JPS5852640B2 - ペルオキシダ−ゼ活性の測定方法 - Google Patents
ペルオキシダ−ゼ活性の測定方法Info
- Publication number
- JPS5852640B2 JPS5852640B2 JP6651877A JP6651877A JPS5852640B2 JP S5852640 B2 JPS5852640 B2 JP S5852640B2 JP 6651877 A JP6651877 A JP 6651877A JP 6651877 A JP6651877 A JP 6651877A JP S5852640 B2 JPS5852640 B2 JP S5852640B2
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- JP
- Japan
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- enzyme
- acid
- activity
- peroxidase
- hrp
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は蛍光分析法によるペルオキシダーゼ活性の新規
な高感度測定方法に関する。
な高感度測定方法に関する。
本発明に用いられるペルオキシダーゼとしては例えば植
物及び動物組織由来の各種のペルオキシダーゼ、牛乳に
含まれるラクトペルオキシダーゼ(Lactoper。
物及び動物組織由来の各種のペルオキシダーゼ、牛乳に
含まれるラクトペルオキシダーゼ(Lactoper。
)(idase )、酵母菌に含まれるチトクロームC
ペルオキシダーゼ(Cytochrorne Cper
oxidase)、及び白血球や骨髄のエオシン好性細
胞に含まれるウェルドペルオキシダーゼ(Verdop
eroxidase )等が対象となるが就中西洋ワサ
ビ(Horseradish )由来のペルオキシダー
ゼ(以下HRPと略す)が最も一般的であり且つ最も代
表的なものである。
ペルオキシダーゼ(Cytochrorne Cper
oxidase)、及び白血球や骨髄のエオシン好性細
胞に含まれるウェルドペルオキシダーゼ(Verdop
eroxidase )等が対象となるが就中西洋ワサ
ビ(Horseradish )由来のペルオキシダー
ゼ(以下HRPと略す)が最も一般的であり且つ最も代
表的なものである。
ペルオキシダーゼは過酸化水素(H2O2)共存下で種
々の基質(水素供与体)の酸化反応を触媒する。
々の基質(水素供与体)の酸化反応を触媒する。
HRPは最も古くからの抽出分離及び精製化が進み、H
2O2の直接定量を目的とした生化学的分析法や糖類、
アミノ酸、有機塩基、コレステロール等の測定対象物か
らH2O2の生成する酸化酵素反応とペルオキシダーゼ
によるH2O2の定量との組合せによって測定対象物の
微量定量を目指すなど臨床化学分野において広く使用さ
れている。
2O2の直接定量を目的とした生化学的分析法や糖類、
アミノ酸、有機塩基、コレステロール等の測定対象物か
らH2O2の生成する酸化酵素反応とペルオキシダーゼ
によるH2O2の定量との組合せによって測定対象物の
微量定量を目指すなど臨床化学分野において広く使用さ
れている。
したがってHRP活性が高感度に測定出来ることにより
ペルオキシダーゼ自身の高感度検出は勿論のこと、この
反応に関与するH2O2、基質、必要によっては酵素阻
害剤等の微量測定、更にはH2O2の微量測定に基ずく
上記の目的測定対象物の超微量測定も可能になって殊に
臨床診断上の意義は極めて犬である。
ペルオキシダーゼ自身の高感度検出は勿論のこと、この
反応に関与するH2O2、基質、必要によっては酵素阻
害剤等の微量測定、更にはH2O2の微量測定に基ずく
上記の目的測定対象物の超微量測定も可能になって殊に
臨床診断上の意義は極めて犬である。
また一方、生体内微量成分の微量測定法の一つとして近
年急速に発展して来た酵母免疫定量法、或いは免疫組織
化学的手法による抗原検出のための酵素抗体法等におい
ては抗原や抗体の標識酵素としてHRPを活用する事例
が非常に多い。
年急速に発展して来た酵母免疫定量法、或いは免疫組織
化学的手法による抗原検出のための酵素抗体法等におい
ては抗原や抗体の標識酵素としてHRPを活用する事例
が非常に多い。
前者の酵素免疫定量法においては、その測定システム上
からも明らかな如く標識酵素の活性が高感度に測定出来
ることに基いてその標識酵素量の微量測定が可能になり
、その結果として測定対象物となる各種の抗原及び抗体
の超微量の定量化が達成される。
からも明らかな如く標識酵素の活性が高感度に測定出来
ることに基いてその標識酵素量の微量測定が可能になり
、その結果として測定対象物となる各種の抗原及び抗体
の超微量の定量化が達成される。
この論理はHRPを標識酵素とする酵素抗体法について
も通用し、微細組織中の表在抗原や内部抗原の局在性を
より微量の試料についてより詳細に追跡する場合にも役
立つ。
も通用し、微細組織中の表在抗原や内部抗原の局在性を
より微量の試料についてより詳細に追跡する場合にも役
立つ。
このようにペルオキシダーゼ活性の高感度測定方法を確
立することは唯単に微量なペルオキシダーゼ酵素量の測
定が容易になるばかりでなく、被酸化性の基質或いはH
2O2の微量測定更には上記の如く、生体微量成分の生
化学的または酵素免疫化学的測定分野或いは免疫組織化
学分野等への広範囲な応用が可能となる。
立することは唯単に微量なペルオキシダーゼ酵素量の測
定が容易になるばかりでなく、被酸化性の基質或いはH
2O2の微量測定更には上記の如く、生体微量成分の生
化学的または酵素免疫化学的測定分野或いは免疫組織化
学分野等への広範囲な応用が可能となる。
HRPをはじめとする各種ペルオキシダーゼの活性の測
定方法としては、従来は専ら可視部吸光法が採用されて
来たが、一般的な他の吸光法における如くその測定感度
は相当に低い欠点があった。
定方法としては、従来は専ら可視部吸光法が採用されて
来たが、一般的な他の吸光法における如くその測定感度
は相当に低い欠点があった。
−力先にギルバウト等はホモバニリン酸を基質とする新
規な蛍光分析法を報告した( Guilbault。
規な蛍光分析法を報告した( Guilbault。
G、 、 Kramer、 D、N、、 and Ha
ckley E、 ;Anal。
ckley E、 ;Anal。
Chem、39(No、2)271(1967)、Gu
−ilbauH,G、、 Brignac、 P、 a
nd Zimmer M ;Anal Chem、、4
0(No、1)190−196(1968) 、 Gu
ilbault、 G、、 Brignac、P’an
dJuneau M、; Anal、 Chem、 、
40 (、No、 8. )1256−1263(1
968)]。
−ilbauH,G、、 Brignac、 P、 a
nd Zimmer M ;Anal Chem、、4
0(No、1)190−196(1968) 、 Gu
ilbault、 G、、 Brignac、P’an
dJuneau M、; Anal、 Chem、 、
40 (、No、 8. )1256−1263(1
968)]。
この蛍光分析法は中性乃至弱アルカリ性の液性下でH2
0□の共存によって非蛍光性の安定な基質(ホモバニリ
ン酸)を高度の蛍光性物質(ホモバニリン酸の2量体)
に変換した後その蛍光度を測定することによってペルオ
キシダーゼ活性を求めるもので、上記可視部吸光法採用
時に比較して全般的に測定感度は高まるものの、ペルオ
キシダーゼを使用する多数の事例において未だ充分な現
状にあった。
0□の共存によって非蛍光性の安定な基質(ホモバニリ
ン酸)を高度の蛍光性物質(ホモバニリン酸の2量体)
に変換した後その蛍光度を測定することによってペルオ
キシダーゼ活性を求めるもので、上記可視部吸光法採用
時に比較して全般的に測定感度は高まるものの、ペルオ
キシダーゼを使用する多数の事例において未だ充分な現
状にあった。
こうした状況の中で本発明者等は前記の欠点を改良すべ
く鋭意研究を重ねた結果、基質に対するペルオキシダー
ゼの反応を酸性下、特に酸性下の特定pH領域で行った
ところ測定感度、測定の精度、再現性の極めて高いペル
オキシダーゼ活性の測定ができることを見出して本発明
を完成するにいたった。
く鋭意研究を重ねた結果、基質に対するペルオキシダー
ゼの反応を酸性下、特に酸性下の特定pH領域で行った
ところ測定感度、測定の精度、再現性の極めて高いペル
オキシダーゼ活性の測定ができることを見出して本発明
を完成するにいたった。
即ち、酵素作用と生成物の蛍光度測定を同−pH下で行
わしめるギルバウド等の手法とは逆に、酵素反応をアル
カリ性下ではなく、酸性下殊にpH3,5〜5.5下で
行った後生成した蛍光性物質の蛍光度をアルカリ性下で
測定すること、更にこの際オキシカルボン酸を素材とし
て調製された緩衝液を用いて酵素反応を行うことによっ
て前記ギルバラト等の方法と比較して蛍光強度がはるか
に上昇することを見出したものである。
わしめるギルバウド等の手法とは逆に、酵素反応をアル
カリ性下ではなく、酸性下殊にpH3,5〜5.5下で
行った後生成した蛍光性物質の蛍光度をアルカリ性下で
測定すること、更にこの際オキシカルボン酸を素材とし
て調製された緩衝液を用いて酵素反応を行うことによっ
て前記ギルバラト等の方法と比較して蛍光強度がはるか
に上昇することを見出したものである。
本発明は上記測定方法において酵素反応を酸性下におい
て行うことに特徴を有するが、酸性下のpH領域の中で
も特に高感度に測定できるpH領域がある。
て行うことに特徴を有するが、酸性下のpH領域の中で
も特に高感度に測定できるpH領域がある。
従って、その領域を特に選択して酵素反応を行うのが好
ましい。
ましい。
その特定領域は使用する酸によってpH3,5〜5.5
の間で多少変化するが、この特定領域を見つけるには当
業者にとって特に困難はなく、例えば酵素の活性を測定
する前に使用する緩衝液のpHを多少変化せしめて酵素
反応を予備に行いデータを取ってみれば簡単に知ること
ができる。
の間で多少変化するが、この特定領域を見つけるには当
業者にとって特に困難はなく、例えば酵素の活性を測定
する前に使用する緩衝液のpHを多少変化せしめて酵素
反応を予備に行いデータを取ってみれば簡単に知ること
ができる。
さらに、本発明者等は上記酸としてオキシカルボン酸を
選択し、これを素材として調製した緩衝液中で上記酵素
反応を行うと、酵素活性の検出感度が著しく向上するこ
とも見出した。
選択し、これを素材として調製した緩衝液中で上記酵素
反応を行うと、酵素活性の検出感度が著しく向上するこ
とも見出した。
以下、本発明の骨子をなす前記2種の要因について実験
例により詳細に説明する。
例により詳細に説明する。
実験例
下記に示した各種緩衝液(pH3,0〜8.3)500
μA 、 )TRP (Type VI 、 RZ :
約2.75、活性:約260 Purpurogall
in Units / mg。
μA 、 )TRP (Type VI 、 RZ :
約2.75、活性:約260 Purpurogall
in Units / mg。
Sigma Chemical Co、米国より買入)
の4.5μ9 / ml液10μ、g、0.25係ホモ
バニリン酸水溶液50μ、ff、0.05係H2O2液
50μtを含む反応混合液を37.5℃でゆっくり振盪
し乍ら30分間インキュベートした後、1.2511K
CN液50μtを添加して反応を停止させ更に0.lN
−NaOH液2.5 mlを添加してから日立製分光蛍
光光度計204型を用いて蛍光強度を測定しく励起波長
315 nm1蛍光波長425nm)で表1の結果を得
た。
の4.5μ9 / ml液10μ、g、0.25係ホモ
バニリン酸水溶液50μ、ff、0.05係H2O2液
50μtを含む反応混合液を37.5℃でゆっくり振盪
し乍ら30分間インキュベートした後、1.2511K
CN液50μtを添加して反応を停止させ更に0.lN
−NaOH液2.5 mlを添加してから日立製分光蛍
光光度計204型を用いて蛍光強度を測定しく励起波長
315 nm1蛍光波長425nm)で表1の結果を得
た。
表1の結果から明らかな如く、酵素作用pHをオ唄むね
3.5〜5.5の間に設定することによって酵素活性の
検出度は約10〜50倍上昇し、またこの酸性pH領域
設定に当ってクエン酸、酒石酸、乳酸等のオキシカルボ
ン酸を素材として調製された緩衝液を用いることにより
従来公知の無機酸(リン酸)系や他の脂肪族カルボン酸
(コハク酸、酢酸)系、芳香族カルボン酸(重フタル酸
)系使用時に比較して酵素活性の検出感度は更に向上し
た。
3.5〜5.5の間に設定することによって酵素活性の
検出度は約10〜50倍上昇し、またこの酸性pH領域
設定に当ってクエン酸、酒石酸、乳酸等のオキシカルボ
ン酸を素材として調製された緩衝液を用いることにより
従来公知の無機酸(リン酸)系や他の脂肪族カルボン酸
(コハク酸、酢酸)系、芳香族カルボン酸(重フタル酸
)系使用時に比較して酵素活性の検出感度は更に向上し
た。
この際の緩衝液は上記遊離型有機酸と有機酸のアルカリ
塩との適宜組合せによって調製することも出来るが有機
酸のアリカリ塩の代りに無機性のアルカリを用いてもよ
い。
塩との適宜組合せによって調製することも出来るが有機
酸のアリカリ塩の代りに無機性のアルカリを用いてもよ
い。
また異種の有機酸を相互に組合せることも可能である。
酵素作用のための最適pHは緩衝液の調製に用いられた
各種酸類の種類如何によって若干異り、オキシカルボン
酸使用時ではpH4゜01 その他の脂肪族カルボン
酸ではpH4,0〜4゜5、芳香族カルボン酸及び無機
酸ではpH4,5〜5.0に設定することが望ましい。
各種酸類の種類如何によって若干異り、オキシカルボン
酸使用時ではpH4゜01 その他の脂肪族カルボン
酸ではpH4,0〜4゜5、芳香族カルボン酸及び無機
酸ではpH4,5〜5.0に設定することが望ましい。
このような本発明を構成する前記2種要因によるペルオ
キシダーゼ活性検出の高感度化の現象は酵素のRZ値、
補欠分子族ヘム蛋白云々の如何を問わず各種のペルオキ
シダーゼ及びその各アイソザイム(i sojyme
)、またnativeなペルオキシダーゼそのものの他
、人工的に化学修飾されたもの、更には各種の抗原や抗
体に標識されたペルオキシダーゼについても、他方ホモ
バニリン酸以外のp−オキシ芳香族カルボン酸等種々の
基質を用いた場合についてもいずれも同様に認められる
。
キシダーゼ活性検出の高感度化の現象は酵素のRZ値、
補欠分子族ヘム蛋白云々の如何を問わず各種のペルオキ
シダーゼ及びその各アイソザイム(i sojyme
)、またnativeなペルオキシダーゼそのものの他
、人工的に化学修飾されたもの、更には各種の抗原や抗
体に標識されたペルオキシダーゼについても、他方ホモ
バニリン酸以外のp−オキシ芳香族カルボン酸等種々の
基質を用いた場合についてもいずれも同様に認められる
。
また実際的には蛍光強度の測定時において通常使用され
る10mmセルの代りにミクロセルを用いる等信の測定
操作上の工夫と組合せれば、更に数分の1量の試料につ
いても測定可能となる。
る10mmセルの代りにミクロセルを用いる等信の測定
操作上の工夫と組合せれば、更に数分の1量の試料につ
いても測定可能となる。
したがって本発明を実施することにより特別な高性能高
感度を有する蛍光分析計は不要となって通常の臨床検査
室等に設置されている蛍光分析計を用いるだけでペルオ
キシダーゼ活性更には各種生体微量成分等がより簡単な
操作で且つ短時間内に精度及び感度よく測定出来て、本
発明の臨床上における意義は極めて犬である。
感度を有する蛍光分析計は不要となって通常の臨床検査
室等に設置されている蛍光分析計を用いるだけでペルオ
キシダーゼ活性更には各種生体微量成分等がより簡単な
操作で且つ短時間内に精度及び感度よく測定出来て、本
発明の臨床上における意義は極めて犬である。
次に実施例により本発明を更に具体的に説明する。
但し以下に示す測定事例は本発明実施の単なる一例にす
ぎず、先述した如き本発明の適用範囲を何ら限定するも
のではない。
ぎず、先述した如き本発明の適用範囲を何ら限定するも
のではない。
実施例 I
HRP量の測定
0.1M−クエン酸−N a 2 B407緩衝液(p
H4,0)または0.05M NaH2PO4NaO
H緩衝液(pH7,0)500μ、l 、 HRP (
Ba5ic Isoenzyme Grade 1−C
、RZ : 3.4、活性:310Purpuroga
llin Units 7m9東洋紡績■より買入)の
1×10〜5×10 ユニット/a液10μt。
H4,0)または0.05M NaH2PO4NaO
H緩衝液(pH7,0)500μ、l 、 HRP (
Ba5ic Isoenzyme Grade 1−C
、RZ : 3.4、活性:310Purpuroga
llin Units 7m9東洋紡績■より買入)の
1×10〜5×10 ユニット/a液10μt。
0.25%ホモバニリン酸水溶液50μt、 0.05
%H2O2液50μtを含む酵素反応混合液を37.6
℃下35分間インキュベーションしてから実験例1の如
く所定量のKCN及びNaOH液を添加後、10關セル
を用いて蛍光度を測定し下表2の値を得た。
%H2O2液50μtを含む酵素反応混合液を37.6
℃下35分間インキュベーションしてから実験例1の如
く所定量のKCN及びNaOH液を添加後、10關セル
を用いて蛍光度を測定し下表2の値を得た。
この際、作用pH4,0下HRP量1×10−3ユニッ
ト区の蛍光度を100として他の各区の活性を相対値で
示した。
ト区の蛍光度を100として他の各区の活性を相対値で
示した。
即ち作用pH7,0下では1×10 ユニットオーダー
以下のHRP活性は全く測定不可能なのに対し、本発明
に基く作用pH4,0下では10 ユニットオーダーの
極めて微量のHRP(重量換算では1609gに相当)
迄も測定出来た。
以下のHRP活性は全く測定不可能なのに対し、本発明
に基く作用pH4,0下では10 ユニットオーダーの
極めて微量のHRP(重量換算では1609gに相当)
迄も測定出来た。
実施例 2
H2O2の定量
0.1M−クエン酸−N a2 B407緩衝液(pH
4,0)または0.05 M −N aH2PO4−N
a OH緩衝液(pH7,0)の500μ7 、 HR
P (実験例1と同じ)の1×10 ユニット/yrt
l液10μt、 0.25係ホモバニリン酸液50μを
及び下記量のH2O2を含む検液50μtから戒る酵素
反応混合液について実施例1と同様な操作を施し下表3
の値を得た。
4,0)または0.05 M −N aH2PO4−N
a OH緩衝液(pH7,0)の500μ7 、 HR
P (実験例1と同じ)の1×10 ユニット/yrt
l液10μt、 0.25係ホモバニリン酸液50μを
及び下記量のH2O2を含む検液50μtから戒る酵素
反応混合液について実施例1と同様な操作を施し下表3
の値を得た。
表から明らかな如く、従来のH2O2使用量を10〜2
0分の1量に減少させることによってHRP活性の検出
感度は約30%上昇した。
0分の1量に減少させることによってHRP活性の検出
感度は約30%上昇した。
更に本発明の実施によって10 g(ng)オーダー
のH2O2量の定量が可能となって公知の測定法のいず
れと比較してもはるかに優れた測定感度を示した。
のH2O2量の定量が可能となって公知の測定法のいず
れと比較してもはるかに優れた測定感度を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 蛍光分析法によるペルオキシダーゼ活性の測定にお
いて酸性下で酵素反応を行わしめることを特徴とするペ
ルオキシダーゼ活性の測定方法。 2 酵素反応をオキシカルボン酸を素材として調製した
緩衝液中で行うことを特徴とする特許請求範囲第1項記
載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6651877A JPS5852640B2 (ja) | 1977-06-06 | 1977-06-06 | ペルオキシダ−ゼ活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6651877A JPS5852640B2 (ja) | 1977-06-06 | 1977-06-06 | ペルオキシダ−ゼ活性の測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS541693A JPS541693A (en) | 1979-01-08 |
JPS5852640B2 true JPS5852640B2 (ja) | 1983-11-24 |
Family
ID=13318151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6651877A Expired JPS5852640B2 (ja) | 1977-06-06 | 1977-06-06 | ペルオキシダ−ゼ活性の測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5852640B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1164389B (it) * | 1983-08-05 | 1987-04-08 | Zambon Spa | Derivati n-sostituiti dell'1-(4'-alchiltiofenil)-2-ammino-1,3-propandiolo |
US4965193A (en) * | 1984-08-06 | 1990-10-23 | Washington Research Foundation | Detection of microbial beta-lactamase |
GB201714745D0 (en) | 2017-09-13 | 2017-10-25 | Atrogi Ab | New compounds and uses |
GB201714736D0 (en) | 2017-09-13 | 2017-10-25 | Atrogi Ab | New compounds and uses |
GB201714734D0 (en) | 2017-09-13 | 2017-10-25 | Atrogi Ab | New compounds and uses |
-
1977
- 1977-06-06 JP JP6651877A patent/JPS5852640B2/ja not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS541693A (en) | 1979-01-08 |
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