JPH11514527A - バキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）用の陽性選択ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 外来性ＤＮＡの存在についてグラム（Ｇｒａｍ）陽性細菌、および特にバキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の形質転換およびスクリーニングに有用な陽性選択ベクターが提供される。このベクターはシグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする突然変異遺伝子を含む。スクロースを代謝する能力を欠失するバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞内での突然変異遺伝子の発現は、その細胞がスクロースの存在下で成長する際には致死的となる。外来性ＤＮＡは、その突然変異体遺伝子を不活化するようにベクター内に挿入され、そのことによりスクロースの存在下で細胞が成長することが可能になり、かつ形質転換体の容易な選択が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】 バキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）用の陽性選択ベクター 発明の分野 本発明は分子生物学の分野、および異種ＤＮＡを含む組換え細菌の同定のため の選択ベクターの使用に関する。より具体的にはバキルス エスピー（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｓｐ．）に致死性を付与し、かつクローン化された外来性ＤＮＡを含 む組換えバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の直接選択のための方法に用い ることができるＢ．アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａ ｃｉｅｎｓ ）シグナル配列の突然変異遺伝子を我々は発見した。 背景 クローン化されたＤＮＡを有する細菌を簡易に単離するための方法はいずれか の源から成功裏にＤＮＡをクローニングするのに必須となる。クローン化された ＤＮＡを含む細菌の同定は、そのクローン化されたＤＮＡが直接的遺伝子選択に 供することができる機能をコードする場合はいつでも、すなわち組換え細菌の生 存がクローン化されるべきＤＮＡによりコードされる機能を取得および発現する ことに依存する場合にはいつでも最も容易に達成される。クローン化されたＤＮ Ａを有する組換え細菌の同定は、そのクローン化されたＤＮＡが遺伝的に選択可 能な機能をコードしない場合には著しくより困難になる。なぜならクローン化さ れたＤＮＡを有する組換え細菌を、クローニングベクターは含むがＤＮＡを欠失 する組換え細菌の可能性が高いバックグラウンドから同定する 必要があるためである。 クローン化された挿入断片を有する組換え細菌を同定するための一つのアプロ ーチは、β−ガラクトシダーゼのための構造遺伝子であるｌａｃＺのようなレポ ーター遺伝子の挿入不活化について細菌コロニーをスクリーニングすることであ る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、ｐ．１．８５−ｐ．１．８６ Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。ｌａｃＺのコーディング部分をそのプロモー ターから分離させる制限部位内にＤＮＡがクローン化される際にはβ−ガラクト シダーゼは作成され得ない。その結果、再連結されたベクターのみを含む青色の 組換えコロニーのバックグラウンドに対し、色素産生性基質であるＸ−ｇａｌを 含む培地上ではクローン化されたＤＮＡを有する組換え体は白色コロニーとして 出現する。ｌａｃＺの挿入不活化のようなスクリーニング方法は、何らかの方法 で適切なコロニーに目印をつけることによりクローン化されたＤＮＡを有する細 菌の同定を容易にする。しかしながらこれらの方法はクローン化されたＤＮＡを 有する細菌の成長には有利でなく、かつそのような細菌を選択するわけでもない 。そのためスクリーニング法が用いられる場合には通常いつでも、クローン化さ れたＤＮＡを含む数少ないコロニーを見つけ出すためには多数のコロニーを十分 に調べることが必要となる。バックグラウンドコロニー数を減らすための一般的 な手法はベクター分子から末端５’リン酸を除去する目的でアルカリ性ホスファ ターゼを用いることによりベクターの自己連結反応を阻止することである。なぜ ならＤＮＡリガーゼはＤＮＡ分子の末 端を連結させるためには末端５’リン酸を必要とするためである（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら、上述、ｐ．１．５６−ｐ．１．５８）。この方法は一般的には、クロー ン化されたＤＮＡを欠失しているバックグラウンドコロニーを減少させはするが 除去はしない。 クローン化された挿入断片を欠失する細菌数を最低限にするためのアプローチ は、クローン化されたＤＮＡを有する組換え細菌についての直接選択を可能にす るベクターを使用する。スクリーニング法に勝る選択法の利点は、クローン化さ れたＤＮＡを有する細菌の成長はクローン化されたＤＮＡを欠失する細菌をはる かにしのぐということである。 宿主に致死性を付与する遺伝子を含む直接的もしくは陽性選択ベクターは良く 知られている。例えば、スクロースの存在下でのＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕ ｂｔｉｌｉｓ ）もしくはＢ．アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑ ｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）のｓａｃＢ遺伝子の発現は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、そ して多種多様の他のグラム（Ｇｒａｍ）−陰性およびグラム（Ｇｒａｍ）−陽性 細菌にとって致死的となる［Ｃａｉら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２、 ３１３８、（１９９０）；Ｇａｙら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６４、９ １８、（１９８５）；Ｊａｇｅｒら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ． １２６、１（１９９５）；Ｊａｇｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４ 、５４６２（１９９２）；Ｋａｍｏｕｎら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６、８０９、（１９９２）；Ｋａｎｉｇａら、Ｇｅｎｅ １０９、１３７ （１ ９９１）；Ｒｉｅｄら、Ｇｅｎｅ ５７、２３９、（１９８７）；Ｓｉｍｏｎら 、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３、１５０２、（１９９１）］。このｓａｃ Ｂ 遺伝子はレバンスクラー ゼをコードする［Ｇａｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３、１４２４ （１ ９８３）；Ｌｅｐｅｓａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． １２８、２１ ３ （１９７４）］。レバンスクラーゼはスクロースの加水分解とスクロースの 重合化の両方の触媒作用を行ってレバンを形成する。スクロースの存在下でのレ バンスクラーゼの致死性についての根拠は完全には理解されていない。しかしな がら大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）およびある一定の他の細菌はスクロースの存在下 でｓａｃＢが発現される場合には成長することができず、これを用いてｓａｃＢ 内に挿入されたＤＮＡを含む細菌についての直接選択を行うことができる（Ｃａ ｉとＷｏｌｋ、上述；Ｇａｙら、上述；Ｊａｇｅｒら、上述；Ｋａｎｉｇａら、 上述；Ｒｉｅｄら、上述］。当然のことながら野生型Ｂ． アミロリキファキエ ンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のｓａｃＢ遺伝子の挿入不 活化は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内のクローン化ＤＮＡについての選択を行う ために用いられている［Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９、２０５６（１９９２）］。 Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はＤＮＡのクローニングにとっ ては大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）に対する重要な代用物である。Ｂ． スブチリス （Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は細胞壁構成成分としてのリポ多糖を有さず、そし てその結果エンドトキシンでの細胞外産物の汚染を生じない［Ｈａｒｗｏｏｄら 、ｐ．３２７−３９０． Ｉｎ Ｃ．Ｒ．ＨａｒｗｏｏｄとＳ．Ｍ．Ｃｕｔｔｉ ｎｇ（ｅｄｓ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ （１９９０） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ ｏｎｓ、Ｎ ｅｗ Ｙｏｒｋ］。Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から分泌され る蛋白質は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）および他のグラム（Ｇｒａｍ）陰性細菌 について良く生じる例のようにペリプラスム間隙内に捕獲されるよりはむしろ培 養培地内に放出される（Ｈａｒｗｏｏｄら、上述）。バイオテクノロジー用の道 具としての使用に加え、Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、胞子 形成を行う能力があるがために細胞分化のためのモデル系としても集中的に研究 されている［（Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ．５ ７、１（１９９３）］。多くの胞子形成遺伝子については、大腸菌内にはその相 対物が存在しない。その結果、多くの胞子形成遺伝子の機能はＢ． スブチリス （Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内でのみ適切に検査することができるに過ぎない。 Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の遺伝子操作のための系も大腸 菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）についてのものとほぼ同様にかなり開発が進んでいるもの の、Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の利用はクローニング目的に ついては大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の使用に遅れをとってしまっている。一つの 問題は、クローン化した挿入断片を有する組換え細菌を同定することが、大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ）についてよりもＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）についてのほうがかなり困難であることである。切れ目を入れたプラスミドは 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における遺伝子操作にとっては有用であるが、Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換では不活性となる［Ｂｏｒｎ ，Ｓ．、ｐ．７５−１７４． Ｉｎ Ｃ．Ｒ．Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｓ．Ｍ ．Ｃｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ （１ ９９０） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。その結 果、アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸化されそして連結させてあるベク ター分子ではＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を形質転換すること はできない。これは挿入断片を有する分子の豊富化について大腸菌（Ｅ． ｃｏ ｌｉ ）に関しては一般的に用いられる手法であるが、これをＢ． スブチリス（Ｂ ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に適用することはできない。それに加え、Ｂ． スブ チリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはＢ． アミロリキファキエンス（Ｂ ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）からのｓａｃＢの野生型対立遺伝子 は、その致死性がために大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内では有用であるがＢ． ス ブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内でのクローン化されたＤＮＡについて選 択を行うために用いることはできず、なぜならこれらの対立遺伝子の発現はＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）にとっては致死的とならないためであ る[Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２、７８７ ( １９９１)]。 バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における遺伝子操作の難題を克服するための試 みでは多種多様のシャトルベクターが大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）とＢ． スブチ リス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のために開発されており、そのためまず大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ）内にＤＮＡをクローン化し、そしてその後にそれを後続の操 作のためにＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に転移することができ る（Ｂｒｏｎ、上述）。しかしながら所定の遺伝子の機能的コピーはＢ． スブ チリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内では発現させることができても大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ） 内ではできないことは良く知られている。場合によっては、異種遺伝子の発現は 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）にとっては有毒となる［Ｙｕｄｋｉｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅ ｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２０２、５５（１９８６）；Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ． ＵＳＡ ８２、２６４７（１９８５）；Ｈａｓ ｎａｉｎら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２、１８６３ （１９８ ６）］。Ｙｏｕｎｇら［ｐ．６３−ｐ．１０３． Ｉｎ Ｎ．Ｐ．Ｍｉｎｔｏｎ とＤ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅ（ｅｄｓ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄ ｂｏｏｋｓ、Ｖｏｌ． ３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ （１９８９） Ｐｌｅｎｕ ｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．］。それに加え、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）は一定の異種遺伝子によりコードされる蛋白質の産生にとっては不向きである ことがあるという多数の事例が存在する。例えば、Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ ）がクロストリジウム酵素の産生にとって好ましい宿主であるこ とは明白となり、なぜならクロストリジウム セルモケルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ ｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）のｃｅｌＡ遺伝子産物の過剰産生は大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ）の生存率の迅速な喪失をもたらすが、Ｂ． スブチリス（Ｂ ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）についてはそうでないためである［Ｓｃｈｗａｒｔｚら 、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７、５０、（１ ９８７）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ−Ｂａｕｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２０８：５３７−５４１ （１９８７）］。他の事例では、好ましいコドン使 用の違いにより、ある遺伝子はＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内 では翻訳されるが、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内ではそうではないことがあって よい［Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｐｌ ａｓｍｉｄ １９、１３４、 （１９８８）］。 従って、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）に基づく系を頼みとすることなく、Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内にクローン化されたＤＮＡを含む組換 え分子を効率的に単離するのに用いることができるベクターおよび方法について の必要性が存在する。解決すべき課題は、プラスミド内に挿入断片を含む形質転 換体が成長に関して選択され、かつそのプラスミド内に挿入断片を含まない形質 転換体が生存不能となるような方法で、バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）をプラス ミドＤＮＡで直接形質転換する手法を開発することである。出願人はこの問題を 、バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）用の陽性選択ベクターの開発を通して解決した 。この選択ベクターは、スクロースの存在下で宿主バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）細胞に致死性を付与する突然変異レバンスクラーゼ遺伝子を利用する。突然変 異レバンスクラーゼ遺伝子内のクローニング部位内への外来性ＤＮＡの挿入によ り遺伝子の不活化がもたらされ、かつ細胞の成長が可能となる。外来性ＤＮＡ挿 入断片を欠失するベクター分子で形質転換させた細胞は全て成長しないであろう 。この様式では、このベクターにより挿入断片を含むコロニーの選択が可能とな る一方で、同時にスクリーニングされなければならない非生産性ベクターを含む 細胞数が制限される。 発明の要約 本発明は、 （ｉ） （ａ）シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする突然変 異遺伝子であって、その遺伝子が追加的にレバンスクラーゼポリメラーゼ活性を コードしかつ異種ＤＮＡの挿入に有用な適合性制限部 位を含む突然変異体遺伝子； （ｂ）抗生物質耐性をコードする遺伝子； （ｃ）多重コピーとしてベクターを維持するための宿主特異的複製 起点；および （ｄ）突然変異遺伝子の調節および発現に適切な調節配列： を含む陽性選択ベクターを構築すること； （ｉｉ） 前記異種ＤＮＡを単離すること； （ｉｉｉ）単離された異種ＤＮＡを、レバンスクラーゼポリメラーゼ活性が破 壊されている突然変異遺伝子の適合性制限部位内にクローニングすること； （ｉｖ） 段階（ｉｉｉ）のベクターでコンピテント宿主細胞を形質転換する こと（この場合、その宿主細胞はスクロースを代謝する能力を保持しない）； （ｖ） 形質転換させた宿主細胞をスクロースを含む適切な増殖培地の存在 下でインキュベーションすること；ならびに （ｖｉ） スクロースの存在下で増殖することができる形質転換体を単離する こと、 を含んでなる、異種ＤＮＡで形質転換されたバキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｐ．）宿主の陽性選択のための方法を提供する。 本発明の更に別の目的は、突然変異レバンスクラーゼ酵素をコードし、かつ配 列番号１に特定される核酸配列を有する陽性選択ベクターに有用なＤＮＡ断片を 提供することである。 図面の簡単な説明 図１は、スクロース有りおよび無しの状態でのＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４） とＢＥ１５１０（ｐＢＥ５１７）の成長のグラフによる説明である。 図２は、ｐＭＧＢ１６１とｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の構築を説明する。 図３は、ｐＭＧＢ１６１の制限地図である。 図４は、ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の制限地図である。 発明の詳細な記述 本明細書に記載される際には以下の用語は請求の範囲および明細書の説明のた めに用いられることがあってよい。 用語「外来性ＤＮＡ」もしくは「異種ＤＮＡ」は、元来発現される細胞以外の 源に由来するＤＮＡを意味する。 用語「断片」は、特別な領域のＤＮＡ配列の一部分を意味する。 本明細書に用いられる場合には「形質転換」は、核酸の取り込みによる細胞内 での新規遺伝子の獲得である。 用語「発現」は本明細書で用いられる場合には、その遺伝子産物の配列をコー ドする遺伝子からの遺伝子産物への転写および翻訳を意味することが意図される 。発現の際には遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖はまずメッセンジャーＲ ＮＡであることがよくある相補的ＲＮＡへと転写され、そしてその転写されたメ ッセンジャーＲＮＡはその後に遺伝子蛋白質産物へと翻訳される。 本明細書で用いられる際には用語「宿主細胞」は、異種ＤＮＡで形質転換して ある細胞を意味する。本発明に有用な宿主細胞は典型的には、スクロースを代謝 する能力を欠失するバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）で ある。 用語「プラスミド」もしくは「ベクター」は本明細書に用いられる際には細胞 の中心的代謝の部分ではなく、かつ通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態を取る遺 伝子を保持することがよくある染色体外要素を意味する。 本発明で用いられる際には用語「陽性選択ベクター」は、異種ＤＮＡを有する 宿主細胞の形質転換および選択に有用なベクターを意味する。本発明の陽性選択 ベクターは、その発現が宿主細胞にとって致死的となる遺伝子を含む。その遺伝 子内のいずれかの地点での外来性もしくは異種ＤＮＡの挿入は致死的特性を不活 化させ、そして宿主細胞を増殖させかつ宿主細胞の選択を可能にする。 用語「ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９」はレバンスクラーゼのシグナルペプチド 内に突然変異を含む遺伝子を意味し、そして宿主細胞内でのその遺伝子の発現は 適切な条件下では致死的となる。 本明細書で用いられる際には用語「挿入断片」もしくは「ＤＮＡ挿入断片」は 、適切な宿主細胞を形質転換する目的のための陽性選択ベクター内に挿入される 異種ＤＮＡの断片を意味する。 「適合性制限部位」は、開裂した際にはいずれかの追加的改変を伴うことなく 連結することができるヌクレオチド末端を提供する異なる制限部位を意味する。 「シャトルベクター」は、通常は二本鎖であり、かつ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）とＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のための複製起点および更に は一本鎖ＤＮＡの調製のためのＦ１遺伝子内領域の両方を含むベクターである。 本明細書で用いられる際には表示「ＡＴＣＣ」は、１２３０１ Ｐａｒｋｌａ ｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２ Ｕ．Ｓ．Ａ．にあ るｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎという寄託機関を意味する。「ＡＴＣＣ Ｎｏ．」はＡＴＣＣにおいてブタペ スト条約の規定に従う寄託に関する以下の培養物に対する受託番号である： 本発明は、異種ＤＮＡを有するバキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ ．）の形質転換および選択に有用な独特な陽性選択ベクターを提供する。この選 択ベクターは、スクロースの存在下で宿主バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に 致死性を付与する突然変異レバンスクラーゼシグナルペプチドをコードする遺伝 子を利用する。構造遺伝子内のクローニング部位内への外来性ＤＮＡの挿入によ り遺伝子の不活化がもたらされ、そしてその細胞が増殖することが可能となる。 そのベクターで形質転換はされてはいるが、その外来性ＤＮＡ挿入断片を欠失す る細胞は全て増殖しない。この様式では、このベクターは挿入断片を含むコロニ ーの選択は可能にする一方で、それと同時に、挿入断片を欠失するベクターを含 むスクリーニングされなければならない細胞の数が制約され る。 本発明は、バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）についての当該技術分野において知 られる唯一の陽性選択ベクターである。このベクターは、いずれかの生物体の外 来性ＤＮＡをクローニングするのに有用であり、その生物体内ではそのＤＮＡの 発現はバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の成長に適合性である。本発明は、バキル ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内でのゲノムライブラリーの作成か、もしくは特異的で 無傷のまま構造遺伝子を含むクローンのスクリーニングに特に有用である。異種ＤＮＡ ： 本発明は広域なスペクトラムの外来性ＤＮＡのクローニングに有用であるもの と企図されている。本発明に特に有用な外来性ＤＮＡは限定されるものではない が、例えば：プロテアーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、アミ ラーゼ、セルラーゼ、レバナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ（ｒｎａｓｅ） 、ヌクレオチダーゼ、トランスフルクトシラーゼ、ラクターゼ、グルコースイソ メラーゼ、ホスファターゼのような好熱性細菌および中温細菌からの産業用酵素 ；例えば、アビジンおよびストレプトアビジンのようなビオチン結合性蛋白質； 例えばプロテインＡ、プロテインＧ、およびプロテインＬのような免疫グロブリ ン結合性蛋白質；免疫グロブリン、レセプター蛋白質、および例えばアクチン、 フィブリン、コラーゲン、シルク蛋白質、およびエラスチンのような構造蛋白質 ；ならびに例えばプロテアーゼリバーストランスクリプターゼのようなウイルス 性蛋白質や包膜蛋白質；ならびに例えばスタフィロコッカスのプロテインＡのよ うな微生物や原生動物からの抗原、レバンスクラーゼ、およびバルナーゼを含む 。シグナルペプチド開裂部位：ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９ シグナルペプチド開裂ほ、巨大アミノ酸がそのシグナルペプチドの−１もしく は−３の位置で置換される場合には阻害され得る。＋１は成熟して分泌された蛋 白質のＮ−末端アミノ酸を意味する。−１はシグナルペプチドのＣ−末端アミノ 酸を意味する。開裂は通常は−１と＋１との連結部で生じる。 突然変異Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃ ｉｅｎｓ ） ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子は最初にＢｏｒｃｈｅｒｔとＮ ａｇａｒａｊａｎ［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３、２７６、（１９９１） ］により報告され、そこではその遺伝子はレバンスクラーゼに関連するシグナル ペプチドのプロセシングを阻害する突然変異を含むということが決定された。こ の突然変異遺伝子の配列が配列番号１に示されている。 Ｗ２９突然変異体は野生型Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏ ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］） によりコードされるシグナルペプチドの−１の位置でアラニンをトリプトファン に変化させる。Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内でのｗ２９突然 変異体の発現により、野生型活性と比較してみると細胞外レバンスクラーゼの９ ０％の低下がもたらされた。 野生型Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉ ｅｎｓ ）（ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］）遺伝子の発現はＢ． スブチリス（Ｂ． ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ ）の成長は阻害しない（Ｎａｇａｒａｊａｎら、上述）。それに 加え、Ｗ２９突然変異体を含むプラスミドを有するＢ． スブチリス（Ｂ． ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ ）株は、レバンスク ラーゼシグナルペプチドのプロセシングを分析する目的で短期間の間スクロース の存在下で合成液体培地内で既に培養されている（Ｂｏｒｃｈｅｒｔら、上述） 。Ｗ２９突然変異体はこれらの実験条件下では宿主細菌の生存率もしくは成長に は悪影響を及ぼすことは観察されなかった。しかしながら出願人は、Ｗ２９突然 変異体で形質転換させたＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はスクロ ースの存在下で延長期間成長させた際には有意な成長阻害、そして更には致死性 を呈することを発見した。「延長期間」によっては、２時間を上回る時間が意味 される。Ｗ２９突然変異によりもたらされた成長阻害によりこの遺伝子は、異種 ＤＮＡを有するバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の形質転換のための陽性選択ベク ター内への取り込み用の優れた候補物となる。 シグナルペプチドプロセシング欠損はｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９に限定され ず、かつ以下の突然変異を含む。−１の位置でのプロリン、グルタミン、チロシ ン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびヒスチジンの置換がｓａｃＢ［Ｂａ ｍＰ ］Ｗ２９のものに類似する効果を有することが期待される。−３での置換も 類似の効果を有するであろうし、そしてそのためトリプトファン、プロリン、グ ルタミン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびヒスチジンの置換 はシグナルペプチドプロセシング欠損をもたらすことになるであろう。本発明は 全てのシグナルペプチドプロセシング突然変異体を含み、かつレバンスクラーゼ シグナルペプチドには限定されない。他の有用なシグナルペプチドがＮａｇａｒ ａｊａｎの表１に列挙されている。（Ｎａｇａｒａｊａｎ、Ｖ． １９９３ Ｐ ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ． ７１３ −７２９． Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｈｏｃｈ およびＬｏｓｉｃｋ （Ｅｄｓ．）． Ｉｎ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｈｙｓｉｏ ｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ ＡＳＭ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．） 野生型レバンスクラーゼ酵素内でのアミノ酸置換は酵素活性を破壊しうること が示されている。具体的にはＣｈａｍｂｅｒｔとＰｅｔｉｔ−Ｇｌａｔｒｏｎ［ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７９、３５、（１９９１）］が、レバンスクラーゼ の位置３３１のアルギニン（Ａｒｇ³³¹）のロイシン（Ｌｅｕ）への転化はその 酵素のポリメラーゼ活性を不活化することを示している。類似方法を用い、出願 人はｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子を改変して３３１の位置にロイシンを含 む蛋白質をコードするようにさせ、その遺伝子を用いてコンピテントなバキルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を形質転換させた。非改変のＷ２９遺伝子で形質 転換させた細胞はスクロースの存在下では成長することができない一方で、ロイ シンで改変させた蛋白質を発現する遺伝子で形質転換させた細胞はスクロースが あっても成長阻害は全く示さなかった。ポリメラーゼ活性を不活化することによ りＷ２９突然変異の致死性を元に戻す能力により、ｓａｃ［Ｂａｍｐ］Ｗ２９遺 伝子は明らかにその致死特性の原因となっていることが示される。それに加え、 そのポリメラーゼ活性の不活化が致死性を元に戻すため、その酵素のポリメラー ゼ活性を妨害するその遺伝子内のいずれかの破壊が陽性選択ベクターの設計の際 の有用な道具となりうるものとが企図されている。宿主細胞 ： 本発明は、外来性もしくは異種ＤＮＡの発現に有用な宿主細胞を提供する。本 方法は、レバンスクラーゼシグナルペプチドのプロセシングのための突然変異を 含むｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子の存在下では成長が阻害される宿主細胞 を頼みにする。これらの細胞における成長阻害もしくは致死性はスクロースの代 謝の結果である（Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ８９：２０５−６）。従ってその結果、スクロースのプロセシングについ て代理手段を含む宿主細胞は本方法には適さないであろう。 スクロースを代謝するための遺伝子機構を欠失するいずれかの宿主細胞が本発 明に適するであろうことが企図される。好ましい宿主細胞はバキルス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ）属に所属し、かつ野生型バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内でのスクロ ース代謝にとって必須であるｓａｃＢ遺伝子もしくはｓａｃＡ遺伝子のいずれか を欠失するであろう。宿主細胞として適切なバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は 制約される訳ではないが、Ｂ． ケレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ． スブ チリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ． パステウリイ（Ｂ． ｐａｓｔｅｕ ｒｉｉ ）、Ｂ． キルクランス（Ｂ． ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ． アミロリ キファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ． オレロ ニウス（Ｂ． ｏｌｅｒｏｎｉｕｓ）、Ｂ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）、Ｂ． スリンギエンシス（Ｂ． ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）、Ｂ． リケニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓ ）、Ｂ． ナット（Ｂ． ｎａｔｔｏ）、Ｂ． インテルメディウ ス（Ｂ． ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｂ． メガテリウム（Ｂ． ｍｅｇａｔ ｅｒｉｕｍ ）、Ｂ． フィルムス（Ｂ． ｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ． マケランス（Ｂ． ｍａｃｅｒａｎ ｓ ）、Ｂ． クルドラノリティクス（Ｂ． ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ） 、Ｂ． インフェルヌス（Ｂ． ｉｎｆｅｒｎｕｓ）、Ｂ． アントラキス（Ｂ ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｂ． プミルス（Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓ）、および Ｂ． ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）を含む。本発明に おいて好ましいのはＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＢＥ１５１ ０： ｔｒｐＣ２、ｍｅｔＢ１０、ｌｙｓ−３、ΔａｐｒＥ６６、Δｎｐｒ−８ ２ 、ｓａｃＢ：：ｅｒｍＣ、ｓａｃＡ：：ｐｈｌｅｏ）である。ベクターの構築 ： 本発明は、突然変異シグナルペプチドを有するバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９構造遺伝子；抗生物 質耐性をコードする遺伝子；多重コピーとして宿主細胞内にそのベクターを保持 するためのバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）複製起点；およびｓａｃＢ［ＢａｍＰ ］Ｗ２９遺伝子の発現に必要な適切な調節配列；を含む陽性選択ベクターを提供 する。 まず、ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子の単離によりその選択ベクターの構 築に取り掛かった。ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌ ｉ ）宿主、ＤＨ５α（ｐＢＥ５１７）（Ｂｏｒｃｈｅｒｔら、上述）から抽出し たが、この宿主ではＷ２９突然変異遺伝子がプラスミドｐＢＥ５１７内に含まれ ていた。標準方法によりプラスミドＤＮＡを回収および精製した（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ 上述）。プラスミドｐＢＥ５１７は、ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子 、バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のための複製起点 、および クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）をコードする遺伝 子を含む。ｐＢＥ５１７を制限酵素Ｋｐｎ１およびＮｄｅ１で消化し、そして得 られた断片を、スペクチノマイシン（ｓｐｍ）耐性のための遺伝子を含むｐＵＳ １９から取得された１．２ｋｂの断片と連結させてｐＭＧＢ１６１を形成した（ 図２）。ｐＭＧＢ１６１は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）とバキルス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ）との間の移動のために有用なシャトルベクターである。その後にｐＭＧＢ １６１をＳａｃ１／Ｎｃｏ１で消化し、そしてその後の平滑末端の連結によりｓ ａｃＢ ［ＢａｍＰ］Ｗ２９、バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）複製起点、およびｓ ｐｍ 遺伝子のみを有するｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１が作成された。 ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１はサイズが小さいため陽性選択ベクターとしてはｐ ＭＧＢ１６１よりも好ましいが、両ベクターは異種ＤＮＡでのバキルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ）宿主の形質転換には同じように良好に機能しうるものと企図される 。 プロモーターおよびリボソーム結合部位をコードする調節配列は、ｓａｃＢ［ＢａｍＰ ］Ｗ２９遺伝子を稼働させるのに有用ないずれかの単一遺伝子から取得 されることがあってよい。プロモーターおよびリボソーム結合部位をコードする 調節ＤＮＡ配列は、その宿主細胞以外の細胞から取得されることがあってよいこ とが理解される。これらの調節ＤＮＡ配列は当業者によく知られる手法により単 離することができ、かつ実例が刊行物に詳細に記述されている。Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ２ Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃ．Ｒ．Ｈａｒｗｏ ｏｄ、Ｅｄ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ （１９８９）、を参照されたい。そのＤＮＡ配列内のプロモーター は、そのベクターの容易な調節を可能にさせる構成的なものであるかもしくは誘 導性のものであるかのいずれかであってよい。ＤＮＡ挿入断片のクローニングおよび発現および陽性選択 ： ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１は適切な宿主細胞内への異種ＤＮＡの挿入用に用い た。既に述べたように、適切な宿主細胞はスクロースの代謝を行うことが不可能 である。バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ではこれは一般的には、野生型細菌内で のスクロース代謝を調節するｓａｃＢもしくはｓａｃＡ遺伝子の欠失もしくは不 在に起因する。本発明において好ましい細胞はバキルス スブチリス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＢＥ１５１０： ｔｒｐＣ２、ｍｅｔＢ１０、ｌｙｓ−３ 、ΔａｐｒＥ６６、Δｎｐｒ−８２、ｓａｃＢ：：ｅｒｍＣ、ｓａｃ Ａ：：ｐｈｌｅｏ ）である。 異種ＤＮＡの挿入に有用な多数の適合性クローニング部位がｓａｃＢ［Ｂａｍ Ｐ ］Ｗ２９遺伝子内に含まれる。ベクターＤＮＡ内への挿入に便利な制限部位で のＤＮＡ断片の工学的操作は一般的であり、かつ当該技術分野ではよく知られて おり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、上述、により記載される例が見いだされるこ とがあってよい。制限部位の互換性を決定するための手助けは、ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ １９８８−１９８９ Ｃａｔａｌｏｇ、Ｎ ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ ０ １９１５ （１９８８）のＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍ ｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔａｂｌｅ から得られることがあってよい。 ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９内のクローニング部位の内の一つへの外来性ＤＮ Ａの挿入によりＷ２９突然変異の不活化がもたらされ、そして 致死性であった宿主細胞が元の状態に戻る。その遺伝子内のいずれかの地点での いずれかの挿入がこの結果を生じることが予期されることが理解される。本発明 の目的のためには、Ｂｃｌ１部位でのＤＮＡの挿入が好ましい（図４）。更には 、代替挿入をＮｈｅ１部位（図４）およびＥｃｏ４７ＩＩＩ部位（図４）でも行 うことがあって良い。 そのベクターの利用性を調査するために、ＤＮＡを２つの異なる源から単離し 、そしてそのベクター内の適切な部位内に挿入した。ゲノムＤＮＡをＢ． ステ アロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から単離 し、そしてＳａｕ３Ａで消化した。この部分消化によりランダムな０．５〜２０ ｋｂの断片がもたらされ、これをその後にｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ内に含まれるｓａｃＢ ［ＢａｍＰ］Ｗ２９内のＢｃｌ１部位内にクローン化した。別法では、 アルカリ性プロテアーゼ遺伝子をコードするＢ． アミロリキファキエンス（Ｂ ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）ａｐｒ構造遺伝子を、適切なプライ マーを用いてＰＣＲにより取得し、そして更にはＢｃｌ１部位内に挿入した。 外来性ＤＮＡを含むベクターを用いてコンピテントなＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を形質転換させた。スペクチノマイシン単独もしくはスペ クチノマイシンと共にスクロースを含む培地内で増殖させた形質転換体の両方を 活発に成長するコロニーについて比較し、そして挿入断片の存在についての分析 を行った。抗生物質耐性のみに関してスクリーニングされた形質転換体はスペク チノマイシン耐性について選択され、かつスクロースの存在下で成長させたもの の少なくとも４倍も多いコロニーを産生した。しかしながらスクロースの存在下 で成長し たコロニーでは、抗生物質耐性についてのみスクリーニングしたコロニーについ ての挿入形質転換体が１％の発生率であることと比較すると、挿入断片を有する 形質転換体の発症率は約９５％〜１００％であった。 以下の実施例は本発明を例証することを意味するが、いずれかの方法において も制限として解釈されるべきではない。 実施例 実施例１ ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９がスクロースの存在下でＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の成長を阻害することの証明 スクロースを含む液体培地中のＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の 成長におけるｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９の効果 野生型ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］を含むＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４）およびＷ２ ９ ｓａｃＢ突然変異を含むＢＥ１５１０（ｐＢＥ５１７）を、５μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含む２０ｍｌのＬＢもしくは５％スクロースクロースを 含む同一培地内に接種した。これらの培養物を振盪しながら３０℃下３００ｍｌ のサイドアームフラスコ内でインキュベートした。細菌の成長は、緑色フィルタ ーを取り付けたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計で培養物の濁度を測定す ることによりモニターした。 スクロース有りおよび無しでのＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４）とＢＥ１５１０ （ｐＢＥ５１７）の成長を比較するデータが図１に示されており、この図の説明 は以下のとうりである： Ａ） スクロース有りでのＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４）（□）； スクロース無しでのＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４）（■）。 図１に示されるようにｐＢＥ５０４はいずれの培地内でも細菌の成長にいては 顕著な効果は示さなかった（図１Ａ）。スクロース無しでの培地内でのＢＥ１５ １０（ｐＢＥ５１７）の成長はＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４）からは識別不能で あった。ＢＥ１５１０（ｐＢＥ５１７）の倍加時間はスクロース無しの培地内で は４０分であった。しかしながら、ＢＥ１５１０（ｐＢＥ５１７）は５％スクロ ースを有する培地中で倍加するには７５分を必要とした。従ってＢＥ１５１０（ ｐＢＥ５１７）の成長速度は５％スクロースを含む培地内では有意に減少した。 それに加え、ＢＥ１５１０（ｐＢＥ５１７）の最終細胞密度はＬＢ中では４００ Ｋｌｅｔｔ単位であった一方で、ＬＢ＋５％スクロース内の最終細胞密度はわず か１００Ｋｌｅｔｔ単位に過ぎなかった。スクロースを有するアガー培地上でのＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ）の成長におけるｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９の効果 ＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４）もしくはＢＥ１５１０（ｐＢＥ５１７）の単一 コロニーを５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２０ｍｌのＬＢ内に接種し た。これらの培養物を振盪させながら３７℃下３００ｍｌサイドアームフラスコ 内で、緑色のフィルターを取り付けたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計で 決定した際に細菌が８２Ｋｌｅｔｔ単位の密度に達するまでインキュベートした 。当業者に良く知られる方法を用いて、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを 含むＬＢアガーもしくは５％スクロースを有する同一培地上での細菌の生存率を 、各アガー培地について液体培養物のｍｌ当たりのコロニー−形成単位（ＣＦＵ ） 数を決定することにより評価した。 表１に示されるように、アガー培地上でのＢＥ１５１０（ｐＢＥ５０４）の生 存率はスクロースによっては影響を受けなかった。それとは対照的に、ＢＥ１５ １０（ｐＢＥ５１７）についてのＣＦＵ数はアガー培地内の５％スクロースの存 在によって１０００倍減少した。従ってスクロースは、ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ ２９を含む細菌によりアガー上での成長を強固に阻害した。 実施例２ ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９を含むクローニングベクターの構築 プラスミドベクターｐＭＧＢ１６１およびｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１を図２に 概略を示す要領で構築した。ｐＭＧＢ１６１は、ｐＢＥ５１７内へのスペクチノ マイシン耐性遺伝子を有するｐＵＳ１９のＰｖｕＩＩ／ＮｄｅＩ制限断片のクロ ーニングにより構築した。ｐＢＥ５１７は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）とＢ． ス ブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内の複製起点を有するため、ｐＭＧＢ１６ １はそれらの細菌のシャトルベクターとなる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）複製起 点とクロラムフェニ コールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子の一部分をｐＭＧＢ１６１ から削除してｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１をもたらした。 ｐＭＧＢ１６１の構築 ＤＮＡの調製−プラスミドｐＢＥ５１７ 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａ（ｐＢＥ５１７）を、５０μｇ／ｍｌの アンピリシンを含むＬＢアガー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、ｐ．Ａ．１とｐ． Ａ．４）上での単離されたコロニーのために線条培養し、そして３７℃で１８時 間インキュベートした。成長が最も著しい領域からの細菌を１ｍｌのＳＴＥ緩衝 液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ）内に懸濁させ、そして１．５ｍｌのマイクロフージ管内での遠心分 離により回収した。プラスミドＤＮＡを、商品として入手可能なＷｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒ ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、２８００ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＭＩ ５３７１１−５３９９）を用い、製造業者 の使用説明書に従い細胞ペレットから抽出した。プラスミドＤＮＡを５０μｌの ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ ）中で回収し、そして当業者に知られる方法を用いてその濃度を決定した。 ｐＢＥ５１７（５μｇ）を、２０単位のＫｐｎＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、そ の製造業者により供給される５０μｌの１×反応緩衝液中、３７℃で１時間消化 した。この反応を１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することにより停止した 。この単位長さの直線化させたプラスミドＤＮＡを、商品として入手可能なＧｅ ｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １ ０１ Ｉｎｃ．社、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ２２８４、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２ ０３８−２２８４）を用いることにより、製造業者の使用説明書に従ってＫｐｎ Ｉ反応緩衝液から抽出した。このＤＮＡを１０μｌの水中に再懸濁させた。Ｋｐ ｎ Ｉ消化してあるｐＢＥ５１７を１００μｌの反応緩衝液（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ −アセテート ｐＨ ７．９、６６ｍＭ 酢酸カリウム、１００ｍＭ 酢酸マグ ネシウム、５ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブ ミン、０．１ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸）中の２０単位のＴ４ Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で３７℃下、１５分間、処理することに よりＫｐｎＩにより製造される突起型３’末端を除去した。この反応は１０μｌ の０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、かつこの反応物を７０℃で１０分間加熱するこ とにより停止した。ＤＮＡを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．社）を用いることによりＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液から抽出 した。このＤＮＡを１０μｌの水中に再懸濁させた。この新しく平滑末端にさせ たＤＮＡを４０単位のＮｄｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、３７℃下、１時間、そ の製造業者により供給される５０μｌの１×反応緩衝液中で消化した。このＤＮ Ａを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．社）を用いるこ とによりＮｄｅＩ反応緩衝液から抽出した。このＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液 内に再懸濁させた。ＮｄｅＩでの消化によりもたらされるこれら２つの制限断片 を、０．８％アガロースゲル（８．３ｃｍ × ６．０ｃｍ × ０．５ｃｍ） 中、１００ボルトで３０分間の電気泳動により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、ｐ ．６．３−６．１９、により記載される要領で分離した。７．９ｋｂの制限断片 を、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．社）を用いることによりアガロースゲルから 抽出した。このＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。ＤＮＡの調製−ｐＵＳ１９のＰｖｕＩＩ／ＮｄｅＩ制限断片 プラスミドｐＵＳ１９はスペクチノマイシン耐性遺伝子（ｓｐｍ）を含むプラ スミドＣｏｌＥ１の誘導体である［ＢｅｎｓｏｎとＨａｌｄｅｎｗａｎｇ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：２３４７−２３５６（１９９３）］。アルカ リ性溶解およびポリエチレングリコール沈殿を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述 、ｐ．１．３３およびｐｐ．１．３８−１．４１、に記載される方法に従って、 ５０μｇ／ｍｌのアンピリシンを含む５００ｍｌのＬＢ中で成長させ、そしてク ロラムフェニコール−増幅させた大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＲＲ１（ｐＵＳ１ ９）からｐＵＳ１９を抽出した。 ｐＵＳ１９（１０μｇ）を４８単位のＰｖｕＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で３７ ℃下、１時間、その製造業者により供給された１００μＬの１× 反応用緩衝液 で消化した。その単位長さの直線化させたプラスミドＤＮＡを、当業者に良く知 られる方法を用いて７．５Ｍ 酢酸アンモニウムと絶対アルコールでＰｖｕＩＩ 反応緩衝液から沈殿させた。このＤＮＡを製造業者により供給される１００μｌ の１× ＮｄｅＩ反応緩衝液中に溶解し、そして８０単位のＮｄｅＩ（Ｐｒｏｍ ｅｇａ社）で、３７℃、１時間切断した。このＤＮＡを７．５Ｍ 酢酸アンモニ ウムと絶対アルコールとでＮｄｅＩ反応緩衝液から沈殿させ、そして１０μｌの ＴＥ緩衝液中に溶解した。ＮｄｅＩでの消化からもたらされる２本の断片を、０ ．８％アガロースゲル中での１００ボルト、３０分間の電気泳動 により分離した。ｓｐｍを含む１．２ｋｂ ＰｖｕＩＩ／ＮｄｅＩ制限断片をＧ ｅｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．社）を用いてアガロース ゲルから抽出した。このＤＮＡを１０ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁した。制限断片の連結およびＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１５１ ０（ｐＢＥ５１７）の形質転換 ｓｐｍ遺伝子を、２３℃下、１８時間、連結反応物［ｐＢＥ５１７からの５μ ｌの平滑末端化させた７．９ｋｂ ＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ制限断片、ｐＵＳ１９か らの２μｌの１．２ｋｂ ＰｖｕＩＩ／ＮｄｅＩ制限断片、４μｌの水、２μｌ の市販品として入手できる１０× 連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社、３２ Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ ０１９１５−５５９９）、６μｌ ５０％ ポリエチレングリコール ８００ ０、４００単位のＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社）］をインキュベートすることによりｐＢＥ５１７内に 挿入した。 Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＥ１５１０（ｐＢＥ５１７ ）を形質転換についてはコンピテントとなるよう作成し、０．５ｍｌのコンピテ ント細胞を、ＨａｒｗｏｏｄとＣｕｔｔｉｎｇ、ｐ．６７、に記載される方法に 従って１０μｌの連結させてあるＤＮＡで形質転換させた。ＤＮＡとのインキュ ベーションの後、この形質転換培養物を１ｍｌのブレイン ハート インフュー ジョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ＢＨＩ；Ｄｉｆｃｏ社 、Ｄｅｔｒｉｏｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で希釈し、そしてローラードラム上、３ ７℃で１時 間インキュベートした。各培養管の中身を遠心分離により１０倍濃縮し、そして １００μｌ／ｍｌ スペクチノマイシンを含むトリプトース ブラッド アガー ベース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒｂａｓｅ）（ＴＢＡＢ；Ｄ ｉｆｃｏ社）上に広げた。このペトリ皿を３７℃で１８時間インキュベートした 。スペクチノマイシン耐性形質転換体の性質決定 幾つかのスペクチノマイシン耐性形質転換体を、１００μｇ／ｍｌスペクチノ マイシンを含む３ｍｌのＢＨＩ内に接種し、そして３７℃で５時間、ローラード ラム上でインキュベートした。プラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐ ｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて各培養物 から抽出した。各プラスミド調製物の試料（１０μｌ）を１２単位のＥｃｏＲＩ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、その製造業者により供給される反応用緩衝液を用いて 総計５０μｌの容量中で消化した。得られる制限断片を、０．８％アガロースゲ ル上での１００ボルト、３０分間の電気泳動により分析した。予想されるサイズ （５．７ｋｂ、１．７ｋｂ、および１．５ｋｂ）の制限断片を有する一つのプラ スミドをｐＭＧＢ１６１と表示した。ｐＭＧＢ１６１の詳細な制限地図が図３に 示される。 ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の構築 アルカリ性溶解およびポリエチレングリコール沈殿を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、上述、により記載される要領で、５０μｇ／ｍｌアンピリシンを含む５００ ｍｌのＬＢ中で成長させたＢＥ１５１０（ｐＭＧＢ１６１）からｐＭＧＢ１６１ を抽出した。ｐＭＧＢ１６１（３５μｌ）を７２単位のＮｃｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇ ａ社）で３７℃下、１時間、その製 造業者により供給される１００μｌの１× 反応緩衝液中で消化した。その単位 長さの直線化させたプラスミドＤＮＡを、７．５Ｍの酢酸アンモニウムと絶対エ タノールとでＮｃｏＩ反応緩衝液から沈殿させた。このＤＮＡを、その製造業者 により供給される１００μｌの１× ＳａｃＩ反応緩衝液中に溶解し、そして７ ２単位のＳａｃＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、３７℃下で１時間切断した。そのＤ ＮＡを、７．５Ｍ 酢酸アンモニウムと絶対アルコールとでＳａｃＩ反応緩衝液 から沈殿させ、そして３５μｌのＴＥ緩衝液中に溶解した。ＮｃｏＩとＳａｃＩ での消化からもたらされるこの２本の制限断片を、０．８％ アガロースゲル内 での１００ボルト、４５分間の電気泳動により分離した。Ｂ． スブチリス（Ｂ ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内の複製起点、ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９、およびｓ ｐｍ を含む５．７ｋｂのＮｃｏＩ／ＳａｃＩ制限断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｋ ｉｔ（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．社）を用いてそのアガロースゲルから抽出した 。 その５．７ｋｂの制限断片の一本鎖末端を、３７℃で５分間、１００μｌの制 限緩衝液（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 ｐＨ７．９、６６ｍＭ 酢酸カリウム、 １００ｍＭ 酢酸マグネシウム、５ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍｇ／ｍ ｌ ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸）中の １００単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）でその断片を処理 することにより平滑にした。この反応を、１０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加 し、かつ７０℃で１０分間、その反応物を加熱することにより停止させた。この 反応混合物を、当業者に良く知られる方法を用いて順次、フェノール／クロロホ ルムおよびクロロホルムで一回づつ抽出した。このＤＮＡを７．５Ｍの酢 酸アンモニウムと絶対アルコールとで沈殿させ、そして１０μｌの水中に溶解し た。 この５．７ｋｂの制限断片を、連結反応物（９μｌの溶解させたＤＮＡ、１． ５μｌの市販品として調製されている１０× 連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社）、４．５μｌの５０％ポリエチレングリコ ール ８０００、４００単位のＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社）］を２３℃で２０時間インキュベートす ることにより環化させた。Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＥ １５１０を形質転換に関してコンピテントとなるように作成し、そして０．５ｍ ｌのコンピテント細胞を、ＨａｒｗｏｏｄとＣｕｔｔｉｎｇ、上述、に記載され る方法に従って９μｌの連結させてあるＤＮＡで形質転換させた。そのＤＮＡと 共にインキュベーションした後、形質転換させた培養物を１ｍｌのＢＨＩで希釈 し、そして３７℃で１時間、ローラードラム上でインキュベートした。各培養物 の試料（０．１ｍｌ）を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＴＢＡ Ｂ上に広げた。このペトリ皿を３７℃で１８時間インキュベートした。 スペクチノマイシン耐性であってクロラムフェニコール感受性である数々の形 質転換体を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む３ｍｌのＢＨＩ内に接 種し、そして３７℃で５時間、ローラードラム上でインキュベートした。プラス ミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて各培養物から抽出した。 各プラスミド調製物の試料（２０μｌ）を１２単位のＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇ ａ社）で、その製 造業者により供給される反応緩衝液を用いて合計５０μｌの容積中で消化させた 。得られる制限断片を、０．８％アガロースゲル中での１００ボルト、４５分間 の電気泳動により分析した。予想されるサイズ（４．０ｋｂおよび１．５ｋｂ） の制限断片を有する一つのプラスミドをｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１と表示した。 ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の詳細な制限地図が図４に示される。 実施例３ Ｂ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の染色体ＤＮＡに由来するランダム制限断片をクローン化するためのｐＭＧＢ １６１Δｃａｔ１の使用 Ｂ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）ＤＮＡの調製 バキルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ のＢ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ ｓ ）株９Ａ２を、振盪させながら６０℃で６．５時間、２５ｍｌのＢＨＩ中で成 長させた。その細菌を遠心分離により回収し、そして２．５ｍｌの緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。リゾチ ームを、２００μｇ／ｍｌの最終濃度になるよう添加し、そして得られる混合物 を３７℃で１５分間インキュベートした。プロテイナーゼＫおよびドデシル硫酸 ナトリウムを添加し（各々５０μｇ／ｍｌおよび０．５％の最終濃度）、そして 得られる混合物を５５℃で２時間インキュベートした。このＤＮＡを７．５Ｍの 酢酸アンモニウムおよび絶対アルコールで沈殿させ、そしてその後に１ｍｌのＴ Ｅ緩衝液中に溶解した。このＤＮＡをＤＮａｓｅを含まな いＲＮａｓｅ（１５０μｇ／ｍｌの最終濃度）と共に２３℃で３０分間インキュ ベートした。当業者に良く知られる方法を用い、このＤＮＡを等容量のフェノー ル／クロロホルムで一回抽出し、等容量のクロロホルムで一回抽出し、そして再 度７．５Ｍの酢酸アンモニウムと絶対アルコールとで沈殿させた。単離したＤＮ Ａを７０％エタノールですすぎ、空気乾燥させ、そして５００μｌのＴＥ緩衝液 中に溶解した。 Ｂ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ ｓ ）のＤＮＡ（６０μｇ）を０．１単位のＳａｕ３Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で２ ３℃下２０分間、その製造業者により供給される５０μｌの１× 反応用緩衝液 中で消化させた。得られる部分消化物は、主なサイズが０．５ｋｂ〜２０ｋｂで ある制限断片のセミランダムコレクションを含む。この反応混合物を当業者に良 く知られる方法を用いて順次、フェノール／クロロホルム、そしてクロロホルム で一回づつ抽出した。このＤＮＡを７．５Ｍの酢酸アンモニウムと絶対アルコー ルとで沈殿させ、そして１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１内へのＢ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅ ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡのクローニング ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１（８μｇ）を２０単位のＢｃｌ１（Ｐｒｏｍｅｇａ 社）で、５０℃下で１時間、その製造業者により供給される２００μｌの１× 反応用緩衝液中で消化させた。この反応混合物を当業者に良く知られる方法を用 いて順次、フェノール／クロロホルム、そしてクロロホルムで一回づつ抽出した 。このＤＮＡを７．５Ｍの酢酸アンモニウムおよび絶対アルコールで沈殿させ、 そして１０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解した。 Ｂ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ ｓ ）のＤＮＡを、連結反応物［Ｂ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａ ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のＤＮＡの４．５μｌのＳａｕ３部分消化物、Ｂｃｌ １で消化させた４．５μｌのｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１、商品として調製 されている１μｌの１０× 連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ ｂｓ、Ｉｎｃ．社）、２００単位のＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社）］を２３℃で２．５時間インキュベ ートすることによりｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１内に挿入した。 Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＥ１５１０のコンピテント 細胞（０．５ｍｌ）を、ＨａｒｗｏｏｄとＣｕｔｔｉｎｇ、ｐ．６７、に記載さ れる要領で、１０μｌの連結させたＤＮＡで形質転換した。そのＤＮＡと共にイ ンキュベートした後、その形質転換体培養物と、ＤＮＡには露出させなかった細 胞の類似対照培養物との試料を１μｌのＢＨＩで希釈し、そして３７℃で１時間 、ローラードラム上に広げた。その細胞を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシ ンを含むＬＢアガー（ＬＢＡＳ）もしくは１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシ ンと５％のスクロースとを含むＬＢアガー（ＬＢＡＳＳ）上に広げて、スペクチ ノマイシンのみに対して耐性を示す、もしくはスペクチノマイシンとスクロース とに対して耐性を示す形質転換体の数を決定した。これらのペトリ皿を３０℃で ２０時間インキュベートした。 表２に示されるように、スペクチノマイシン単独に対してよりもスペクチノマ イシンとスクロースとに対して耐性を示す形質転換体の方が有意に少なかった。 ＬＢＡＳから１０の形質転換体を取り出し、そしてＬ ＢＡＳＳから１０の形質転換体を取り出した。ＬＢＡＳＳからの形質転換体を、 ３７℃で５時間、ローラードラム上でインキュベーションさせながら１００μｇ ／ｍｌのスペクチノマイシンと５％のスクロースとを含む３ｍｌのＢＨＩ中で成 長させた。ＬＢＡＳからの形質転換体を、培地がスクロースを欠く事を除外して は類似の様式で培養した。プラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅ ｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社） を用いて各培養物から抽出した。各プラスミド調製物の試料（２５μｌ）を１２ 単位のＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、その製造業者により供給される反応 用緩衝液を用いて５０μｌの合計容積中で消化させた。得られる制限断片を、０ ．８％アガロースゲル内での１００ボルト、３０分間の電気泳動により分析した 。ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１のＥｃｏＲＩ消化物は３．７および１．４ｋｂのサ イズの制限断片に対応する２本のバンドを生じた。この１．４ｋｂの断片はｓａ ｃＢ ［ＢａｍＰ］Ｗ２９配列を含み、かつｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１のＢｃｌ１ 制限部位内にＤＮＡがクローン化されている場合にはサイズが変化するであろう 。ＬＢＡＳから取り出した１０の形質転換体全てからのそのプラスミドのＥｃｏ ＲＩ消化物はサイズの点でｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１のＥｃｏＲＩ消化断片とは 識別不可能な２本のバンドを生じた。従って、ＬＢＡＳに由来する形質転換体の 内のいずれのものも、クローン化されたＢ． ステアロセルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のＤＮＡ配列を含んでいなかった。Ｌ ＢＡＳＳから取り出された１０の形質転換体からのプラスミドのＥｃｏＲＩ消化 物は、３．７ｋｂの断片が各消化物中に存在するが１．４ｋｂの断片が消失して いるという点では互いに類似し ていた。各事例とも、その１．４ｋｂの断片は、１．４ｋｂを上回るサイズの一 つの断片もしくは合わさったサイズが１．４ｋｂを上回る２本の断片に置き換わ っていた。従って、ＬＢＡＳＳから取り出された１０の形質転換体の各々はクロ ーン化された挿入断片を有するプラスミドを含んでいた。表３に示されるように 、調査した形質転換体の中では小さな挿入断片が多勢を占めていた。しかしなが ら、ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１は６．３ｋｂ程の大きさの挿入断片を収容するこ とができる。 実施例４ Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉ ｅｎｓ）ａｐｒ遺伝子を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させたＤＮ Ａをクローン化するためのｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の使用 Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ） のＤＮＡの調製 Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ）を、振盪しながら３７℃で５時間、２５ｍｌのＢＨＩ中で成長させた。この細 菌を遠心分離により回収し、そして３ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。リゾ チームを３３３μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加し、そして得られた混合物 を３７℃で１５分間インキュベートした。プロテイナーゼＫおよびドデシル硫酸 ナトリウムを添加し（各々５０μｇ／ｍｌおよび０．５％の最終濃度）、そして 得られる混合物を５５℃で２時間インキュベートした。当業者に良く知られる方 法を用いてそのＤＮＡを７．５Ｍの酢酸アンモニウムと絶対エタノールとで沈殿 させ、２ｍｌのＴＥ緩衝液中に溶解し、等容量のフェノール／クロロホルムで一 回抽出し、当容量のクロロホルムで一回抽出し、再度７．５Ｍの酢酸アンモニウ ムと絶対エタノールとで沈殿させた。単離されたＤＮＡを７０％エタノールです すぎ、空気乾燥させ、そして１ｍｌのＴＥ緩衝液中に溶解した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＢ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）ａｐｒ遺伝子の増幅 Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ）ａｐｒ遺伝子のプロモーターとコーディング配列とを、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）およびＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣ Ｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を製造業者の説明書に従って用いるＰＣＲにより増幅させた。 各々３０塩基の２つのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応の際の使用の ために合成した。この反応に用いられる３０量体のオリゴヌクレオチドプライマ ーの配列は、Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａ ｃｉｅｎｓ ）ａｐｒ遺伝子について報告されているヌクレオチド配列に基づいて いた［Ｖａｓａｎｔｈａら、Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ． １５９：８１１−８１９ （１９８４）］。プライマーは、その標的配列をＢａｍＨＩ制限部位でフランク するように設計した。各プライマーの配列が以下に示される：プライマーNo. ヌクレオチオド配列 APR3 CCC CCA AAA ATG GAT CCA AAC CGT TCG ACC 配列番号2 APR4 CGA TTA TGG AGC GGA TTG AGG ATC CGG AGG 配列番号3 この１００μｌのＰＣＲ混合物は０．８μｇのＢ． アミロリキファキエンス （Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡを含んでいた。このＰＣ Ｒ混合物中の各プライマーの最終濃度は１．０ｍＭであった。この反応は、融解 段階（９４℃で１分間）、プライマーアニーリング段階（４５℃で１分間）、お よびプライマー伸長段階（７２℃で２分間）からなる４０周期を用い、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００ サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃ ｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）内で実施した。最終周期の完了後 、市販品として入手することができるＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮ Ａ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用 いることにより、取り込まれなかったプライマーから増幅させ たＤＮＡを分離した。 ２つの個別の増幅反応からのＤＮＡを合わせ（総計８μｇ）、そして２０単位 のＢａｍＨＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、その製造業者により供給される１００μ ｌの１× 反応緩衝液中、３７℃で１時間消化させた。このＤＮＡを７．５Ｍの 酢酸アンモニウムと絶対エタノールとで ＢａｍＨＩ反応緩衝液から沈殿させ、 そして５μｌのＴＥ緩衝液内に溶解した。ＢａｍＨＩで消化させたＤＮＡは、０ ．８％アガロースゲル内での１００ボルト、３０分間の電気泳動により分析した 。１．５ｋｂの断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ． 社）を用いてアガロースゲルから抽出した。このＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液 中に再懸濁させた。増幅させたＤＮＡのｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１内へのクローニング ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１（１０μｇ）を４０単位のＢｃｌＩ（Ｐｒｏｍｅｇ ａ社）で、その製造業者により供給される５０μｌの１× 反応緩衝液中、５０ ℃で１時間消化させた。このＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １ ０１ Ｉｎｃ．社）を用いることによりＢｃｌ１反応緩衝液から抽出した。この ＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。ＢｃｌＩで消化させたｐＭＧ Ｂ１６１Δｃａｔ１（１０ｍｌ）およびＢａｍＨＩで消化させた１．５ｋｂ断片 （１０μｌ）を合わせ、７．５Ｍの酢酸アンモニウムとエタノールとで沈殿させ 、そして２００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社）を含む１０μｌの１× リガーゼ緩衝液内に再懸濁させ た。この連結反応物を２３℃で２０時間インキュベートした。 Ｂ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＥ１５１０のコン ピテント細胞（０．５ｍｌ）を１０μｌの連結させたＤＮＡで、Ｈａｒｗｏｏｄ とＣｕｔｔｉｎｇ、ｐ． ６７、に記載される要領で形質転換させた。そのＤＮ Ａとのインキュベーションの後に形質転換培養物の試料、およびＤＮＡに露出さ せなかった細胞の類似対照培養物を１ｍｌのＢＨＩで稀釈し、そして３７℃下１ 時間、ローラードラム上でインキュベートした。これらの細胞をＬＢＡＳもしく はＬＢＡＳＳ上に広げ、スペクチノマイシンのみに対して耐性を示す、もしくは スペクチノマイシンとスクロースとに対して耐性を示す形質転換体の数を決定し た。これらのペトリ皿は３０℃で２０時間インキュベートした。 表４に示されるように、スペクチノマイシン単独に対するよりも、スペクチノ マイシンとスクロースとに対して耐性を示す形質転換体は有意に少なかった。幾 つかの形質転換体をＬＢＡＳもしくはＬＢＡＳＳから取り出し、そしてスペクチ ノマイシンと１％のスキムミルクとを含むＴＢＴＡにパッチした。スキムミルク を含む培地上で透明なかさに囲まれたパッチは細胞外プロテアーゼの産生に関し て陽性となる（Ｖａｓａｎｔｈａ，Ｎ．，ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ． １５ ９、８１１、（１９８４））。これらのペトリ皿を３７℃で１８時間インキュベ ートした。 表５に示されるように、スペクチノマイシンに対してのみ耐性を示す形質転換 体の内のいずれのものもプロテアーゼ陽性ではなかった一方で、スペクチノマイ シン／スクロース耐性形質転換体の内のほぼ半数はプロテアーゼ陽性でもあった 。４つのプロテアーゼ陽性形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシ ンと５％のスクロースとを含む３ｍｌのＢＨＩ内に接種し、そしてローラードラ ム上、３７℃で５時間インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用 いて各培養物から抽出した。各プラスミド調製物の試料（２０μｌ）を１２単位 のＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、その製造業者により供給される反応緩衝 液を用いて５０μｌの合計容量中で消化させた。得られる制限断片を、０．８％ アガロースゲル中、１００ボルト、４５分間の電気泳動により分析した。この４ つのプロテアーゼ陽性形質転換体の各々のものからのプラスミドは予想されたサ イズ（１．５ｋｂ）のクローン化された挿入断片を含んでいた。 実施例５ ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子産物のポリメラーゼ活性の不活化 ＣｈａｍｂｅｒｔとＰｅｔｉｔ−Ｇｌａｔｒｏｎ［Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７９：３５−４１ （１９９１）］は、レバンスクラーゼの 位置３３１のアルギニン（Ａｒｇ³³¹）のロイシン（Ｌｅｕ）への転換がその酵 素のポリメラーゼ活性を不活化させることを示した。従って、ｓａｃＢ［Ｂａｍ Ｐ ］Ｗ２９遺伝子産物のポリメラーゼ活性は類似様式で不活化され、このことが スクロースの存在下でのＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の成長を 阻害する原因になっていることが示された。位置指定突然変異誘発によるｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９の改変 ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９の一部分を、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラ ーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）およびＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇ ｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、その製造業者の使用 説明書に従い、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。プラスミドｐＭＧＢ１６ １Δｃａｔ１を鋳型ＤＮＡとして用いた。（ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１はｐＢＥ ５１７の誘導体である。ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の構築法は実施例２に記載さ れており、かつ図２に詳細に説明されている。ｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の制限 地図が図４に示されている）。２本のオリゴヌクレオチオドプライマーを、ＰＣ Ｒ反応の際の使用のために合成した。この反応に用いられる２本のオリゴヌクレ オチドプラーマーの配列は、Ｂ． アミロリキファキエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏ ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ）のｓａｃＢ遺伝子［Ｔａｎｇら、Ｇｅｎｅ ９６： ８９−９３（１９９０）］およびｐＢＥ５０４のポリリンカー領域についての報 告されているヌクレオチド配列に基づいていた（ＢｏｒｃｈｅｒｔとＮａｇａｒ ａｊａｎ、上述）。これらのプライマーは、ＢｓｓＨＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ 制限部位との間の４７３塩基対を含むｐＭＧＢ１６１Δｃａｔ１の領域の増幅を 可能に するように設計した。プライマーＭＢ３はｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９のＡｒｇ コドン３３１と重複しており、かつ増幅させたＤＮＡ内ではコドン３３１をＬｅ ｕコドンへと転化させるように設計した。各プライマーの配列が以下に示されて いる：プライマーNo. ヌクレオチド配列 MB2 AGT GGA TCC CCC GGG CTG CAG GAA TTC ACC 配列番号4 MB3 GAG CGC GCG AAT GTT TTC AAA ATG AAC GGC AAA TGG TAC TTG TTC ACT GAT TCA CTC GGT TC 配列番号5 この１００μｌのＰＣＲ混合物は、ＮｈｅＩで消化してある１ｎｇのｐＭＧＢ １６１Δｃａｔ１を含んでいた。このＰＣＲ混合物中の各プライマーの最終濃度 は１．５ｍＭであった。この反応は、融解段階（９４℃で１分間）、プライマー アニーリング段階（４５℃で１分間）、およびプライマー伸長段階（７２℃で２ 分間）からなる４０周期を用い、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６ ００ サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ ｅｒ社）内で実施した。最終周期の完了後、増幅させたＤＮＡを、市販品として 入手することができるＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いることにより 、取り込まれなかったプライマーから分離した。 一つの反応からの増幅されたＤＮＡの全てを１０単位のＢｓｓＨＩＩ（Ｐｒｏ ｍｅｇａ社）で、その製造業者により供給される１００μｌの１× 反応緩衝液 中、５０℃で１時間消化させた。消化は、１０単位のＢａｍＨＩ（Ｐｒｏｍｅｇ ａ社）の添加後に３７℃で１時間継続させた。 当業者に良く知られる方法を用い、この反応混合物を当容量のフェノール／クロ ロホルムで一回抽出し、そして当容量のクロロホルムで一回抽出した。このＤＮ Ａを７．５Ｍの酢酸アンモニウムと絶対エタノールとで沈殿させた。単離したＤ ＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。 プラスミドｐＭＧＢ１６１（１０μｇ）を、前の段落に記載される要領でＢｓ ｓ ＨＩとＢａｍＨＩとで消化した。（ｐＭＧＢ１６１はｐＢＥ５１７の誘導体で ある。ｐＭＧＢ１６１の構築法は実施例２に記載されており、かつ図２に詳細に 説明されている。ｐＭＧＢ１６１の制限地図が図３に詳細に説明されている）。 このＢｓｓＨＩＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡを７．５Ｍ 酢酸アンモニウムと絶対エ タノールとで沈殿させた。ＢｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩとでの消化からもたらされ る２本の断片を、０．８％アガロースゲル中、１００ボルト、３０分間の電気泳 動により分離した。８．６ｋｂのＢｓｓＨＩＩ／ＢａｍＨＩの制限断片を、Ｇｅ ｎｅｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．社）を用いてそのアガロー スゲルから抽出した。このＤＮＡを２０μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。 ＢｓｓＨＩＩ／ＢａｍＨＩで消化しＰＣＲで増幅させたＤＮＡを、連結反応物 中［２μｌの８．６ｋｂ ＢｓｓＨＩＩ／ＢａｍＨＩ ｐＭＧＢ１６１制限断片 、５μｌのＢｓｓＨＩＩ／ＢａｍＨＩで消化しＰＣＲで増幅させたＤＮＡ、２μ ｌの水、１μｌの商品として調製された１０× 連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社、３２ Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ、Ｂｅｖｅ ｒｌｙ、ＭＡ ０１９１５−５５９９）、および２００単位のＴ４ ＤＮＡ Ｌ ｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．社）］、その ８．６ｋ ｂのＢｓｓＨＩＩ／ＢａｍＨＩ ｐＭＧＢ１６１制限断片に連結させた。この反 応物を２３℃で１８時間インキュベートした。この連結混合物全てを用い、アン ピリシン耐性についての選択に関する標準方法［Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ． ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ、ｐ．１．８．１−ｐ．１．８．３ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］に従い、商品として調製された大腸菌（Ｅ． ｃ ｏｌｉ ）株ＲＲ１（ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．社 、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ ２０８７７）を形質転換させた。一つの典 型的な形質転換体をＲＲ１（ｐＭＧＢ１６５）と表示した。 ＲＲ１（ｐＭＧＢ１６５）を、５０μｇ／ｍｌのアンピリシンを含む３ｍｌの ＬＢ内に接種し、そしてローラードラム上で、３７℃下６時間インキュベートし た。プラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてその培養物から抽出した。Ｂ． ス ブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＥ１５１０を形質転換に関してコンピ テントになるよう作成し、そして０．５ｍｌのコンピテント細胞を、Ｈａｒｗｏ ｏｄとＣｕｔｔｉｎｇ、ｐ．６７、に記載される方法に従って１０μｌのプラス ミド調製物で形質転換させた。そのＤＮＡと一緒のインキュベーションの後に、 形質転換培養物を１ｍｌのブレイン ハート インフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ＢＨＩ；Ｄｉｆｃｏ社、Ｄｅｔｒｉｏｔ、Ｍ ｉｃｈｉｇａｎ）で希釈し、そして３７℃で１時間、ローラードラム上でインキ ュベートした。各培養管の内容物を遠心分離により１０倍濃縮し、そして、１０ ０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを 含むトリプトース ブラッド アガー ベース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ ｂａｓｅ）（ＴＢＡＢ；Ｄｉｆｃｏ社）上に広げた。このペトリ皿 を３７℃で１８時間インキュベートした。 ＢＥ１５１０（ｐＭＧＢ１６５）という一つの形質転換体を、１００μｇ／ｍ ｌのスペクチノマイシンを含む３ｍｌのＢＨＩ内に接種し、そして３７℃で６時 間、ローラードラム上でインキュベートした。プラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒ ｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを 用いてその培養物から抽出した。そのプラスミド調製物の試料（２５μｌ）を１ ２単位のＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、その製造業者により供給される反 応緩衝液を用いて５０μｌの合計容量内で消化させた。得られる制限断片を、０ ．８％アガロースゲル内での１００ボルト、３０分間の電気泳動により分析した 。ｐＭＧＢ１６５は予想されたサイズ（５．７ｋｂ、１．７ｋｂ、および１．５ ｋｂ）の制限断片を有していた。ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９内でのＡｒｇ³³¹のＬｅｕへの変更の効果 ＢＥ１５１０（ｐＭＧＢ１６１）もしくはＢＥ１５１０（ｐＭＧＢ１６５）の 単一コロニーを、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２０ｍｌのＬＢ内 に接種した。この培養物を振盪させながら３００ｍｌのサイドアームフラスコ内 で３７℃下、緑色のフィルターを取り付けたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比 色計を用いて決定した際に約８５Ｋｌｅｔｔ単位の密度に細菌が達するまでイン キュベートした。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢアガーもしく は５％のスクロースを有する同一培地上での細菌の生存率を、各アガー培地につ いてのその液体培養物のｍｌ当たりのＣＦＵ数を決定することにより評価した。 表６に示されるように、ＢＥ１５１０（ｐＭＧＢ１６１）についてのＣＦＵ数 はそのアガー培地中の５％のスクロースの存在により１０００倍減少した。それ とは対照的に、アガー培地上でのＢＥ１５１０（ｐＭＧＢ１６５）の生存率はス クロースによっては影響を受けなかった。従ってｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺 伝子産物のポリメラーゼ活性は、スクロースを有する培地上でのｓａｃＢ［Ｂａ ｍＰ ］Ｗ２９による成長の阻害にとっては必須であった。それに加えこの実験に よりｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９の不活化を用いて、ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２ ９内にクローン化された挿入断片を含むＢ． スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌ ｉｓ ）のコロニーの成長についての選択を行うことができることが示唆された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年９月５日 【補正内容】 請求の範囲 １． （ｉ）（ａ）シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする突然 変異遺伝子であって、前記突然変異がスクロースの存在下で前記宿主細胞に致死 性を付与することが可能であり、前記遺伝子が追加的にレバンスクラーゼポリメ ラーゼ活性をコードし、かつ異種ＤＮＡの挿入に有用な適合性制限部位を含む突 然変異遺伝子； （ｂ）抗生物質耐性をコードする遺伝子； （ｃ）多重コピーとしてのベクターを保持するための宿主特異的複製起 点；および （ｄ）突然変異遺伝子の調節および発現のための適切な調節配列； を含む陽性選択ベクターを構築すること； （ｉｉ）異種ＤＮＡを単離すこと； （ｉｉｉ）前記単離された異種ＤＮＡを、前記突然変異遺伝子の前記適合性制 限部位内にクローニングすること（この場合、レバンスクラーゼポリメラーゼ活 性は破壊される）； （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）のベクターでコンピテント宿主細胞を形質転換させる こと（この場合、前記宿主細胞がスクロースを代謝する能力を保持しない）； （ｖ）前記形質転換させた宿主細胞をスクロースを含む適切な成長培地の存在 下でインキュベートすること；および （ｖｉ）スクロースの存在下で成長することができる形質転換体を単離するこ と； を含んでなる異種ＤＮＡで形質転換させたグラム（Ｇｒａｍ）陽性細菌宿主細胞 の陽性選択のための方法。 ２． 前記グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞が、バキルス エスピー（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ロドコックス エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓ ｐ．）、ノカルディア エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）、ストレプトミ セス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ストレプトコックス エ スピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、スタフィロコックス エスピ ー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム エスピー （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、およびクロストリディウム エ スピー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）からなる群より選択される請求の範 囲１に記載の方法。 ３． グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞が、バキルス スブチリス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バキルス プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕ ｍｉｌｕｓ ）、バキルス ロケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｏｃｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓ ）、バキルス アミロリキファキエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍ ｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ）、バキルス スルギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｔｈｕｒｇｉｅｎｓｉｓ）、バキルス ステアロセルモフィルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびバキルス スフ ェアリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈｅａｒｉｃｕｓ）からなる群より選択さ れる請求の範囲２に記載の方法。 ４． 前記グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞がｓａｃＢ遺伝子もしくはｓａｃ Ａ 遺伝子のいずれか、あるいはｓａｃＡ遺伝子とｓａｃＢ遺伝 子の両方を欠失する請求の範囲３に記載の方法。 ５． グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞がバキルス スブチリス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求の範囲３に記載の方法。 ６． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−１） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含む請求の範囲１に記載の方法。 ７． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−３） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含んでなる請求の範囲１に記載の方法。 ８． 前記突然変異遺伝子がｓａｃＢ［Ｂａｍｐ］Ｗ２９である請求の範囲１ に記載の方法。 ９． （ｉ）（ａ）ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子であって、前記遺伝子 がスクロースの存在下で前記宿主細胞に致死性を付与することができ、突然変異 レバンスクラーゼ酵素をコードし、かつ異種ＤＮＡの挿入に有用な適合性制限部 位を含むｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子； （ｂ）抗生物質耐性をコードする遺伝子； （ｃ）多重コピーとしてのベクターを保持するためのバキルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ）複製起点； （ｄ）ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子の調節および発現のための適 切な調節配列； を含む陽性選択ベクターを構築すること； （ｉｉ）異種ＤＮＡを単離すこと； （ｉｉｉ）前記単離された異種ＤＮＡを、前記ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］ Ｗ２９遺伝子の前記適合性制限部位内にクローニングすること； （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）のベクターでコンピテントバキルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ ）宿主細胞を形質転換させること（この場合、前記宿主細胞がスクロースを代 謝する能力を保持しない）； （ｖ）スクロースを含む適切な成長培地の存在下で前記形質転換させた宿主細 胞をインキュベートすること；および （ｖｉ）スクロースの存在下で成長することができる形質転換体を単離するこ と； を含んでなる異種ＤＮＡで形質転換させたバキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ ｓｐ．）宿主の陽性選択のための方法。 １０． 前記宿主細胞がｓａｃＢ遺伝子もしくはｓａｃＡ遺伝子のいずれか、あ るいはｓａｃＢ遺伝子とｓａｃＡ遺伝子の両方を欠失する請求の範囲９に記載の 方法。 １１． 異種ＤＮＡで形質転換させたグラム（Ｇｒａｍ）陽性細菌宿主細胞の陽 性選択のための陽性選択ベクターであって： （ｉ）シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする突然変異遺伝子で あって、前記突然変異がスクロースの存在下で前記宿主細胞に致死性を付与する ことができ、前記遺伝子が追加的にレバンスクラーゼポリメラーゼ活性をコード し、かつ異種ＤＮＡの挿入に有用な適合性制限部位を含む突然変異遺伝子； （ｉｉ）抗生物質耐性をコードする遺伝子； （ｉｉｉ）多重コピーとしてのベクターを保持するための宿主特異的複製起点 ；および （ｉｖ）突然変異遺伝子の調節および発現のための適切な調節配列； を含んでなるベクター。 １２． 前記突然変異体遺伝子がバキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ ．）から単離されたレバンスクラーゼ遺伝子である請求の範囲１１記載のベクタ ー。 １３． 多重コピーとしてのベクターを保持するための複製起点がバキルス エ スピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）に特異的である請求の範囲１１に記載のベ クター。 １４． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−１） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含んでなる請求の範囲１１に記載のベクター。 １５． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が配列番号 １に対応する核酸配列を有する請求の範囲１１に記載のベクター。 １６． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−３） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含んでなる請求の範囲１１に記載のベクター。 １７． ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ ６９９４５を有する請求の範囲１１に記載の陽 性選択ベクターを含む形質転換させたバキルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞。 １８． ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ ６９９４６を有する請求の範囲１１に記載の陽 性選択ベクターを含む形質転換させたバキルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）（ａ）シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする突然変 異遺伝子であって、前記遺伝子が追加的にレバンスクラーゼポリメラーゼ活性を コードし、かつ異種ＤＮＡの挿入に有用な適合性制限部位を含む突然変異体遺伝 子； （ｂ）抗生物質耐性をコードする遺伝子； （ｃ）多重コピーとしてのベクターを保持するための宿主特異的複製起 点；および （ｄ）突然変異遺伝子の調節および発現のための適切な調節配列； を含む陽性選択ベクターを構築すること； （ｉｉ）異種ＤＮＡを単離すこと； （ｉｉｉ）前記単離された異種ＤＮＡを、前記突然変異遺伝子の前記適合性制 限部位内にクローニングすること（この場合、レバンスクラーゼポリメラーゼ活 性は破壊される）； （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）のベクターでコンピテント宿主細胞を形質転換させる こと（この場合、前記宿主細胞はスクロースを代謝する能力を保持しない）； （ｖ）前記形質転換させた宿主細胞をスクロースを含む適切な成長培地の存在 下でインキュベートすること；および （ｖｉ）スクロースの存在下で成長することができる形質転換体を単離するこ と； を含んでなる異種ＤＮＡで形質転換させたグラム（Ｇｒａｍ）陽性細菌 宿主細胞の陽性選択のための方法。 ２． 前記グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞が、バキルス エスピー（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ロドコックス エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓ ｐ．）、ノカルディア エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）、ストレプトミ セス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ストレプトコックス エ スピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、スタフィロコックス エスピ ー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム エスピー （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、およびクロストリディウム エ スピー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）からなる群より選択される請求の範 囲１に記載の方法。 ３． グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞が、バキルス スブチリス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バキルス プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕ ｍｉｌｕｓ ）、バキルス ロケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｏｃｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓ ）、バキルス アミロリキファキエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍ ｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ）、バキルス スルギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｔｈｕｒｇｉｅｎｓｉｓ）、バキルス ステアロセルモフィルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびバキルス スフ ェアリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈｅａｒｉｃｕｓ）からなる群より選択さ れる請求の範囲２に記載の方法。 ４． 前記グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞がｓａｃＢ遺伝子もしくはｓａｃ Ａ 遺伝子のいずれか、あるいはｓａｃＡ遺伝子とｓａｃＢ遺伝子の両方を欠失す る請求の範囲３記載の方法。 ５． グラム（Ｇｒａｍ）陽性宿主細胞がバキルス スブチリス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求の範囲３記載の方法。 ６． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−１） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含む請求の範囲１記載の方法。 ７． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−３） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含む請求の範囲１記載の方法。 ８． 前記突然変異体遺伝子がｓａｃＢ［Ｂａｍｐ］Ｗ２９である請求の範囲 １記載の方法。 ９． （ｉ）（ａ）突然変異レバンスクラーゼ酵素をコードし、かつ異種ＤＮＡの挿 入に有用な適合性制限部位を含むｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子； （ｂ）抗生物質耐性をコードする遺伝子； （ｃ）多重コピーとしてのベクターを保持するためのバキルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ）複製起点； （ｄ）ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺伝子の調節および発現のための適 切な調節配列； を含む陽性選択ベクターを構築すること； （ｉｉ）異種ＤＮＡを単離すこと； （ｉｉｉ）前記単離された異種ＤＮＡを、前記ｓａｃＢ［ＢａｍＰ］Ｗ２９遺 伝子の前記適合性制限部位内にクローニングすること； （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）のベクターでコンピテントバキルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ）宿主細胞を形質転換させること（この場合、前記宿主細胞はスクロ ースを代謝する能力を保持しない）； （ｖ）スクロースを含む適切な成長培地の存在下で前記形質転換させた宿主細 胞をインキュベートすること；および （ｖｉ）スクロースの存在下で成長することができる形質転換体を単離するこ と； を含んでなる異種ＤＮＡで形質転換させたバキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ ｓｐ．）宿主の陽性選択のための方法。 １０． 前記宿主細胞がｓａｃＢ遺伝子もしくはｓａｃＡ遺伝子のいずれか、あ るいはｓａｃＢ遺伝子とｓａｃＡ遺伝子の両方を欠失する請求の範囲９に記載の 方法。 １１． 異種ＤＮＡで形質転換させたグラム（Ｇｒａｍ）陽性細菌宿主細胞の陽 性選択のための陽性選択ベクターであって： （ｉ）シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする突然変異遺伝子で あって、前記遺伝子が追加的にレバンスクラーゼポリメラーゼ活性をコードし、 かつ異種ＤＮＡの挿入に有用な適合性制限部位を含む突然変異遺伝子； （ｉｉ）抗生物質耐性をコードする遺伝子； （ｉｉｉ）多重コピーとしてのベクターを保持するための宿主特異的複製起点 ；および （ｉｖ）突然変異遺伝子の調節および発現のための適切な調節配列； を含んでなるベクター。 １２． 前記突然変異遺伝子がバキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ）から単離されたレバンスクラーゼ遺伝子である請求の範囲１ １に記載のベクター。 １３． 多重コピーとしてのベクターを保持するための複製起点がバキルス エ スピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）に特異的である請求の範囲１１に記載のベ クター。 １４． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−１） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含む請求の範囲１１に記載のベクター。 １５． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が配列番号 １に対応する核酸配列を有する請求の範囲１１に記載のベクター。 １６． シグナルペプチドプロセシング突然変異をコードする遺伝子が（−３） 位置に、トリプトファン、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択され るアミノ酸を含む請求の範囲１１に記載のベクター。 １７． ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ ６９９４５を有する請求の範囲１１に記載の陽 性選択ベクターを含む形質転換させたバキルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞。 １８． ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ ６９９４６を有する請求の範囲１１に記載の陽 性選択ベクターを含む形質転換させたバキルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞。