニジじドリンテスト（ＫＡ
ＩＳＥＲテスト）にて確認した。

Ｂｅｔ　ｇは、ジクｏｏメタシ中３０％トリフルオ０酢
酸を用いたアシドリシスで脱陛した。他の基（Ｃ末端官
能基を含む）は、合成の終υに液体フッ化水素酸の作用
によシ遊離させた。

遊離ペプチドは、下記分子篩カラムを順次通過させるこ
とにより精製した。

［ウルト０ゲＨ，（ＵＬＴＲＯＧＥＬ）　Ａ　ＣΔ　２
０１」（Ｌ、に、Ｂ１社製）。０．１Ｍ酢酸で溶出。

［バイオゲル（ＥＩＯＧＥＬ）Ｐ４」（バイオラド社製
）。又′Ｍ酢酸で溶出。

「バイオゲルＰ４」（バイオラド社製）。０．ＩＭｅ酸
で溶出。

種々の分画のアミノ酸の分析は、分離されるべき所望の
ペプチドが得られていることを示した。

最終的には、下記条件の逆相カラムを用いた高性能液体
りＯマドシラフィー（ｌｆＰＬｃ）により精製された。

［すｔ）０９　ルーｊ　（ＬＩＣＨＲＯ５ＯＲＢ）Ｊ　
ＲＢ　Ｉ　８　カラム（メルク社製）（５μｍ）２５０
絹×４浦。

溶出液Ａニアｔトニトリル；溶出液Ｂ　：　Ｋ１１２Ｐ
Ｏ４゜５ＸＩＯＡｆ（戸／／−６．Ｏｉ流速’　１．５
　ｍｌ　／　ｍ１ｎ）。

３０分でＡを２０から８０％への直線的タラチイエント
。フルスケールが０．０２の光学密度ユニットを用いて
２２０　ｎｆｎでＵＶ検出した。生成物（ＴＲ７７，１
８分）の純度は、溶媒（Ｔ　Ｒ＜　２．５０分）による
ピークの表面を差し引いて、９４％であった。

完全なコレラド士シンの生物学的活性は、極めて多様で
ある。それは、メディエータ−環状ＡＭＰとして有する
酵素活性でまとめられる。本発明の合成ぺづラドの抗原
性を以下の方法により調べだ。

本発明合成ぺづラドで、ウサ千を免疫した。これはオー
ディン（ＯＵＤＩＮ）の方法（合成ト十シン１０マイク
ｏＪラム（以下ｒ−ＣｑＪと表記する）十フ０イシドア
ジユバシトを第１回目皮肉注入し、その後はアジュバン
トなしで１日毎に筋肉内注入し、次いで皮下及び静脈内
注入する）によった。

血清を１５日後に集めた。

ゲ０−ス上の二重拡散：血清をオーチテ〇ニー（０ＵＣ
ＨＴＥＲＬＯＮＹ　）法に従い、ゲ０−７．上で二重拡
散によυ試験した。

生物学的試験は、フジタ及びフィンケルシュタ・インの
方法に従いＣ３Ｈマウスの十二指腸ループ（１ｏｏｐ　
）　上で、合成配列のＩＯｍｔｖ及び比較のため精製コ
レラド士シンＩ　Ｏｍｔｙを用いて行なった。

結　果 インじト０：インピトロで得られた結果は、添付図面第
１図に示されている。これは、ゲ〇−ス内二重拡散のオ
ーチテ〇ニー図 （ＯＵＣＨＴＥＲＬＯＮＹ　ｄｉａｇｒａｍ　）　テあ
る。コノ図から、γ−鎖の第１０〜２４番の配列を再現
した本発明によるペシタデカペづラドで感作したつり千
血清の抗体とト牛シンの沈降線が認められる。この図に
よれば、Ｉ、７．５のウェルに含まれている抗］レラト
士シシ血清は、２のウェルに含まれている合成フラグメ
ントを、分子量が低過ぎる故、認識しない（ウェル１対
２及び５対２を参照）が、しかし、３．４のウェルに含
まれている完全なト士シシを認識する（ウェルｌ対３及
び５対４を参照）。６．７のウェルに含まれている合成
フラグメントに対抗して得られた血清は、合成フラグメ
ントに対して何等の沈降線も与えない（７対２を参照）
、一方血清の１つ（７）は、完全なト十シン（３）中の
アミノ厳配列全認識する（７対３を３照）。免疫する前
の血清１．５．６及び７を同じ配；ａにし７′ごときの
ゲ０−スニ重拡散プレートは、完全にネカテイプであっ
た。

１′ンじポ：サプユニットＡのフラグメントを再現した
本発明合成ペプチドの活性を、Ｃ３１１マウスの腸ルー
プで調べた。比較の結果（コシ上０−ルの動物について
の腸ｌα当りの重さは、６０−６５Ｍ９ｆ６つだ）は、
１ｔｊＡｌｒｔｎ当りのｔｙで示され、１実験について
３匹のマウスの平均値で示される。

ａ）１８時間後のｌｉｋ＋Ｊルーづ（・こ」レラト士シ
ン（シグマ社製、バッチ１２２Ｆ０２３９）の１０−ζ
２を導入後　：１２６．７ｑ ｈ）サブユニットＢ（シグマ社製、バッチ１２Ｆ０５０
３　）のＩ　Ｏｔｎｃｑを導入後　：６７ダＣ）サブユ
ニットＡ（シグマ社製、バッチ１２２ＦＯ２４０）のＩ
　Ｏｍｅｙを導入後　＝６２ｑｄ）サブユニットＢ（同
上）のｌ　Ｑ　ｐｙｔｃｑ　、次いでｌＯ分後サすユニ
ットＡ（同上）の１００　ｍＣりを導入後　：１１６．
６ｗ１ ｌ）　”ｉプユニットＢ（同上）の１００　ｍｃｙ　、
次いで１０分後コレラド士シシ（同上）のＩ　ＯｒｎＣ
りを導入後：Ｉ２６．７■ ｆ）サブユニットＡの合成フラグメント１００ｍｔ（ｔ
を導入後　：６１〜 ｆ）サブユニットＢ（同上）のｌ　Ｑ　ｍｃｙ　、次い
で１０分後サすユニットＡの合成フラグメント１００ｔ
ｎＣｖを導入後　：６３．２ｇ９ｈ）サブユニットＢ　
１００　ｍｃｙ＋サブユニットＡの合成フラグメントＩ
　００　ｍｅｔ　、次いでＩＯ分後コレラド士シン（同
上）のＩ　Ｏｍｃｔｙを導入後６７１１ これらの結果は、本発明の合成ペンタデカペプチドが、
完全な］レラト士シシ中の合成物に相当するアミノ酸配
列を認識できる抗体をウサ甲に起こさせたことを示して
いる。

サブユニットＢと共に、本発明のベンタデカベづチドは
、市販の］レラト＋シンの作用による組織からの水の流
出を阻害する。

本発明のペンタデカペプチドは、ト士シンについて「お
とり」の役を演じる。

コレラド士シシのサブユニットＡとニジエリしア・コリ
の不対熱性ト士シンとの間の類似性の重要な程度を考慮
すれば、上記おとりの役割りは、また青紫原性ニジエリ
しア・コリについても存在し、之等の二種の疾病の処置
のための医学的アブ０−チ及び同時に診断薬としてのア
づＤ−チを企図することが可能となる。

本発明ペプチドは、薬理的に許容される形態、例えば溶
液、粉末等又は患者に対する徐放性及び持続性を許容す
るために、適当な支持体に吸着させるか非共有結合的に
カップルさせて使用することができる。

本発明の合成ペンタデカペプチドが、コレラ又は感染性
胃腸炎又はこれらの双方に対して有効な防護薬になυ得
るという事実の他に、生理学上の観点から重要な関心が
存在する。即ち、環状ＡＭＰのアクチベーターは、実際
、数が少ないが、環状ＡＭＰの形成の刺激と関連する生
物学的活性の作用機構の解明を可能にし、またアデニル
サイクラーゼ−環状ＡＭＰ系の活性化と関連し、及びホ
ル七ンや他の生物学的メディエータ−の活性成分とカッ
プリンク又は関係している可能性のある障害に、本発明
のべづチドの注入により得られた血清が、腸に侵入した
ニジエリしア・コリへに関する毒素原性ニジエリしア・
コリと非毒素原性で病原性のニジエリしア・］りとをう
まく区別する診断の実現を可能にする。以下の記載の第
１の部分は、本発明の診断テストに使用するのに適した
血清の製造法でちり、第２の部分は、種々の生物学的媒
質についての該血清を用いた診断テストの方法である。

前記により調製した合成ペンタデカペプチドを出発原料
とする。この合成ト士シシ結晶を、まず緩衝化させた生
理水に溶解させて１ツ／ゴの濃度とした。

かくして製造された溶液を、を柱の両側２０ａｘの部分
の毛をそつた体重１．８〜２　ｋｑのシＯウサ千に、以
下の通り注射した。

第１回の注射：合成ト士シン（１ダ／＊？）１１１＋／
及び完全フロイシド　アジュバント１耐を３７°Ｃで混
合した。を柱の両側の皮肉ｌＯ力所に０．１コずつ注射
した。

第２回の注射：５日後、合成１−＋シンｌ　ｎｌを深部
筋肉内経路で注射した。

第３回の注射１５日後、合成ト十シンＩ　ｍｅを皮下注
射した。

第４回の注射：５日後、合成ト＋シンＩ　ｙｓｌを静脈
内注射した。

第４回の注射１５日後、つり千を屠殺した。血清を集め
、力価を測定し、アンプルに小分けした。

於断試験 以下の様に行なった： 一グＯ−ス上で１８時間分離したＥ、コリの菌株につい
て調べた。

−並びに糞便及びＥ、コリが存在する汚染水について調
べた。

１１０ｓＪ！のミュラー−シントン（Ｍｕｌｌｅｒ　−
Ｈｌｎｔｏｎ　）　培地を入れたベトリ皿（直径５鋼）
の中心に、約１ａ＋＋の培養物（「パステイレ（戸ｔｘ
ｓｌｉｌｌｔ　）　Ｊ　で）を形成させる。

２３０°Ｃのイシ士ユベーター中に１８時間放訝する。

３　菌株の最初の培養物の８Ｍをくり抜いて、８耶のウ
ェルの底をゲ０−スを１滴滴下し７て満たす。

４　ウェルに、合成ト十シンの抗血清を入れる。

５　マウスの腸ループを取り出し、引き続く分離のため
、分離菌株の最初の培養物の小片を該腸ループ上にｔｒ
ｊ　＜。

６　パステイレ（−菌株のＪ７５養・ノーン）上に２滴
のトルエンを置いて培養物を溶解させる。

７１８時間実験室の温度で接触させておく。

バステイレから１順のところに抗原−抗体沈降線が出現
することにより、Ｅ、コリのＬＴト士シンの存在が判る
。

８　次いで、グロースプレートを生理水で３ｔ−い、ｐ
紙ディスクの間で乾燥し、アミドシュワルッ（Ａｔｎｉ
ｄｏｓｔｈｗａｒｚ）で染色する。

Ｂ）水について ■　試験すべき水ｔｒｊ中に、１９８２年１２月９日の
仏国特許出願Ａ８２２０６３２において用いられた様な
抗Ｅ、コリへ抗体の全部でチャージした磁化性ゲルのし
−ズ０．２０　ｍｌを加える。可能ならば攪拌下、３７
°Ｃで１時間接触させておく。

２　じ−ズを、上記仏国特許出願に記載されている様に
、又は１９８３年１０月２７日の仏国特許出願Ａ８３１
７１６６の装置により、磁性棒で取り出す。それらをミ
ュラー−しントン培地を入れたペトリ皿の中心に置く。

操作の続きは、上記Ａ）の２〜８と同じである０ Ｃ）糞便 約Ｉｆの糞便をＩ　ＯＯｍｅの生理水中に乳化し、操作
は上記Ｂ）の記載に従って行なう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の合成ペプチドの抗原性を試験して得
られたゲ０−ス内二重拡散のオーチテ〇ニーダイｔ７グ
ラムを示す。番号１〜７は、各ウェルの番号である。 （以　上） １へｓ’ｒ１．濱ゝ丁Ｔ丁　三　Ｔダ　多回　ニ一図面
の浄書（内容に変更なＬ） 第１頁の続き １０１「 ］　パリ　リュ・ド・う・シース　２６手続補正書（自
制 ６０　２　２２ 昭和５９、年り０月゛１８日 ビー− 特許庁長官　志賀　学　殿＋ＩＱ″ １、事件の表示 昭和５９年特　許　願第１８０２５０　号２・　発ｎＡ
（Ｄ名″″　ユゆ、成ぺづ、ド゛、イエ１ケ３、補正、
、７６者法を含む医ゝ 事件との関係特許出願人 ４、代理人 大阪市東区平野町２の１０ｔＲ〕鶴ヒル電話０６−２０
３−０９４１１自　発 ６、補正により増加する発明の数 １　゛ 別紙添附の通り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　コレラド十シンのサブユニットＡのγ鎖及びニジエ
   リしア−１す（Ｅｓｃｈｔｒｉｃｈｉａ　ｔｏｌｉ　）
   　Ｆ）ＬＴＦ牛シコシン鎖に共通の１１のアミノ酸のう
   ちの少なくとも５個を再現する合成べづチド。 ■　コレラド士シンのサブユニットＡのγ鎖の第１０〜
   ２４番の配列に対応し、且つ、ニジエリしアψ］す（Ｅ
   ｓｅｈｔｒｉｔｈｉａ　ｔｏｌｉ　）　のＬＴ熱熱不安
   定性トルシンすづ１ニツトＡのｒ＠と共通の１１のアミ
   ノ酸のうちの５個のアミノ酸を含有し、次の式 ％式％ で表わされるペンタデカペプチドから構成される特許請
   求の範囲第１項に記載のべづチド。 （リ　特許請求の範囲第１項に記載の合成ペプチＦの該
   ５個以上のア三）碌に対応するスクレオチド配列。 ■　特許請求の範囲第２項に記載のベンタデカベづチド
   １５個のアミノ酸に対応する特許請求の範囲第３項（て
   記載のスクレオチに配列。 ■　コレラド＋シンのサブユニットＡのγ鎖及びニジエ
   リしア＋］す（Ｅｓｔｈｔｒｉｔｈｉａ　ｔｏｌｉ　）
   　のＬ　Ｔト十シンのγ鎖に共通の１１のアミノ酸のう
   ちの少なくとも５個を再現する合成ぺづチドの製造法で
   あって、該ペプチド鎖のＣ−末端から出発し、該ペプチ
   ドの構成アミノ酸を順次結合させて段階的にペプチド鎖
   を構築することを特徴とする製造法。 ■　コレラド士シンのサブユニットＡのγ鎖の第１０〜
   ２４番の配列に対応し、且つ、ニジエリじア−］す（Ｅ
   ｔｃｋｅｒｉｔｈｉａ　ｔｏｌｉ　）　のＬＴ熱不安定
   性ト十シンのサブユニットＡのγ鎖と共通の１１のアミ
   ノ酸のうちの５個のアミノ酸を含有し、次の式 ％式％ で表わされるペンタデ力ペラチドを、該ベンタデカベづ
   チドのＣ−末端、即ちバリシから出発し、該ベンタデカ
   ベづチドの構成アミノ酸を順次結合させて段階的にぺづ
   チド＠を構築することにより合成することを特徴とする
   特許請求の範囲第５項に記載の製造法。 ■　カップリンタ剤の存在下、固相にて反応を行なう特
   許請求の範囲第５項又は第６項に記載の製造法。 ■　固相での反応を、樹脂からなる固体支持体を用いて
   行なう特許請求の範囲第７項に記載の製造法。 ■　ペプチド鎖を構成すべく順次結合されるアミノ酸の
   α−アミノ官能基が、ｔ−ブト士ジカルボニル基（Ｂａ
   ｔ）によシ一時的に保護される特許請求の範囲第５項乃
   至第８項のいずれかに記載の製造法。 ■）　ペプチド鎖を構成すべく順次結合されるアミノ酸
   の側鎖官能基が、合成終了までベニＪ、；ル基により保
   護される特許請求の範囲第５項乃至第９項のいずれかに
   記載の製造法。 ［有］）　アスパラ４−Ｊ酸及びタルタ三ン酸のカルボ
   牛シル基が、ベンジルエステル基により保護される特許
   請求の範囲第１Ｏ項に記載の製造法。 ■）　ｔすｙのしドロ士シル基が、ベンジルエーテル基
   により保護される特許請求の範囲第１０項に記載の製造
   法。 ■）　リジンのε−ア三ジが、カルポベンジルオ牛シ基
   （ＣＢＺ）により保護される特ＦＦ　請求のＶ！囲第１
   ０項に記載の製造法。 ■　べづチド鎮の段階的構築に用いるカップリッタ剤が
   、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン等の溶媒に、ジ
   シクＤへ士ジルカルボシイ三ドと１−しドロ士シベンリ
   トリアジールの等ｔル混合物を溶解させたものである特
   許請求の範囲第７項に記載の製造法。 ０　順次結合されるアミノ酸のα−アミノ官能基のＥａ
   ｔ保護基が、酸加水分解により脱離される特許請求の範
   囲第９項に記載の製造法。 ［相］　ペプチド鎖を形成すべく順次結合されるア三さ
   れる特許請求の範囲第１０項乃至第１３項のいずれかに
   記載の製造法。 Ｏ保護基を脱離して得られる遊離べづチドが分子ふるい
   の少々くとも１つのカラムを通過させ、次いで高性能液
   体り０マドグラフイーにょシ精製される特許請求の範囲
   第５項乃至第１６項のいずれかに記載の製造法。 ［相］　特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の合成
   ぺづチドを含有し、非経口的、皮下的、皮肉的又は経口
   的に投与し得る血清及びワクチンから選ばれた］レラ及
   び／又は感染性胃腸炎に対する保護剤。 ■心　合成ぺづチドと共に、コレラド士シンのサブユニ
   ットＢ及び／又はニジエリじア・］リド士シンのサブユ
   ニットＢを含有する特許請求の範囲第１８項に記載の保
   護剤。 ［相］　特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のペプ
   チドを有効成分として含有し、環状Ａ　、Ｍ　Ｐの活性
   化、より詳しくはアデニルシクラーぜ−４状ＡＭＰ系の
   活性化に関連する疾病の治療に用いられることを特徴と
   する新規薬剤。 ＠　有効成分として、特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載の合成へづチドを含有するコレラ及び感染性胃腸
   炎の治療用薬剤。 ［相］　特許請求の範８第３項又は第４項に記載のヌク
   レオチド配列を含有するコレラ及び／又は感染性胃腸炎
   の診断剤。 ［相］　特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の合成
   ペプチドを含有するコレラ及び／又は感染性胃腸炎の診
   断剤。 ［相］　特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の合成
   ぺづチドから得られた血清から実質的になる特許請求の
   範囲第２３項に記載の診断剤。 ［相］　特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の合成
   ペプチドを法則して処置したうさぎから得られた血清か
   ら実質的になる毒素原性ニジエリしア゛コリの診断剤。 ［相］　毒素原性ニジエリしア・コリで汚染されている
   と考えられる生物学的媒質と、特許請求の範囲第２５項
   に記載の診断剤とを、１６〜２４時間接触させることに
   より、該媒質が汚染されている場合に、抗原−抗体沈降
   線が出現するととを特徴とする毒素原性ニジエリしア・
   つりの診断法。 ・功　特許請求の範囲第２２項乃至第２５項のいずれか
   に記載のコレラ及び／又は感染性胃腸炎の診断剤と、特
   許請求の範囲第１項又は第２項（（記載のペプチドに対
   する抗体とを備えたことを特徴とする病源性微生物検出
   のだめの診断試艶用十ット。