JPS5886094A - 発酵法によるｌ−リジンノ製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なｌ−リジン生産性微生物およびそれら微
生物を用いる発酵法によるＬ−リジンの製造法に関する
。さらに詳しくは、本発明はコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物で二種以上の抗
生物質に耐性を有しかつＬ−リジンを著量蓄積する能力
を有する微生物、あるいはコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物を親株とし、−間
または属内薗株間でプロトプラスト融合せしめて得られ
た融合株でかつＬ−リジンを著量蓄積する能力を有する
微生物、あるいは融合株で二種以上の抗生物質に耐性を
示しかつＬ　＋　１７ジンを着量蓄積する能力を有する
微生物に関し、さらにこれらの微生物を栄養培地に培養
し、培養物中にＬ−リジンを着量蓄積せしめ％鋏培養物
からＬ　−１７ジンを採取することを特徴とする発酵法
によるＬ　−ＩＪレジン製造法に関する。

本発明の目的とするところは、飼料、飼料添加物、食品
添加物、医薬品の原料、その他広い使途を有するＬ−９
ジンの工業的に安価な製造法管提供するにある。

従来、発酵法によるし一リジンの製造法に関しては、コ
リネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アースロ
バフタ−属、シュードモナス属、バチルス属、ノカルデ
ィア属、サツカロマイセス属、エシェリヒア属、クレプ
シエ２属、ストレプトミセス属、アルカリ土類金属、Ｚ
クロバクテリウム属、アクｐモバクター属、セラチアｊ
ｌＫ属する微生物の各種栄養要求性株や、各種薬剤感受
性株、薬剤耐性株を用いる方法、あるいはこれらの組合
せの性質を有する突然変異株を用いる方法などが知られ
ている。

本発明者らは、Ｌ−リジンの生産性の数置された菌株を
得るため種々研究を重ねた結果、コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属するＬ−ＩＪジン生童
株を二種以上の抗生物質に対し抵抗性にすると咳１株の
し一リジン生産能が向上することを見出した。

また、プロトプラストを用いた細胞融合による組換え株
の取得法を利用して、新たにＬ−９ジン高生産株を取得
できることを見出した。この方法はＬ−リジンの高生産
性変異株の育成に際し、効率的に１復変異株の取得を可
能ならしめるものであ抄、親株をうまく選定することに
より、双方の欠点を補ない長所を活かすことが可能とな
る有効な方法である。発酵法によるＬ−リジンの製造に
際し、二種以上の抗生物質抵抗性変異株やプロトプラス
ト融合により取得した菌株を用いれば、Ｌ、−９ジンの
生産性が飛躍的に改善されることは本発明者らによって
はじめて見出され九知見である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の微生物としては、異なる性質を有する親株の組
合せのプロトプラスト融合から生じたし一リジン生産菌
株およびプロトプラスト融合の手法または従来の変異処
理もしくは自然変異によって得た二種以上の抗生物質に
耐性を有するリジン生産菌株があげられる。

本発明の二種以上の抗生物質に耐性を有するＬ−リジン
生産１株としては、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属し、Ｌ−リジン生産能をすでに有す
る菌株に二種以上の抗生物質に対する耐性を付与せしめ
た菌株を用いてもよいし、逆にコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属し、二種以上の抗生物質
に対する耐性を有する菌株に、Ｌ−９ジン生産能を付与
せしめ九菌株を用いてもよい。

九とえば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、Ｌ−リジン生産能を有する菌株としては
、各種の栄養（例えば、ホモセリン、メチオニン、スレ
オニ／、ヒスチジン、プロリン、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、セリン、グルタはン酸、パント
テン酸、ニコチン酸アミド、酢峻、アデニン、ヒポキサ
ンチン、イノシ＋−ルおよびこれらの組合せ）要求性、
各種アミノ酸アナログ（例えばリジン、スレオニン、メ
チオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラ
ギン酸、トリプトファンあるいはヒスチジンのアナログ
およびこれらの組合せ）抵抗性、核酸アナログ抵抗性、
その他の薬剤（例えば、サルファ剤、ベニシリ／系統生
物質、各種有機酸、キノン化合物、キノリン化合物およ
びこれらの組合せ）抵抗性の１つあるいはこれらの組合
せの性質を有するＬ　＋　リジン生産菌株が挙げられる
。かくの如きＬ　＋　リジン生産菌株を変異させて二種
以上の抗生物質に対する耐性を有する１株を得ることも
できる。

又コリネバクテリウムＩＩ！ｔ＆はブレビバクテリウム
属に属し、２種以上の抗生物質に対し耐性を有する菌株
に上記のとと自各種栄養責求性、各種アミノ酸、核酸ア
ナログ抵抗性またはその他薬剤抵抗性を付与することに
よって得られるＬ−９ジン生産菌株も本発明で使用でき
る。

また本発明に用いる菌株は上記の如き性質の他にＬ−、
Ｉ）ジン生産に寄与するいかなる性質を備えていてもさ
しつかえない。本発明に用いる二種以上の抗生物質に対
する耐性としては、たとえば、ペニシリン類、セファロ
スポリ／＠、ジヒドロストレプトマイシン、リファンピ
シン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン類、ス
ピラマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、カナ
マイシン、１イトマイシフＣ，アクチノマイシンＤ％ポ
リミキシ／、コリスチン、リンコマイシン、ゲンタマイ
シン、サカミシン、フォーティミシン、オレアンドマイ
シンなどに対する耐性があげられる。本発明の変異株を
Ｉ導する際に用いられる親株は、従来グルタミン酸生産
菌として知られているコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に鵬する微生物であり、例えばコリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴｃ０１３０３１２、コ
リネバクテリウム・アセトアシドフイラムＡＴＣＣ１３
８’７０　、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ムＡＴＣＣ１３８６９，７’レビバクテリウム・フラバ
ムＡＴＣＣ１４０６７などがある。

本発明に使用する微生物のうち、二種以上の抗生物質に
対する耐性を有する一株の具体例としてコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＨ−３１２７（以下１４−３１２７
という）（微工研菌寄第６２１１号）およびブレビバク
テリウム・ラクトフェルメンタムＨ−３１２５（以下Ｈ
−３１２５という）（黴工研＃ｉ薔第６２０９号）があ
げられる。またプロトプラスト融合によって取得したＬ
−ＩＪリジン生産菌株具体例としてはコリネバクテリウ
ムＨ＝３１２２（以下Ｈ−３１２２という）（倣工研薗
寄第６２０８号）とブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムＨ−３１２８（以下Ｈ−ａｔｚａという）（ｍ
ｌ工研菌寄・４６２１０号）との融合株Ｈ−３０５７株
（以下Ｈ−３０５７という）（徽工研−寄第６２０６号
）およびＨ−３１２２とコリネバクテリウム・グルタミ
クムＨ−３１１９（以下Ｈ−３１１９という）（黴工研
菌寄第６２０７号）との融合株ａ−ａｏｓｓ（以下Ｈ−
３０５５という）（＃１研菌寄第６２０５号）があげら
れる。

本発明のプロトプラスト融合株の取得例を以下に示す。

培養細胞からプロドブ２ストを形成させるためには例え
ば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｖ１酵母エキス５ｔ
を純水１）に含みｐＨ７，２に調整し九培地）に菌を１
捕し、振盪培養する。

比濁計によって６６０　ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を
測定し、対数増殖期の初期（ＯＤ＝０．１〜０．２）に
培養液中０．１−０．８ｐ／ｙｄの濃度になるようにペ
ニシリンＧｔ−添加する。培養を続けて、さらにＯＤが
０．３〜０，５に増加したところで細胞を集菌し、８８
Ｍ培地〔グルコース１０９、ＮＨ，Ｃ１４ｆ、尿素２ｆ
、酵母エキス１　　ｆ、　　ＫＨ２ＰＯａ　　１１％　
Ｋ意ＨＰＯａ　　３　ｆ、　　ＭｙＣ１ｚ６Ｈ，Ｏ（Ｌ
４　　ｔ　、　ＦｅＢＯａ　　拳　’ｌＨ２Ｏ１Ｑｍｙ
　、　ＭｎＳＯ４−４〜６Ｈ，Ｏα２■、Ｚｎ８０ａ　
　７Ｈ１０Ｇ、９＃、ＣｕＳＯ４−５Ｈ１０Ｃ）、４ｍ
＝９、ＮＩＬｚＢｉＯｙ・１０Ｈ１００，０９’Ｗｂ　
　（ＮＨａ）ｓＭｏｙｏｚｍ　・４ＨｔＯＱ、０４１ｇ
ｇ、ビオチン３０μ２、サイアミン塩酸塩ＩＱを純水１
ｊに含み、ｐ　Ｈ７，２にＷＩＩ４整し友培地、アミノ
鐵要求性の菌の培養には、要求アミノ酸５０μｔ　／ｄ
を追加〕で洗浄する。次に菌体をＰＦＭ培地（８８Ｍ２
倍希釈液中にシュクロース０，４Ｍ、　ＭｙＣｌｚ　・
６ＨｇＯ０，０１Ｍを含み、ｐ　Ｈ７，０〜＆５に調整
した培地）に合懸濁する。この細胞ｍ濁液にリゾチーム
（（１２〜２穆／ｄ）を加え、３０〜３７℃で１６時間
処虐する。プロトプラストの形成を光学顧黴鏡で確値す
る。融合させようとする両株の、上記の如くして得たプ
ロトゲラストの数を計測し１：ｌになるように混合し、
遠心分離によりＰＦＭ培地で洗浄後０．１−に肖懸濁す
る。これに４０％ポリエチレングリコール（ＰＥ（））
４０００を含むＰＦＭ培地１５ｍ１を加え静かに攪拌し
、５分後ＣＬ１ｉｄを、例えばジヒドロストレプトマイ
シン耐性株およびリファンピシン耐性株を用いた場合、
ジヒドロストレフトマイシン１００μ？／ｄおよびリフ
ァンピシンへ０５μｆ／ｗＪを含むＲＣＧ庫大事大平板
ルコース５Ｆ、カザミノ酸Ｓｔ、酵母エキＸ　ｌ　５　
ｆ　、　ＫｓＨＰＯａ　２Ｌ５　ｆ、　ＫＨｘＰＯａ　
１．５ｆ、　ＭｙＣｌｚ−６ＨＣｌα４１　ｔ、　Ｆｅ
ＢＯａ　・７Ｈ２０１０４ｂ−Ｍｎ　８０４　・４〜６
　Ｂ　意０２８９ｓ　Ｚ　ｎ　Ｓ　０４　・７　Ｈ２０
０，９す、ＣｕＳＯ４・５Ｈ意０α４ｍｇ、Ｎａ１Ｂ４
０７　１０）ｆ、ＯＯ，０９Ｑ、（ＮＨ４＞１Ｍ０ｔＱ
ｉ４・４Ｈ，ＯＯ，０４ｍｖ、ビオチン３０μｔ１サイ
アミン塩酸塩２峙、コハク酸ナトリウム１３５　Ｆ、寒
天１４Ｆを純水１ｊ中に含み、ｐＨ７，４に調整し死培
地〕に゛塗布する。３０℃１２日間培養後に生じてきた
ストレプトマイシンおよびリファ／ビシンニ重耐性株の
コロニーを取得で睡る。

本発明に使用する培地組成としては使用菌株の利用しう
る炭素源、無機物その他の必要な栄養素を程良く含有す
るものであれば合成培地、天然培地のいずれも使用でき
る。

すなわち炭素源としてはグルコース、フラクトース、ソ
ルビトール、グリセロール、庶糖、でん粉、でん粉加水
分解物、糖蜜、果汁などの各種炭水化物、酢酸、７マー
ル酸、乳酸などの有機酸、さらにエタノール、メタノー
ルなどのアルコール類も使用できる。

ｆｆ１Ｘ源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、す／酸アンモニ
ウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、尿素
、アミン類、その他含窒累化合物、ならびにベグトン、
肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カ
ゼイン加水分解物、大豆粕酸加水分解物、各種発酵一体
およびその消化物などが使用できる。

さＩらに無機物としては、リン酸第・−カリウム、す／
酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、像酸
銅、炭酸カルシウムなどを使用する。勿論本発明に使用
する倣生吻が生育のために特定の栄養素を必要とする場
合には、その栄養素を適尚量培地中に存在させなければ
ならないが、これらの物質は窒素源として例示−した天
然物に含まれて添加される場合がある。

また培地中に各種の添加物、例えば各種抗生物實、α−
アミノ酪酸、システィン、ロイシン、ロイシン発酵液あ
るいはアスパラギン酸、グルタミン酸などを添加するこ
とによＩＬ−リジン生麺量を増加させうる場合がある。

培養は振盪培養あるいは深部通気攪拌培養な保持するこ
とが望ましいが、これ以外の条件下でも使用−株が生育
すれば実施できる。培地のｐＨ１１節は、炭酸カルシウ
ム、酸、あるいはアルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ１ｌ
ｋＨ剤などによって行なう。培養期間は通常１〜６日間
で培養液中にｌ、−９ジンが生成蓄積する。

培養終了後、培養液から１体などの沈殿物を除去し、公
知のイオン交換処理法、濃縮法、鉄層法、塩析法などを
併用することにより、培養液からＬ−リジンを回収する
ことができる。

以下実施例をあげて本発明を具体的に示す。

実施例１．　　（Ｈ−３１２７およびＨ−３１２５の取
得）リジン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＦｇＲＭ−ｐ３ａｇ＋（ホモセリン要求性、ロイ
７ン賛求性、チアリジン抵抗性、サルファメサジン抵抗
性）をブイヨン培地で一夜培養したものを直接２００ｒ
／ｄのジヒドロストレプトマイシンを含むブイヨン寒天
平板培地に塗床する。２〜１０日間３０℃で保温して生
育するコロニーの中から選択された自然変異株の細胞を
０．　Ｉ　Ｎ　）リス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）中に１０　”　ｃａｌｌｓ／ニー　の一度に懸濁し、
ここにＮ−メチル−Ｎ１−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを最終濃度α２！ｙ／ｄになるように添加して、室
温で３０分間靜装置た後ペニシリンＧ　１　ｕｎｉｔ／
ｄを含むブイヨン寒天平板培地に塗床する。生育するコ
ロニーの中から選択された変異株からＨ−３１２７を得
る。

この１株はジヒドロストレプトマイシンとペニシリンＧ
に耐性を有する点で表−１に示すように明らかに親株の
ＦＥＲＭ−Ｐ−３６３４と区別で龜る。′＊九リすン生
生産を有するブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ムＨ−３０５６（チアリジン抵抗性、ロイシン要求性、
ホモセリ／リーキー、以下Ｈ−３０５６という）から同
様の処理によって得九ジヒドロストレブトマイシ／耐性
株にさらに上記と同様の変異処理を行ないりファンビシ
ン５０μｆｏｗｌを含むブイヨン鎌大平板培地で生育す
るコロニーの中から選択され九変異株としてＨ−３１２
５を得る。この菌株は衆−１に示すようにジヒドロスト
レプトマイシンおよびリファンピシンに対する耐性を有
する点で明らかに親株と区別できる。

嵌　−１ ５ ぺ＝、シリ／Ｇ　α５　ｕｚｈ４’　　　　　　　　　
＋）　　　　　−一１、Ｏ＃　　　　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　−−ジヒドロストレグ　１００
ｐｆ／ｆＬｌ　　　−廿　　　　　−廿”トフイシ’２
００１　　　　　　　　　　　　　　　廿　　　　　　
　−什リフアンビシ；／２５１　　　　−　　　　　−
　　　　　−　　　　廿５０＃　　　　　−−−什 無　　添　　加　　　　　　　　　　廿　　　　　廿　
　　　　＋　　　　廿（＋：充分な生育、＋：或程度の
生育、−二生育せず）実施例２ コリネバクテリウム・グルタミクムＦｇＲＭ−Ｐ　３６
３４（以下ＦＥＲＭ−Ｐ３６３４という）から鋳導した
Ｌ−リジン生産菌Ｈ−３１２２（ホモセリ／リーキー、
ロイシン要求性、チアリジン抵抗性、サルファメサジン
抵抗性、リファ／ビシ／抵抗性）とＬ−ロイシン生産１
であるブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＦＥ
ＲＭ−Ｐ１８３７から鋳導したＨ−ｓｌｚｓ　（チアリ
ジン抵抗性、ストレプトマイシ／抵抗性）を用いて、そ
れぞれプロトプラストを調整し、前述の如くにプロトプ
ラスト融合を行ない、リファンピシンおよびストレプト
マイシンの二重耐性を有する融合株を多数取得した。な
２それぞれの親株についてリファンピシンおよびストレ
プトマイシンに対する自然二重耐性株の出現率はそれぞ
れ１．３ｘｌＯ，６，５ｘｌＯ−’であルプロトプラス
ト融合による二重耐性株の出現頻度は１．１×１０−’
であ鼠−ので、プロトプラスト融合によれば自然変異よ
りも１０倍以上耐性穫４率が高いことからも、融合によ
って二重耐性を獲得しているものが大部分占めているこ
とがわかる。それぞれについてＬ−９ジン生童性および
１株の特性音検討した。

その代表例として選んだ菌株Ｈ−３０５７について諸性
質を両方の親株と比較し九結果を表−２に示し丸、この
表から明らかなようにＨ−３０５７はサルファメサジン
感受性、ストレプトマイシン抵゛抗性についてはＨ−３
１２６の性質ｔ−，Ｅ−イシン要求性、ｚ−チェニルア
ラニン感受性、リファンピシン抵抗性、ＮＯＩ還元能、
Ｌ−リジン生産性についてはＨ−３１２２の性質を受継
いでシ）、このような株が自然変異で一回の処理で取得
することは考えられないことであり、典製的な融合株で
ある。

１−２ Ｒ：抵抗性　　Ｓ：感受性 ８−Ｌｙｅ：５−（２−アミノメチル）−システィン２
ＴＡ：２−チェニルアラニン Ｌｅｕ　：ロイシン ＳＴＭ　：ストレプトマイシン ＲＩＦ　：リファンピシン 実施例＆ Ｈ−３１２２とコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴ
ＣＣ２１５４３から誘導し九Ｈ−３１１９（ホモセリン
リーキー、ロイシン非要求性、チアリジン抵抗性、２−
チェニルアラニン抵抗性、α−アミノ−β−ヒドロキシ
酪酸抵抗性、ストレフ’）マイシン抵抗性）について、
それぞれプロトグラストを調整し、前述の方法でプロト
ゲラスト融合を行ない、ストレプトマイシンおよびリフ
ァンピシンの二重抵抗性株を獲得した株について］＝−
リジン生産性および諸性質について検討した。なおＨ−
３１２２およびＨ−３１１９から自然変異でそれぞれが
ストレプトマイシン、す７アン′ビシ／に対する抵抗性
を獲得する頻度は各１．０Ｘ１Ｇ　　、２ｈＯＸＩＯで
あるが、本操作によって二重抵抗性を獲得する照度は４
×１Ｏ−７で自然変異による頻度より約２０〜４０倍高
い頻度を示し、融合が高頻度で起っていることが確認さ
れ友。Ｌ−リジン生産能の顕著に向上した株として例え
ばＨ−３０５５が挙げられる。本株について両親株との
諸性質について比較した結果を表−３に示す。

）ｆ−３０５５株のロイシン非要求性、サルファメサジ
ン抵抗性、およびストレプトマイシン抵抗性については
Ｈ−３１１９の性質を２−チェニルアラニン感受性、リ
ファンピシン抵抗性はＨ−３１２２の性質を有してお如
、生育およびＬ　−１７ジン生童能に関しては、いずれ
の親株以上に向上している仁とがわかる。

？ Ｒ：抵抗性　　Ｓ：感受性 秦　対糖収率（至適条件下）（Ｈ−３１２２はＬ−Ｌｅ
ｕ１５ｆ／ｊ添加） 実施例４゜ ａｉ＋＊としてＨ−３１２２とＨ−３１２６との融合株
Ｈ−３０５７を使用した。

この菌株をグルコース４０１７１％尿素３ｆ／ｌ、ＫＨ
ｌＰＯａ　　１．５ｆ／１．　ＫｌＨＰＯａ　Ｑ、５ｆ
／ｌ。

ＭｙＳＯａ７ＨｘＯａ５ｆ／ｊ、ビオチン　５Ｏｐｆ／
Ｉ、ペプトン２０１／１．酵母エキス５ｆ／１からなる
樵培地（ｐＨ７，２）２０ｗｊを含む３００．ｗｊ容三
角フラスコに接種し、３０℃で２４時間培養した。この
培養液２１を廃糖蜜１００　ｆ／ｌ　（グルコース換算
）、大豆粕酸加水分解物２０　ｆ／１（大豆和電量換算
）、硫安５ｆ／Ｉ、工・−ロイシンｌｙ／ｌ、尿Ｊｇ　
３　ｆ　／　ｌ　、　ＭｙＳＯａ　＃７Ｈｚ　Ｏｏ、５
ｙ７ｉ、Ｋ　Ｈｌ　Ｐ　Ｏａ　　α７１／ｌ、ＣａＣ０
）　　３゜ｖ／ｌからなる発酵培地（ｐＨ７，２）２０
ｍを含む３００ｄ容三角フラスコに接種し、３０℃で３
日間振盪培養（２２０ｒｐｍ）を行なった。

この時、培養液中にＬ−リジン（１塩酸塩として、以下
同様）が３Ｓ１．５ｆ／ｊ生成蓄積した。

対照として同一の条件で同時に培養し九親株ＦＢ：ｉ（
Ｍ−Ｐ　３　ｇ　３４が３６１１／１．　Ｈ−３１２６
がｏ、ｓｔ／Ｉであつ九。

培養終了後、本発明菌株の培養液１１を遠心分離して得
九↓清液をダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ＋型、強酸性イ
オン交換樹脂の商品名、三菱化成社製）のカラムに通塔
してＬ−リジンを吸着させ、カラムを水洗後、希アンモ
ニア水工溶出してＬ−リジンを含む画分を集めて濃縮し
た。

−縮液のｐＨを塩駿でｐＨ２に＠整し友後、エタノール
を添加しながら冷却することにより、Ｌ−リジンを晶出
させ、Ｌ−リジン塩酸塩の結晶３１ｆを得た。

実施ガミ ｓＭとしてＨ−３１２２とＨ−３１１９とのプロトプラ
スト融合株Ｈ−３０５５を使用した。

本１株を実施例４と同様の種培地に接種し、３０℃で２
４時間培養した。この培養液２１１ＩＩを廃糖蜜１００
ｆ／７（グルコース換算）、硫安４０　ｔ　／　ｊ％Ｋ
Ｈ１ＰＯ４α５　ｆ、　ＭｙＳＯｎ　　ｏ、、５　ｆ。

ＣａＣＯ５３０１／ｌ　　かちなる発酵培地（ｐＨ７，
２）２０ｍ１１に含む３００ｄ容三角フラスコに線種し
３２℃で３日間振盪培養（２２０ｒｐｍ）を行なった。

このとき培養液中にＬ−リジン・塩酸塩が４１　ｆ／ｌ
蓄積した。対照として、同一の条件で同時に培養した親
株のＨ−３１２２およびＨ−３１１９はそれぞれ１５　
ｆｉｌ、２４　ｆｉｌであった。Ｈ−３１２２のＬ−リ
ジン生産性が著しく低いのは、本１がＬ−ロイシン要求
性であるが本培養条件ではＬ−ロイン／が添加されてい
ないためである。

実施例＆ 種菌として）（−３１２７＆よび１（−３１２５を使用
した。本−株を実施例４と同様の櫨培地に接種し、３０
℃で２４時間培養した。この培養液２ｔｄを実施例３と
同様の発酵培地に接種した。３０℃で３゛日間振盪培養
（２２０ｒｐｍ）を行なつ九。このとき培養液中に蓄積
したＬ−ＩＪレジン酸塩の濃度を！Ｓ！−４に示す。ま
た対照として同一条件で同時に培養したそれぞれの蟻株
のＦｌ（ＲＭ−Ｐ　３６３４および１（−３０５６の結
果も併せて示す。

表　−４ ＦＥ：ＲＭ−Ｐ３６３４　　　　　３６Ｈ−３１２７３
９ Ｈ−３０５６３１ ｆ（−３１２５３６ 実施例７゜ Ｈ−３０５５、Ｈ−３１２７、Ｈ−３１２５およびＨ−
３０５７を種菌として使用した。各−株を実施例４と同
様の種培地に接種し、３０℃２４時間ｔ＠養した。各培
養液２−をグルコースｉｏ。

ｔｔ　／　Ｉ　、塩化アンモニウム２０　ｆｉｌ、コー
ンステイーグリカー２９ｆ／ｌ、ビオチン２００μｆ／
ｌ、　ＫＨＩＰＯ４１ｆ／Ｉ％ＭｙＢＯａ・７Ｈ３００
，５ｆ／ｊ、サイアミン塩酸塩０．２　Ｑ　／ｙｄ。

Ｆｅ５ｏ４　＃　７Ｈｓ　ＯＩ　Ｇ１１ｌ／ｊ、　Ｍｎ
ＳＯ４＋　４Ｈ＊　Ｏ１０、ｇｙ　／　ｌ　、尿：ｇ　
３　ｆ　／　Ｉ　、　ＣａＣＯ５２０ｆ／　ｌ　　から
なる発酵培地（ｐＨ７１）２０ｍを含む３００ｄ容三角
フラスコに接種し、３０℃で３日間振盪培養を行なった
。同時に同条件で行なつ丸缶菌株の親株ＩＲＭ”Ｐ３６
３４、Ｈ−３１２２、Ｈ−３１２６およびＨ−３１１９
の結果と併せて表−５に示す。但しＬ−ロイシン要求株
、についてはＬ−ロイノンを０．５ｆ／ｌを添加する。

表−５ ）（−３１２５３ａ５ Ｈ−３１２７４０，０ Ｈ−３０５５４１，０ Ｈ−３０５７３９，０ ＦｇＲＭ−Ｐ３６３４　　　　　　　　３６．５Ｈ−３
１２２３７ Ｈ−３１１９２９ 夾施例８゜ 櫨繭としてＨ−３０５５′ｆｔ使用した。この菌株を実
施例４で使用した種培地３０ｍを含む３００ＩＬｌ三角
フラスコに接種し、３０℃で２４時間振盪培養を行なっ
た。この種培養液１００虹ヲクルコースｓ　ｏ　ｙ／ｌ
、　酢１１／、アンモニウム３　？　／　ｌ　、　ＫＨ
１ＰＯ４１ｆ／　１．　ＭｙＳＯａ　・７ＨｚＯＯ，５
ｆ／ｌ　、　ＦｅＳＯ４４Ｈ１０１０ｔｒｙ／１％Ｍｎ
Ｅ３０ａ１ｏｍｇ／ノ、ビオチン　２００μｆ／ｌ、サ
イアミン塩酸塩２００μｖ／ｌ、大豆粕酸加水分解物２
１／ｌ（大豆粕重量換算）からなる発酵培地（ｐＨ７，
２）ａ８ｊを含む２ｊ容ジャーファーメンタ−に接種し
、通気量１１／分、攪拌速度８００ｒｐｍ、３５℃で、
発酵液のｐＨを酢酸と酢酸アンモニウムとの混合液〔酢
酸：酢酸アンモニウムとの混合液比率（６：１）、混合
液の酢酸一度６０％）でｐＨａｌに調整しながら５５時
間培養した。この時培養液中にＬ−リジンが３９ｆ／ｊ
生成蓄積した。親株であるＨ−３１２２とＨ−３１１９
をそれぞれ同条件で同様に培養した場合のＬ　−１３ジ
ン蓄積量はそれぞれ３５ｆ／ｊ、ｚｒｔ／ｌであった。

Ｊ　　続　　補　　正　　書 昭和５７年／Ｉ月／ｃ）１１ 特　　許　　庁　　ＩＬ　　　’１ｓ　　　　殿１、＄
１＋１の表小 昭和５６年特許願第１８２０９５Ｇ； ２、発明の名４ヅ」、 発酵ｌ去による１　　リシンの餐造ｌ去３、補正を４°
る者 事１′１との関係　　特許出願人 垂１史査　−Ｊ　　　１００ １１　所　　束尾都」代Ｉｌｌ　区人４町−’Ｉ”　１
１　ｂ　ｉｌ’　Ｉ　ｌ乙　　　（ゴト　　　　　　　
（Ｉｆ＋２＞　　　協和的６ゲ　１１１株式公　ン１（
１１・Ｌ　　：　０３２０１７２１１内線２７５１）明
細書の特許請求の範囲お、Ｌび発明の詳細な説明の欄 ５、補ｉ−の内容 （１）　　特許請求の範囲 「別紙の通りＪ （３）回書第１０頁６〜７、毛、１３．１５〜１６．１
７〜１８．１９行および第１１頁２行１微工研菌寄第６
２１１号」を １微工研条寄第１５３号」に、 １微工研菌寄第６２０９号」を １微工研条寄第１５１号」に、 １−微工研菌寄第６２０８号」を 「微工研条寄第１５０号」に、 「微工研菌寄第６２１０号」を 「微工研条寄第１５２号」に、 「微工研菌寄第６２０６号」を 「微工研条寄第１４８号」に、 ［゛微工研菌寄第６２０７号」を ｒｍ工研条寄第１４９号」に、および 「微り研菌寄第６２０５号」を 「微工研条寄第１４７号」にそれぞれ訂正する。

（４）　　同書第１Ｏ頁１２行 「コリネバクテリウム」を［コリネバクテリウム・グル
タミクム」に訂正する。

（５）　　同書第１２頁下３および１行「ジヒドロスト
レプトマイシン」を　［ストレプトマイシン」に訂正す
る。

（６）　　同書１７頁４行 ［以下Ｈ−３０５６という）」の後に［（微工研条寄第
１５４号）」を加入する。

（７）同書第１８頁４〜５行 「ホモセリンリーキー」を［ホモセリンリーキー要求性
」に訂正する。

（８）同書第１９頁１０行、第２０頁３，１１行および
同書第２１頁１１〜１２行 １２−チェニルアラニンＪＧｒ２−チアゾールアラニン
」に訂正する。

（９）同書第２０頁２行 「−シスケイン」の後に「（チアリシン）」を加入する
。

θ０）同書第２０頁１０行 ［ホモセリンリーキー」を「ホモセリンリーキー要求性
」に訂正する。

０１３　　同書第２１頁９〜１０行 「サルファメサジン抵抗性Ｊを「サルファメサジン感受
性」に訂正する。

１２１　　同書第２３頁４行 ｒＦＥＲＭ＝Ｐ３６３４ＪをｒＨ−３ｉ２２」に訂正す
る。

〔腸　同書第２４頁下３行 「実施例３」を「実施例４」に訂正する。

％ハ請求の範囲 ｆｉ＋　　プロトプラスト融合によって得たし一リジン
生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
リジンを１＠せしめ、該培養物からし一リジンを採取す
ることを特徴とするＬ〜リジンの製造法。

（２）　　該微生物が二種以上の抗生物質に耐性を有す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。

（３）該抗生物質がアミノグリコシド系抗生物質、β−
ラクタム系抗生物質、マクロライド系抗生物質およびリ
ファマイシン系抗生物質から選ばれる抗生物質であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。

（４１該抗生物質がストレプトマイシン、ジヒドロスト
レプトフィシン、リファンピシン、スピラマイシンおよ
びペニシリンＧから選ばれる抗生物質であることを特徴
とする特許請求の範囲第３項記載の方法。

（５）該抗生物がコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物から選ばれる微生物である
ことを特徴とする特許請求の範囲１．２．３または４項
の方法。

（６）　　コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、二種以上の抗生物質に耐性を有゛４るＬ
−リジン生産菌株を培地に培養し、培養液中にＬ−ＩＪ
リジン蓄積せしめ、該培養液から１、−リジンを採取す
ることを特徴とする■、−リジンの製造法。

（７）該抗生物質がアミノグリコシド系抗生物質、β−
ラクタム系抗生物質、マクロライド系抗生物質およびリ
ファマイシン系抗生物質から選ばれる抗生物質であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の製造法。

イシンおよびペニシリンＧから選ばれる抗生物質である
′ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の製造法
。

（９）　　プロトプラスト融合によらて得た【、−リジ
ン生産能を有する微生物。

θ０）該微生物が二種以上の抗生物質に耐性を有するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の微生物。

（１υ　該微生物がコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物であることを特徴とする
特許請求の範囲第９または１０項記載の微生物。

［＋２）　　該微生物がコリネバクテリウム・グルタミ
クムおよびブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム
に属する菌株の同一菌種または真菌種間のプロトプラス
ト融合によって得られた微生物であることを特徴とする
特許請求の範囲第９．１０または１１項記載の微生物。

【Ｉり　該抗生物質がアミノグリコシド系抗生物質、β
−ラクタム系抗生物質、マクロライド系抗生物質および
リファマイシン系抗生物質から選ばれる抗生物質である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の微生物
。

（１４１該抗生物質がストレプトマイシン、ジヒドロス
トレプトマイシン、リファンピシン、スピラマイシンお
よびペニシリンＧから選ばれる抗生物質であることを特
徴とする特許請求の範囲第１３項記載の微生物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１グロトプツスト融合によって得たし一すジン生童
   能を有する微生物を“培地に培養し、培養物中にＬ　−
   １７ジンを蓄積せしめ、諌培養物からＬ−リジンを採取
   することを特徴とするＬ−リジンの製造法。 （２）咳黴生物が二種以上の抗生物質に耐性を有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）骸抗生物質がアはノグリコシド系抗生物質、β−
   ラクタム系抗生物質、マクロライド系抗生物質およびリ
   ップマイシン系抗生物質から過はれる抗生物質であるこ
   とを特徴とする特許請求の範−１＆３項記載の方法。 （４）骸抗生物質がストレプトマイシン、リファンピシ
   ン、スピラマイシンおよびペニシリンＧから選ばれる抗
   生物質であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記
   載の方法。 （５）　　該微生物がコリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる微生物で
   あることを特徴とする特許請求の範−嬉１．２．３まえ
   は４項の方法。 （６）　　コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
   ウム属に属し、二種以上の抗生物質に耐性を有するＬ−
   リジン生産菌株を培地に培養し、培養液中にＬ　＋　１
   ７ジンを蓄積せしめ、該培養液からＬ−リジンを採取す
   ることを４Ｉ涼とするＬ−リジンの製造法。 （７）誼抗生物質がアミノグリコシド系抗生物質、β−
   ラクタム系抗生物質、マクロ２イド系抗生物質およびリ
   ファマイシン系抗生物質から選ばれる抗生物質であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の製造法。 （８）骸゛抗生物質がストレプトマイシン、リファンピ
   シン、スピラマイシンおよびペニシリンＧから選ばれる
   抗生物質であることを％愼とする特許請求の範−ｄｇＴ
   項記載の製造法。 （９）プロトプラスト融合によって得たＬ−リジン生産
   能を有する微生物。 （ＩＩ　　咳黴生物が二種以上の抗生物質に耐性を有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の微生物
   。 θυ　骸黴生物がコリネバクテリウム属ま九はブレビバ
   クテリウム属に属する微生物であることを特徴とする特
   許請求の範囲第９まえは１０項記載の微生物。 ａ３葭黴生物がコリネバクテリウム・グルタミクムおよ
   びプレビバクテリクム・ラクトフェルメンタムに属する
   菌株の同−１種または異＃ｉ株間のプロトプラスト融合
   によって得られ九黴生物であることを特徴とする特許請
   求の範囲第９．１０ｔた１ｉ１１項記載の微生物。 ｔＥｌ　　該抗生物質がアミノグリコシド系抗生物質、
   β−ラクタム系抗生物質、マクロライド系抗生物質およ
   びリファマイシン系抗生物質から選ばれる抗生物質であ
   る仁とを特徴とする特許請求の範＃ＩＡ第１０１１紀幀
   の微生物。 住４Ｊ鋏抗生物質がストレプトマイシン、リフアンピシ
   ン、スピラマイシンおよびペニシリンＧから選ばれる抗
   生物質であることを特徴とする特許請求の範囲第１３項
   記載の微生物。