JPS5818167A - 分析フイルム及びこれを用いる分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生化学的過程で重要な役割を演じる物質ある
いは生物体由来の種々の物質（被分析物）を、とれと特
異的に結合しうる蛋白を用いて、競争反応によシ、これ
ら物質の存在濃度を測定する方法に関するものである。

更に、詳しくは、上記被分析物を、これと特異的に結合
しうる蛋白と競争的に反応させ、被分析物の存在濃度に
対応して変調された信号体を検出する反応層からなる分
析フィルムに関するものである０ 臨床検査分野において、検体液に数種の反応試薬溶液を
加え、被分析物の濃度を測定する各種の方法祉古くから
知られている。これらの方法に訃いては、測定結果の再
現性を高める上で、反応試薬を正確に計量したのち十分
に混合し、ある場合には、遠心分離によって沈澱と上澄
液とを厳密に分別するのに声変の熟練を必要とするＯ このような従来の方法に代って、すべての操作を自動化
することによシ、高度の熟練を要することなく、充分高
い再現性をもたらす装置が、特に溶液臨床検査の分野、
いわゆる湿式分析の分野で開発されている。これら自動
化され九分析機器は、たしかに多量の検体を分析する１
１便利である。しかしながら、湿式分析技術は、複雑な
溶液の取扱いを必要とし、又、これに対応して複雑な輸
送機能をもつ分析装置を必要にする。しかも、湿式分析
機器は非常に高価であるという欠点がある。その上、操
作中の汚染あるい紘自動化装置に供給される検体同志の
汚染を防止するため、常に高水準の清潔度を維持しなけ
ればならない。これらのいずれの操作本やは抄高度の熟
練を要する。

これら従来の湿式分析に代わるものとして、実質上反応
試薬溶液を必要とせず、よシ簡便迅速に分析を行なうこ
とができる、いわゆる乾式（ドライタイプ）の多層分析
要素が種々提唱されている。例えば、時分１１８５３−
２１６７フ号には、自動化学分析用の乾式多層分析フィ
ルムが記載されており、これを用いると、古典的な乾式
分析材料である神祇含浸型分析テープにおいて観察され
るクロマトグラフ現象のない乾式分析が可能になりたと
言われている。この多層分析フィルムは、従来の湿式自
動分析機器に比して極めて安価であるという特色をもっ
ており、血清中のアルブミンやビリルビン等の成分の分
析に有用であることが示されている。

しかしながら、特公昭５Ｂ−２１６７７号に記載の多層
分析フィルムを始めとして、これまでに知られている化
学反応あるいは酵素反応を利用し九多層分析材料を使用
する場合、微量の成分や構造ＩｐＩｊＪ！性の高い成分
の測定は困難でありたＯ 従って、このような成分の分析には、依然として、湿式
分析技術を適用しているのが実情である０高価な装置を
必要とするにも拘らず、湿式分析に頼らざるを得ない分
析法の代表的なものの一つに免疫学的反応を応用するも
のがある。

従来公知の多層分析フィルムに免疫学的反応を適用しよ
うとすると、後述スる免疫学的分析に同有の問題から、
満足な分析結果を得ることは困難である。また、これら
公知の多層分析フィルムに用いられた免疫的反応は、液
相反応の免疫的測定方法のうち、いわゆるＢ／Ｆ分離を
必要とする不均一競争的反応である。

すなわち、従来よシ実施されている不均一競争的免疫反
応においては、試ＩＥａ、Ｇ４）予め検出可能な信号を
有する色素、螢光物質又状酵素等の標識物質と化学的に
結合した、測定されるべき被分析物の標識体又はそのＩ
ｌ縁体、および（ロ）これらに共通な特異結合性を有す
る蛋白質（一般には抗体）とからなる０実際の反応ＫＩ
ＩＬ、被分析物と前記標識体とは、特異結合性蛋白質に
対して競合的に反応する。その結果、特異結合性蛋白質
と結合した複合体中の標識体（Ｂ）の量あるいは遊離の
ま＼の（すなわち、特異結合性蛋白質と結合していない
）標識体（ト）の量は、競合する被分析物の存在量の関
数となる０標識の測定にあたり、結合した標識化物（Ｂ
）と、結合していない標識体（ト）とを区別して各別の
測定値を得ること拡本質的に不可能であるから、分析に
先立つて必ず、いわゆるＢ／Ｆ分離操作によって、標識
体が特異結合性蛋白質と結合した複合体（Ｂ）と遊離の
標識体（蜀とを分離しなければならない。

あるいは、特異結合性蛋白質と結合した標識体、すなわ
ち複合体（Ｂ）又は遊離の標識体（ト）のいずれか一方
からは実質上信号が生成しないようにする特別のしくみ
を必要とする。いずれの方法を採るにしても、これらの
反応の乾式多層構成要素への導入は、層構成、各層機能
の賦与方法、各層の素材の選択などｋおいて困難が多く
、また、前記のようなしくみを実現しようとすると、著
しい感度低下を免れない。

一方、免疫反応を利用する特定成分の測定を含む、これ
ら構造特異性の高い成分や微量成分の測定においては、
検体液を相当多量用いなければ、信号変化量を検知し得
るのに充分な反応が生起し難いという固有の問題がある
。例えば、血清中のグルコースを検知するには、一般に
１ＯＳｔ程度の微量の検体液で足りるが、免疫反応を利
用する特定成分のためＫは、通常ｔ５〜１００Ｊ１ｊ程
度の検体液途必要である。従来の測定対象成分のための
検体液量に比し、か表秒大童の液量を必要とする免疫反
応型分析においては、さらに、検知すべき信号変化量を
放出することができる程度に免疫反応が充分進行しなけ
ればなら表いという時間的な血精もある。

このような特別堅慮を要する免疫反応型分析においては
、その余のタイプの分析用に開発された技術がそのま＼
適用できない仁とは多言を要しない。−例をあげると、
従来の湿式分析技術を乾式多層分析フィルムに転用する
際の最大の問題は、検体液を分析フィ　・ムに点着した
ときに生じる、化学物質の局部的高濃度であった。この
現象はクロマトグラフ現象と称され、この非均−濃度分
布によって、測定すべき成分量と検知信号変化量との間
に存すべき対応関係が損われる結果となる０このような
欠点を餘くため、乾式多層分析フィルムの技術的関心は
、もりばら、いかに検体液を均一に展開展延するかに向
ゆられた。しかしながら、公知の多層分析フィルムにお
いては、免疫反応型分析に特有の上記の如き問題点を認
識しているものはなく、従って、その他の、より微量の
検体液しか必要としない分析に有効ガ多層分析フィルム
が免疫反応型分析にも有効に使用することができるかど
うかは疑問である。前記のクロマトグラフ現象を考慮す
ると、比較的大量の検体液量を要求する免疫反応型分析
においては、むしろ、り四マドグラフ現象はより深刻な
影響を与えるであろうと考えられた。それ以上に、クロ
マトグラフ効果を回避するための対策である検体液の横
方向への展開は、すなわち、引きつづく下方向への迅速
な拡散泳動と直結しているから、免疫反応を十分に進行
させる時間を確保しなければ表らないという免疫反応型
分析における要求とは相反している。

例えば、前出特公昭５３−２１６７７においては、非繊
維多孔質媒体よシなる展開層と、ゼラチンあるいはＰｖ
ムのような媒体に試薬を含有せしめた試薬層を有する多
層分析要素に関する記載がある。しかしながら、通常入
手しうるプラ、シ、ポリマーのような等方的多孔質媒体
や、ゼラチンのようなコロイド媒体において社、短時間
に吸蔵しうる試料液体の容量がＩＣＩＦ当り数μｔから
たかだか２０μｔにすぎず、免疫学的分析に必要な２５
μｔ〜３００μｔの試料液を短時間に吸蔵することがで
きないので、著しく低感度にならざるを得ない。

また、非繊維多孔質媒体よりなる展開層、検鉱い能力あ
散、イ、ヤ□４え、１作□工を含有する試薬層、光し中
へい層、検出層および透明支持体をこの順に積層してな
る多層分析要素が提案されている（％開開５１−４０１
９１号）が、この分析要素において使用される非繊維多
孔質媒体も、短時間に充分な保水量を確保する仁とがで
きず、低感度の分析結果しか得られない欠陥がある。

ｔだ、特開昭５６−２４５７６号には、透明支持体コロ
イド物質中に試薬を含有せしめた試薬層及び試料中の妨
害成分を除去する繊維質多孔質担体層からなる多層分析
要素が記載されている。しかし、反応試薬（特異的に結
合しうる蛋白）をコルイド物質中に含有させると検出に
有効な成分との結合反応は署しく阻害され、従うて、検
出感度や精度の低下を生じる結果となる。

免疫学的分析に固有の性質を考慮し、明らかに免疫学的
反応を意図した多層分析フィルムも、前記の如く若干知
られている。

例えば、％開閉５５−９０８５９号に記載の発明は、前
述の多孔性媒体層として熱安定性有機ポリマー粒子を前
記ポリマー粒子とは異種の有機ポリマーからなる接着剤
で前記ポリマー粒子を点接触的に接着した三次元の粒状
構造物を生成して用いることを特徴としているが、この
ような特殊な構造物を安定に製造することは極めて離し
く、コスト面での不利も免れない。

また、免疫学的分析に必要な２５μを以上の試料液体を
吸蔵しうるように、粒状構造物の厚みを増加させると、
試料液体の点着時に、当該構造物を含む多層分析要素の
平面性が著しく損われ、光学的濃度の測定精度が低下す
るという欠点がある。

さらに特開昭５３−１３１０８９号には、克復合体を予
め含有させた試薬層及びその下に配置された拡散物質受
容層からなる多層分析要素が開示されている。この要素
を用いる方法においては、試料液滴が試薬層上に点着さ
れると、予め含有されている既知量の免疫学的結合対（
標識抗原と抗体との結合物）と試料中の被分析物との間
に、いわゆる置換放出型の免疫学的競争反応が生じ、免
役学的反応後払散性を獲得して、拡散物質受容層へ拡散
していった放出信号を、光学的に検知するものである。

しかしながら、標識抗原と抗体との結合物に、試料液中
の未知量の抗原が相互作用して標識抗原を放出させる本
方法において、その放出は非常に緩慢にしか起こらず、
その結果、放出される検知可能な拡散性物質も極めて少
量となって、著しく低感度、低レスポンスとなる。殊に
、数千程度の分子量をもつ成分（例えば、インシュリン
、″　　Ａ 分子量約５６００）の場合には、たとえ２４〜４８時間
のインキ、ベージ、ンを行なっ九としても、標準検量線
とはほど遠い検量線しか得られず、とうてい迅速なアッ
セイ法とは言い難い。

一般に、液体試薬による免疫学的反応と同時に、試料液
中の抗原と標識された抗原とを、抗体に対して同時に競
争的に相互作用させるか、むしろ逆に、試料液中の抗原
と抗体とを先に相、　互作用させる方法を用いた方が遥
かに高感度の結果を得ることができる０そのためには、
標識された抗原と抗体との結合物を用いる代りに、標識
された抗原か抗体のいづれか一方のみを含有させた反応
層と、抗体あるいは標識された抗原を含有させた試薬層
に分離する必要がある０この場合、試薬層に含有された
試薬性試料液体によって溶出され、実質上自由に反応層
に拡散し、試料液体中に未知量台まれる抗体あるいは抗
原と競争的に抗原−抗体反応を起こす。

我々は、種々の試薬を用い、分析用フィルムを組み立て
、その性能について研究した結果、上記の諸問題解決の
為に、（１）　Ｂ　／　Ｆ分離不要の、いわゆる均一系
酵素免疫検査法用の試薬を用いること、および、（２）
反応層に適した素材を選択することがきわめて有効であ
りうることを見出し九〇 本発明の分析フィルムは、上記の如き均−系の特異的蛋
白質結合反応及び酵素反応を利用する被分析物の定量分
析に適した乾式分析材料である〇 本発明の目的は、簡便かつ迅速で、高感度、高精度かつ
再現性にすぐれた特異的蛋白質結合分析用要素を提供す
ることにある。

本発明者ら拡、試料溶液を計量混合して反応させる従来
公知の免疫学的測定法に匹敵する高い感度及び再現性を
維持し、しか屯、乾式分析の特徴たる熟練を要すること
なく簡単に操作でき、高感度で、かつ、高い再現性を確
保するＫは、試料溶液を計量混合して反応させる従来法
と同様に、少く、とも２５μｔ１望ましくはＳＯ〜２ｏ
ｏμｔの試料溶液を競争的免疫反応に関与せしめる必要
があることを知−）ｒｏ少くとも２５μｔの試料溶液量
は、従来の乾式多層分析フィルムがその対象としている
被分析物（アナライト）の量に比し、か々りの大量であ
り、公知の多層分析フィルムを単に転用しても満足な分
析結果を保証できない程の量である。

上記の知見にもとづき、反応媒体としては、少くとも２
５μｔの試料溶液を吸蔵することができるスペースを有
する繊維質又は非繊維質多孔性媒体が好適であることが
見出された。

本発明に−よる分析フィルムは、基本的には、多孔性媒
体で構成された反応層からなり、これに、従来ドライタ
イプの多層分析要素に適用され九ことのない均−系の特
異的蛋白結合反応用試薬を組みこんだものである０さら
に詳しくは、該反応層は、 １）繊維質及び１又は非繊維質多孔性媒体からなシ、 ２）酵素反応によ）生成される検出信号の量を、特異的
蛋白質結合反応の結果として変調しうるよう表該標識体
と、該被分析物との双方に対して共通に、特異的に結合
しうる蛋白質を含有するが、 ３）誼被分析物と、該被分析物の類縁体と、もしくは、
該標識体と、該蛋白質との複合体を実質上含有しない。

上記の反応層からなる本発明による分析フィルムは、反
応後のＢ／Ｆ分離を必要としない均−系の特異的蛋白結
合反応試薬を用いたものであるから、反応層に被検液又
はその他の試薬との混合液とをスポットするだけで、変
調された検知信号を得ることができ、この信号を、用い
られた標識物に応じた方法（後述）Ｋより適宜検出する
０ 本発明の分析フィルムにおいては、後記する代表的な均
一系免疫反応のタイプ一応じ、特異的蛋白結合反応を進
行させる機能と、特異的蛋白結合反応によシ生成される
検知信号を受容してこれを検出する機能とを、それぞれ
別の層として構成してもよい０このような場合には、本
発明の分析フィルムは、前記反応層の上又は下に、さら
に、多孔性媒体よりなり、変調信号を検出するための試
薬を含んだ試薬層を積層して構成される。又、生成され
た検知信号を、さらに、後述する自体公知の酵素反応や
化学反応に付し、他の検知信号に変換したあと、これを
検出するために必要な公知の試薬系を組みこんだ検出層
を、設けてもよい。

いずれの場合にも、必要ならば、光学的測光に対して透
明な支持体を設けることができる。

この場合の層構成は、支持体の上に、必要によって検出
層を積層し、その上にさらに試薬層及び１又は反応層を
積層した一体蓋多層フイルムとなる〇 検知信号は、試料溶液中の被分析物の関数であシ、該成
分と特異的に結合する蛋白の一定量と、すの成分あるい
はその成分類縁体と標識物質との標識体で、かつ、上記
の特異的に結合する蛋白にも反応しうるものの一定量と
を共存させて生起する競争的反応の結果として、誘導さ
れる標識物質複合体量（２））あるいは遊離の標識体量
（ＦＳＫ依存して生成されるものであシ、光学的な測定
が可能である０ 本発明に用いられる均−系の酵素免疫反応用試薬は、試
料液中の被分析物と特異的に結合しうる蛋白質（一般に
拡抗体、特異結合性蛋白質など）、信号体を生成する反
応にあずかる酵素、信号体の前駆体、−嵩又は、酵素活
性を変調させる成分（たとえば、阻害剤、補酵素、酵素
基質濃度を変える為の第２の酵素など）で標識化された
該被分析物又はその類縁体などである０上記の均一系酵
素免疫反応試薬は、それぞれその関与する免疫反応の形
式と共に、湿式分析においてはよく知られている亀ので
ある。すなわち、本発明の一体型分析フィルムに組みこ
まれる反応試薬に関与すべき競争的免疫反応自体は公知
であり、従って、ここで特異的蛋白結合反応の各メカニ
ズムについて詳細に言及すること杜差しひかえるが、当
業者は各反応の進行に対応して適宜必要な技術的配慮を
行うことができる。

すなわち、酵素免疫反応用試薬としては、その反応を構
成する各ステップに応じて複数の試薬を用いるのが普通
であるが、これらの試薬の中１１、反応を生起する以前
には別々にしておき、反応時に始めて混合されるべきも
のがある〇そのように取扱うべき試薬は、用いられる酵
素免疫反応のメカニズムと関連して自ずから決まシ、湿
式分析においては、それぞれ独立の容器に収容されてい
る。本発明においても、原理的には湿式分析のために開
発された酵素免疫反応が適用されるものであるから、当
該反応において事前の接触を避けるべき試薬については
、それらをそれぞれ別の層に含有せしめるのは当然のこ
とである。たｙ１本発明の分析要素を用いる場合には、
反応層ｉが非常に大きいという利点のために１湿式分析
におけるｔｌど厳密に時間的コンレールを行なう必要は
なく、酵素反応（例えば−素と基質との接触）が特異的
蛋白結合反応（抗原と抗体との接触）と少くとも同時に
生起すれば目的は達成される。もちろん、まず免疫反応
が生起したのちに酵素反応が続いて起るのが好ましい０
反応のメカユズ上常識的なこのような要請から、酵素と
基質とは同一の層でなく各別の層に含有させるのが望ま
しく、被分析物（例えば、抗原）と競争的な関係！ＩＣ
ある標識体（例えば、１ｆｉＡ織抗原）は、これらと特
異結合性を有する蛋白質（例えば、抗体）含有層と°１
別の層に含有されていることが望ましい０同様な理由に
より、酵素は阻害剤含有層とは別の層に含有されている
ことがｇＩｌましい。

なお、分析の効率や感度を高めるため、標識体（例えば
、標識ｂｂ原）は被分析物にできるだけ近い層（すなわ
ち、本発明の基本的構成においては、反応層よりも試薬
層）に含有されているのが普通である０従って、これと
特異結合性を有する蛋白質（例えば、抗体）杜、その他
の層（上記の例においては、反応層）Ｋ含有せしめるこ
とになる。

以下、本発明の分４ｒｔ要素に組みこまれる代表的な反
応系について、その進行の大略を、これに関連する本発
明の分析要素の構成との関係において説明する。

（１）上記標識体の標識物質が信号体を生成する酵素で
あり、その酵素活性が、被分析物に特異的に結合する蛋
白質との結合反応により変調される場合には、特異結合
性蛋白質−酵素標識化した被分析物又はその類縁体、該
酵素によシ信号体を主成する為の酵素基質などが、反応
層及び試薬層に含有される。この場合、上記のように、
酵素は基質含有層とは別の層に組みこまれることが望ま
しい。例えば、酵素欅識化被分析物又はその類縁体が試
薬層に含有されている場合には、特異結合性蛋白質およ
び基質は反応層に組みこむのが望ましい０なお、上記の
反応系において、酵素活性の変調が特異的蛋白質結合反
応により誘起され４場合でも、阻害剤を選択して用いる
ことによシ、同様の酵素活性の変調を実現できる０たと
えば、特異的蛋白質結合反応により生成した特異結合性
蛋白質複合体中の酵素と遊離の酵素標識体とに対して異
なる阻害性を有する阻害剤を使うことによシ、酵素活性
を変調する場合である。この場合、阻害剤は、通常酵素
標識体や特異的結合性蛋白質を含有した層とは別の層に
含有されるように設計される。

上記の酵素標識化した被分析物又はその類縁体など、こ
のタイプの競争的免疫反応に有効な例及びそれらの合成
法については、米国特許第４０４０９０７号、同第４０
４３８７２号、同第４１９１６１３号、！開明４８−５
４９１号、同５１−１０６７２４号等に１ｍ書剤を使用
する場合については同５４−２０１３４号に詳細に記載
されている〇（２）上記特定成分の標識体が信号体を生
成する反応に関与する酵素の阻害剤である場合には、該
特定成分と特異結合性蛋白質（たとえば、抗体）との結
合反応によシ、当初の阻害活性が変調された結果、酵素
の全活性が変調されるの°で、その変調された信号体が
検知される〇このような系においては、特異結合性蛋白
質、信号体生成用酵素、該酵素の阻害剤で標識化した被
分析物又祉その類縁体、信号体を生成するための酵素基
質などが、反応層や試薬層含有されることになる。

分析フィルムが各層構成である場合における上記試薬Ｏ
層配分の原則は、次のとお抄である。

■　特異結合性蛋白質は多孔性媒体中に含有させ、標識
体祉それとは別の層に含有させる０ ■　酵素と阻害剤および／又は基質とは別の層に含有さ
せる。

阻害剤標識化物質および基質を試薬層に入れた場合、該
特異結合性蛋白質および＃識は反応層に組みこまれる。

また、例えば、阻害剤標識化物質のみを試薬層に入れた
場合には、反応層を二層に分層し、試薬層に隣接した第
一の反応層に＃特異結合性蛋白質および基質を含有せし
め、第二の反応層に酵素を含有せしめた構成に設計して
もよい。

これら試薬の臭体例およびその調整法は、米国特許出願
第７４８００５号、特開昭５５−１０４８９６号、同５
３−１０５２９１号、同５Ｂ−１１５８１４号、に詳細
に記載されている。

俤）　複合酵素が補欠分子族（例えば、補酵素）との結
合により始めてその、酵素活性を顕著に発現するという
特性を利用し、その補欠分子族を上記阻害剤におきかえ
た系についても同様に１酵素の全活性が変調されること
となるので、変調された信号体にもとづく分析可能な系
が構成される。このような系において杜、特異結合性蛋
白質、補欠分子族で標識化した特定成分又はその類縁体
、信号体生成用アポ酵素、信号体生成用酵素基質などが
Ｔｏ臀。又、補欠分子族でなくてもいわゆるアロステリ
。

クエフェクターとして知られている物質も上記目的に使
用可能である。

詳細には特開昭５５．−２９９７号に記載の試薬、およ
び、同５１−１４６２９５号に記載の試薬のうち、均−
系に適したものが有効である。

（４）信号体を生成する酵素系の基質濃度や、その酵素
系の補酵素濃度を変えるような酵素系が、特定成分の標
識物や特異結合性蛋白質の標識物によって組みあげられ
、それらの特異結合反応により、前述の基質や補酵素の
局所濃度が変わり、それに応じて信号体生成量が変化す
る系、たとえば、酵素チャンネリングによる均一系試薬
なども本発明用の試薬として有効に使用できる０これら
の試薬系及びそれらの調製法は、特開昭５４−１３６８
９６に詳細に記載されである。

上記に述べた種々の均−系イムノアッセイ用試薬は、従
来の不均一系イムノアッセイ法にくらべてＢ　／　Ｆ分
離を不要にする大きなメリットを持っている。また、生
成した信号体・の全量がそれぞれの一定されるべき特定
成分濃度に相関性を示す為、測定そのものについても簡
単であシ、自動化龜容易であるＯこれらの試薬は、その
特性から、Ｂ／Ｆ分離不要である為に、特異結合性蛋白
質の固定化を必要としない利点を有する。これは、不均
一系イムノアッセイ法では、＃１ぼ必然的に要求される
特異結合性蛋白質の化学修飾が不要となるメリットにつ
ながシ、試薬の作成上ま九、生物活性上、有利であると
いえる。ただし、これらの試薬をドライフィルム化した
検査シートに組みこむためＫは、種々の困難が想定され
る。たとえば、限られた容量のスポット液内で免疫反応
と酵素反応をうまく進行させるための要件や、試料液体
中の妨害成分の影響を除去する方法、また、単位面積当
り一定量の試薬を活性を保持してとじζめる方法などで
ある。

上記の如く構成された本発明の分析要素は、まず第一に
、免疫学的競争反応に必要な試料液量を充分に反応層に
吸蔵することができるので、高感度及び高い再現性を与
えることができる。

又、特別の熟練を要することなく、非常に簡単な操作で
極めて短時間で完了する分析を可能にするものである。

本発明の分析要素は、分析を行ないうる形態てあればど
のようなものであって４よいが、一般に、シート状ない
しフィルム状の形態が好ましい。

本発明の分析要素は、例えば、次のように用いられる。

試料中の特定成分（例えば、抗原又れ抗体）と＊＊され
た被分析物（抗原又は抗体）とは、反応層中の特異結合
性蛋白（例えば、抗体又は抗ｉ）と競争的に反応し、免
疫学的結合物を生成する。ここに遊離の標識化された被
分析物と特異結合性蛋白との結合にあずかった標識化さ
れた被分析物の比率は、試料中の特定成分の員数となり
、これに対応して信号体を生成する酵素系の統活性が定
ｔｂ、それに応じて信号体が形成される。次に信号体は
、検出層に拡散し、光学的に測定され、一方、既知量の
特定成分に対して得られた信号量にもとすいて予め検量
線を得、この検量線と対照することによシ、特定３１− 成分を測定又は定量するものである〇 上記の検出は、検出すべき信号体が酵素反応により直接
生成する場合について説明したが、本発明において生成
する信号体は、直接検出することができる信号体だけに
限られるものではない。そのような信号体、すなわち、
信号体がそれ自体ではそのま＼検知できず、他の二次的
信号に変換する必要がある場合（例えば、グルコース分
析における過酸化水素や、ロイコ染料で標識した場合Ｏ
ロイ３体）には、常法に従ってその＠１号体（信号前駆
体と呼ぶこともできる）Ｋ既存の＃嵩反応又は化学反応
を適用し、検知信号を生成せしめることができる。例え
ば、グルコース分析にお−て、生成する過酸化水嵩（−
次信号体又は信号前駆体）を、さらにベルオ中シダーゼ
、水素供与体およびカブツーからなる試薬と反応させて
、呈色生成物に変換させる如きである・このための試薬
は適宜反応層や、独立に設妙九慣出層に含有させること
ができる０本発明において、被分析物はもっばら光学的
な手ＲＫより検知されるので、検知すべき特定成分以外
の干渉愉質（例えば、検体試料として全血を用いた場合
の赤血球やヘモグロビン、あるいは、螢光標識又は染料
標識した抗原又は抗体等）が光学的測定に関与する不都
合を除くために光しやへｉ゛層を設けることが望ましい
Ｏ光じゃへい層は、通常、反応層の下、試薬層と反応層
の閏、又は反応層と検出層との間に組み込まれるが、試
薬層又嬬反応層に光じゃへい機能が賦与されている場合
には、覚しゃへい層を省略することができる０ 反応層に用いられる多孔性媒体としては、種々の孔径を
もつポリτ−ｆ過膜（ペンプランフィルター）、セファ
デックス、アガロース、デキストラン等の非繊維質媒体
；ノ（ルプ、綿、絹、羊毛のような天然繊維；セルロー
スエステル、ビスコ−スレー璽ンのような半合成繊維；
ホリアント、ポリエステル、ポリオレフィンのような合
成繊維；更に、繊維質無機材料、例えば、ガラス繊維、
増色ガラス繊維、石綿等を織物、フェルト、不織布など
の形にして用いる仁とができ、あるいは、水透過性の紙
などを用いることができる０ メンブランフィルタ−としては「ミクロフィルター」（
富士写真フィルム社製）、「建すポアー」（ミリボアー
コーポレーション族）などを用いることができる〇 反応層に用いることができる織物としては、植物、動物
及び鉱物などの天然繊維、無機、ｈ生、半合成及び合成
などの人造繊維から得られる広範囲の棟類の繊物があり
、Ｍｌｌ１組織Ｏ５ちでは、たて糸とよこ糸とで蒙った
平織が好ましい０平織を構成するたて糸およびよこ糸と
しては、２０誉手から１２０誉手の範囲が好ましい。

平織織物のうちでは、細布、盆布、ブロード、ボプリク
とよばれる種類の！Ｉ威物が好ましい０これらと同じ１
１）方をした天然繊維（カポツタ、亜麻、大麻、ラミー
、絹等）または化学線維（ビスコースレーヨン、銅アン
モニアレーヨン、セルロースアセテート、セルロースト
リアセテート、ビニロン、ボリエテレンテレフタレート
等）と綿との混紡織物、化学繊維糸を用いてこれらと同
じ織り方をした織物も周込ることができる。

前記繊１１１ｔ−１織物とせず布状に底蓋せしめた不繊
布も、臓物と同様に反応層に用いることができる。

反応層に用−ることができる紙としては、水透過性であ
れば広範ｉｍｏａｉＩＩｏ紙が用ｉられる。

具体的には、例えば、１紙を用いることができ、薄手で
目の細か％／′ｈｆｓ紙が特に好ましい。インディアン
紙、こうぞ、みっま友などの和Ｍ４Ｍ％Ａることができ
る・天然竜ルロースの紙ばか）でなく、合成高分子の繊
維をすいて紙状にした透過性を有する合成紙や、石綿、
ガラス５ｌＩｌ／ＩｍｆＪｔｈも反応層として用いるこ
とができる。

さらに、これらの多孔性物質、殊に繊維質多孔性物質に
絡めて、デキストラン、アガロース、アクリルア々ド、
七ルーースなとの微粒状物を混入すると、試料液の保水
総力が増し好適であるＯ このように、微粒状物を混入した場合であっても、反応
層の保水能力は多孔性媒体の属性を保持して、かつ、微
粒状物の保水能力により、反応層全体の保水能力をさら
に向上できる・反応層全体としては、多孔性状を維持す
る必要があり、このような機能上の４Ｍ膚から混入する
（好ましく絡めるンことができる微粒状物の量は自ずか
ら決定される。一般的に社、反応層の全１量に対して９
０−ム量までである＠ 微粒状物を含有する多孔性物質は被分析物と特異的に結
合しうる蛋白′に！舊させるためにり。

予め微粒状物に物理的ま九は化学的に上記蛋白を結合さ
せたものを多孔性物質に混入するか、あるいは予め多孔
性物質に物理的ｔたは化学的に上記蓋白を結合させたも
のに微粒状物を混入するかあるいは微粒状物を含有する
多孔性物質に上記蛋白の含有１１ｉ１に含ましめて凍結
乾燥させることによって遜せられる◎ 上記の繊維質および／または非ｌｌ１−質多孔性媒体は
、そのすぐれ友保水性に由来して、スポットされた検体
試料の必要量（少くとも２５μりを、免疫反応が進行す
るに充分な時間、反応層中にとどめることができる・こ
の多孔性媒体の保水力ないし吸賦力を、より効果的に発
現させるに社、多孔性媒体で構成される反応層に加えて
さらに１検出部材（検出層の外、該層の機能を補助する
ため後記の如き補助層が設けられる場合があり、これら
を総称して検出部材という）を設け、その際、該反応層
を検出部材よシも小面積とし、かつ、検出部材からはみ
出さないように、検出層上に重ね合わせた構成であって
、結果的に適正な側光を可能にする面積が保証されて−
ることが好ましい。このように構成された多層分析景累
にあって社、試料液をスポットした際、反応層Ｆｉ；に
、その面方向の−を限定しただけのむとであるが、これ
によって、同方向への１１＃が殆んど与られず、もつは
ら、反応層のＪ＃さ方向にのみ膨むことができるのであ
る。

従って、Ｌり大きｇＡ値号賀化蓋をもたらすことができ
る禽争的免疫反応を行なうに充分な時間、検体試料を反
応層中にとどめる仁とができ、しかも、従来公知の多層
分析フィルムに観ＩＩされるカールが生じることがない
ので、光学測定上も特に好都合である。

反応層は、抗体のはかに特異的蛋白結合反応及び検出を
可能にする反応に必ａｔ、検出層に用いられる橡鐵体を
除く槍々の試薬を含有することができる。標鍼体の添加
は、被検体ｔ）一定感度を著しく低下させるため、透け
なけれはならない＠さらに、反応層を２層以上ＫＩＩＩ
＃威し、その上層には被検体成分の妨害成分に対する特
異結合性蛋白＊（抗体など）ｔ−Ｊ、有させ、これによ
シ妨害成分ｔ−除去した後、下層の特異蛋白結合反応層
におｉて被検体成分を抗原又は抗体とする抗原−抗体反
応を行なうむともてきる・本発明の一膳禄におｉて、検
出フィルムよ襲小面積となるように設計される反応層は
、面方向への物着的制限が付されていることに意義を有
するのであるから、具体的な数値をもってその面積を特
定することは無意味であるが、点着すべき検体試料の必
要量中分析すべき被分析物の種類及びＩＩＩＦＩＬ＃Ｉ
Ｐ、ある−は製造コスト上の配属かも決定される。

元学的測定の対象となる検出部材社、十分な測定糟ＩＩ
ＩＬを維持するために画定時に平面性を確保される必要
があり、一定開口部の周辺を機械的に押えられるような
保持部分をもたせることが必要である＠他方、反応層の
方は検出層の測定開口ｓＫ対応した闇槓があれば十分で
あり、検出部材の保持部分にまで拡けることは＾価な試
薬管無駄にすることになる。

反応層には、被分析物と特異的に＃合し得る蛋白を含有
させる。金層の方法としてａ、（１）皺蛋白を含Ｍする
水性媒体を線維質および／又は非稙維質多孔性織体に含
浸させた後、常法により凍結を燥する方法、あるーは（
匂轍紬質および／又鉱非楓維質多孔性媒体に、智壇的手
Ｒ（吸着等）又は化学約手Ｍ（・共有結合等）によ襲、
イムノグロブリンＯアｉノ基、あるいは、カルボキシル
基金弁して直接に緘体に結合させるか、あるいはリンク
成分を介して間接に結合させる方法、（３）微粒状物を
混入する場合には、予め蛋白を微粒状成分に共有結合又
は吸着によって、あるいはＦｃ７ラグメントを特異的に
結合するようなリンク成分（例えば、プロティン人など
）を介して含有させる方法等がある。

反応層内に含有される蛋白は、一定容量の試料液が点着
されて初めて、反応層内の水性媒体中において特足成分
との特異的結＠−能力を発揮することが可盲ヒとなる。

従って、上記含有方法の中でも、共有結合等により蛋白
の固定化を行う方法より、むしろ、単に物理ｍ沼による
方法、あるいは該蛋白の含有液ｔ−含浸せしめて後、単
に凍結乾斃せしめ、蛋白を混在せしめたま＼の状態をも
たらす方法が、試料叙点着時の失活が少なく、かつ、ま
た結合能力を早期に発揮できるので特に好都合であるＯ 被分析−を特異的に結合し借る蛋白は、被分析物に対応
して決定されるべきＷｈｖでめる０本発明の分析要素を
用いて分析測定することができる被分析物とは、生化学
成分含有液及び生体液、例えば、血液、血漿、血清、髄
液、唾液などの存在する抗原性を有するもの、あるいは
抗体をいう＠以下に代表的被分析物を例示する０ （１）　　ポリペプチド、タンパク質、多糖類、核酸、
およびこれらの結合体： 結合体は、すなわち細菌、ウィルス、細胞膜、遺伝子、
核等である◇これらの分子量献少くとも５，０００、通
常１０，０００以上である０ポリペプチド、タンパク質
では一般に、５，０ｆ）０〜氏ｏｏｏ、ｏｏｏ％通常２
０．０００〜１．Ｇｏｏ。

０００である。

ペプチドホルモンの場合、その分子量は、通常５，００
０〜６０，０００である０ （２）　タンパク質 ■　単純タンパク質 プロタミン、アルプ建ン、グロブリン（α、／、４？に
完投ダロプリンーＩ　ｇ　Ｇ　＃Ｉｇム、ＩｇＥａＩｇ
Ｍ、ＩｇＤ）ｍ硬タンパク質（５ラーゲン、エラスチン
。

アクチンなどの構造タンパク質）； ■　複合タンパク質 ムコタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、核
タンパク質、勧タンパタ質、リンタンパク質； ■　その他のタンパク＊（−素、補体を含む） （６）ペプチドホルモン インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン、コルチコ
トロピン、ゴナドトロピン、ガストリン、セクレチン、
下Ｉ！１体ホルモンなど、およびこれらの前駆体、代−
戚豐：（ａ）　　微生物由来の抗鳳性多５１１ＩＩＩ球
−←連−球−、ブドウ球１など）、桿−（炭ｍｍ　、　
枯単＃ｉ、ａｍｍｉｉｉｉｔどン、放愈■（アクテノマ
イセスなど）、＾―（ノカルジア、アスペルギルス、カ
ンジダ嫌と）、リケッチア（発疹チフス、ツツガ真、ロ
一−＝ｖ−ｔｙ国隠、Ｑ熱など）、ウィルス（ヘルペス
、庖疹、アデノ、アルボ、肝炎など）、スピロヘータ（
４１１１，レズトスピッ、トレポネ−ｉなど）、その他
の病原菌； （２）抗原性低分子物質 −ＩＩ！ｊ：に％　１００〜２．０００．−９１通には
１２５〜１．０００の分子量を持つ。例えば、以下に示
す薬物、凝薬、小ぺ１チツト、アミノ酸、低分子ホルモ
ンおよびこれらの代−産物・−）薬　　物 アルカｕイド（モルヒネ、コディン、キニーネ、ジゴキ
シンなど）、５〜６員環ラクタム（ハルヒラレートなど
ン、ア々ノアルキルベンゼン（アンフェタばン、エピネ
フリン−カテコールアミンなどン、ベンゾ複本環武化合
書（オ牟すゼパム、クロルプ關マシンなど）、プリン（
テオフィリン、力２エインなど）、ビタミン（Ａ、Ｂ複
合体、Ｃ，Ｄ、Ｅなど）、グミスタブランジン、抗生ｊ
ＩＩＪ質（ペニシリン、テト′ｙサイタリン。

、−にファロスボリンなど）、アミノグリコシド（ゲン
タマイシン、カナマイシンナトン、その仙の栗＋ｋＪ（
メサトン、メプロバメート。

リドカイン、グリセオフルビンなト）、および以上の業
物の代ＷＭ産物； 伽）農　栗 ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオホスフェ
ートなどおよびこれらの代■厳物・ （Ｃ）小ペプチド、アミノ酸、世分子ホルモントリヨー
ドサイロニン、チロキシン、二ンケ７アリン、プラジキ
ニン、アンギオテンシンＩ、ｌ、および仁れらの代−ｉ
ｔＭ曹。

本発明の分＠賛累七尾匹る均−系＃索兜波反応成分によ
る被分析豐の分析は、ＩＩａ＃ｉＲ及び非確Ｉｌｔ特足
成分がこれらと籍異的に結合する蛋白と−争反応をする
ことにより、１８号体−素（七〇−駆体を含む）全生成
するＴＩ＃本ｌ古性が健−され、その結果、信号体生成
菫が変イヒする＠本発明は、このように変調されｆｃｊ
４Ｍ号の髪化量を測定するという原理に基づいている＠
この原理に過用できる被分析豐の検出を可能にする標識
−質としては、前記（１）ないしく４）の分類に対応し
て、酵素、＃素組害剤、補酵素、基質および厄二の酵素
の組合せ、アロステリックエフェクターなどがある。

本発明において、光学的検出系としては、分元元度分析
法、螢光元度分ｖｒ法など七尾いることができ、いずれ
もＪＸ射糸又は−ｊ１１過糸で実施できるが、訪膏因子
を回通できる点で反射系が望ましい。

分元元皺分析においては、ｏＴ視元の他に、紫外光、赤
外光など１使用できる・ 螢光χ度分析法は、検出層に移動した螢光資質に対して
竹なわれ、勧起光、螢光ｍ長は、目的及び用途に応じて
任意に通訳する仁とができる。

被分析物の標識化は、常法によって行われる。

＃本については、「酵Ｘ兇投側建法」（石川栄泊１河會
忠、宮井纒輪集、医学書院、１９７８年刊）に１献の方
法が一般的な方法として参照できる。

基質、阻害剤、補欠分子族（＠酵素など）ｔ−櫨繊物質
と、して用いるときも、酵素と同様な方法て標識化する
０特に、上記（１）のタイプの反応に使用される標識体
の標識化は、特開昭４８−５４９１号及び同５４−２０
１３番号に、（２）及び（３）のタイプの反応を適用す
る場合には、％開昭５３−１０５２９１号及び同５５−
ｚ０４８９６号あるいは同５５−２９９７号に、（４）
のタイプの反応を適用する場合には、特開昭５４−１３
６８９６号に、それぞれ詳細に記載されているＯ 前記（幻ないしく４）のタイプの反応において、標識物
質として用いられる酵素、基質、阻ｖＩ剤、補欠分子族
（補酵素など）の代表的なものｔ以下に例示する０ （１）−１（１）のタイプの反応に用−られる橡鐵用−
素の例： プリンデアミナーゼ　：アデナーゼ、グアナーゼシン ーゼ ルコースデヒドログｆ　−−ｖ！、 チトクローム還元酵素：コノ１り酸デヒド關ゲナーゼム
ターゼ　　　　：グリオキザラーゼ 上記および上記以外の便用可総な酵素、酵素銀、基質な
らびに最終生成物については、ホーク等の［プラクディ
カル４Ｉフイジオ闘ジカル拳クミストリー」、第３０６
〜３０７貞（１９５４年）、！クグロクヒル社（二ニー
曹−り）刊、バーマンの「工ンザイム・ハンドブック」
、スプリンガーフエルラーク、ニューヨーク（１９６９
年）に詳記されている。

（１）−２（１）のタイプの反応において使用される酵
素および変調信号を増幅するために 該酵素と併用される６１１１１剤の例ニルー４−ペンテ
ン酸（１） Ｄ−シクロセリン マン 血漿アミンオキシダーゼ　　２−ブロモエテルアミン ２−プ目ビニルアミン ２−クロロアリルアミ ン フェニルグリシン アミノアセトニトリル ルーｌエーテル ミドトランス７エクーゼ アザセリン ジアゾオキソノルパリ シン ジアゾオキソノルパリ ン Ｂ、結合酵素　　　　　ミモシン セリンプ鑓テアーゼ　　フイソステグイングルタミンシ
ンセターゼ　メチオニンスルホ中ジイミン （２）−１（２）のタイプの反応において使用される阻
害剤の例を、これにより＃素活性が 叫害される当骸酵素の例と併せて示す〇阻害剤　　　　
酵　素 有機燐酸トリエステル類　　トリプシンーゼ 中モトリプシン トロンビン エラスターゼ アデノシンデアミナー ゼ アル今ルイノシアネート類　　エラスターゼトナプシン キモトリプシン キモパパイン アデノシンデアミナー ゼ リパーゼ Ｉ−ア建ラーゼ ペプシン グリセロアルデヒド− ルシ７エラーイ ス７エラーゼ ヘキソキナーゼ 基質エポキシ化物　　　ペプシン デキストラナーゼ 特に有用なｍ沓剤は、式 （式中、Ｒ１νよびＲ３は、１−１０の炭素原子を有す
る、アルキル基又はアルコキシ基を、Ｂは窒素又はイオ
ウ又社それらのアルキル化塩を、ｎは１−１０の整数を
、Ｘは、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、α−ハロメ
トキシカルボキシ等の官能基を表わす０）で示される有
機リン化合物残基が結合されたものである。また、式　
　　　０ （式中、８１社、？Ｎ記Ｒ１およびＲ８と同義；Ｒ４拡
有機離脱基（例えば、ｐ−二トロ７二二ル、ヒト−キシ
キノリル等）を表わすＯＢ％ｎ訃よびＸは前記と同ｈ）
で示される基を結合したものもｌｉｄ害剤として特に有
用である。

本発明において好壜しく用いられるアセテルコリンエス
デラーゼに対しては、下記式で示される阻署剤配合体が
妹に有用でめる・ ■ （式中　Ｒ１社エテル又ｔｉｖ＊−ブチルを表わし、逆
イオンはＭり化物又はメチル硫酸等である。）（乃−２
同　上 スルファ品ルアミド 好ましい阻害剤配合体の例： （ｌｌ　　上記（→のタイプの反応に用−られる補欠分
子族の４Ｎ（併せてアポ酵素の例を補欠分子族　　　　
　　　アポ酵素 ＦＡＤ　　　　　　グルタチオ７還元鍵ＦＭＮ　　　　
　チトクローム還元酵素ＦＭＮ　　　　　ＮＡＤＰＨ ＰＡＤ　　　　　　グルコースオキシダーゼＦＡＤ　　
　　　　　　リポアミドデヒドロゲナーゼへ　ム　　　
　ペルオキシダーゼ へ　ム　　　　チトクロームＣ 詳細については、スコツトら、「ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル−ケミストリー」第２３８巻第３９２８頁
（１９６３年）、ハースら、同誌、第１４３巻、第３４
１頁（１９４２都）、スタールラ「ビオヒン力・ビオフ
イジカ・アクタ−ｆ第１８５巻、！１ｌＧ３９頁（１９
６９年）、ノポダ、同誌、［１？５巻、１ｌｉ３６５貞
（１９６１゜ ９年）、ビセールら、同誌、第２０６巻、第２２４頁（
１９７０年）等参照０ （３）−２（３）のタイプの反応に用いられるアロスデ
リックエフエクターの例を、これに よシその活性が変調される酵素の例と 併せて示す０なお、（＋）は正のアロステリック効果、
（へ）は負のアロステリック効果を表わす０ ＣＴＰＨアスノくルアートドラン スカルバミラーゼ ムＴＰ（ホ） ｄＴＴＰ（ハ）　　　　　　デオ中シシチジレートアミ
ノヒドロラーゼ ｄＣＴＰ（ホ） ＡＴＰ（ハ）　　　　　　　　ホスホフルクト中ナーゼ
３’、５’−ＡＭＰ（ホ） ａＴＴＰＨデオキシチミジンキナーゼ ｄｃＤｌ’… ＣｒａｓａａＪ フェノ醸（ホ） Ｌ−スレオニン（ハ）　　　　ホモセリンデヒドロゲた
ゼム−ロイシン（→ Ｌ−メチオニン（ホ） ＡＤＰ（ト）　　　　　　　　　Ｌ−スレオニンデアミ
ナーゼミナーゼ ＧＴＰ（ハ） 艦元臘ＮムＤ（ハ） エストａゲン（ハ） チロキシン（ハ） ＡＤＰ（ト） ａイシン（ト） メチオニン（ト） ＡＴＰ（へ）　　　　　　　ホスポリラーゼｂ５’−Ａ
ＭＰ（ト） Ｌ−リジン（へ）　　　　　　　　リジンアスノ堪トキ
ナーゼなお、ｗ＃ｉ１１は、「ジャーナル拳オプ・モレ
キュラー・バイオロジー」第１２巻、８８頁（１９６５
年）に記載されている。

（４）−五　上記（４）のタイプの反応において用いら
れる試薬の組合せ例、すなわち、第一 の酵素４Ａにより、４８に下す化合物 の局所鹸皺か変化し、これに応じて第 二の＃巣父は信号生成懐鍼４ｃの相対 活性が変化する組合せ例： 一ゼ アラーゼ ラーゼ ーゼ なお、上ｍｌ儂減用の扉本のうち、ペルオΦシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン敏デ
ヒドロゲナーゼ、アセテルコリンエスデラーゼ、アルカ
リ７オス７アターゼ、グルコースオキシダーゼなどは、
本発明において特に好適に用いられる。

検出層には、反応層と同じ繊維質および／又は非繊維質
の多孔性媒体である、前−〇−物、不繊布、秋、あるい
は、前記のポリマーｅ過膜、セファデックス、アガロー
スなどを用いることができ、こｉしに工９、競争反応を
進してメーされた信号が受容される。

検出層には親７に往＾分子をバインダーとして用いるこ
とができる。

本発明に用いることができるバインダーとしては、ゼラ
チン、アガロース、アルギン酸ナトリウム、カルボキシ
メチルセルロース、メチルセルロースなどの大然観水性
晶分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、
ホリビニルビロリドン、ポリアクリル誠ナトリウム、ポ
リヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸を含む
一ポリマー、マレインｔｌｔを含むコポリマーなどの域
水注ｊ！ｒ属−分子などがある０検出層に吸水性のポリ
マーを含有させると、信号体を効果的に検出層に集める
ことができるため、感度ならびに定量性が改善されるの
で望ましい。さらに、構出ノーの上層あるいは下層ある
いは両層の１１４接層に吸水性のポリマーを含有させた
吸水層（補助層）を設けると、Ｌり効果的Ｋｆ１号体刃
体められ嘲°利である。これらの吸水性のポリマーとし
てＣよ、前述υ親水性の合成又扛天然＾分子を単独又は
これらを二極以上組合せて用いることができ、ゼラチン
とカルボキシル基を有するポリマー、例えば、ビニルピ
ロリド／−アクリル峻の共重会体との組合わせは、ｊ１
＠をきわめて容易にし、特に好ましい結果を与える。

この場合、支持体と光じゃへい層との闇には複轡の層が
存在するが、これらはすべて検出部材として０−きｔし
ている。

反応層の上筒たけ下には、必要に応じ、試薬ノーを設け
ることができる。

試秦層は、免役反応及び構出ｔｏ］′能にする七の他の
反応に必要な抗体を除く、生成された＜７４．刃体の光
学的測定を可能にする徨々の試薬を含有することができ
る。カえば、前出の＃素、＃素基質、ＮＡＤ、ＮＡＤ）
ｉ、（ＮＡＤＰ　、ＮＡＤＰＨ）などの前記補酵素、Ｐ
Ｈを一定にするための緩衝剤、界面活性剤、ゼラチン、
牛血溝。

アルブミンなどの安定化剤、発色用試薬などである＠さ
らに、蛋白質などの生体成分と結合した被検体成分をフ
リーにするためのブロッカ−試薬←例えば、Ｔ４におけ
るメルチレート、サルチル酸、８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルホン酸（ムＮＳ）など）ｔ−言有させてもよ
い０これらの試薬の一部は、必要により、試薬ノーより
上層に設けられた展開層及び／又Ｉ／ｉ展＠福助層に含
有させることもできる。

さらに、これら試薬の一部（例えは、ブロッカ−試薬）
は、フィルム中に含有させなめて、儀検体試料とあらか
じめ、混合した彼、フィルム上にスポットしてもよい。

反応層と検出部材との間には、必要により、タイミング
層を設けることが望ましい。これは、検体ｆ＆會反応層
に一定時間保持して反応させ、一定時間後に検出部材に
拡散させる。役割をもち、本層會存在させると、検出ｌ
ＩＡ度や定量性は更に着しく改善される０タイ建ング層
用の素材としては、前述の親水性の合成又は天然ポリマ
ーを、単独又はこれら全二種以上組合せて用いることが
できる。

本発明の分析要素は、上記の外さらに、その基本的准反
応層の慎能ｔ−補助するため、あるいはその構造ｔ″維
持るため、当分野に会知の各棟の機能補助層あるいは構
造補助層ｔ＆けることができる０それらの補助層として
は、例えば、試料＃＆液のｊｌｉ＃＠を補助する展開（
又は拡散）層、場合によっては必要とされる血球分離層
、接着層などである０これらの膚が設けられる１所は、
その機能によって容易に決定されるもので６９、例えは
、展開鳩又社血球分離層は反応層より上層、％Ｋ１１ｌ
上層に、多孔性媒体を用いて設けることができる０ ４識された被分析物がＩｇＧの如き分子量十蘇万の場合
、特に適しているのはアガロース、ポリアクリルアミド
、ポリアクリル試ナトリウム、アクリル波・ト宮むコポ
リマーであるＱ本発明の好ましい一悪様においては、反
応層と検出層と（１）間に光じゃへい層を設けることが
望ましく、元じゃへいノーは放射−吸収層又は反射層で
あることが望ましい０放射ＭＡ１Ａ収ノーは、例えば、
支持体側ρ為ら反射４＆元＃Ｉ１足する場合、励起１ｔ
−ａ収し、ｗＪ起尤の反射によるブランクｉｌＩを下げ
るのに有効である０ＪｉｉＪ起元と螢光の波長に応じて
好ｔしい系を直針することがｏＴ総であり、ま几、例え
ば、黄色コロイド−〇他、植々の染料、色素、該科など
を用いることができる・−万、放射−反射ノーは、支持
体−から反射分光吸収画定する場合に必要であり、Ｔｉ
ｅ、。

ＢａＳＯ４砿粉末等の白色粉末ｆ：哉水性＾分子のバイ
ンダー中に１〜２５ｆｆｉｎ＊で分値し１厚さ１μｍｍ
いし５０μｍ、好ましくは、２μｍから２０μｍの、範
西の層となしたものでめるＯ検出層には、検出可能な４
５号を効果的に集める必要がある。このため、木屑には
、上記材料のなかでも殊に吸水性の大きい材料、例えば
、ゼラチン、ポリビニルアルコールなどのれ水性の天然
あるいは合成篩分子が好ましく用いられ、さらに１紙、
ガラス繊維１紙、ミクロフィルターなども用いることが
できる。さらに本発明の好ましい態様においては、検出
に町ｈｔならしめる信号を本ｌ−に渠中的に果めるため
、これらの物質と彊い相互作用を示す物質、例えば、媒
染剤を添加することが望ましい。媒染剤としては、４−
ビニルピリジン、２メチル−１−ビニルイミダゾールの
４級塩及びＮ、Ｎ、Ｎ−）リメチ／ｌ／　−Ｎ−ビニル
ベンジルアンモニウムクロッイドなどの特開昭５５−２
４６９４記載のカチオン性ポリマーの外、写真業界で良
く知られているｇＩＬ多くのカナオン性ポリマー又は４
＃願昭５６−２８１５８に記載の如きアニオン性ポリマ
ーを用いることができ、さらに、これらのポリマーのラ
テックスは、−イ拡散性の向上や取扱いの検出層にはさ
らに１１１布性能、拡散性化合物の拡散性、反応性、保
存性などの諸性能の向上を目的として、界面活性剤、ｐ
Ｈ１１１１用試薬、微粉末、酸化防止剤、その他Ｍ機物
めるい社、無機物からなる４！ｒ槍添加剤を加えること
ができる。

本発明の多層分析材料の支持体は、光学的測定に対して
透明なものであり、必要に応じて水透過性を写している
ことが好ましい・光透過性水不透過性支持体としては、
ポリエチレンテレフタレート、セルロースエステル（セ
ルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セ
ルロースアセテートプロピオネート逢ど］、ポリカルボ
ネート、ポリスチレン、ポリメチルメタアクリレートな
どＯプラスチツタフィルム類やガラス板などで、厚さが
約５０μｍから約２ｍまでの公知の透明支持体を用いる
ことができるＯ 光し中へい層としては、信号体として遺ばれた壷元物質
のＪｉｌ！Ｉ起光を吸収する染料、或いは、信号体とし
て選ばれた物質と１１１−吸収波長の染料で染色した層
を用いることができ、これにより、他層の成分の干渉を
同様に取り除くことができる。

本発明の分析材料の支持体は、学的測定に対して透明な
ものであり、必要に応じて水透過性を有していることが
好ましい０光透過性水不透過性支持体としては、ポリエ
チレンテレフタレート、七ルＵ−スエステル（セルロー
スジアセテート、セルローストリアセテート、セルロー
スアセテートプロピオネートなど）、ポリカルボネート
、ポリスチレン、ポリメチルメタアクリレートなどのプ
ラスチツタフィルム類やガラス板などで、厚さが約５０
μｍから約２簡までの公知Ｏ：ｌｌ１ＩＪ１１支持体を
用いることができる◎支持体が疎水性で、検出層の親水
性バインダーとの接着が不十分の場合には支持体の表面
を親水化する処理（例、紫外線照射、電子ｍｌＩ射、火
焔処理、アルカリによる加水分解、プラズマ錫塩、グレ
ー放電処理等］、または支持体の表面に支持体と検出層
の親水性バインダーの両者に適当な大きさの接着力を有
する物質からなる下塗層を設けたり、支持体の表面に光
透過性！着しく減少させない範囲で微細な凹凸を形成さ
せる（ブラシかけ、電解エツチング等）等の公知の葡助
処理金はどこすことができる０本発明の分析要素の最上
層に水性液体試料展開層（以下単に展開層という）ｔ−
ｄけることができる。展開層は多層分析材料に点着した
検体試料を均一に展開せしめる効果がある０反応層が繊
物、不織布２よび祇の場合は１もちろん展開層はなくて
もよい０ 展開層には親水化処理した織物が用いられる０親水化処
理した織物としては、十分に洗浄水洗して脱脂してＩＩ
Ｌ煉した臓物、洗浄水洗脱脂した後に界面活性剤、湿潤
剤、蛾水性ポリマー、またはＴｉＯ，ｔたはＢａ８０．
！粉末を分散した親水性ポリマーを少量含浸させた織物
がある。

親水化処理し友織吻を展開層として用いる技術、織物、
層厚等については特開＃ｋＨ１ｅｇ−１６４３５６号に
詳細に記載されており、その記載に従りて本発町に適用
することができる。

なお、本発明によろ分析フィルムを用いて分析するＫｍ
つては、被検試料をスポットしたのち、通常、１分ない
し２４Ｍ＃関（′４１分析物、反応の湿式、層構成等に
より異なる）、好ましくは０〜６５℃、より好ましくｔ
ｉｔ　０〜４５℃の温度でインキュベーション全行なう
。

本発明の；０ましい実逓躍様を以下に示すＯｌ、本発明
の分析フィルム及び分析方法において： （１）　　検出信号が紫外又はａ７視部の光線の吸収で
ある。

（匂　検出信号が紫外又は可視部の光−の吸収に１９発
生した螢光である。

（萄　検出信号が紫外又は可視部の発光である＠（４）
　　砿分析物と特異的に結合しうる蛋白が繊・磁性及び
／又は非繊維性多孔質媒体に化学的Ｋｍ合することなく
含有されている状態である。

重層よりなる多層分析フィルムを用い、変調された信号
を分光光度法により画定する本発明の分析方法において
、眩光しやへい層が反射層よりなる。

３、少くとも、反広層、光しやへい層および検出層より
なる多層分析フィルムを用い、変調された信号を螢光光
度法により画定する本発明の分析方法において、眩光し
やへい層が励起光および／又は螢光の吸収層である。

チロキシンメチルエステル塩酸ｍ　２　ｇ　＠ム５ｔＲ
１のジメチルホルムアミド（Ｄ　ｆｖｉ　Ｆ　）にｂ解
し、５００μｌのトリエチルアミンを加えた０１０分後
に、Ｎ−メナルイミノニｖｔｉ＆０　、５５　ｇをテト
ロヒドロ７ラン（ＴＨＦ）５ＭＶＣ嬉解したものを加え
た。反応欧をロータリーエバポレーターでρ〜し、奴欣
を５０ｄのＴ）ＩＦに清解し、さらに酢酸エテル１５０
ｄを庫え、蚕とう攪拌し、酢酸エチル層を分堰し、蒸留
水で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。酢酸エチル層を
無水ｇｔ０ナトリツムで乾燥し、上清をローターリ−エ
バポレーターで濃縮した。残直に２０１７のＴＨＦを加
え、ｎ−ヘキサンを少量４口え、生じた沈でんを吸引Ｓ
ｉｔ、、白色結晶を得た０結晶を減圧デシケータ−で乾
燥し、２．３ｇの白色結晶を得九〇このときの収率は、
６９−であったＯ Ｔ、−ＭｇＭＩＤＡｌ（ＩＪを乾燥したジメチルホルム
アミド２００μ）に−解し、Ｎ−ヒドロキシコハク改イ
ミドｌ　、５１／ｆｌＪＯえ、水冷下に２．５７％ｌの
１−エテル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
メジイミド（）ｌ：ＣＤＩ）を加え、４℃で一夜反応さ
せる０ 他方、リンゴ［脱水系１！（ＭＤＨ，ブタ心筋ミトコン
ドリア山本、ベーリンガーマンノ〜イ五社製）２６岬を
、０．０６Ｍ炭酸ナトリウム緩１ｉｔ（ＰＨ９，２）５
ｍｊＫ溶解し、水冷下に上記活性エステル溶１［ｔｌＯ
ｓＪ／ｗｉｎで加えて−〈０添加後反応液を水冷下で２
時間攪拌し、セファデックスＧ−５０でゲル濾過を行な
い、ＭＤＨの分−を得たＯこの分画は、もとのＭＤ）ｉ
に比し五〇〜２０−の酵素活性を示したＯ実施例（１−
３）　　抗チーキシン抗体Ｏ作ｍ：実施例（１−２）と
同様の方法で活性化し九’１’４ＭＥＭＩＤＡ１００ダ
を、氷冷下、牛血清アルプミｙ（マイルス社製、フラク
シンＶ）１００ダを含む０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９
，０）２０−中に滴下し、反応させるｏｊＬ応液を同じ
緩衝液に対し二昼夜透析（！ｊＸ４回）して未反応物を
除去し、次に、蒸留水に対して二昼夜透析（２ｊＸ４回
）を行な一説塩した後、凍結乾燥した０乾燥ｌ１ｉｉａ
ｔ分約１３０４Ｆを得九〇赤外吸収スペクトルの一定に
より、牛血清アルプミ２１分子に対し、約２０９０ハプ
テンが導入された仁とがわかった。これを用いて常法に
よりウサギに免疫し、Ｔ　４抗血清を得九〇無色透明の
３酢酸セルロースフイルム（厚さ１３０μｍ）の上に、
下記に従って、多層分析要素音ｍ布また社ラミネートに
よってｇ４製した。

■　吸水層 セラ？ン５９１１水溶液、ビニルピロ’Ｊ）”、／ニア
クリル酸＝９＝１のコポリマーを、ゼラチン：コポリマ
ー−１０：１となるように混合し、塗布した。塗布後の
ゼラチン量は、２２．８ｇ／ｗ１丁コポリマーは２　、
８　ｇ／ｄで、そのときの膜厚性１９μｍであった■ ■　検出層 ゼラチン５−水溶液と媒染剤としてスチレンとＮ、Ｎ、
Ｎ−）リメテルーＮ−ビニルーベンジルアンモニウムク
ロリドのコポリマーをそれぞれ３．０２ｇ、／ｍ″とな
る！５Ｋｍ布した０そのときのａｍは５μｍであった。

■　光し中へい層 銀量が３．０ｇ／ｊとなるように塗布した。そのときの
膜厚は５μｍであった０ ■　免疫反応層 厚さ０　、３μｍのガラス繊維１紙（東洋Ｐ紙ＧＡ−１
００）に、実施例（１−３）に記載の方法で作製した抗
Ｔ、血清を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．５多含
有する０、０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ５，５
）で権釈したもの、およびβ−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド酸化城（β−ＮＡＤ）水溶液を混合し、
１ｃｘＢ方に裁断し九ガラス繊維Ｐ紙に含浸させ、凍結
乾燥した。凍結乾燥後後２１四方に裁断し九前記検出部
材ＯＲ面を水でぬらしたものの上に積層した◎ ■　試薬層 免疫反応層で用いたのと同じガラスｆ１紙に、実施例（
幻で調製したＴ、−ＭＤＨ，０，１Ｍリンゴ酸ナトリウ
ム水溶ｉ［ＢｓＡｔ０．５％含むグリシｙ塩ａｍ憾液（
ｐａｓ、２）ｅ混合したものを、ｌ傷四方に裁断したガ
ラス繊維１紙に７０μ！含浸させ、凍結乾燥した。

凍結乾燥後、前記免疫反応層の上に積層したＯ実施例（
１−３）で調製した多層分析フィルムにチロキシン（シ
グマ社）’ｋｌ〜２０μｇ／ｄｊとなるように０　、０
６Ｍリン酸緩僑生理食塩水二ＰＢ８（ｐＨ７，３Ｊに溶
解した標準溶液を１４０μ）調下し、３７℃で１５分イ
ンキュベート後、支持体側より螢光測定（励起波長３４
０ｕｍｓ螢光波長４６０ｎｍ）したところ、下記のよう
に定量的結果を得たＯ 実施例（１−６）　　繞加回収実験 テロ中シ一度７．６μｔＪｄｌのヒト血清に標準Ｔ　ａ
　ｔ　Ｏ−０５Ｍリン酸毅価生理食塩水：　ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７，３）に溶解し九ものを添加し、ｌｄｊあたりのＴ
４量かもとの血清に存在する量より、１．２．４．８μ
ｇ過剰に存在するような試料をｌｌ製した０この試料ｉ
ｏｏμｌをとり、０．１ＮＮａＯＨ１００Ｊｊｔ加え、
室温で１０分放置後、その１４０μノを実施例（３）で
調製した多層分析要素に１４０＃Ｊ滴下し、３７℃で１
５分インキエペートシ、実施例（４）と同様に螢ｉ糊定
した０回収５４を１ｒ算したところ、第２表に示す結果
が得られたＯなお、検量−は実り例（１−４）で作成し
たものを用いたＯ 第２表 実ＪｌｉＮ（２）　　比色法を用＾た多層分析フィルム
゛−−−−−−□と 実施例Ｃｈ−ａ）と同様の方法により下記のような多層
分析フィルムを作成した。

■　吸水層 実施例（１−４）に同じ ■　検出層 ５′ｓゼラチン水溶液と２，４−ジクロロインドフェノ
ール７エナジンハサルフエート（Ｐｈ／Ｉｓ　３１０　
％７Ｘ！液、３＃　”−（４＃　４’　−ビフェニレン
）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムク
ロリド）（Ｎ・０−ＴＢ）メタノール溶液をそれぞれ１
−当シゼラチン３．０２ｇ５　ＰＨ８０、ａ７ｇ％Ｎ＠
ｏ−’ＴＢＯ−８ｇと＆るようＫ１１ｋ布した０また媒
染剤としてスチレンとＮ　−Ｎ　＊　Ｎ　−）　９　ｆ
ｉ　＋　ルーＮ−ビニルーペンジルアンモニウムクｑリ
ドのコポリマーを３．０２ｇ／ｉとなるよう罠塗亜した
◇そのときの膜厚は６．９μｍであった。

上記のようにｌｌ＃ＩＩした多層分析フィルムを用いて
実施例（ｘ−ｓ）と同様に処理し、５０５１１ｍで反射
鏡度を支持体側よシ測定したところ、菌３表に示すとお
９定蓋的な給米を得九◇第　３　！！ ４１ＮｋＢＳ３−１０８９０ｉｏ実ｋＮ五〜６に従って
合成したｐ−アミノリドカインへミスクシンアミドを同
特許の実施例１５に従ってＧ−６−ＰＤ）Ｉと結合した
・ ’ＷＩＨＨ６３−１０８９０４０実ｍ例１０ＫｉＥつて
結合上行った０得られた結合−についてＩＲ法によりハ
プテン価を求めたととろ１２であったＯ これを用いて常法によシクサギに免疫して、抗リドカイ
ン血清を作成した・　・ 実施例Ｃｌ−４）と同様にして作成した〇■　吸水層 実施例（五−４）に１司じ ■　検出層 実施例（１−４１に同じ ■　元しやへい層 実施例（１−４）に同じ ■　免役反応層 厚さ１００μｎｔｏガラス城維Ｐ紙（東洋１紙ＧＡ−１
００）に、抗リドカイン血清を、ＢＳＡｏ　、５−を含
有する０、０５Ｍ）リスｔｉ酸緩衝献（Ｐｌ（５，０）
で稀釈したもの、および＃累基實であるグルコース−６
−りン鍍、補＃素０ＮＡＤの水溶液を混会し、ｌ偉四方
に裁断したＧＡ−１００に含浸させ、凍結乾燥した０凍
結乾燥後２ＣＲ四方に裁断した前記検出部材の表面をぬ
らした上に積層した０（２）　　試薬層 実施例（３−１３で作成したＧ−６−ＰＤＨで標識した
りドカインをＢ５Ａｔ０１５−含有する０゜０５Ｍトリ
ス塩ｆＲ緩爾液（ｐＨ７，９）に溶解し、ｌａａ四方ｒ
ｃ　＊　ｍしたＧＡ−１００に含浸させ凍結乾燥した・
凍結乾課後前記免疫反応層上に積層した。

塩酸リドカインを０．０５ＭＰＢＳ（ＰＨ７，３）に浴
解し、稀釈して１．２．４．６゜８、ｌＯμｇ〜となる
ようにした。

こ０２０μｌｔ１″とり、ＰＢＳを五〇〇〇μ！加えて
再稀釈し、その１４０μｌを実施例（３−３）で作成し
た多層分析フィルムの上に滴下した０滴下後ｌＯ分放置
し、支持体側より反射螢ｉ測定した。（励起波長３４０
ｎｍ、蛍光披長４６０ｎｍ）その結果＠４表に示すよう
な定量的結果を得た＠ 第　４　表 ■　反応Ｊ＃： 実施例＜１−３）に記載したと崗じ方法で、抗テ目キシ
ン血清および８−７ニリノナ７メレンスルホンａｌｔ−
含有する免疫反応層を調製し友。

■　吸水層： 実施狗（Ａ−４）Ｋ四じ ■　検出ｍ： １０””Ｍのアセチルコリンニスｆｔ−ゼおよび５Ｘｉ
Ｇ−’Ｍ０６，５’−ジテオビス（２−二トロ安息香赦
）を含む５％ゼラチン液Ｙｔ塗布乾燥して作−する０ １１ｉ、燥腿厚社ｌＯμｍであった。

無色透明のポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ
１４０μｍ）の上に、上記各層をＱ。

０．０の胆に積みかさね、塗布、又はラミネートして作
成した。

試薬ｌ：０．１−十血清アルブミンを含有する０、１Ｍ
リン＃に後−液（ｐ　Ｍｌ、０）中に１０　　Ｍの７セ
チルチオコリン を含有する試薬 試薬２−下記化置物Ｉ（特開昭５５−１０４８９６、災
施例ｖｏ記載により一蜀： １、ＯＸＩＯＭの濃度になるように、ｏ、ｉ牛血精アル
ブミン分含む０　、１　Ｍリン酸緩衝（ＰＨ７，０）に
溶解した試糸。

０．１１牛血清アルブミンを含有する上記り滅緩Ｗ棟中
に、稙ｋ　Ｏ＆Ｊｆ　（１Ｇ−”〜１０−’Ｍ　）チロ
キシンを貧有する血清と、試薬五及び試２を各１００μ
！混合し、このうち、１５０１を、冥施例（４−１）で
′ＥＪ４製した多“層分析イルムにスポットして、３７
℃で温置反応さる０スポツト後、５分及び２０分経通猿
におる反射一度を４１０ｎｍで画短し、☆細定値差を読
みとると、各チロキシン績度に対し、５表に示す結果を
得た◇ 第５表 ａｔ３％　０．５１００．４７３０．４５９０．４０５
０．３４２０．２８６射幽度浬＝（スポラ）２０分恢の
反射員度）−（スポット５分嵌の反射１１１１ＩＩ！Ｌ
）５表に示されるように、本ａＡ＃４の方法にょ９良好
な検量Ｉｎ１Ｉｌを作成する仁とができた・実施例５ １０’″″励アセチルチオコリン及び実施例（４−２）
の化合物１　ｔ　１Ｇ”’Ｍ金含有、Ｏ，１ｇｋ牛血清
アルブミンを含有する０、１Ｍリン酸緩衝叡（ＰＨ７，
０）ｔ１００＃ｊ／ｉｏ割合で含浸させたガラス繊維１
紙″ｆ：凍結乾課して試薬層をｗ４糾した・ こうして得られた試糸層を、犬−例＜４−１）に記載の
栴成ｔもつ多層分析フィルム上に積み重ねて、一体製分
析フイルムを作成し比〇線分析フィルムに、−身のＭｈ
ｏチロキシンを含有する血清ｌＯμｊと０．１９Ｇ牛血
清アルブミン含有０・’五Ｍ９ン績駁軛液（Ｐｊｉ７．
り五５０μ）との混合′＆ｔ−綱下して、３７℃で温直
反応させた０この一合にも、実ｍ？ＩＪ（４−２）と１
械の検量−が侍らｎた。

実施例６ 粒状榊遺体を含む反応層の一＊： バイオラツドラボラトリー製アガロースＡ−５０ｍ　　
Ｏ，５１１ｊ（ｗｅｔ　　ｖｏｌｕｍｅ）ｔ−、ホモプ
レンダーを用いてよくほぐしたガラス横＋ＩｉＦＭ　（
ＩＬ＃”Ａｆｒ、ｄ、ＧＡ−２００，５，５（＋ｌｌ中
）２枚分を含み、かつ、０．１％ＭＳＡＩ３０１１ｊ含
む０　、０５Ｍす／酸緩備１（ｐ）１７４）と鶴和した
０混相遺をヌツテエ上で吸引Ｐ遇し、７　ｃｍ　／の大
きさに張形し九のち乾燥する。久いで、乾ｔｌＩｋ物に
抗テロ今シン血清及び８−アニリノナフタレンスルホン
戚を含む０．９−食塙含有の上記ｔ＆−液を含浸させて
、該−両液を１５０μｊ／、ｊｔ＊−させ次のち、諏績
乾藏して反応層を作成した〇 このよりにして作成した反応層を実施４ｓ（４−１）で
作成した反応層とおきかえた外はＪ凍施例と全く同じ傅
成の多層分析フィルムを得九〇上記多ｊ−分析フイルム
を用いて、実施例（４−２）と同様ｋＣシーＣＴ　ａの
一定を４？仁なっ九〇得られたデータにもとづき、チロ
キシン纜度に対応する良好なｍｋｔｍｔ−作成すること
ができた。

実施ｉ＃１７ 実施例６において作製した多層分析フィルム上に、実施
例５で作製した試薬Ｍを積み重ね、分析フィルムを得た
。

上ｍ１分分析フィルム用いて実施例（４−２７と同様に
してＴ４０測定を行なった。得られたデータにもとづｉ
てチロキシン線区に対応する良好な慣駕巌を作成するこ
とができた〇実施例８ 実ｍ例（１−３）ｃＯ方沃でｒ「−シた抗ｎａ　盲ｆ　
ｓ’／（ルスーテロキシンｂＡ５１：、化アガロースを
用いて精−した０棺輔したシｉ：１［１ｍを、常法に工
９（「生化学夷ｋＩＬ−座」−白質の化学、籐２分冊、
第３２１頁、日本生化学会−１東京化宇同人刊ンＢｒＣ
Ｎで活性化したアガロースム−５ｏｎ（バイオラッドラ
ボラトリ−裟］に固足化し、均一な抗体−渡Ｏアガロー
スビーズーｉｆｍＥ製した。

このアガＵ−スビーズを−に１ｔｔｒ有させたガラス稙
巌１輛からなる反応層（仇チロ今シンＩ　ｇＧＩ＃１１
１１Ｌｓ　ｌ　Ｏモジ／ａｉ反応ノーンが得られた〇こ
のようにして憎られたｈＬ応層を用いる以外は実施例（
４−１）と同様にしてＴ４測定用多層分析フィルム′ｔ
−得た〇 この多層分析フィルムを用いて、実施例（４−２）に記
載の方法に従−１１％４の一定を行なった◎ 得られたデータｐｋら、同呆−例と同じく良好なチロキ
シン詞定用検−ｍＭ１−作成することができたＯ ＝２ 実施例８において作製した多層分析フィルム上に、実施
例５で作製した試薬層ｔ−槓−９−重ね、分析フィルム
を得九〇 上記分析フィルムを用いて実施例（４−２）と同様にし
てＴ４の測定を行なった０得られたデータにもとづいて
チロキシンａａＡｔ：に対応する良好な検量＋ｌｉｍを
作成することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明Ｏ−Ｓ本的な分析要素を示すｗｔ面図
である。 第２図から第６図までは、本発明の分析要素を多層構成
とした場合の好ましい１４１を示す断面図である。 ｌ：　反応層　　　　　４：　光しゃへい層２：　検出
層　　　　　５：　吸水層 ３：　試薬Ｈ７６６：　　支持体 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　水性媒体中の被分析物と４１Ｉ典的に結合す
   る蛋白質の一定量と、該蛋白質に対して反応性を有する
   、皺被分析物の、もしく紘、皺被分析物Ｏ類縁体の標識
   物質による標識体の一定量との共存下における刺争的反
   応による水性媒体中の被分析物の分析用分析フィルムに
   おいて、皺分析フィルムが、 １）多孔性媒体からｅｓ、 り　ｍｌ素反応によ〉生成される検出信号の量を、特異
   的蛋白質結合反応の結果として変調しうるような皺標識
   体と、該被分析物との双方に対して共通に、４１ＪＩ！
   的に結合しうる蛋白質を含有し、 ３）皺被分析物と、皺被分析物の類縁体と、もしく社、
   該標識体と、該蛋白質との複合体を実質ｊ含有しまい 反応層からなる仁とを特徴とする分析フづルム０ （２）標識物質が、酵素、基質、基質誘導体、補欠分子
   族、補酵素、アｐステリックイ７エクター及び酵素阻害
   剤からなる群から選ばれたものであることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載された分析フィルム。 （３）多孔性媒体が、繊維質多孔性媒体であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１１［Ｋ記載され九分析フィ
   ルム。 （４）繊維質多孔性媒体が、独立した粒子を含有せしめ
   九繊維質多孔性媒体であることを特徴とする特許請求の
   範囲第３項に記載された分析フィルム。 （５）水性媒体中の被分析物のもしくは該被分析物の類
   縁体の標識体を含有した試薬層を有し九ことを特徴とす
   る特許請求の範Ｉ！！第１項に記載された分析フィルム
   。 （６）被分析物の分析に用いられた酵素反応によシ生成
   される検出信号を受容する検出層を有し九ことを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載され九分析フィルム。 （７）反応層が検出層よりも小面積でかっ社み出さない
   ように重ね合わされていることを特徴とする特許請求の
   範囲第６項に記載された分析フィルム。 （８）　　検出層と反応層との間に光し中へい層を有し
   九ことを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載された
   分析フィルム。 １９）　　水性媒体中の被分析物と特異的に結合する蛋
   白質、または水性媒体中の被分析物のもしく紘該被分析
   物の類縁体の標識体を凍結乾燥することによシ反応層ま
   たは試薬層に含有させることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項または第５項に記載された分析フィルム〇・呻
   　の水性媒体中の被分析物を、■該被分析物と特異的に
   結合する蛋白質の一定量と、■鼓張白質に対して反応性
   を有する該被分析物の、もしくは、該被分析ｊ物′の類
   縁体の標識物質による標識体の一定量との共存下に１競
   争的に１）皺被分析物と該標識体との双方に対して共通
   に特異的に結合しうる蛋白質を含有し、２）＃被分析物
   と、該被分析物の類縁体と、屯しくけ、該標識体と、該
   蛋白質との複合体を実質上含有しない反応層からなる分
   析フィルムを用い、該分析フィルム中において、 （、）　　被分析物を （ｂ）　　該分析フィルム中の蛋白質と、（ｃ）（１）
   　　検出可能な信号が酵素反応により生成され、 （２）＃検出可能な信号量を特異的蛋白質結合反応の結
   果として変調しうる標識 体の共存下に競争的に反応せしめ、 ３）該競争的反応によシ生成する変調された信号を、フ
   ィルム面から直１Ｍ測定することを特徴とする水性媒体
   中の被分析物の分析方法。　　　　　−” ・盪　標識物質が、酵素、基質、基質誘導体、補欠分子
   族、補酵素、アロステリックィフェク゛ター及び酵素阻
   害剤からなる群から選ばれたものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１０項に記載された分析方法。 峙　多孔性媒体が、繊維質多孔性媒体であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１０項に記載された分析方法。 ―　繊維質多孔性媒体が、独立した粒子を含有せしめた
   繊維質多孔性媒体である仁とを特徴とする特許請求の範
   囲第１２項に記載された分析方法。 軸　水性媒体中の被分析物のもしく社、骸被分析物の類
   縁体の標識体を含有した試薬層を有し九ことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１０項に記載された分析方法〇 ■　被分析物の分析−に用いられた酵素反応により生成
   される検出信号を受容する検出層を有し九ことを特徴と
   する特許請求の範８１１／Ｅ１０項に記載された分析方
   法。 顧　反応層が検出層よりも小面積でかつ紘み出さないよ
   うに重ね合わされていることを特徴とする特許請求の範
   囲第１５項に記載された分析方法。 鰭　検出層と反応層との間に光し中へい層を有したこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載された分析
   方法。 軸　水性媒体中の被分析物と特異的に結合する蛋白質、
   または水性媒体中の被分析物もしく拡該黴分析物の類縁
   体と標識物との標識体を凍結乾燥することにより反応層
   または試薬層に含有させることを特徴とすゐ特許請求の
   範ｌ！第１０１［また紘第１４項に記載され九分析方法
   。