JPH11511128A - リポソームオリゴヌクレオチド組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 (Ａ)ヒトｒａｆをコードするｍＲＮＡを標的とし、ｒａｆ発現の阻害ができる、８から５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを(Ｂ)立体的安定化リポソームに包含させて含む、医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソームオリゴヌクレオチド組成物 本発明は、リポソームオリゴヌクレオチド組成物、その製造法およびその使用 に関する。 直接的または間接的に細胞成長および分化を制御する細胞性遺伝子の変化は、 癌の主要な原因と考えられている。オンコジーンと呼ばれる、ヒト癌形成に関係 する遺伝子の約３０のファミリーがある。このようなファミリーの一つのメンバ ーであるｒａｆ遺伝子ファミリーは、ヒト癌へ変異することが頻繁に発見されて いる。ｒａｆファミリーは、Ａ−、Ｂ−およびｃ−ｒａｆ(ｒａｆ−Ｉとも呼ば れる)と呼ばれる３つの非常に保存的な遺伝子を含む。ｒａｆファミリーの中で 最も特徴付されているｃ−ｒａｆは、マウスサルコーマウイルス36IIの形質転換 遺伝子ｖ−ｒａｆの細胞性相同物である。ｒａｆ遺伝子は、細胞増殖の調整をす るシグナル伝達過程において重要な制御的役割を担うと考えられているプロテイ ンキナーゼをコードする。アミノ末端における機能的陰性調節ドメイン無しのｒ ａｆキナーゼの発現を導く切断または他の修飾を起こすｒａｆ遺伝子の変異は、 培養哺乳類細胞の形質転換および癌形成に関係する形質を形成する変換をもたら す。調節ドメインを欠くまたは不完全であるｒａｆは、“活性化された”と呼ば れる。活性化(切断)されたｒａｆは、小細胞肺癌、原発性胃癌、腎癌、乳癌、喉 頭癌、癌傾向ファミリーのメンバー由来の皮膚線維芽細胞(リーフラウメニ症候 群)を含む種々のヒト癌およびヒト膠芽細胞腫細胞系に検出されている。正常(非 活性化)ｃ−ｒａｆタンパク質の異常な発現は、全肺癌細胞系の６０％が、正常 ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡおよびタンパク質の異常な高いレベルを発現すると報告さ れているため、異常な細胞増殖に役割を担うと考えられている。Ｒapp et al.， Ｔhe Ｏncogene Ｈandbook，Ｅ.Ｐ．Ｒeddy，Ａ.Ｍ．ＳkalkaおよびＴ．Ｃuurra n，編，Ｅlsevire Ｓcience Ｐublishers，Ｎew Ｙork，1988，pp．213-253。 オリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの疾病状態の処置における治療的分子 として使用されている。例えば、ウイルス、真菌および代謝性疾患に関連する遺 伝子の発現を調節できる同定されたアンチセンス、３本鎖および他のオリゴヌク レオチド組成物が存在している。異常ｒａｆ遺伝子発現を有効に阻害できる、即 ち活性化ｒａｆ生産物の発現を阻害するか、正常ｒａｆ生産物の異常高レベルの 発現を阻害する組成物の必要性がまだ存在する。 本発明により、異常遺伝子発現を阻害し、血流中での長時間の循環後も高い抗 過増殖活性を残す組成物が、ヒトｒａｆをコードするｍＲＮＡを標的とするｒａ ｆ発現を阻害できるオリゴヌクレオチドを立体的安定化リポソーム内に調製する ことにより製造できることが判明した。これらの組成物は、非標的器官における オリゴヌクレオチドの蓄積の減少および長期間処置の間の急性および慢性副作用 の減少を容易にする。 従って、本発明は、(Ａ)ヒトｒａｆをコードするｍＲＮＡを標的とし、ｒａｆ 発現の阻害ができる、８から５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを( Ｂ)立体的安定化リポソームに包含させて含む医薬組成物を提供する。 オリゴヌクレオチドおよびそれがハイブリダイズするその相補的核酸標的の間 の関係を、一般に“アンチセンス”と呼ぶ。オリゴヌクレオチドが選択核酸標的 を標的とするのは、多段階過程を含み得る。これは、例として、その発現が特定 の疾病状態に関与する細胞性遺伝子(または遺伝子から作られたｍＲＮＡ)または 感染作動体由来の異種核酸であり得る。本発明において、標的はｒａｆをコード する核酸である；言い換えると、ｒａｆ遺伝子またはｒａｆ遺伝子から発現され るｍＲＮＡである。標的過程は、また、所望の効果−異常ｒａｆ遺伝子発現阻害 −がもたらされるように、オリゴヌクレオチド相互作用が起こる核酸配列内の部 位または複数部位の決定も含む。一度標的部位または複数部位が同定されると、 オリゴヌクレオチドは、十分標的に相補的である、即ち、所望の阻害を得るため に十分にハイブリダイズするおよび十分特定化を有するように選択される。 異常ｒａｆ遺伝子発現の阻害は、当分野で慣用の方法、例えば、ｍＲＮＡ発現 のノーザンブロット検定またはタンパク質発現のウエスタンブロット検定で測定 できる。細胞増殖または癌細胞成育における効果もまた下記実施例に示すような 方法で測定できる。本発明の明細書中の“ハイブリダイゼーション”は、ワトソ ン・クリック塩基対形成としても既知の、通常の逆の核酸鎖の、または核酸鎖の 二つの領域の、相補的塩基間の水素結合形成を意味する。グアニンおよびシトシ ンは、それらの間に３つの水素結合形成をすることが知られている相補的塩基対 の例である。アデニンおよびチミンは、それらの間に二つの水素結合を形成する ことが知られている相補的塩基対の例である。“特異的ハイブリダイズ可能”お よび“相補的”は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチド間に安定で特 異的な結合が起こるような、十分な相補性を示すために使用する用語である。オ リゴヌクレオチドは特異的ハイブリダイズ可能であるために、標的核酸配列と１ ００％相補的である必要はないことは理解される。オリゴヌクレオチドは、オリ ゴヌクレオチドの標的への結合が、利用性の損失をもたらすように標的分子の正 常機能を妨害し、特異的結合が望まれる条件下で、即ち、インビボ検定または治 療的処置の場合、生理学的条件下で、またはインビトロ検定の場合、検定を行う 条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を避ける十分な相 補性が存在する時、特異的ハイブリダイズ可能である。 本発明の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは(Ａ)ｃ−ｒａｆまたは Ａ−ｒａｆを標的とする。本発明に関して、ｍＲＮＡが３文字遺伝子コードを使 用するタンパク質をコードする情報を有するコード領域だけでなく、当業者に、 ５'−非翻訳領域、３'−非翻訳領域、５'キャップ領域、イントロン領域および イントロン／エクソンとして既知の領域を形成するリボヌクレオチドまたはスプ ライス連結部リボヌクレオチドも含むことを当業者は理解する。従って、本発明 において、オリゴヌクレオチドは、これらの関連リボヌクレオチドおよびコード リボヌクレオチドを完全にまたは部分的に標的とするように、調製される。好ま しい態様において、オリゴヌクレオチドは、ヒトｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの翻訳開 始部位(ＡＵＧコドン)または５'−または３'非翻訳領域の配列を標的とする。妨 害すべきメッセンジャーＲＮＡの機能は、タンパク質翻訳領域へのＲＮＡの転座 、ＲＮＡからのタンパク質の実体的翻訳、ＲＮＡのスプライシングまたは成熟お よび恐らくＲＮＡが携わり得る独立触媒活性をも含む。ＲＮＡ機能のこのような 妨害による全体的な効果は、ｒａｆタンパク質発現の妨害をもたらす。 ヒトＡ−ｒａｆおよび特にヒトｃ−ｒａｆを標的とするオリゴヌクレオチドが 、 現在のところ好ましい；しかしながら、ｒａｆの他の形の発現を調節する組成物 もまた実用性を有すると考えられ、本発明に含まれる。 本発明の内容において、“オリゴヌクレオチド”なる用語は、天然に存在する 塩基、糖および糖間(骨格)結合から成るヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマ ーのオリゴマーまたはポリマーを意味する。“オリゴヌクレオチド”なる用語は また、機能的に同様な天然に存在しないモノマーまたはその一部を含むオリゴマ ーも含む。オリゴヌクレオチドのこのような修飾または置換は、例えば、促進さ れた細胞への取り込み、ヌクレアーゼ存在下での安定性増加等の特性のため、し ばしば天然形より好ましい。 ある好ましいオリゴヌクレオチド(Ａ)において、少なくとも一つのヌクレオチ ドが糖分子の２'位を修飾されている。ある好ましいオリゴヌクレオチド(Ａ)は キメラオリゴヌクレオチドである。本発明の内容における“キメラオリゴヌクレ オチド”または“キメラ”は、それぞれ少なくとも一つのヌクレオチドから形成 される２個またはそれ以上の化学的に異なる領域から成るオリゴヌクレオチドで ある。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、１個またはそれ以上の(例え ば、増加したヌクレアーゼ耐性、増加した細胞への取り込み、増加したＲＮＡ標 的への結合親和性のような)利点を付与する少なくとも一つの修飾ヌクレオチド の領域およびＲＮase Ｈ開裂の基質である領域を含む。一つの好ましい態様に おいて、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加するために修飾し た少なくとも一つの領域およびＲＮＡseの基質として働く領域を含む。オリゴヌ クレオチドのその標的(この場合、ｒａｆをコードする核酸)への親和性は、オリ ゴヌクレオチドと標的が分解する温度である、オリゴヌクレオチド／標的対のＴ ｍを測定することにより慣用的に測定する；分解は、分光光学的に検出する。Ｔ ｍが高い程、オリゴヌクレオチドの標的への親和性が高い。より好ましい態様に おいて、ｒａｆ ｍＲＮＡ結合親和性を増加するために修飾したオリゴヌクレオ チドの領域は、少なくとも一つの糖の２'位を修飾されたヌクレオチド、特に２' −アルコキシ、２'−アルコキシアルコキシまたは２'−フルオロ−修飾ヌクレオ チドを含む。このような修飾は、慣用的にオリゴヌクレオチドに含まれ、これら のオリゴヌクレオチドは、標的に対して２'−デオキシオリゴヌクレオチドより 高いＴｍ(即ち、高い標的結合親和性)を有する。このような増加した親和性の効 果は、ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を非常に促進す る。ＲＮＡse Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを開裂する細胞性エンドヌ クレアーゼである；この酵素の活性化は、従って、ＲＮＡ開裂をもたらし、それ 故アンチセンス阻害の効果を非常に促進できる。ＲＮＡ標的の開裂は、慣用的に ゲル電気泳動により証明できる。他の好ましい態様において、キメラオリゴヌク レオチドはまたヌクレアーゼ耐性を促進するために修飾される。細胞は、核酸を 分解できる種々のエキソ−およびエンド−ヌクレアーゼを含む。多くのヌクレオ チドおよびヌクレオシド修飾は、オリゴヌクレオチドを、天然オリゴデオキシヌ クレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対して耐性とすることが示されている。ヌ クレアーゼ耐性は、慣用的に、オリゴヌクレオチドを細胞抽出物または単離ヌク レアーゼ溶液とインキュベートし、程度を測定するか、ヌクレアーゼ溶液を単離 し、通常、ゲル電気泳動によりその時間に残った無傷オリゴヌクレオチドの程度 を測定することにより測定する。そのヌクレアーゼ耐性を促進するために修飾さ れたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも長時間無傷で残る 。種々のオリゴヌクレオチド修飾が、ヌクレアーゼ耐性を促進するか付与するこ とが証明されている。少なくとも一つのホスホロチオエート修飾を有するオリゴ ヌクレオチドが、現在より好ましい。ある場合、標的結合親和性を促進するオリ ゴヌクレオチド修飾が、また独立して、ヌクレオチド耐性も促進できる。 ある好ましいオリゴヌクレオチドの具体的例は、ホスホロチオエートホスホト リエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合 または短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環糖間(“骨格”)結合を含み得る。最も好ま しいのは、ホスホロチオエートおよびＣＨ₂−ＮＨ−ＯＣＨ₂、ＣＨ₂Ｎ(ＣＨ₃)− Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ(ＣＨ₃)−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ(ＣＨ₃)−Ｎ(ＣＨ₃)−Ｃ Ｈ₂およびＯ−Ｎ(ＣＨ₃)−ＣＨ₂−ＣＨ₂骨格(ホスホジエステルがＯ−Ｐ−Ｏ− ＣＨ₂である時)を有するものである。好ましいのは、また、例えば、米国特許第 ５,０３４,５０６号に記載のようなモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオ チドである。他の好ましい態様において、タンパク質−核酸またはペプチド−核 酸(ＰＮＡ)骨格のような、オリゴヌクレオチドのホスホジエスエル骨格を、Ｐ． Ｅ．Ｎielsen，Ｍ．Ｅgholm，Ｒ.Ｈ．Ｂerg，Ｏ．Ｂuchardt，Ｓcience 1991，2 54，1497に記載のようなポリアミド骨格に置換し得、塩基は直接または間接的に ポリアミド骨格のアザ窒素原子に結合する。他の好ましいオリゴヌクレオチドは 、以下のものの一つを２'位に含むアルキルおよびハロゲン置換糖分子を含み得 る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ₂ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃ 、ＯＣＨ₂Ｏ(ＣＨ₂)_nＣＨ₃、Ｏ(ＣＨ₂)_nＮＨ₂またはＯ(ＣＨ₂)_nＣＨ₃(式中、ｎ は１から約１０)；Ｃ₁からＣ₁₀低級アルキル、置換低級アルキル、アリカリルま たはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ₃；ＯＣＦ₃；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−ア ルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ₃；ＳＯ₂ＣＨ₃；ＯＮＯ₂； ＮＯ₂；Ｎ₃；ＮＨ₂；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノ アルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ脱離基；コレステリ ル基；結合体；レポーター基；インターカレーター(intercalator)；オリゴヌク レオチドの薬物動態特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬物力学特 性を改善する基および他の類似の特性を有する基。オリゴヌクレオチドはまたシ クロブチルのような糖模倣体を、ペントフラノシル基の代わりに有し得る。他の 好ましい態様は、少なくとも一つの修飾塩基形またはイノシンのような“自在塩 基”を含み得る。 本発明のある特に好ましい態様において、オリゴヌクレオチド(Ａ)の全てのヌ クレオチドは２'−デオキシヌクレオチドであり、全ての骨格結合がホスホロチ オエート結合である。 ある別の特に好ましい態様において、オリゴヌクレオチド(Ａ)は、２'−デオ キシヌクレオチドを有する１個またはそれ以上の領域および１個またはそれ以上 の２'−アルコキシアルコキシヌクレオチド、特に２'−メトキシエトキシヌクレ オチドを有するキメラオリゴヌクレオチドであり、１個またはそれ以上の２'− デオキシヌクレオチド領域は好ましくはホスホロチオエート骨格結合を有し、１ 個またはそれ以上の２'−アルコキシアルコキシヌクレオチド領域は好ましくは ホスホジエステル骨格結合を有する。これらのキメラオリゴヌクレオチドは、好 ましくは、二つの２'−アルコキシアルコキシヌクレオチドの領域の間に２'−デ オキシヌクレオチドの領域を含む。 本発明の組成物の成分(Ａ)として使用するオリゴヌクレオチドは、簡便にはお よび慣用的には、固相合成のような既知の技術を使用して製造する。このような 合成の装置は、Ａpplied Ｂiosystemsを含む種々の源から商品として入手可能で ある。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチド を製造するためのこのような方法の使用は既知である。蛍光標識、ビオニニル化 またはコレステロール修飾オリゴヌクレオチドのような他の修飾オリゴヌレオチ ドを製造するための、類似の技術および商品として入手可能な、ビオチン、フル オレセイン、アクリジンまたはソラレン修飾アミデイトのような修飾アミデイト および制御ポアガラス(ＣＰＧ)生産物および／またはＣＰＧ(Ｇlen Ｒesearch， Ｓterling ＶＡ)の使用も既知である。 特に好ましいオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列がＷＯ９５／３２ ９８７に公開されており、下記のものを含む。 ＯＮ１からＯＮ１０は、Ｇenbank ｃ−ｒａｆ配列ＨＵＭＲＡＦＲ(Ｇenbankリ スト×０３４８４)を使用して設計したホスホロチオエート骨格を有するオリゴ デオキシヌクレオチドであり、合成し、Ｔ２４膀胱癌細胞におけるｃ−ｒａｆｍ ＲＮＡ発現についてノーザンブロット検定を使用して試験した。 他の特に具体的に好ましいオリゴヌクレオチドは： を含む。 ＯＮ１１、ＯＮ１２およびＯＮ１３は、ホスホロチオエート骨格を含み、糖分 子の２'位をメトキシ基により均一に置換されているように合成したオリゴヌク レオチドである。ＯＮ１４は、ホスホジエステル骨格を含み、糖分子の２'位を プロポキシ基により均一に置換されているように合成した。ＯＮ１５は、ホスホ ロチオエート骨格を有し、糖分子の２'位をフッ素で均一に置換されているよう に合成した。 特に具体的に好ましいキメラオリゴヌクレオチドは： を含む。 ＯＮ１６からＯＮ２５は、均一ホスホロチエート骨格を有するキメラオリゴヌ クレオチドであり、下線で示すヌクレオチドは、糖分子の２'位をメトキシで置 換されている。 他の具体的に特に好ましいキメラオリゴヌクレオチドは： を含む。 ＯＮ２６、ＯＮ２７およびＯＮ２８は、均一ホスホロチオエート骨格を有する キメラオリゴヌクレオチドであり、下線で示すヌクレオチドは糖分子の２'位を 、ＯＮ２６ではプロポキシにより、およびＯＮ２７およびＯＮ２８ではフッ素に より置換されている。 具体的に好ましい、２'修飾およびキメラホスホロチオエート／ホスホジエス テル骨格を有するキメラオリゴヌクレオチドは： を含む。 ＯＮ２９およびＯＮ３０は、２'−プロポキシ置換基およびホスホジエステル 骨格の両方を有する下線で示す領域を有する。ＯＮ３１は、２'−メトキシエト キシ置換基およびホスホジエステル骨格を有する下線で示す領域を有する。 Ａ−ｒａｆ ｍＲＮＡを標的とし、Ａ−ｒａｆ発現を阻害するあるオリゴヌク レオチドが、細胞過増殖の阻害に有用であると考えられている。 Ｇenebank Ａ−ｒａｆ配列ＨＵＭＡＲＡＦＩＲ(Ｇenebankリスト×０４７９０ )を使用して設計および合成し、そのヌクレオチド配列はＷＯ９５／３２９８７ で 公開されているこの種類の具体的ホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチ ドは、以下のものを含む： 本発明の組成物において、オリゴヌクレオチド(Ａ)は、立体的安定化リポソー ム(Ｂ)に包含されている。立体的安定化リポソームの例は、脂質部分が糖脂質で あるもの、特にガングリオシドＧＭ、飽和ホスファチジルイノシトールまたはＷ Ｏ８８／０４９２４に記載のようなガラクトセレブロシドスルフェートエステル ；ＷＯ９１／０５５４５またはＵＳ５２２５２１２に記載のような脂質の部分が 親油性ポリマーで誘導体化されているもの；およびＷＯ９４／２００７３に記載 のような疎油性分子および極性頭基を有する小胞形成脂質および脂質ポリマー結 合体である。 本発明の好ましい態様において、リポソーム(Ｂ)は、少なくとも一つの非誘導 体化小胞形成脂質および、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸のようなヒドロ キシおよび／またはカルボキシル基を含むポリマーまたは好ましくはポリエチレ ングリコールであり得る親水性ポリマーで誘導体化された少なくとも一つの小胞 形成脂質を含む。より好ましくは親水性ポリマーは、１５００から２５００ダル トン、特に１８００から２２００ダルトンのような１０００から５０００ダルト ンの分子量を有するポリエチレングリコールである。親水性ポリマーは、好まし くは、リン脂質の極性頭基、特にアミノ頭基を有するリン脂質に由来し、即ち、 誘導体化脂質は、好ましくはアミノ基、特に、ジラウロイルホスファチジルエタ ノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイル ホスファチジルエタノールアミン、または特にジステアロイルホスファチジルエ タノールアミンのようなホスファチジルエタノールアミンを有するリン脂質であ る。 アミノ含有脂質を、ヒドロキシル−および／またはカルボキシル−含有親水性 ポリマーで誘導体化する方法は、当業者には明白である。幾つかのこのような方 法は、ＷＯ９１／０５５４５およびＵＳ５２２５２１２に記載されている；アミ ノ基を有するリン脂質は、これらの方法により親水性ポリマーで誘導体化し得る 。好ましくは、アミノ基を有するリン脂質を、ポリマーがカルバメート結合を介 してリン脂質に結合するように、ヒドロキシル含有親水性ポリマーで誘導体化す る；これは、ＷＯ９１／０５５４５またはＵＳ５２２５２１２に記載のように、 ポリマーのヒドロキシル基(他のヒドロキシル基は、その反応性の観点から必要 であれば、例えば、エーテル化によりキャップする)を、ジイミダゾールと反応 させ、活性化イミダゾール末端ポリマーを得、次いでそれをアミノ含有リン脂質 と反応させ、リン脂質をカルバメート基を介して親水性ポリマーと結合させるこ とにより達成される。本発明の特に好ましい態様において、誘導体化脂質は、カ ルバメート基を介して、アルコキシ基、特にメトキシまたはエトキシ基により一 端をキャップされたポリエチレングリコールに結合したアミノ含有リン脂質、特 にホスファチジルエタノールアミンである。このような誘導体化脂質は、商品と して入手可能である。 誘導体化脂質は、一般に、リポソームの全脂質含量に対して少ないモル量、好 ましくは全脂質含量の１から２０モル％で存在するが、誘導体化脂質が高分子量 である時、それより少ない量、例えば０.１モル％が適当であり得る。リポソー ムの脂質成分の主要な部分は、一般に、慣用のリポソームで使用されているよう な１個またはそれ以上の非誘導体化小胞形成脂質から成る。このような脂質は、 例えば、通常アシル基に、二つの炭化水素鎖を有し、極性頭基を有する、リン脂 質、例えば、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジ ルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジ ルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジル コリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンのようなホス ファチジルコリン、前記のようなホスファチジルエタノールアミン、およびジミ リストイルホスファチジン酸およびジパルミトイルホスファチジン酸のようなホ スファチジン酸を含む脂質を含む。他の慣用の使用する脂質は、ステロール、特 にコレステロールおよび前記のような糖脂質を含む。好ましくは、非誘導体化脂 質が、リン脂質、特にホスファチジルコリンとステロール、特にコレステロール の混合物を含む。 上記の好ましい態様において、立体安定化リポソーム(Ｂ)は、好ましくは４− １０モル％の誘導体化脂質、４０−８０モル％の非誘導体化リン脂質および２０ −５０モル％のステロールを含む。特に好ましいリポソーム(Ｂ)において、誘導 体化脂質：非誘導体化脂質：ステロールのモル比は１：１０：５である。 本発明の他の好ましい態様において、リポソーム(Ｂ)は(ｉ)糖脂質を、(ii)小 胞形成リン脂質またはスフィンゴ脂質またはそれらの混合物および所望により(i ii)ステロールおよび／またはアシルグリセロール脂質と共に含む。糖脂質は、 好ましくは陰性電荷糖脂質、特にガングリオシドＧＭ₁(モノシアロガングリオシ ド)または水素化ホスファチジルイノシトールである。小胞形成リン脂質は、前 記のリン脂質の１個またはそれ以上、好ましくはホスファチジルコリン、ホスフ ァチジルエタノールアミンまたはそれらの混合物であり得る。特に好ましいリン 脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジオレオイルホスファチジ ルエタノールアミンである。スフィンゴ脂質は好ましくはスフィンゴミエリンで あり、好ましくはリン脂質と共に使用する。ステロールは、例えば、エルゴステ ロールまたは好ましくはコレステロールであり得る。アシルグリセロール脂質は 、それぞれ少なくとも１２炭素原子を有する二つの脂肪酸アシル基、例えばラウ ロイル、ミリストイル、パルミトイルまたはオレオイル基および式Ｒ¹ＣＯ−(式 中、Ｒ¹は、式Ｒ¹ＣＯＯＨの、−ＣＯＯＨ基を除去した後の１０までの炭素原子 を有 する残基)、または好ましくは式−ＣＯＲ²ＣＯＯＨ(式中、Ｒ²は、式ＨＯＯＣ− Ｒ²−ＣＯＯＨのジカルボン酸、特にコハク酸の両方の−ＣＯＯＨ基除去後の１ ０までの炭素原子、好ましくは１から４の炭素原子を有する残基)の一つのアシ ル基を含むグリセロールのエステルであり得る。特に好ましいアシルグリセロー ルは、１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−サクシニルグリセロールである。 この本発明の第２の好ましい態様において、リポソームは好ましくは(ｉ)陰性 電荷糖脂質を、(ii)小胞形成リン脂質および／またはスフィンゴ脂質および(iii )ステロールまたはアシルグリセロール脂質、特に(ｉ)ガングリオシドＧＭ₁また は水素化ホスファチジルイノシトールを、(ii)ジステアロイルホスファチジルコ リンまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンまたはそれらとスフィ ンゴミエリンの混合物および(iii)コレステロールまたは１,２−ジパルミトイル −ｓｎ−３−サクシニルグリセロールを含む。 リポソームは、２から２０モル％の糖脂質(ｉ)および８０から９８モル％の(i i)リン脂質、スフィンゴ脂質またはそれらの混合物を含み得る。好ましい態様に おいて、リポソームがまたステロールまたはアシルグリセロールを含む場合、そ れらは２から２０モル％、好ましくは４から１０モル％の糖脂質、４０から８０ モル％、好ましくは６０から８０モル％のリン脂質、スフィンゴ脂質またはそれ らの混合物および１０から５０モル％、好ましくは２０から４０モル％のステロ ールまたは５から４０モル％、好ましくは１０から３０モル％のアシルグリセロ ールを含む。 特に具体的に好ましいリポソーム(Ｂ)は、下記の実施例に記載するものである 。 本発明のオリゴヌクレオチド含有リポソームは、医薬含有リポソームの製造に 関して既知の方法を使用して製造できる。例えば、一つの方法において、脂質組 成物をアルコール、エーテル、ハロゲン化炭化水素またはそれらの混合物のよう な有機溶媒に溶解し、溶媒を得られる溶液から、例えば、ロータリーエバポレー ターまたは凍結乾燥により除去し、得られる脂質フィルムを、リン酸緩衝食塩水 または、その媒体がまたオリゴヌクレオチド(Ａ)を含む糖、例えばラクトースの 水性溶液のような水性媒体に分散させることにより水和し、多層小胞(ＭＬＶ)の 形のリポソームの水性懸濁液を得る。水性リポソーム懸濁液を、既知の方法を使 用して、例えば超音波処理による処理をして、または選択ポアサイズを有する１ 個またはそれ以上の膜、例えばポリカーボネート膜を通して押出して、リポソー ムサイズを減少させ、例えば、小単層小胞(ＳＵＶ)を得る。本発明のリポソーム は、好ましくは５００nm以下、より好ましくは５０から２００nm、特に８０から １２０nmの平均粒子サイズを有する。 リポソーム安定性と一致して、オリゴヌクレオチド対脂質の重量比が出来るだ け高いことが一般に望まれる。この重量比の最大値は脂質成分の性質および組成 に依存して変化し得るが、一般に、最大値は約１：２０であるようである。１： ４０から１：４００の間の比を使用して良好な結果が得られる。 本発明は、ヒトｒａｆを発現する組織または細胞と、前記の本発明の組成物を 接触させることによるヒトｒａｆ発現の阻害法を含む。本発明はまた、前記の本 発明の組成物を、このような処置を必要とする哺乳類、特にヒトに投与すること を含む、哺乳類癌の処置法も含む。 本発明の組成物は、肺送達、または好ましくは非経口、例えば、静脈内、皮下 、腹腔内または筋肉内により投与し得る。用量は、投与の方法および処置すべき 状態の重症度および反応性に原則として依存する。個々の用量および投与レジメ は、病気の具体的な例の個々の判断により最良に決定できる。本組成物で処置し 得る疾病は、肺癌、胃癌、腎臓癌、乳癌、喉頭癌、膵臓癌、大直腸癌および悪性 黒色腫のような哺乳類癌、特に、ヒト癌を含む。 本発明を、下記実施例により説明する。実施例１ ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを、分子量２０００のメトキ シキャップポリエチレングリコールに、カルバメート基を介して結合させた誘導 体化脂質(Ｇenzymeから入手可能なＤＳＰＥ−ＭＰＥＧ２０００)、ジステアロイ ルホスファチジルコリン(Ｓigma Ｃhemicalから入手可能)およびコレステロール を、クロロホルム中にモル比１：１０：５で溶解させる。溶媒をロータリーエバ ポレーターで除去し、脂質フィルムを得る。このフィルム(２５０mg)を、２５m Ｍ ４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−エタンスルホン酸(ＨＥＰＥ Ｓ)でｐＨ７.４に緩衝化し、前記のオリゴヌクレオチドＯＮ３(１.２mg)を含む ハンクス平衡化塩溶液(２ml)で水和する。得られるＭＬＶを、１０回液体窒素− 水凍結−融解サイクルに付し、次いで２分、超音波処理(波長６μm)し、平均直 径８０から１００nmを有する小単層小胞(ＳＵＶ)を得る。得られるリポソームを 、Ｓephadex G-150カラムおよび２５mＭ ホウ酸ナトリウム溶出緩衝液を使用し たサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して非包含オリゴヌクレオチドを除 去する。 ヒト肺アデノカルシノーマＡ５４９細胞を、ヌードマウスの背面の外皮に皮下 的に移植する。リン酸緩衝食塩水中のオリゴヌクレオチド含有リポソームの懸濁 液を、０.６０mg／kgの投与量で、一日一回、癌細胞接種後１０日に開始して静 脈内注射により投与する。癌細胞接種後１０、１４、１７、２１、２４および２ ７日に、癌サイズを測定し、癌容量を計算する。上記試験をオリゴヌクレオチド 含有リポソームで、０.６０mg／kgの投与量でａ）二日毎、ｂ）３日毎およびｃ ）一週間一回投与して、癌細胞接種１０日目に開始して繰り返す。上記試験法を 、ＯＮ３含有リポソームの代わりに、リン酸緩衝食塩水中のオリゴヌクレオチド ＯＮ３の溶液で繰り返す。試験結果は下記の通りである： 毎日の投与 二日毎の投与 ３日毎の投与 １週間一回の投与 実施例２ 包含オリゴヌクレオチド含有リポソームを、実施例１記載の方法を使用するが 、その実施例で使用した脂質混合物を、モル比１：１０：５の水素化ホスファチ ジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびコレステロール に代えて製造する。 マウスマクロファージ様Ｊ７７４細胞によるオリゴヌクレオチドＯＮ３の取り 込みを阻害するリポソームの能力を、Ｎamba et al.，1992，Ｌife Ｓciences， 50，1773-1779記載の方法を使用して、僅かに変えて試験する。３６０分のイン キュベーション時間後、Ｊ７７４細胞によるＯＮ３の取り込みは０.５８３％で ある。リポソームを、リン酸緩衝食塩水中のＯＣＮ３の溶液に代えて方法を繰り 返した時、Ｊ７７４細胞によるＯＮ３の取り込みは８.７１４％である。実施例３ 包含ＯＮ３含有リポソームを、実施例１記載の方法を使用するが、その実施例 で使用した脂質混合物を、モル比１：１０：５のカングリオシドＧＭ₁(Ｓigma Ｃhemicals販売)、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびコレステロール の混合物に代え、脂質の溶媒としてクロロホルム単独の代わりにメタノール：ク ロロホルムの２：１(容量)混合物を使用して製造した。リポソームを実施例２の ように試験した：３６０分のインキュベーション時間後、Ｊ７７４細胞によるＯ Ｎ３取り込みは０.４２２％である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ニックリン，ポール・レスリー イギリス、ビーエヌ５・９アールイー、ウ エスト・サセックス、ヘンフィールド、ウ エスト・エンド・レイン、タングルウッド (72)発明者 ハミルトン，カレン・オフィーリア アメリカ合衆国66046カンザス州ローレン ス、アラバマ・ナンバー・アイシー2406番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(Ａ)ヒトｒａｆをコードするｍＲＮＡを標的とし、ｒａｆ発現の阻害がで きる、８から５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを(Ｂ)立体的安定化 リポソームに包含させて含む医薬組成物。 ２．オリゴヌクレオチド(Ａ)の少なくとも一つのヌクレオチドが糖分子の２' 位を修飾されている、請求項１記載の組成物。 ３．オリゴヌクレオチド(Ａ)が、標的親和性を増加するために修飾した少なく とも一つのヌクレオチドを有する第１の領域およびＲＮＡse Ｈの基質である第 ２の領域を有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の組成物。 ４．標的親和性を増加するために修飾したヌクレオチドが、糖の２'位を修飾 されている、請求項３記載の組成物。 ５．修飾ヌクレオチドが、２'位にアルコキシ、アルコキシアルコキシまたは フッ素置換基を有する、請求項２または４記載の組成物。 ６．オリゴヌクレオチド(Ａ)がキメラオリゴヌクレオチドであり、ＲＮＡse Ｈの基質である領域に少なくとも一つの２'−デオキシヌクレオチドを含む、請 求項３、４または５のいずれかに記載の組成物。 ７．オリゴヌクレオチド(Ａ)が少なくとも一つのホスホロチオエート結合を有 する、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。 ８．オリゴヌクレオチド(Ａ)の全てのヌクレオチドが２'−デオキシヌクレオ チドであり、全ての骨格結合がホスホロチオエート結合である、請求項１記載の 組成物。 ９．オリゴヌクレオチドが(Ａ)２'−デオキシヌクレオチドを有する１個また はそれ以上の領域および２'−アルコキシアルコキシヌクレオチドを有する１個 またはそれ以上の領域を有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項１から ７のいずれかに記載の組成物。 １０．２'−アルコキシアルコキシヌクレオチドが２'−メトキシエトキシヌク レオチドである、請求項９記載の組成物。 １１．１個またはそれ以上の２'−デオキシヌクレオチド領域がホスホロチオ エート骨格結合を有し、１個またはそれ以上の２'−アルコキシアルコキシヌク レオチド領域がホスホジエステル骨格結合を有する、請求項９または１０のいず れかに記載の組成物。 １２．オリゴヌクレオチド(Ａ)が、二つの２'−アルコキシアルコキシヌクレ オチドの領域の間に２'−デオキシヌクレオチドの領域を含む、請求項９から１ １のいずれかに記載の組成物。 １３．オリゴヌクレオチド(Ａ)がヒトＡ−ｒａｆをコードするｍＲＮＡを標的 とする、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。 １４．オリゴヌクレオチド(Ａ)がヒトｃ−ｒａｆをコードするｍＲＮＡを標的 とする、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。 １５．オリゴヌクレオチド(Ａ)がヒトｃ−ｒａｆをコードするｍＲＮＡの翻訳 開始部位、３'−非翻訳領域または５'−非翻訳領域の配列を標的とする、請求項 １４記載の組成物。 １６．オリゴヌクレオチド(Ａ)がヌクレオチド配列 を有する、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。 １７．リポソーム(Ｂ)が少なくとも一つの非誘導体化小胞形成脂質および親水 性ポリマーで誘導体化された少なくとも一つの小胞形成脂質を含む、請求項１か ら１６のいずれかに記載の組成物。 １８．親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１７記載の組 成物。 １９．誘導体化脂質がアミノ基を有するリン脂質である、請求項１７または１ ８記載の組成物。 ２０．親水性ポリマーがリン脂質にカルバメート結合を介して結合している、 請求項１９記載の組成物。 ２１．アミノ含有リン脂質がホスファチジルエタノールアミンである、請求項 １９または２０記載の組成物。 ２２．アミノ含有リン脂質がジステロイルホスファチジルエタノールアミンで ある、請求項２１記載の組成物。 ２３．誘導体化脂質が、リポソームの全脂質含量の１−２０モル％である、請 求項１７から２２のいずれかに記載の組成物。 ２４．非誘導体化脂質が２つの炭化水素鎖および極性頭基および／またはステ ロールを有する脂質である、請求項１７から２３のいずれかに記載の組成物。 ２５．２つの炭化水素鎖および極性頭基を有する脂質がホスファチジルコリン である、請求項２４記載の組成物。 ２６．ホスファチジルコリンがジステアロイルホスファチジルコリンである、 請求項２５記載の組成物。 ２７．ステロールがコレステロールである、請求項２４から２６のいずれかに 記載の組成物。 ２８．リポソームが４−１０モル％の誘導体化脂質、４０−８０モル％の非誘 導体化リン脂質および２０−５０モル％のステロールを含む、請求項１７から２ ７のいずれかに記載の組成物。 ２９．誘導体化脂質：非誘導体化脂質：ステロールのモル比が１：１０：５で ある、請求項２８記載の組成物。 ３０．リポソーム(Ｂ)が、(ｉ)糖脂質を、(ii)小胞形成リン脂質またはスフィ ンゴ脂質またはそれらの混合物および所望により(iii)ステロールおよび／また はアシルグリセロール脂質と共に含むものである、請求項１から１６のいずれか に記載の組成物。 ３１．糖脂質が陰性電荷糖脂質である、請求項３０記載の組成物。 ３２．リポソームが、(ｉ)陰性電荷糖脂質を、(ii)小胞形成リン脂質および／ またはスフィンゴ脂質および(iii)ステロールまたはアシルグリセロール脂質と 共に含む、請求項３1記載の組成物。 ３３．糖脂質がガングリオシドＧＭ₁または水素化ホスファチジルイノシトー ルである、請求３１または３２記載の組成物。 ３４．小胞形成リン脂質がホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノ ールアミンである、請求項３０から３３のいずれかに記載の組成物。 ３５．リン脂質がジステアロイルホスファチジルコリンまたはジオレオイルホ スファチジルエタノールアミンである、請求項３４記載の組成物。 ３６．スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項３０から３５のい ずれかに記載の組成物。 ３７．アシルグリセロール脂質が、それぞれ少なくとも１２炭素原子を有する 二つの脂肪酸アシル基、および式Ｒ¹ＣＯ−(式中、Ｒ¹は、式Ｒ¹ＣＯＯＨの、− ＣＯＯＨ基を除去した後の１０までの炭素原子を有する残基)、または式ＯＣ− Ｒ²−ＣＯＯＨ(式中、Ｒ²は、式ＨＯＯＣ−Ｒ²−ＣＯＯＨのジカルボン酸の両方 の−ＣＯＯＨ基除去後の１０までの炭素原子の炭素原子を有する残基)の一つの アシル基を含む、請求項３０から３６のいずれかに記載の組成物。 ３８．アシルグリセロールが１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−サクシニル グリセロールである、請求項３７記載の組成物。 ３９．リポソームが、２から２０モル％の糖脂質、４０から８０モル％のリン 脂質、スフィンゴ脂質またはそれらの混合物および１０から５０モル％のステロ ールまたは１０から３０モル％のアシルグリセロールを含む、請求項３０から３ ８のいずれかに記載の組成物。 ４０．リポソームが、４から１０モル％の糖脂質、６０から８０モル％のリン 脂質、スフィンゴ脂質またはそれらの混合物および２０から４０モル％のステロ ールまたは１０から３０モル％のアシルグリセロールを含む、請求項３９記載の 組成物。 ４１．リポソームが５０から２００nmの平均粒子サイズを有する、請求項１か ら４０のいずれかに記載の組成物。 ４２．リポソームが８０から１２０nmの平均粒子サイズを有する、請求項４１ 記載の組成物。 ４３．哺乳類癌の処置用医薬を製造するための、請求項１から４２のいずれか に記載の組成物の使用。 ４４．実質的に実施例に記載の、請求項１記載の組成物。 ４５．ヒトｒａｆを発現する組織または細胞と、請求項１から４２のいずれか に記載の組成物を接触させることによるヒトｒａｆ発現を阻害する方法。 ４６．請求項１から４２のいずれかに記載の組成物を、このような処置を必要 とする哺乳類に投与することを含む、哺乳類癌を処置する方法。