JPH11508134A

JPH11508134A - Obesity protein intermediates and their preparation and use

Info

Publication number: JPH11508134A
Application number: JP9503935A
Authority: JP
Inventors: ヘイル，ジョン・エドワード; マッケラー，ウォーレン・キャメロン
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-20
Publication date: 1999-07-21
Also published as: CA2224867A1; EP0833835A4; EP0833835A1; AU6284896A; WO1997000886A1

Abstract

(57)【要約】本発明は患者に投与した時に、脂肪組織を調節する抗肥満症蛋白質に関する。本発明は肥満症蛋白質再生経路の最終中間体を提供する。本発明はさらにこの中間体の製法およびその生物学的に活性な肥満症蛋白質またはその類似体を製造するための使用法を提供する。 (57) [Summary] The present invention relates to anti-obesity proteins that regulate adipose tissue when administered to a patient. The present invention provides the final intermediate of the obesity protein regeneration pathway. The present invention further provides a process for preparing this intermediate and its use for preparing a biologically active obesity protein or analog thereof.

Description

【発明の詳細な説明】肥満症蛋白質中間体およびその製法と使用本発明はヒト用医薬品、特に肥満症および肥満症関連疾患の処置、の分野に属する。最も特定的には、本発明は患者に投与した時に脂肪組織を調節する肥満症蛋白質を製造するために使用する中間体に関する。異種宿主生物での蛋白質産生は不活性で難溶な蛋白質凝集体すなわち封入体を形成する。このような封入体の形成は発現に起因する細胞内の高い蛋白質濃度の結果である。生物学的に活性な蛋白質を得るためには、封入体を変性して可溶化し、還元し、次に適当な条件に調整して在来型空間構造の蛋白質第三次元構造を形成しなければならない。Ｒ．Ｊａｅｎｉｃｋｅ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、４９巻：１１７〜２３７頁（１９８７年）。しかしながら、生物学的活性立体配座への再生は定量的過程ではない−−その蛋白質の非機能的種および立体配座が多数作成されることもある。生物学的活性立体配座を形成するように平衡を移動するには、不正な蛋白質立体配座の樹立を防止し、再生を妨害しない条件を選択する。ポリペプチド鎖を高度に整備された構造の立体配座に再生する方法を予測することは不可能とは言えないまでも困難なため、生物学的活性蛋白質の形成に偏る条件は予測できない。最近、ＹｉｙｉｎｇＺｈａｎｇとその共同研究者は肥満症および糖尿病にリンクするマウス遺伝子の位置的クローニングを発表した。ＹｉｙｉｎｇＺｈａｎｇほか、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：４２５〜３２頁（１９９４年）。この報告は専ら脂肪組織に発現し、２１アミノ酸の推測的シグナルペプチドを持つ１６７アミノ酸の蛋白質をコードする遺伝子を開示した。このペプチドは脂肪調節ホルモンであると推測されている。同様にして、ＭｕｒａｋａｍｉほかはＢｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ・Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０９（３）巻：９４４〜５２頁（１９９５年）に肥満ラット遺伝子および蛋白質を開示した。本発明は肥満症蛋白質への再生経路の最終中間体を提供する。本発明はさらにこの中間体の製法およびその生物学的活性肥満症蛋白質またはその類似体を製造するための使用を提供する。最も顕著な利点はこの中間体を経由することで生物学的活性蛋白質の本質的収率向上が観察されることである。この中間体は肥満症蛋白質の大量生産を可能にする顕著な生産上の利点も提供する。本発明は肥満症蛋白質またはその類似体への正しく折畳まれた中間体を提供する。さらに特定的には本発明は正しく折畳まれた式（Ｉ）：［式中、Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残基９５までから構成されるポリペプチドである。Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから構成されるポリペプチドである。Ｒ₁およびＲ₂は独立してＨであるか、またはそれが結合している硫黄とともに混合ジスルフィドを形成する。但し、Ｒ₁およびＲ₂の双方がＨであることはないものとする］で示される蛋白質を指向する。本発明は肥満症蛋白質またはその類似体をｐＨが約７から約１２までで、変性剤および濃度が約１から１００ｍＭまでのチオール還元剤を含有する溶液と混合することを包含する、式Ｉで示される蛋白質の製法も提供する。本発明はさらに式（ＩＩ）：［式中、Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残基９５までから構成されるポリペプチドである。Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから構成されるポリペプチドである］で示される正しく折畳まれた蛋白質の製法であって、（ａ）肥満症蛋白質封入体をこの蛋白質を可溶化するために十分な濃度の変性剤、および約７から約１２のｐＨで、約１から１００ｍＭまでの濃度のチオール還元剤を含有する溶液中に可溶化すること、（ｂ）この溶液のチオールおよび変性剤の濃度をジスルフィド結合形成が起きるまで低下させることを包含する製法を提供する。図面の説明図１はＺｏｒｂａｘ・Ｃ−８カラムでｐＨ７．６の５０ｍＭ−燐酸アンモニウム、０．５％ＳＤＳ、および５％ｎ−プロパノールである緩衝液Ａ、およびｐＨ７．６の５０ｍＭ−燐酸アンモニウム、０．５％ＳＤＳ、および５０％ｎ−プロパノールである緩衝液Ｂ、を使用して展開したＨＰＬＣクロマトグラムを示す。約３８５秒に出るピークは生物学的活性肥満症蛋白質を表し、後で約５７３秒に溶離するピークは実施例で製造した本発明の中間体を表す。本明細書中に開示し、請求する本発明の目的では次の用語および略号を以下の通りに定義する：塩基対（ｂｐ）−−はＤＮＡまたはＲＮＡに関連する。ＤＮＡ分子にある時、略号Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは（デオキシ）アデニン、（デオキシ）シトシン、（デオキシ）グアニン、および（デオキシ）チミンの各５’−モノホスフェート型ヌクレオチドに対応する。ＲＮＡ分子にある時、略号Ｕ、Ｃ、ＧおよびＴはウラシル、シチジン、グアニン、およびチミンの各５’−モノホスフェート型ヌクレオシドに対応する。２本鎖ＤＮＡでは、塩基対はＡとＴまたはＣとＧの組合せを示すこともある。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖では、塩基対はＴとＵまたはＣとＧの組合せを示すこともある。変性試薬または変性剤−−は当技術分野の熟練者に知られている。変性試薬の例はＲ．Ｊａｅｎｉｃｋｅ著、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、４９巻：１１７〜２３７頁（１９８７年）に記載されている。好適な試薬には尿素、チオシアネート、およびグアニジン、最も好ましくは６Ｍから８Ｍ− までの尿素を包含する。混合ジスルフィド−−はチオール還元試薬とポリペプチドのシステイニル残基の間でジスルフィド交換可能なその試薬から誘導された基を示す。肥満症蛋白質−−は肥満症遺伝子から転写およびイントロン除去、蛋白質への翻訳、および、たとえばＮ−末端バリン−プロリンからＣ−末端システインまでの成熟蛋白質からのプロセッシングなど、分泌シグナルペプチドを除去する成熟蛋白質へのプロセッシング、によって産生される蛋白質を示す。マウス肥満症蛋白質およびヒト肥満症蛋白質はＺｈａｎｇほか、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：４２５〜３２頁（１９９４年）に発表された。ラット肥満症蛋白質はＭｕｒａｋａｍｉほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ・ａｎｄ・Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ・Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０９（３）巻：９４４〜５２頁（１９９５年）に発表された。この明細書のアミノ酸番号は完全長成熟蛋白質のアミノ末端から順に数えたものである。この同一基準の番号付けは当技術分野の通常の熟練者がよく認めるところである。ヒト、マウス、ブタ、ウシ、およびラットの肥満症蛋白質では、ジスルフィド形成に関与するシステインは９６番および１４６番の残基にある。語句「Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残基９５までから構成されるポリペプチドである」はＮ−末端からジスルフィド結合形成に関与する第一のシステインまでのアミノ酸を含める意図である。語句「Ｂは基本的に肥満症蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから構成されるポリペプチドである」は第一のシステインからＣ−末端までのアミノ酸を含める意図である。天然変種または断片でのアミノ酸１個またはそれ以上の欠失ならびに、本発明の新規で基本的な特徴に影響を及ぼさない１４６位Ｃｙｓへの付加を含む、アミノ酸付加はＡおよびＢの定義内に包含するものと理解する。この蛋白質のアミノ酸残基の番号付直しは不必要であり、しかも混乱を招くこともある。例えば、特にマウスおよびヒトの肥満症蛋白質ではデスＧｌｎ（２８）変種が観察されている。このような変種は本発明に包含する意図である。肥満症蛋白質類似体は１個またはそれ以上のアミノ酸置換、好ましくは５個またはそれ以下、最も好ましくは３個またはそれ以下の置換を持つ肥満症蛋白質を示し、式（ＩＩＩ）：（配列番号１）［配列中、２３位のＸａａはＧｌｎまたは不在である、この蛋白質は次の置換を少なくとも１個有するものとする：４位のＧｌｎをＧｌｕで置換、７位のＧｌｎをＧｌｕで置換、２２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐで置換、２７位のＴｈｒをＡｌａで置換、２８位のＸａａをＧｌｕで置換、３４位のＧｌｎをＧｌｕで置換、５４位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙで置換、５６位のＧｌｎをＧｌｕで置換、６２位のＧｌｎをＧｌｕで置換、６３位のＧｌｎをＧｌｕで置換、６８位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙで置換、７２位のＡｓｎをＧｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐで置換、７５位のＧｌｎをＧｌｕで置換、７７位のＳｅｒをＡｌａで置換、７８位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐで置換、８２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐで置換、９７位のＨｉｓをＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏで置換、１００位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕで置換、１０１位のＡｌａをＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌで置換、１０２位のＳｅｒをＡｒｇで置換、１０３位のＧｌｙをＡｌａで置換、１０５位のＧｌｕをＧｌｎで置換、１０６位のＴｈｒをＬｙｓまたはＳｅｒで置換、１０７位のＬｅｕをＰｒｏで置換、１０８位のＡｓｐをＧｌｕで置換、１１１位のＧｌｙをＡｓｐで置換、１１８位のＧｌｙをＬｅｕで置換、１３０位のＧｌｎをＧｌｕで置換、１３４位のＧｌｎをＧｌｕで置換、１３６位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙで置換、１３８位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕで置換、または１３９位のＧｌｎをＧｌｕで置換］で開示される蛋白質またはその医薬的に許容される塩を包含する。正しい折り畳みの肥満症蛋白質またはその類似体は肥満症および、たとえば糖尿病、循環器病および癌腫のような、肥満症に関連する病状の処置に有用な生物学的活性蛋白質を与える立体配座または３次構造をとる蛋白質である。Ｏｂ遺伝子−−はＺｈａｎｇほか、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：４２５〜３２頁（１９９４年）およびＭｕｒａｋａｍｉほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ・ａｎｄ・Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｃｏｍｍ．２０９（３）巻：９４４〜５２頁（１９９５年）に開示された在来型Ｏｂ遺伝子遺伝子配列にハイブリダイズし、また少なくとも５０％相同的、好ましくは７０％相同的、最も好ましくは８０％相同的な核酸配列のいずれかを示す。このＯｂ遺伝子産物は脂肪組織に特異的に発現され、エネルギーの平衡を調節する。肥満症蛋白質封入体−−は回収すべき肥満症蛋白質を少なくとも部分的に含有する不溶性蛋白質凝集体または細胞質凝集体を示す。同様にして、肥満症蛋白質類似体を製造する時は、封入体は回収すべき肥満症蛋白質類似体を少なくとも部分的に含有する不溶性蛋白質凝集体または細胞質凝集体を示す。プラスミド−−は染色体外の自己複製遺伝子エレメントである。読取り枠−−はヌクレオチド配列であって、それからｔ−ＲＮＡの翻訳装置、リボソームおよび関連因子、によってトリプレットで「読み」取られて翻訳が起きるもので、各トリプレットは特定のアミノ酸に対応する。トリプレットは各々別個で、同じ長さなので、コード配列は３の倍数でなければならない。塩基一対の挿入または欠失（フレームシフト突然変異と呼ばれる）は同じＤＮＡセグメントがコードする２種類の異なる蛋白質を与えることもある。これを確実に回避するため、所望ポリペプチドに対応するトリプレットコドンは開始コドンから３の倍数で並んでいなければならない、すなわち正しい「読取り枠」を維持しなければならない。組換えＤＮＡクローニングベクター−−は別のＤＮＡセグメント１個またはそれ以上を付加できるか、または付加してあるＤＮＡ分子から構成される自律的に複製する作因のいずれかであって、これに限定するものではないが、プラスミドおよびファージを含む。組換えＤＮＡ発現ベクター−−はプロモーターが組込まれている組換えＤＮＡクローニングベクターのいずれかである。レプリコン−−はプラスミドまたはその他のベクターの自律的複製を制御し、可能にするＤＮＡ配列である。Ｒ₁およびＲ₂は独立してＨであるか、またはそれが結合している硫黄とともに混合ジスルフィドを形成する、この混合ジスルフィドはジスルフィド交換が可能なチオール還元試薬から誘導するものであると認識され、理解される。適当なチオール試薬には混合ジスルフィドを形成でき、およびジスルフィド交換を作動できる遊離の−ＳＨを含むメルカプト試薬の１種またはそれ以上を包含する。それ故、チオールには、これに限定するものではないが、システイン、２−メルカプトエタノール、グルタチオニン、システアミン、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、その他を包含する。たとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）のようなチオール試薬も本発明に包含する、しかし、この試薬で形成する混合ジスルフィドが不安定なため好適さは劣る。従って、Ｒ₁ またはＲ₂で表される好適な基はＳＯ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ（ＮＨ₂）（ＣＯＯＨ）、ＳＣＨ₂ＣＨＮＨ₂、ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、およびＨ₂ＮＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ₂ＣＨ₂ ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ₂Ｓ）ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＯＯ^-を含む。但し、Ｒ₁およびＲ₂の両方がＨであることはないものとする。転写−−はＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報が相補的ＲＮＡ配列に伝達される過程である。翻訳−−メッセンジャーＲＮＡの遺伝子情報を用いてポリペプチド鎖の合成を特定し、指示する過程である。トリス−−はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの略称である。処置−−は疾病、病状または障害を改善する目的で患者を管理し、看護することを記述し、疾病、病状または障害の症状または合併症の発症を防止し、症状または合併症を緩解し、排除するため、本発明化合物を投与することを含む。それ故、肥満症の処置にはそれを必要とする患者における食事摂取の阻止、体重増加の阻止、および体重減少の誘導を含む。ベクター−−は遺伝子操作において細胞の形質転換のために使用するレプリコンであって、適当な蛋白質分子に対応するポリヌクレオチド配列を有し、適当な制御配列と組合せると形質転換する宿主細胞に特定の性質を与える。プラスミド、ウイルス、およびバクテリオファージは本来レプリコンなので、適切なベクターである。人工的ベクターは制限酵素および連結酵素を用いて異なる起源から得たＤＮＡ分子を切断し、結合して構築する。ベクターには組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換えＤＮＡ発現ベクターを包含する。アミノ酸の略号は３７ＣＦＲ§１．８２２（ｂ）（２）（１９９３年）に記載の通り、米国特許商標庁が承認するものである。当技術分野の熟練者はある種のアミノ酸に転位を起こす傾向があることを認識していることであろう。例えば、１４巻：４８５〜９４頁（１９７９年）およびその引用文献に記載の通り、Ａｓｐはアスパルチミドおよびイソアスパリギンに転位することもある。これらの転位誘導体は本発明の範囲内に含める。特段の記載がない限り、アミノ酸はＬ−配置である。前記の通り、本発明は式（Ｉ）：［式中、Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残基９５までから構成されるポリペプチドである。Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから構成されるポリペプチドである。Ｒ₁およびＲ₂は独立してＨであるか、またはそれが結合している硫黄とともに混合ジスルフィドを形成する。但し、Ｒ₁およびＲ₂の双方がＨであることはないものとする］で示される蛋白質を提供する。好適な態様ではＡは式：（配列番号２）［配列中、Ｒ₃は不在であるか、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｒ₄、またはリーダー配列である。Ｒ₄はＰｒｏ以外のアミノ酸のいずれかである。２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である。４位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、７位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、２２位のＡｓｎは所望ならＧｌｎまたはＡｓｐに置換する、２７位のＴｈｒは所望ならＡｌａに置換する、２８位のＸａａは所望ならＧｌｕに置換する、３４位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、５４位のＭｅｔは所望ならメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する、５６位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、６２位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、６３位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、６８位のＭｅｔは所望ならメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する、７２位のＡｓｎは所望ならＧｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐに置換する、７５位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、７７位のＳｅｒは所望ならＡｌａに置換する、７８位のＡｓｎは所望ならＧｌｎまたはＡｓｐに置換する、または８２位のＡｓｎは所望ならＧｌｎまたはＡｓｐに置換する］で示されるポリペプチドである。その他の好適な態様にはＡが式：（配列番号２）［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］で示されるポリペプチであるものを含む。さらに別の好適な態様にはＢが式：（配列番号３）［配列中、９７位のＨｉｓは所望ならＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換する、１００位のＴｒｐは所望ならＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換する、１０１位のＡｌａは所望ならＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換する、１０２位のＳｅｒは所望ならＡｒｇに置換する、１０３位のＧｌｙは所望ならＡｌａに置換する、１０５位のＧｌｕは所望ならＧｌｎに置換する、１０６位のＴｈｒは所望ならＬｙｓまたはＳｅｒに置換する、１０７位のＬｅｕは所望ならＰｒｏに置換する、１０８位のＡｓｐは所望ならＧｌｕに置換する、１１１位のＧｌｙは所望ならＡｓｐに置換する、１１８位のＧｌｙは所望ならＬｅｕに置換する、１３０位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、１３４位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、１３６位のＭｅｔは所望ならメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する、１３８位のＴｒｐは所望ならＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換する、または１３９位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する］で示されるポリペプチドである蛋白質を含む。他の好適な態様にはＢが式：（配列番号３）［配列中、１００位のＴｒｐは所望ならＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換する］で示されるポリペプチである蛋白質を含む。当技術分野の熟練者は肥満症蛋白質またはその類似体の原核生物発現系での生産では蛋白質のＮ−末端にＮ−末端延長付加物を有する蛋白質を発現することが必要なことを認識しているであろう。このＮ−末端延長は所望ならば投与の前に蛋白質から切断する。好適なＮ−末端延長はＭｅｔまたはＭｅｔ−Ｒ₄であり、ここにＲ₄はＰｒｏを除いたアミノ酸のいずれかである。本発明はまた精製またはその他の目的に使用してもよいアミノ酸リーダー配列１個またはそれ以上を所望ならばＡに含む蛋白質も包含する。最も好適なリーダー配列には次のものを含む：（配列番号４）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、（配列番号５）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、（配列番号６）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ａｌａ、（配列番号７）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、（配列番号８）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−、（配列番号９）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、および（配列番号１０）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−。このようなＮ−末端延長および／またはリーダー配列はこの発明の基本的な特性および新規性のある特性には影響を及ぼさない。式（Ｉ）で示される化合物は生物学的活性肥満症蛋白質の折り畳み中間体である。好適な肥満症蛋白質は在来型配列および、たとえばＢａｓｉｎｓｋｉほか、１９９５年２月６日出願の米国出願番号０８／３８３６３８号および１９９６年１月１９日出願の出願番号０８／５８８０６１号に記載されている式（ＩＩＩ）で示される類似体である。マウスおよびウシの配列はＨａｎｓｅｎ・Ｍ．ＨｓｉｕｎｇおよびＤｅｎｎｉｓ・Ｐ．Ｓｍｉｔｈ、１９９５年５月１９日出願の米国特許出願番号０８／４４５３０５号に記載されており、ここに参考のために引用する。本発明の最も好適な蛋白質には式（ＩＩＩ）、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４で示される蛋白質を包含する。（配列番号１１）［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］（配列番号１２）（配列番号１３）［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］ヒト肥満症蛋白質（配列番号１４）［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］本発明のその他の好適な蛋白質は式（ＩＩＩ）で示される蛋白質であって、その式中：４位のＧｌｎをＧｌｕに置換、７位のＧｌｎをＧｌｕに置換、２２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、２７位のＴｈｒをＡｌａに置換、２８位のＧｌｎをＧｌｕに置換、３４位のＧｌｎをＧｌｕに置換、５４位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、またはＡｌａに置換、５６位のＧｌｎをＧｌｕに置換、６２位のＧｌｎをＧｌｕに置換、６３位のＧｌｎをＧｌｕに置換、６８位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、またはＬｅｕに置換、７２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、７５位のＧｌｎをＧｌｕに置換、７８位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、８２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、１３０位のＧｌｎをＧｌｕに置換、１３４位のＧｌｎをＧｌｕに置換、１３６位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅに置換、または１３９位のＧｌｎをＧｌｕに置換、したものである。その他の好適な蛋白質は式（ＩＩＩ）で示される蛋白質であって、その式中、２２位のＡｓｎをＧｌｕまたはＡｓｐに置換、２７位のＴｈｒをＡｌａに置換、５４位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、またはＡｌａに置換、６８位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、またはＬｅｕに置換、７２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、７８位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、８２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、または１３６位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅに置換、したものである。さらになお追加的に好適な蛋白質は式（ＩＩＩ）で示される蛋白質であって、その式中、２２位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、２７位のＴｈｒをＡｌａに置換、５４位のＭｅｔをＬｅｕ、またはＡｌａに置換、６８位のＭｅｔをＬｅｕに置換、７２位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、７８位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、８２位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、または１３６位のＭｅｔをＬｅｕ、またはＩｌｅに置換、したものである。最も顕著な利点のある他の好適な態様は配列番号１で示される蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１１１までおよび／またはアミノ酸残基１３８での特異的な置換体である。この置換体は安定性が顕著に改善され、優れた治療薬を与える。この特定蛋白質はさらに製剤化し易く、医薬的に単純精密で、治療用量の送達に優れている。従って、好適な態様は式（ＩＶ）：（配列番号１）［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である、この蛋白質は次の置換から構成される群から選択した置換を少なくとも１個有する：９７位のＨｉｓをＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換、１００位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換、１０１位のＡｌａをＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換、１０２位のＳｅｒをＡｒｇに置換、１０３位のＧｌｙをＡｌａに置換、１０５位のＧｌｕをＧｌｎに置換、１０６位のＴｈｒをＬｙｓまたはＳｅｒに置換、１０７位のＬｅｕをＰｒｏに置換、１０８位のＡｓｐをＧｌｕに置換、１１１位のＧｌｙをＡｓｐに置換、または１３８位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換］で示される蛋白質またはその医薬的に許容される塩である。好適な蛋白質は式（Ｖ）：（配列番号１５）で示される蛋白質またはその医薬的に許容される塩であって、その蛋白質は次の置換から構成される群から選択した置換を少なくとも１個有する：９７位のＨｉｓをＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏに置換、１００位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換、１０１位のＡｌａをＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換、１０２位のＳｅｒをＡｒｇに置換、１０３位のＧｌｙをＡｌａに置換、１０５位のＧｌｕをＧｌｎに置換、１０６位のＴｈｒをＬｙｓまたはＳｅｒに置換、１０７位のＬｅｕをＰｒｏに置換、１０８位のＡｓｐをＧｌｕに置換、１１１位のＧｌｙをＡｓｐに置換、または１３８位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換。式（Ｖ）で示される、さらに好適な蛋白質は次のものである：９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏに置換されている、１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＬｅｕに置換されている、１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換されている、１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換されている、１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換されている、１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換されている、１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換されている、１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換されている、または１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換されている。式（Ｖ）で示される、その他の好適な蛋白質は次のものである：９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換されている、１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕに置換されている、１０１位のＡｌａがＴｈｒに置換されている、または１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＬｅｕに置換されている。式（Ｖ）で示される、さらに別の好適な蛋白質は次のものである：９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換されている、１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕに置換されている、１０１位のＡｌａがＴｈｒに置換されている、または１３８位のＴｒｐがＧｌｎに置換されている。式（Ｖ）で示される最も好適な種は配列番号１６および１７の分子種を含む。（配列番号１６）（配列番号１７）最も顕著な利点は、本発明は肥満症蛋白質の生物学的活性蛋白質立体配座への非常に効率的な変換を誘導する中間体を提供する。それ故、本発明中間体を製造することによって生物学的活性蛋白質の３次構造が最初に形成される。こうしてジスルフィド結合の殆ど定量的な変換が可能になる。Ｓ−Ｓリンク二量体またはその他の多量体の形成は減少する。本発明の蛋白質は組換えＤＮＡ技術によってまたは、たとえば液相または固相ペプチド合成または蛋白質断片から始めて通常の液相法を経て組合せた半合成のようなよく知られている化学操作法によって調製する。式（ＩＩＩ）または配列番号１１、１２、１３、または１４で示される蛋白質は組換え合成によって調製するのが好ましい。好収率を望むなら組換え法が好適である。蛋白質組換え生産の基本的工程には次の段階を含む：ａ）その蛋白質をコードする合成または半合成（または天然起源から分離）ＤＮＡの構築、ｂ）その蛋白質の単独蛋白質または融合蛋白質として発現に適する様式によるそのコード配列の発現ベクターへの組込み、ｃ）その発現ベクターによる適当な原核生物宿主細胞の形質転換、およびｄ）組換え生産蛋白質の回収および精製。ａ．遺伝子構築試験管内または生体内での転写および翻訳が蛋白質の生産を起こす合成遺伝子は当技術分野でよく知られている技術で構築してもよい。遺伝子コードの天然縮重のため、熟練した専門家はこの蛋白質をコードする多数であるが限定された数のＤＮＡ配列が構築しうることを認識するであろう。本発明の好適な実行では、合成を組換えＤＮＡ技術で達成する。合成遺伝子構築の方法論は当技術分野でよく知られている。例えばＢｒｏｗｎほか（１９７９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、ＮＹ、６８巻：１０９〜１５１頁参照。合成蛋白質遺伝子に対応するＤＮＡ配列はたとえばＡｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８０Ａ型または３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、８５０リンカーンセンタードライブ・フォスター市、ＣＡ９４４０４から購入できる）のような通常のＤＮＡ合成装置を用いて作製してもよい。適用によっては、融合蛋白質構築物からシグナルペプチドの制御された切除を促進するため好都合なプロテアーゼ感受性切断部位をたとえばシグナルペプチドと構造蛋白質の間などに導入するように蛋白質のコード配列を修正することが望ましいこともある。例えばＭ１３プライマー突然変異誘発など、既知配列を持つＤＮＡの所定部位に置換突然変異を起こす技術はよく知られている。本抗肥満症蛋白質をコードするＤＮＡに誘発する突然変異は配列を読取り枠の外に出してはならず、また二次的ｍＲＮＡ構造を作ることがあるかも知れない相補領域を作成しないものが好ましい。ＤｅＢｏｅｒほか、欧州特許第７５４４４Ａ号（１９８３年）参照。本蛋白質をコードする遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて作製してもよい。鋳型はｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社またはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入できる）でも、ヒト脂肪組織から分離したｍＲＮＡでもよい。その方策は当技術分野でＭａｎｉａｔｉｓほか、「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）などによく知られている。ｂ．融合蛋白質の直接的発現この肥満症蛋白質は直接的発現によって、またはこの蛋白質を含む融合蛋白質として、製造した後に酵素的または化学的切断をしてもよい。ポリペプチドを特定部位で切断して消化するか、またはペプチド鎖のアミノ末端（たとえばジアミノペプチダーゼ）またはカルボキシ末端から切断する種々のペプチダーゼ（たとえばトリプシン）が知られている。さらにその上、特殊な化学薬品（たとえばシアノーゲンブロミド）にはポリペプチド鎖を特定部位で切断する。熟練した専門家は部位特異的な内部切断部位を導入するためのアミノ酸配列（および組換え手法を採用するなら合成的または半合成的コード配列）への必要な修正を認識するものであろう。例えば「蛋白質の精製：分子機構から大量生産まで（Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ・ｔｏ・Ｌａｒｇｅ・Ｓｃａｌｅ・Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」、米国化学会、ワシントン、ＤＣ（１９９０年）、第１３章のＣａｒｔｅｒ，Ｐ．、融合蛋白質の部位特異的蛋白質分解（Ｓｉｔｅ・Ｓｐｅｃｉｆｉｃ・Ｐｒｏｔｅｏｌｙｉｓｉｓ・ｏｆ・Ｆｕｓｉｏｎ・Ｐｒｏｔｅｉｎ）参照。ｃ．ベクターの構築所望のコード配列および制御配列を含有する適当なベクターの構築は標準的な連結技術を採用する。分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を制限酵素によって消化し、仕立て、連結して必要なプラスミドを形成する。所望蛋白質に翻訳させるため、適切な組換えＤＮＡ発現ベクター多数の何れかに適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて加工した合成ＤＮＡ配列を挿入する。合成コード配列は転写物の両端に制限エンドヌクレアーゼ部位を持つように設計して発現プラスミドからの分離および増幅プラスミドへの挿入を促進する。分離したｃＤＮＡコード配列は当技術分野でよく知られている技術によって所望クローニングベクターへのこの配列挿入を促進するため合成リンカーを使用することによって容易に修飾しうる。採用する特定エンドヌクレアーゼは採用する親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンによって支配される。制限部位の選択では制御配列とともにコード配列が正しい方向に向くように選択して正しい枠内読取りおよび蛋白質発現を達成させる。一般に、宿主細胞に適合する種に由来するプロモーターおよび制御配列を含有するプラスミドベクターを用いる。通常、このベクターは複製部位ならびに形質転換された細胞に表現型選択を与えることのできるマーカー配列を有する。例えば、大腸菌は典型的には大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換する（Ｂｏｌｉｖａｒほか、Ｇｅｎｅ、２巻：９５頁（１９７７年））。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、形質転換細胞の容易な確認手段を提供する。このｐＢＲ３２２プラスミドまたはその他の微生物プラスミドは組換えＤＮＡ技術で通常に使用するプロモーターおよびその他の制御エレメントを含んでいるか、または含めるように修正しなければならない。所望のコード配列は宿主細胞内で機能するプロモーターおよびリボソーム結合部位の両者から転写翻訳するために正しい方向に発現ベクターに挿入する。かかる発現ベクターの例はＢｅｌａｇａｊｅほか、米国特許第５３０４４９３号に記載のプラスミドであって、その教示を参考のために引用する。米国特許第５３０４４９３号に記載のあるＡ−Ｃ−Ｂプロインスリンをコードする遺伝子は制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでプラスミドｐＲＢ１８２から除去できる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子はプラスミド骨格のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限断片カセットに挿入できる。ｄ．原核生物発現一般に本発明に有用なベクターを構築するには原核生物を使用してＤＮＡ配列をクローニングする。例えば大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）は殊に有用である。その他の使用しうる微生物株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ３１５３７）を含む。これらの例は単なる例示であって、限定ではない。また、原核生物は組換え蛋白質の発現にも使用する。前記の株ならびに大腸菌Ｗ３１１０株（原栄養株、ＡＴＣＣ２７３２５）、枯草菌のようなバチラス種、およびその他サルモネラ・ティフィムリウムまたはセラチア・マルセッセンスのような腸内細菌類、および種々のシュードモナス種も利用しうる。原核生物宿主における使用に適するプロモーターにはβ−ラクタマーゼプロモーターシステム（ベクターｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ３９３４４］はレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する）、乳糖プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇほか、Ｎａｔｕｒｅ、２７５巻：６１５頁（１９７８年）；Ｇｏｅｄｄｅｌほか、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：５４４頁（１９７９年））、アルカリホスファターゼ、トリプトフアン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（ベクターｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ３７６９５］はｔｒｐプロモーター制御下にｔｒｐＥ融合蛋白質として読取り枠の発現を促進するように設計されている）およびたとえばｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤＲ５４０、ＡＴＣＣ３７２８２から分離できる）のようなハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、ヌクレオチド配列が一般に知られている他の機能的細菌プロモーターに本蛋白質をコードするＤＮＡをリンカーまたはアダプターを用いて連結し、必要な制限部位を供給することが当技術分野の熟練者には可能になる。細菌系で用いるプロモーターに蛋白質をコードするＤＮＡに作動可能に連結するシャイン−ダルガノ配列を含めるとよい。次の製造例は本明細書に記載する蛋白質の製造法をさらに例示するために提供するものである。製造例１Ｎ−末端延長Ｍｅｔ−Ａｒｇとともに配列番号１４の蛋白質をコードするＤＮＡ配列は標準的ＰＣＲ法を使用して調製した。正方向プライマー（５’−ＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＡＣ、配列番号１８）および逆方向プライマー（５’−ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴ、配列番号１９）を使用してヒト肥満細胞ライブラリー（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社から購入できる）から得た配列を増幅した。このＰＣＲ産物をＰＣＲ・Ｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入できる）にクローニングし、配列決定した。製造例２ベクター構築所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含めて構築する。クローニングしたＰＣＲ産物を有するプラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化する。小さな〜４５０ｂｐ断片をゲル精製し、Ａ−Ｃ−Ｂプロインスリンをコードする配列を除去したベクターｐＲＢ１８２に連結する。連結産物でＥ．ｃｏｌｉ・ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ− ＢＲＬ社から購入できる）を形質転換し、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ添加トリプトン−イースト（ＤＩＦＣＯ社）プレート上で増殖するコロニーを分析する。プラスミドＤＮＡを分離し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動で分離する。所期の〜４５０ｂｐＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位断片を含むプラスミドを保存する。Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｂ・ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＯＧＥＮ社から購入できる）をこの蛋白質産生用培養に適する第二の発現プラスミドで形質転換する。前記のベクターで細胞を形質転換する技術は当技術分野でよく知られており、たとえばＭａｎｉａｔｉｓなど（１９８８年）「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓs社、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨークまたは「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８９年）とその補遺のような一般的参考文献にも見出される。本明細書に例示するような本発明の好適な実行に使用するＥ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換に関する技術は当技術分野でよく知られている。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を培養する精密な条件は採用するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞系列および発現またはクローニングベクターの性質に依存する。例えばｃ１８５７温度誘導性ラムダ−ファージプロモーター−オペレーター領域のような温度誘導性プロモーター−オペレーター領域を導入したベクターは蛋白質合成を誘導するために約３０℃から約４０℃への温度シフトが必要である。本発明の好適な態様ではＥ．ｃｏｌｉ・Ｋ１２・ＲＶ３０８細胞を宿主細胞として採用するが、これに限定するものではないが、たとえばＥ．ｃｏｌｉ・Ｋ１２・Ｌ２０１、Ｌ６８７、Ｌ６９３、Ｌ５０７、Ｌ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６９５、Ｌ８１４（Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｂ）のようなその他多数の細胞系列も採用できる。次に発現プラスミドに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質の選択圧下の適当な培地に形質転換した宿主細胞を塗布する。次に採用する宿主細胞系列に適する時間と温度で培養物をインキュベーションする。高レベルの細菌発現システムで発現すると、蛋白質は凝集し、過剰発現蛋白質を高濃度で含む顆粒体または封入体を形成することが多い。ＧｉｅｒａｓｃｈとＫｉｎｇ編、「蛋白質の折畳み（Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｆｏｌｄｉｎｇ）」中、Ｋｒｅｕｇｅｒなど、Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ・ｆｏｒ・ｔｈｅ・Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ・ｏｆ・Ｓｃｉｅｎｃｅ・Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第８９−１８Ｓ、ワシントン、ＤＣ。蛋白質を可溶化するため十分な濃度の変性剤、好ましくは約６Ｍから８Ｍまでの尿素でｐＨ約７からｐＨ約１２まで、より好ましくは８から１２までのｐＨ、に肥満症蛋白質を含む封入体を可溶化する。最も好ましくは、封入体を約６Ｍから７Ｍ−尿素にｐＨ約８から１０で可溶化する。所望の蛋白質濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬからその溶液における本蛋白質の溶解度まで、より好ましくは０．１から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬから５．０ｍｇ／ｍＬである。これらの条件下に本蛋白質は変性する。変性した蛋白質分子は注意深く制御した条件で再生を行うと在来型立体配座を再取得する。しかしながら、生物学的活性立体配座への再生は定量的な過程ではなく、分子の非機能的種および立体配座が多数形成することもある。本発明はこの再生における鍵となる中間体を提供するものである。本発明の中間体は約１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭから２０ｍＭ、最も好ましくは１ｍＭから１０ｍＭのチオール還元剤を添加することによって製造する。このチオール型還元剤はジスルフィド交換を作動できる遊離−ＳＨを含み、好ましくはシステイン、シスタミン、ＢＭＥ、その他である。好適なチオール試薬はシステインおよびシステアミンである。本発明の中間体は約１分間から２４時間に生成する。この中間体は濾過、クロマトグラフィーまたはその他の通常の方策によって精製できる。この中間体は正しい３次構造（在来型立体配座）を有するので、この中間体は生物学的活性治療剤として使用でき、効果または作用の始動にも利点を示すであろう。しかしながら、この中間体を式ＩＩＩで示される生物学的活性蛋白質に変換するのが好ましい。最も予想が外れたのは、この中間体から生物学的活性蛋白質への変換が極めて効率的で、凝集した蛋白質の沈降が殆どまたは全く認められず、共有結合二量体または高次な多量体の形成が最低だったことである。混合ジスルフィド形成によるこの蛋白質のシステイン残基の保護および中間体の形成によってジスルフィド結合形成とほとんど無関係な３次構造形成が可能になる。この条件は生物学的活性単量体蛋白質における分子内ジスルフィド結合形成に有利に働く。溶液中のチオール還元試薬濃度および変性剤濃度を低下させることによってこの中間体にジスルフィド結合を形成させて式ＩＩで示される生物学的活性蛋白質に変換する。チオールおよび変性剤の減少は希釈、透析、透析濾過またはその他の当技術分野で認められている技術によって実行してもよい。好ましくは、封入体の可溶化と中間体の形成の後、溶液を蛋白質濃度約０．０５ｍｇ／ｍＬから約５．０ｍｇ／ｍＬ、およびチオール約１ｍＭから２０ｍＭまで希釈し、次に透析または透析濾過をする。好ましくは、透析または透析濾過に使用する緩衝液はＰＢＳ（約５ｍＭから約１０ｍＭ−燐酸および５０ｍＭから５００ｍＭ−ＮａＣｌの燐酸緩衝食塩水）、ｐＨ約７．０から１２．０、より好ましくは７．５から９．０である。その他の適当な緩衝液には、これに限定するものではないが、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）を含む。好ましくは、チオール還元剤および変性剤の濃度はＰＢＳまたは約５ｍＭから１０ｍＭ−ＴＲＩＳに対する透析濾過または透析によって低下させる。この中間体から生物学的活性立体配座への変換は最も顕著な利点である−−定量的変換に近い。そこで、この中間体を経ることにより、式ＩＩで示される生物学的活性蛋白質が高収率で産生される。この中間体の形成で遊離ＳＨから直接に行う折畳みよりも高蛋白質濃度で折畳みを行うことが可能になる。好適な範囲は０．０５から５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１から３ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１．０から２ｍｇ／ｍＬである。高濃度での折畳みは低容積（小さいタンク）および下流での操作減少を意味する。この折畳みは蛋白質凝集防止用グリセリンまたはその他の添加試薬の不在下に行ってもよい。このような試薬、殊にグリセリン、は下流の精製において除去しなければならないので、この試薬不在下に折畳みする性能は多量生産では顕著な利点である。そこで、この中間体を経て操作することによって、本発明は式ＩＩで示される蛋白質の効率的な製法をさらに提供する。すなわち：（ａ）蛋白質を可溶化するために十分な濃度の変性剤およびｐＨ約７から約１２まで、濃度１ｍＭから１００ｍＭまでのチオール還元試薬を含む溶液に肥満症蛋白質封入体を可溶化すること、および（ｂ）この溶液のチオールおよび変性剤の濃度を低下させてジスルフィド結合を形成させること、からなる。好ましくは、約６から８Ｍ−尿素および約３から７ｍＭ−システイン添加８ｍＭから１２ｍＭ−トリス緩衝液中、ｐＨ約８から１２、さらに好ましくはｐＨ約８から１０で封入体を添加して可溶化する。この条件で混合ジスルフィド中間体が形成され、所望ならば濾過および／またはクロマトグラフィーによって精製する。顕著な利点はこの中間体から鎖内単一ジスルフィドが形成する効率が希釈、透析濾過または透析前のチオール還元試薬の追加によって増大することである。好ましくはチオールを過剰当量−−好ましくは１から６０００倍、より好ましくは３から６０００倍過剰に−−添加する。最も好ましくは、５ｍＭのチオール、好ましくはシステイン、を添加する。生物学的活性蛋白質に変換した後、この蛋白質を反応混合物から、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、その他のような当技術分野で認められている技術によって精製する。式（Ｉ）で示される中間体は変性剤の存在下または不在下に安定である。この中間体はＰＢＳに可溶性であって、正しい３次構造の形成を示唆する。所望ならば、この中間体はサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換、逆相クロマトグラフィーを含む当技術分野で知られている技術によって精製してもよい。この中間体はＨＰＬＣで特性解析した。代表的な本発明中間体のクロマトグラムを図１に示す。さらにその上、この中間体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で生物学的活性蛋白質よりも移動の遅い分子種として確認される。以下の実施例はさらに本明細書に記載する本発明を例示するために提供する。本発明の範囲が下記実施例のみから構成されるものとは理解すべきではない。比較実施例１配列番号１４で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。顆粒体を６Ｍ−グアニジンＨＣｌ、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１ｍＭ− ＤＴＴに室温、１時間で可溶化した。本発明の混合ジスルフィドはこの条件では検出できなかった。肥満症蛋白質のシステインはこの条件下にプロトン化されて（−ＳＨ）を形成する。溶解した蛋白質を遠心分離により透明にし、よく混合しながら２０％グリセリン、５ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、５ｍＭ−ＣａＣｌ₂で最終蛋白質濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬまで希釈（希釈倍率１：１５００）することによって透明になった蛋白質溶液の再生を開始した。この溶液は希釈直後に濁り、蛋白質凝集が認められた。希釈した蛋白質溶液を室温で８時間混合せずに放置後、固体トリス塩基を１０ｍＭまで加えて溶液のｐＨを８．６８に上昇させた。この溶液を遠心分離で透明にし、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−質量分析によって分析した。分析結果はこの蛋白質の通算回収率６８％を示し、その中で７％は共有結合性二量体であって、単量体蛋白質６３％を回収し、蛋白質３２％を損失した。比較実施例２配列番号１４で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。顆粒体を６Ｍ−グアニジンＨＣｌ、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１ｍＭ− ＤＴＴに蛋白質濃度１．３ｍｇ／ｍＬで室温、１時間で可溶化した。本発明の混合ジスルフィドはこの条件下には検出できなかった。システインはこの条件下にプロトン化されて（−ＳＨ）を形成する。可溶化した蛋白質を遠心分離により透明にし、よく混合しながら２０％グリセリン、２０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．４）、２.５ｍＭ−ＣａＣｌ₂で最終蛋白質濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬまで希釈（希釈倍率１：５５）することによって透明になった蛋白質溶液の再生を開始した。希釈蛋白質溶液を室温で１８時間混合せずに放置した。この溶液を遠心分離で透明にし、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ、およびＥＳＩ−質量分析によって分析した。分析結果はこの蛋白質の通算回収率＞９５％を示し、その中で１６％は共有結合性二量体であって、単量体蛋白質８０％を回収した。実施例１配列番号１４で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。顆粒体を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−システインに蛋白質濃度０．１ｍｇ／ｍＬで可溶化した。この蛋白質溶液の再生をＰＢＳに対する透析により開始して過剰な変性剤とシステインを除去した。溶液を遠心分離によって透明にし、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ、およびＥＳＩ−質量分析によって分析した。分析結果はこの蛋白質の回収率＞９５％を示し、その中で＜１％が共有結合性二量体であって、単量体蛋白質通算回収率９４％を得た。実施例２配列番号１１で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製の出発材料とした。顆粒体を緩衝液Ａ（８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−システイン）に懸濁したところ、高濃度で（４０ｍｇ蛋白質／ｍＬまで）溶解することを見出した。可溶化した蛋白質を遠心分離または濾過で透明にした。この蛋白質は非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにダブレットバンドとして移動し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは単一バンドとして移動した。これは内部ジスルフィド結合を有するある量の蛋白質および緩衝液のシステインとの混合ジスルフィドとして存在するシステイン残基を持つある量の蛋白質の存在に起因する。この蛋白質を先ず緩衝液Ａの存在下にＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。ＤＥＡＥ樹脂に結合した蛋白質を０．２５０ｍＭまでのＮａＣｌ勾配で溶離した。各画分の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で殆どの夾雑蛋白質は主たるＯｂピークの先端に存在することが判明した。ＤＥＡＥ画分の保存的収集で比較的純粋な再生用Ｏｂ蛋白質を得た。ＰＢＳ中でこの蛋白質を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈することによってこの蛋白質の再折畳みを開始した。この実施例を緩衝液Ａへの希釈およびＰＢＳに対する透析による変性剤とチオールの除去によって反復した。透析後も蛋白質は可溶性で、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥに単一バンドを示した。この蛋白質を還元すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで僅かに遅い易動度を示す単一バンドを示し、再生の過程でジスルフィド結合が完全に形成されたことを示す。蛋白質の最終的精製はサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス７５カラム、ＰＢＳ）で行い、精製したＯｂ蛋白質はＳＤＳ −ＰＡＧＥで単一バンドとして移動し、ＥＳＩ−質量分析によって単一なＮ−末端アミノ酸配列を持つことが確認された。実施例３配列番号１２で示される蛋白質を実施例１と類似の方法で製造した。実施例４配列番号１３で示される蛋白質を実施例１と類似の方法で製造した。実施例５配列番号１４で示され、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｎ−末端延長を持つ部分精製蛋白質を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス、５ｍＭ−システイン、ｐＨ８．０中、４℃で４８時間インキュベーションしてこの蛋白質の各型の混合物を得た。非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥは約半分の蛋白質が内部ジスルフィド結合を持ち、他の半分は持っていないことを示した。この蛋白質溶液をスルフヒドリル試薬ＤＴＮＢで分析すると溶液には遊離スルフヒドリルは存在していなかった。これは溶液中のシステインがＯｂ蛋白質のシステインと混合ジスルフィドを形成したことを示す。こうして生物学的活性Ｏｂ蛋白質への折畳み中間体を捕捉した。この溶液の所定量をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。第二の所定量を２０ｍＭ−ＤＴＴ添加ＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。両希釈試料を１００００倍過剰のＰＢＳに対して２４時間透析した。透析に続いて各試料を非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＰＢＳで希釈した試料は内部ジスルフィド結合を持つＯｂ蛋白質および内部ジスルフィド結合を持たないＯｂ蛋白質（可溶性中間体）を含有していた。ＰＢＳ／ＤＴＴで希釈した試料は内部ジスルフィド結合を持つＯｂ蛋白質のみを含有していた。一度形成されると、Ｏｂ蛋白質とシステインの間の混合ジスルフィドは変性剤除去後にも安定であった。この混合ジスルフィドＯｂ蛋白質はＰＢＳに可溶性であって正しい２次構造の形成を示唆する。チオール試薬を過剰に添加するとジスルフィド交換が刺激され、チオール試薬が徐々に外れて内部ジスルフィド結合を有するＯｂ分子の形成を有利にする。実施例６式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであり、１００位のＴｒｐがＧｌｕに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発材料とした。この封入体を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−システインに可溶化し、混合ジスルフィド蛋白質をアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。精製した蛋白質を緩衝液Ａと４８時間４℃でインキュベーションした。システインが混合ジスルフィド（Ｒ₁＝ＳＣＨ₂Ｃ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ₂））を形成したことの確認は１０ｍＭ−ＤＴＮＢ含有０．１Ｍ−トリス、ｐＨ８（遊離−ＳＨ不在下に測定した値）を使用して行った。可溶化した蛋白質の再生はこの蛋白質を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０で０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＰＢＳに対する透析で開始した。２４時間後、試料１ｍＬをＣ１８・ＨＰＬＣから３０〜７０％直線状ＣＨ₃ＣＮ勾配１ｍＬ／分で溶離した。非還元性緩衝液中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで別々のバンド２個として移動するピーク２個を集めた。早く溶離するピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥでは遅く移動し、その質量が本発明の混合ジスルフィド含有中間体に期待される質量であることをＥＳＩ−質量分析で確認した。遅く溶離するピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥで速く移動した。式ＩＩで示される鎖内ジスルフィド含有蛋白質に期待される質量を確認した。この分析結果は蛋白質がジスルフィド含有蛋白質に変換される前に本発明の混合ジスルフィド中間体が形成していることを確認した。実施例７式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであり、１００位のＴｒｐがＧｌｕに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発材料とした。この顆粒体を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−システインに可溶化した。この蛋白質を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＰＢＳに対して透析して過剰な変性剤およびシステインを除去して蛋白質の再生を開始した。実施例８式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであり、１００位のＴｒｐがＡｌａに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発材料とした。この顆粒体を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−システインに懸濁した。この蛋白質を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＰＢＳに対して透析して過剰な変性剤およびシステインを除去することによって蛋白質の再生を開始した。Ｎ−末端Ｍｅｔ−Ａｒｇジペプチドはジペプチジルアミノペプチダーゼ（ｄＤＡＰ）を用いる当技術分野で認められている技術によって除去した。この蛋白質はカチオン交換クロマトグラフィーで精製した。実施例９式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであり、１００位のＴｒｐがＡｌａに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離を用いる標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発材料とした。この顆粒体を７Ｍ−尿素および５ｍＭ−システイン添加１０ｍＭ−トリス、ｐＨ約８．０の添加によって可溶化した。可溶化した標本を濾過して透明にした。この条件でこの蛋白質のシステイン残基は還元されたものとシステイニル混合ジスルフィドとなったものとの組合せとして存在していた。尿素で溶解した混合ジスルフィド中間体を７Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス、５ｍＭ−システイン、ｐＨ約８中、Ｂｉｇ・Ｂｅａｄ・Ｑ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）アニオン交換クロマトグラフィーで精製した。産物を直線状ＮａＣｌ勾配で溶離した。アニオン交換精製した中間体にシステインを追加して、ｐＨを約９に調整した。この中間体を次に７Ｍ−尿素で約２ｍｇ／ｍＬまで希釈した。折畳みおよび単一鎖内ジスルフィド結合形成はｐＨ約９の１０ｍＭ−トリスに対する膜限外濾過／膜透析濾過を用いる尿素とシステインの除去で行った。名目１００００ダルトンの分子量カットオフ限外濾過膜を用いた。Ｎ−末端Ｍｅｔ−Ａｒｇジペプチドは当技術分野で認められている技術によってジペプチジルジアミノペプチダーゼ（ｄＤＡＰ）を用いて除去した。この蛋白質は約１から１０００μｇ／ｋｇの間の用量で投与する。好適な用量は活性化合物約１０から１００μｇ／ｋｇまでである。成人に対する典型的な日用量は約０．５から１００ｍｇまでである。この方法を実行するに当たって、式（Ｉ）で示される化合物は毎日単回または多回投与できる。長期間の投与計画が必要なこともある。投与あたりの用量または全投与量は医師が決定するものであって、たとえば疾病の性質および重症度、患者の年齢および一般的健康状態およびその化合物に対する患者の寛容度のような因子に依存する。ここに本発明の原理、好適な態様および操作の様式を記載した。しかしながらそれらの記載は説明用記載であるが限定用記載ではないので、本明細書によって保護を求める本発明は開示の特定の型によって限定されると理解すべきでない。当技術分野の熟練者は本発明の本質から逸脱することなく、種々の変種や変化を行うことができるものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Obesity protein intermediates and their preparation and use The present invention belongs to the field of human pharmaceuticals, especially the treatment of obesity and obesity-related diseases. I do. Most particularly, the present invention relates to obesity, which regulates adipose tissue when administered to a patient. The present invention relates to an intermediate used for producing a protein. Protein production in heterologous host organisms requires inactive and poorly soluble protein aggregates or inclusions. Form. The formation of such inclusions is due to the high protein concentration in the cells due to expression. The result. Denaturation and solubilization of inclusion bodies to obtain biologically active proteins And then reduce it to an appropriate condition to obtain a protein with the conventional spatial structure Must be formed. R. Jaenike, Prog. Biophys. Molec. Biol. 49: 117-237 (1987). However, regeneration to a biologically active conformation is not a quantitative process--the Many non-functional species and conformations of proteins may be created. Biological activity To shift the equilibrium to form a conformation, establish an incorrect protein conformation. Select conditions that prevent and hinder playback. Highly organized polypeptide chains Difficult if not impossible to predict how to regenerate into the conformation of the structure As such, conditions biased toward the formation of biologically active proteins cannot be predicted. Recently, Yiying Zhang and co-workers reported that obesity and diabetes were at risk. We have announced the positional cloning of mouse genes that link. Yiing Zha ng et al., Nature, 372: 425-32 (1994). This report Is expressed exclusively in adipose tissue and has a putative signal peptide of 21 amino acids. A gene encoding a protein of amino acids has been disclosed. This peptide is a fat regulatory hormone. It is speculated to be Mont. Similarly, Murakami et al., Bioch em. and Biophys. Res. Comm. Volume 209 (3): 944- On page 52 (1995) disclosed genes and proteins for obese rats. The present invention provides the final intermediate in the regeneration pathway to the obesity protein. The invention further provides Preparation of this intermediate and its biologically active obesity protein or its analog Provide use to The most notable advantage is that via this intermediate It is observed that a substantial increase in the yield of biologically active protein is observed. This intermediate is obese It also offers significant production advantages that allow for large-scale production of proteins. The present invention provides a correctly folded intermediate to an obesity protein or analog thereof You. More particularly, the invention relates to the correctly folded Formula (I): [Where, A is basically from amino acid residue 1 to amino acid residue 1 of the obesity protein or its analog. It is a polypeptide consisting of up to 95 groups. B is basically from amino acid residue 97 to amino acid residue 145 of this protein. It is a composed polypeptide. R₁And R_TwoIs independently H or with the sulfur to which it is attached Form mixed disulfides. Where R₁And R_TwoAre not both H] Is directed to the protein indicated by. The present invention relates to a method of denaturing an obesity protein or analog thereof at a pH of about 7 to about 12, Mixed with solution containing thiol reducing agent at a concentration of about 1 to 100 mM Also provided is a method for preparing a protein of Formula I, comprising: The present invention further provides a compound of formula (II): [Where, A is basically from amino acid residue 1 to amino acid residue 1 of the obesity protein or its analog. It is a polypeptide consisting of up to 95 groups. B is basically from amino acid residue 97 to amino acid residue 145 of this protein. Is a composed polypeptide] A method for producing a correctly folded protein represented by (A) Obesity protein inclusion bodies A denaturant at a concentration sufficient to solubilize the protein, and A thiol reducing agent at a pH of about 7 to about 12 and a concentration of about 1 to 100 mM is used. Solubilizing in the containing solution, (B) The concentration of thiol and denaturing agent in this solution was determined to cause disulfide bond formation. Lowering Is provided. Description of the drawings Figure 1 shows a Zorbax C-8 column with 50 mM ammonium phosphate pH 7.6. Buffer A, which is 0.5% SDS, and 5% n-propanol, and pH 7.6 of 50 mM ammonium phosphate, 0.5% SDS, and 50% n-pro FIG. 4 shows an HPLC chromatogram developed using Buffer B, which is panol. The peak at about 385 seconds represents a biologically active obesity protein, later at about 573 seconds. The eluting peak represents the intermediate of the present invention prepared in the examples. For the purposes of the present invention as disclosed and claimed herein, the following terms and abbreviations have been set forth below. Define as follows: Base pairs (bp)-relate to DNA or RNA. When in a DNA molecule, Abbreviations A, C, G and T are (deoxy) adenine, (deoxy) cytosine, (deoxy) 5′-monophosphate type oxy) guanine and (deoxy) thymine Corresponds to cretide. When in RNA molecules, the abbreviations U, C, G and T are , Cytidine, guanine, and thymine 5'-monophosphate nucleosides Corresponds to Sid. In double-stranded DNA, base pairs indicate a combination of A and T or C and G. Sometimes. In DNA / RNA heteroduplexes, base pairs are T and U or C and G May be shown in combination. Denaturing reagents or agents are known to those skilled in the art. Denaturing reagent Examples are R. Jaenicke, Prog. Biophys. Molec. Bio l. 49: 117-237 (1987). Suitable reagent Include urea, thiocyanate, and guanidine, most preferably from 6M to 8M- Up to urea. The mixed disulfide is a thiol reducing agent and a cysteinyl residue of the polypeptide. Shows groups derived from that reagent which are disulfide exchangeable between. Obesity protein--transcribes and removes introns from obesity genes Translation and, for example, from N-terminal valine-proline to C-terminal cysteine Maturation to remove secretory signal peptides, such as processing from mature proteins 2 shows a protein produced by processing into a protein. Mouse obesity protein White matter and human obesity proteins are described by Zhang et al., Nature, 372: 42. 5-32 (1994). Rat obesity protein is Murakam i, et al., Biochemical and biophysical Res. Comm. 209 (3): 944-52 (1995). this The amino acid numbers in the specification are counted in order from the amino terminus of the full-length mature protein. You. This numbering of the same criteria is well recognized by those of ordinary skill in the art. is there. In human, mouse, pig, bovine, and rat obesity proteins, disulfate The cysteines involved in id formation are at residues 96 and 146. The phrase "A Is basically from amino acid residue 1 to amino acid residue 9 of the obesity protein or analog thereof. 5 "is a disulfide-linked form from the N-terminus. It is intended to include amino acids up to the first cysteine involved in the formation. The phrase "B is Basically composed of amino acid residue 97 to amino acid residue 145 of obesity protein Is the amino acid from the first cysteine to the C-terminus. It is intended to be included. Deletion of one or more amino acids in a natural variant or fragment And to the 146th position Cys, which does not affect the novel and basic features of the present invention. Amino acid additions, including additions, are understood to be included within the definitions of A and B. This Renumbering of amino acid residues in proteins is unnecessary and can be confusing. is there. For example, the death Gln (28) alteration, particularly in the mouse and human obesity proteins Species have been observed. Such variants are intended to be included in the present invention. An obesity protein analog may have one or more amino acid substitutions, preferably up to five. Or less, most preferably 3 or less obesity proteins with substitutions And the formula (III): (SEQ ID NO: 1) [In the sequence, Xaa at position 23 is Gln or absent, This protein shall have at least one of the following substitutions: Gln at position 4 is replaced with Glu, Replacing Gln at position 7 with Glu; Replacing Asn at position 22 with Gln or Asp; Thr at position 27 is replaced with Ala, Xaa at position 28 is replaced with Glu; Replacing Gln at position 34 with Glu; Met at position 54 is replaced with methionine sulfoxide, Leu, Ile, Val, Al substituted with a or Gly, Replacing Gln at position 56 with Glu; Replacing Gln at position 62 with Glu; Replacing Gln at position 63 with Glu; Met at position 68 is replaced with methionine sulfoxide, Leu, Ile, Val, Al substituted with a or Gly, Replacing Asn at position 72 with Gln, Glu, or Asp; Replacing Gln at position 75 with Glu; Replace Ser at position 77 with Ala, Replacing Asn at position 78 with Gln or Asp; Replacing Asn at position 82 with Gln or Asp; His at position 97 is replaced with Gln, Asn, Ala, Gly, Ser, or Pro. Replace with Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu, Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr or Ala at position 101 Replace with Val, Replace Ser at position 102 with Arg, Replace Gly at position 103 with Ala, Replacing Glu at position 105 with Gln; Replacing Thr at position 106 with Lys or Ser; Leu at position 107 is replaced with Pro, Replacing Asp at position 108 with Glu; Replacing Gly at position 111 with Asp; Replacing Gly at position 118 with Leu; Replacing Gln at position 130 with Glu; Replacing Gln at position 134 with Glu; Met at position 136 is converted to methionine sulfoxide, Leu, Ile, Val, Al substituted with a or Gly, 138th Trp is Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu, Or Gln at position 139 is replaced with Glu] Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Correctly folded obesity proteins or analogs thereof are known to be obesity and Organisms useful for treating conditions associated with obesity, such as urine, cardiovascular disease and carcinoma A protein that has a conformation or tertiary structure that gives a biologically active protein. Ob gene --- see Zhang et al., Nature, 372: 425-32. (1994) and Murakami et al., Biochemical and ・ Biophysical ・ Research ・ Comm. Volume 209 (3): 9 Hybridization of the conventional Ob gene gene sequence disclosed on pages 44-52 (1995) And at least 50% homologous, preferably 70% homologous, most preferably Or 80% homologous nucleic acid sequence. This Ob gene product is a fat group Weave And regulates energy balance. Obesity protein inclusions--at least partially contain the obesity protein to be recovered Insoluble protein aggregates or cytoplasmic aggregates. Similarly, obesity protein When producing the analog, the inclusion bodies should include at least a portion of the obesity protein analog to be recovered. 1 shows insoluble protein aggregates or cytoplasmic aggregates containing fractionally. Plasmids are extrachromosomal self-replicating genetic elements. The open reading frame is a nucleotide sequence, which is then translated into t-RNA, The ribosome and related factors `` read '' the triplet for translation. Each triplet corresponds to a particular amino acid. Each triplet Because they are distinct and of the same length, the coding sequence must be a multiple of three. Base pair Insertions or deletions (called frameshift mutations) in the same DNA segment In some cases, two different proteins encoded by the protein may be provided. Avoid this reliably Therefore, the triplet codon corresponding to the desired polypeptide is 3 Must be in multiples, i.e. maintain the correct "reading frame" Must. Recombinant DNA cloning vector-one separate DNA segment or its Autonomously composed of DNA molecules to which more or more can be added Any of the agents that replicate, including but not limited to, plasmids And phage. The recombinant DNA expression vector is a recombinant DNA having a promoter incorporated therein. Any of the cloning vectors. A replicon--controls autonomous replication of a plasmid or other vector; DNA sequence to enable. R₁And R_TwoIs independently H or with the sulfur to which it is attached Forms mixed disulfides, which can be disulfide exchanged It is recognized and understood to be derived from a suitable thiol reducing reagent. Suitable All reagents can form mixed disulfides, and can activate disulfide exchange And one or more mercapto reagents containing free -SH. It Thus, thiols include, but are not limited to, cysteine, 2-mercap Triethanol, glutathionin, cysteamine, β-mercaptoethanol (B ME) and others. For example, dithiothreitol (DTT), dithioe Thiol reagents such as risritol (DTE) are also included in the present invention, however, Is less suitable because the mixed disulfide formed by the above reagent is unstable. Therefore, R₁ Or R_TwoA preferred group represented by is SO_Three, SCH_TwoCH (NH_Two) (COOH), S CH_TwoCHNH_Two, SCH_TwoCH_TwoOH, and H_TwoNCH (COOH) CH_TwoCH_Two CONHCH (CH_TwoS) CONHCH_TwoCOO^-including. Where R₁And R_Twoof It is assumed that both are not H. Transcription-the information contained in the nucleotide sequence of DNA is transmitted to the complementary RNA sequence. This is the process that is reached. Translation-synthesis of polypeptide chains using genetic information of messenger RNA It is the process of specifying and giving instructions. Tris is an abbreviation for tris (hydroxymethyl) aminomethane. Treatment-Managing and nursing a patient for the purpose of ameliorating a disease, condition or disorder. To prevent the onset of symptoms or complications of a disease, condition or disorder, Or administering a compound of the present invention to alleviate or eliminate the complications. It Therefore, deterring food intake and gaining weight in patients who need it to treat obesity And induction of weight loss. Vectors-Replico used for cell transformation in genetic engineering Having a polynucleotide sequence corresponding to a suitable protein molecule, Combination with control sequences confer certain properties on the transforming host cell. Plasmid , Viruses, and bacteriophages are naturally replicons, so It is. Artificial vectors are obtained from different sources using restriction and ligation enzymes. The cut DNA molecules are cut and ligated to construct. Vector contains recombinant DNA clone And recombinant DNA expression vectors. Abbreviations of amino acids are described in 37 CFR §1.822 (b) (2) (1993). As approved by the United States Patent and Trademark Office. Someone skilled in the art You will recognize that amino acids have a tendency to rearrange. For example, 14: 485-94 (1979) and as cited therein, As p may rearrange to aspartimide and isoasparigine. These rolls Position derivatives are included within the scope of the present invention. Amino acids are in the L-configuration unless otherwise specified. It is a place. As described above, the present invention provides a compound of formula (I): [Where, A is basically from amino acid residue 1 to amino acid residue 1 of the obesity protein or its analog. It is a polypeptide consisting of up to 95 groups. B is basically from amino acid residue 97 to amino acid residue 145 of this protein. It is a composed polypeptide. R₁And R_TwoIs independently H or with the sulfur to which it is attached Form mixed disulfides. Where R₁And R_TwoAre not both H] The protein represented by is provided. In a preferred embodiment, A is of the formula: [In the array, R_ThreeIs absent, Met, Met-R_FourOr a leader sequence. R_FourIs any amino acid other than Pro. Xaa at position 28 is Gln or absent. Gln at position 4 is replaced with Glu if desired. Gln at position 7 is replaced with Glu if desired. Asn at position 22 is replaced with Gln or Asp if desired, Thr at position 27 is substituted with Ala if desired. Xaa at position 28 is replaced with Glu if desired, Gln at position 34 is replaced with Glu if desired. Met at position 54 may be methionine sulfoxide, Leu, Ile, Va if desired. replacing with 1, Ala, or Gly; Gln at position 56 is replaced with Glu if desired. Gln at position 62 is replaced with Glu if desired. Gln at position 63 is replaced with Glu if desired. Met at position 68 may be methionine sulfoxide, Leu, Ile, Va if desired. replacing with 1, Ala, or Gly; Asn at position 72 is replaced with Gln, Glu or Asp if desired. Gln at position 75 is replaced with Glu if desired. Ser at position 77 is replaced with Ala if desired. Asn at position 78 is replaced with Gln or Asp if desired; Or Replace Asn at position 82 with Gln or Asp if desired] Is a polypeptide represented by In another preferred embodiment, A is of the formula: [In the sequence, Xaa at position 28 is Gln or absent.] Including those which are the polypeptides represented by In yet another preferred embodiment, B is of the formula: [In the array, His at position 97 can be Gln, Asn, Ala, Gly, Ser, or Replace with Pro, The 100th Trp is Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Le replace with u Ala at position 101 is Ser, Asn, Gly, His, Pro, Th if desired replacing with r or Val, Ser at position 102 is replaced with Arg if desired. Gly at position 103 is replaced with Ala if desired. Glu at position 105 is replaced with Gln if desired, Thr at position 106 is replaced with Lys or Ser if desired. Leu at position 107 is replaced with Pro if desired. Replace Asp at position 108 with Glu if desired, Gly at position 111 is substituted with Asp if desired. Gly at position 118 is replaced with Leu if desired. Gln at position 130 is replaced with Glu if desired. Gln at position 134 is replaced with Glu if desired. Met at position 136 may be methionine sulfoxide, Leu, Ile, Va if desired. replacing with 1, Ala, or Gly; Trp at position 138 is Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Il if desired e, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu Replace, Or Replace Gln at position 139 with Glu if desired] And proteins that are polypeptides represented by In another preferred embodiment, B has the formula: [In the sequence, Trp at position 100 is Ala, Glu, Asp, Asn, Me if desired. t, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Replace with Leu] And proteins that are polypeptides represented by One skilled in the art is aware of the production of obesity proteins or analogs thereof in prokaryotic expression systems. In production, it is possible to express a protein having an N-terminal extension adduct at the N-terminus of the protein. You will know what you need. This N-terminal extension can be added prior to administration if desired. Cleavage from protein. Preferred N-terminal extensions are Met or Met-R_FourAnd Where R_FourIs any of the amino acids except Pro. The present invention also provides amino acid leader sequences that may be used for purification or other purposes. Also included are proteins that include one or more, if desired, in A. Most preferred leader sequences include: (SEQ ID NO: 4) Gly-Ser-His-Met, (SEQ ID NO: 5) Met-Gly-Ser-Ser-His-His-His- His-His-His-Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro- Arg-Gly-Ser-His-Met, (SEQ ID NO: 6) Leu-Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu- Ala, (SEQ ID NO: 7) Glu-Ala-Glu-Ala, (SEQ ID NO: 8) Leu-Glu-Lys-Arg-, (SEQ ID NO: 9) Met-Gly-Ser-Ser-His-His-His- His-His-His-Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro- Arg-Gly-Ser-Pro, and (SEQ ID NO: 10) Gly-Ser-Pro-. Such N-terminal extensions and / or leader sequences are essential features of the invention. And does not affect novel properties. The compounds of formula (I) are folding intermediates of biologically active obesity proteins. You. Suitable obesity proteins include native sequences and, for example, Basinski et al. U.S. Ser. No. 08 / 383,638, filed Feb. 6, 1995 and 1996 Formula (III) described in application No. 08 / 588,061 filed on Jan. 19, Is an analog represented by Mouse and bovine sequences are described in Hansen M. et al. Hsi ung and Dennis P. Smith, US filed May 19, 1995. No. 08 / 445,305, which is incorporated herein by reference. I do. The most preferred proteins of the present invention have the formula (III), SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1 2, the proteins represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14. (SEQ ID NO: 11) [In the sequence, Xaa at position 28 is Gln or absent.] (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) [In the sequence, Xaa at position 28 is Gln or absent.] Human obesity protein (SEQ ID NO: 14) [In the sequence, Xaa at position 28 is Gln or absent.] Another preferred protein of the present invention is a protein represented by formula (III): In that formula: Replacing Gln at position 4 with Glu; Replacing Gln at position 7 with Glu; Replacing Asn at position 22 with Gln or Asp; Substitution of Thr at position 27 with Ala, Replacing Gln at position 28 with Glu; Replacing Gln at position 34 with Glu; Replacing Met at position 54 with methionine sulfoxide, Leu, or Ala; Replacing Gln at position 56 with Glu; Replacing Gln at position 62 with Glu; Replacing Gln at position 63 with Glu; Substitution of Met at position 68 with methionine sulfoxide or Leu; Replacing Asn at position 72 with Gln or Asp; Replacing Gln at position 75 with Glu; Replacing Asn at position 78 with Gln or Asp; Replacing Asn at position 82 with Gln or Asp; Replacing Gln at position 130 with Glu; Replacing Gln at position 134 with Glu; Substitution of Met at position 136 with methionine sulfoxide, Leu, Ile; Or Replacing Gln at position 139 with Glu; It was done. Another preferred protein is a protein of formula (III), In that formula, Replacing Asn at position 22 with Glu or Asp; Substitution of Thr at position 27 with Ala, Replacing Met at position 54 with methionine sulfoxide, Leu, or Ala; Substitution of Met at position 68 with methionine sulfoxide or Leu; Replacing Asn at position 72 with Gln or Asp; Replacing Asn at position 78 with Gln or Asp; Replacing Asn at position 82 with Gln or Asp; Or Substitution of Met at position 136 with methionine sulfoxide, Leu, Ile; It was done. Still further additionally preferred proteins are proteins of formula (III), In that formula, Replacing Asn at position 22 with Gln or Asp; Substitution of Thr at position 27 with Ala, Replacing Met at position 54 with Leu or Ala; Replacing Met at position 68 with Leu, Replacing Asn at position 72 with Gln or Asp; Replacing Asn at position 78 with Gln or Asp; Replacing Asn at position 82 with Gln or Asp; Or Replacing Met at position 136 with Leu or Ile; It was done. Another preferred embodiment with the most significant advantages is the amino acid sequence of the protein of SEQ ID NO: 1. From acid residue 97 to amino acid residue 111 and / or at amino acid residue 138 Specific substitution. This substitute has a markedly improved stability and offers superior therapeutics. give. This specific protein is easier to formulate, pharmaceutically simple and precise, Excellent delivery. Thus, a preferred embodiment is of formula (IV): (SEQ ID NO: 1) [In the array, Xaa at position 28 is Gln or absent; This protein has at least one substitution selected from the group consisting of: Do: His at position 97 is replaced with Gln, Asn, Ala, Gly, Ser or Pro. Replacement, Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu, Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr or Ala at position 101 Replace with Val, Replace Ser at position 102 with Arg, Replace Gly at position 103 with Ala, Replacing Glu at position 105 with Gln; Replacing Thr at position 106 with Lys or Ser; Leu at position 107 is replaced with Pro, Replacing Asp at position 108 with Glu; Replacing Gly at position 111 with Asp; Or 138th Trp is Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu] Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. A preferred protein has the formula (V): (SEQ ID NO: 15) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the protein comprises the following: Having at least one substitution selected from the group consisting of: His at position 97 is replaced with Gln, Asn, Ala, Gly, Ser, or Pro. Replace with Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu, Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr or Ala at position 101 Replace with Val, Replace Ser at position 102 with Arg, Replace Gly at position 103 with Ala, Replacing Glu at position 105 with Gln; Replacing Thr at position 106 with Lys or Ser; Leu at position 107 is replaced with Pro, Replacing Asp at position 108 with Glu; Replacing Gly at position 111 with Asp; Or 138th Trp is Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph Replace with e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu. Further preferred proteins of formula (V) are: His at position 97 is Gln, Asn, Ala, Gly, Ser, or Pro Has been replaced by 100th Trp is Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln or Leu, Ala at position 101 is Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr or Replaced with Val, Glu at position 105 has been substituted with Gln; Thr at position 106 has been replaced with Lys or Ser, Leu at position 107 is replaced with Pro, Asp at position 108 has been substituted with Glu; Gly at position 111 has been substituted with Asp; Or Trp at position 138 is Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Ph e, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val or Leu ing. Other suitable proteins of formula (V) are: His at position 97 has been replaced with Ser or Pro; 100th Trp is Ala, Gly, Gln, Val, Ile, or Leu Has been replaced by Ala at position 101 is replaced with Thr, Or The Trp at position 138 is Ala, Ile, Gly, Gln, Val, or Leu Has been replaced by Yet another preferred protein of formula (V) is: His at position 97 has been replaced with Ser or Pro; Trp at position 100 has been replaced with Ala, Gln, or Leu; Ala at position 101 is replaced with Thr, Or Trp at position 138 is replaced with Gln. The most preferred species of formula (V) include the species of SEQ ID NOs: 16 and 17. (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17) The most notable advantage is that the present invention relates to the binding of an obesity protein to a biologically active protein conformation. Provide intermediates that induce very efficient conversion. Therefore, the intermediate of the present invention is produced. By doing so, the tertiary structure of the biologically active protein is first formed. In this way Almost quantitative conversion of disulfide bonds is possible. SS link dimer or Other multimer formation is reduced. The proteins of the invention can be obtained by recombinant DNA technology or, for example, in liquid or solid phase. Semi-synthetic starting from peptide synthesis or protein fragments and combined via normal liquid phase methods It is prepared by well-known chemical procedures. Formula (III) or sequence The protein represented by No. 11, 12, 13, or 14 is prepared by recombinant synthesis Is preferred. If a high yield is desired, the recombinant method is preferred. The basic process of recombinant protein production Includes the following steps: a) a synthetic or semi-synthetic (or isolated from natural source) D encoding the protein Construction of NA, b) in a manner suitable for expression of the protein as a single protein or a fusion protein Integration of the coding sequence into an expression vector, c) transforming a suitable prokaryotic host cell with the expression vector, and d) Recovery and purification of the recombinantly produced protein.a. Gene construction Synthetic genes whose transcription and translation in vitro or in vivo cause protein production May be constructed with techniques well known in the art. Natural reduction of genetic code Due to the weight, skilled professionals have a large but limited number of encoding this protein. Will be recognized. In a preferred implementation of the invention, Synthesis is achieved with recombinant DNA technology. Synthetic gene construction methodologies are well known in the art. For example, Brown (1979), Methods in Enzymology, Acad emic Press, NY, 68: 109-151. Synthetic protein The DNA sequence corresponding to the gene can be obtained, for example, from Applied Biosystems. 380A or 380B DNA synthesizer (Applied Biosystem) ems, 850 Lincoln Center Drive Foster City, CA 94404 And can be prepared using a conventional DNA synthesizer. For some applications, controlled excision of signal peptides from fusion protein constructs A convenient protease-sensitive cleavage site to facilitate It is desirable to modify the protein coding sequence so that it is inserted between There are good things. Has a known sequence, eg, M13 primer mutagenesis Techniques for making substitution mutations at predetermined sites in DNA are well known. This anti-obesity Mutations induced in the DNA encoding the protein may cause the sequence to go out of reading frame. Create complementary regions that may not create secondary mRNA structures Those that do not are preferred. DeBoer et al., EP 75444A (198 3 years). Gene encoding this protein is prepared using polymerase chain reaction (PCR) May be. The template is a cDNA library (CLONETECH or STR Can be purchased from ATAGENE), but with mRNA isolated from human adipose tissue Is also good. The strategy is described in the art by Maniatis et al., "Molecular cloning: Laboratory Handbook (Molecular Cloning: A Laboratory) ・ Manual) ", Cold Spring Harbor Press, C old Spring Harbor Laboratory, Cold Sp Well-known as ring Harbor, New York (1989) .b. Direct expression of fusion proteins The obesity protein can be a direct expression or a fusion protein containing the protein. Alternatively, enzymatic or chemical cleavage may be performed after production. Feature polypeptides Cleavage at a fixed site for digestion, or at the amino terminus of the peptide chain (eg, diamine Nopeptidase) or various peptidases that cleave from the carboxy terminus (eg, For example, trypsin) is known. In addition, special chemicals (eg Anogen bromide) cleaves a polypeptide chain at a specific site. Skilled professional The house uses the amino acid sequence (and recombination tools) to introduce a site-specific internal cleavage site. The necessary modifications to the synthetic or semi-synthetic coding sequence (if applicable) Will be. For example, “Protein Purification: From Molecular Mechanism to Mass Production (Prote in ・ Purification: From ・ Molecular ・ Mecha nisms to large, scale, processes) " Academic Society, Washington, DC (1990), Chapter 13, Carter, P .; ,fusion Site-specific proteolysis of proteins (Site, Specific, Proteol) sisis of Fusion Protein).c. Vector construction Construction of suitable vectors containing the desired coding and control sequences is standard. Adopt connection technology. Separated plasmid or DNA fragment with restriction enzymes Digest, tailor and ligate to form the required plasmid. Any of a number of suitable recombinant DNA expression vectors for translation into the desired protein Insert a synthetic DNA sequence processed using an appropriate restriction endonuclease. Synthetic coding sequence designed to have restriction endonuclease sites at both ends of the transcript To facilitate separation from the expression plasmid and insertion into the amplification plasmid. Separation The cDNA coding sequence can be used to obtain the desired clone by techniques well known in the art. Use of synthetic linkers to facilitate insertion of this sequence into the Can be easily modified by The specific endonuclease to be adopted is the parental expression to be adopted Governed by the restriction endonuclease cleavage pattern of the vector. Restriction site In the selection, make sure that the coding sequence together with the control sequence is oriented in the correct direction. To achieve in-frame reading and protein expression. Generally contains promoter and control sequences from a species compatible with the host cell Use a plasmid vector. Usually, this vector contains the replication site and It has a marker sequence that can confer phenotypic selection on the transformed cells. example For example, E. coli typically uses pBR322, a plasmid derived from an E. coli species. (Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)). Year)). Plasmid pBR322 contains the ampicillin resistance gene and tetracycline. It contains a phosphorus resistance gene and provides easy means for identifying transformed cells. This pBR The 322 plasmid or other microbial plasmid is commonly used in recombinant DNA technology. Contains or contains the promoter and other regulatory elements used Must be modified to The desired coding sequence is a promoter and ribosome binding that function in the host cell Insert into the expression vector in the correct orientation for transcription and translation from both sites. Heel Examples of such expression vectors are described in Belagaje et al., US Pat. No. 5,304,493. Plasmid, the teachings of which are incorporated by reference. US Patent 530 The gene encoding ACB proinsulin described in No. 4493 is a restriction enzyme. Plasmid pRB182 can be removed with the elements NdeI and BamHI. The present invention Is a NdeI / BamHI restriction fragment of the plasmid backbone. Can be inserted into a cassette.d. Prokaryotic expression Generally, prokaryote-based DNA sequences are used to construct vectors useful in the present invention. Clone. For example, E. coli K12 strain 294 (ATCC 31446) Especially useful. Other microbial strains that can be used include E. coli B and E. coli X17. 76 strains (ATCC 31537). These examples are merely illustrative and are not limiting. is not. Prokaryotes are also used for expression of recombinant proteins. The above strain and E. coli W3110 strain (prototrophic strain, ATCC 27325), Bacillus species such as Bacillus subtilis, And other Salmonella typhimurium or Serratia marcescens Such enteric bacteria and various Pseudomonas species may also be utilized. Prokaryotic host Suitable promoters for use in the present invention include the β-lactamase promoter system (Vector pGX2907 [ATCC39344] contains the replicon and β-lac Lactose promoter system (containing the tamase gene), Chang et al. atature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nat. ure, 281: 544 (1979)), alkaline phosphatase, bird Putfan (trp) promoter system (vector pATH1 [ATCC3 7695] is an open reading frame as a trpE fusion protein under the control of the trp promoter. (Designed to promote expression) and, for example, the tac promoter (pro (Such as Rasmid pDR540, which can be separated from ATCC 37282). Includes double promoter. However, the nucleotide sequence is generally unknown. Linking DNA encoding the protein to another functional bacterial promoter Skilled in the art to connect with an adapter and supply the necessary restriction sites Will be able to do so. DNA encoding proteins for promoters used in bacterial systems An operably linked Shine-Dalgarno sequence may be included. The following preparation examples are provided to further illustrate the methods for preparing the proteins described herein. Is what you do. Production Example 1 DN encoding the protein of SEQ ID NO: 14 with N-terminal extension Met-Arg The A sequence was prepared using a standard PCR method. Forward primer (5'-GG GG CAT ATG AGG GTA CCT ATC CAG AAAG TC CAG GAT GAC AC, SEQ ID NO: 18) and reverse primer (5'-GG GG GGATC CTA TTA GCA CCC GGG AGA CAG GTC CAG CTG CCA CAA CAT, SEQ ID NO: 19) using human mast cell library (purchased from CLONETECH) Was amplified. This PCR product is used for PCR / Script (ST (Available from RATAGENE) and sequenced. Production example 2 Vector construction Plasmids containing the DNA sequence encoding the desired protein were cloned into NdeI and Ba Construct including the mHI restriction site. Plus with cloned PCR product The mid is digested with NdeI and BamHI restriction enzymes. Small ~ 450 bp fragment Was purified by gel purification to remove the sequence encoding ACB proinsulin. Ligation to pRB182. The ligation product E. coli DH10B (GIBCO- (Purchasable from BRL) and add 10 μg / mL tetracycline Analyze colonies growing on tryptone-yeast (DIFCO) plates You. Plasmid DNA was isolated, digested with NdeI and BamHI and the resulting The fragments are separated by agarose gel electrophoresis. The expected ~ 450 bp NdeI and Save the plasmid containing the BamHI restriction site fragment. E. FIG. coli ・ B ・ BL 21 (DE3) (available from NOVOGEN) for this protein production culture Transform with a suitable second expression plasmid. Techniques for transforming cells with the above vectors are well known in the art, See, for example, Maniatis et al. (1988) "Molecular Cloning: Laboratory Handbook. (Molecular Cloning: A Laboratory Manu) al) ", Cold Spring Harbor Laboratory, C old Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York or "The latest protocol in molecular biology (C current ・ Protocols ・ in ・ Molecular ・ Biolog y) (1989) and its supplements. This specification Used in a preferred implementation of the invention as exemplified in For transformation of E. coli cells Related techniques are well-known in the art. The transformed E. coli coli cells The precise conditions for culturing E. coli are employed. E. coli host cell line and expression or Depends on the nature of the roning vector. For example, c1857 temperature inducible lambda Temperature-inducible promoters such as the The vector into which the translator region has been introduced is used at about 30 ° C. to induce protein synthesis. A temperature shift to 40 ° C is required. In a preferred embodiment of the present invention, E. coli. E. coli / K12 / RV308 cells as host cells Although not limited to this, for example, E. coli K1 2. L201, L687, L693, L507, L640, L641, L695 , L814 (E. coli B) can also be employed. Then, under the selective pressure of the antibiotic corresponding to the resistance gene present in the expression plasmid, Apply the transformed host cells to a suitable medium. Suitable for the next host cell line Incubate the culture at the time and temperature. When expressed in high-level bacterial expression systems, proteins aggregate and overexpressed proteins It often forms granules or inclusions containing high concentrations. Gierash and K ing, Kre in "Protein Folding" U.S.A., American Association, for the the Advancement of Science Publication, No. 89-18S, Washington, DC. Denaturant at a sufficient concentration to solubilize proteins PH from about 7 to about pH 12, preferably with about 6M to 8M urea, more preferably Preferably, the inclusion bodies containing the obesity protein are solubilized at a pH of from 8 to 12. Most Also preferably, the inclusion body is solubilized in about 6 M to 7 M urea at a pH of about 8 to 10. . The desired protein concentration is from about 0.1 mg / mL to the dissolution of the protein in the solution. Degree, more preferably 0.1 to 50 mg / mL, most preferably 0.5 mg / mL / ML to 5.0 mg / mL. Under these conditions, the protein denatures. Strange Stable protein molecules regain their native conformation when regenerated under carefully controlled conditions. Profit I do. However, regeneration to the biologically active conformation is not a quantitative process, Numerous non-functional species and conformations of the molecule may form. The present invention To provide key intermediates in Intermediates of the present invention comprise from about 1 mM to 100 mM, preferably 1 mM to 20 mM, Most preferably, it is prepared by adding 1 mM to 10 mM of a thiol reducing agent. Build. This thiol-type reducing agent contains free-SH which can activate disulfide exchange. And preferably cysteine, cystamine, BME and others. Suitable thio Reagents are cysteine and cysteamine. The intermediate of the present invention can be prepared from about 1 minute. Generates in 24 hours. This intermediate may be used for filtration, chromatography, or other It can be purified by usual methods. This intermediate has the correct tertiary structure (conventional conformation) This intermediate can be used as a biologically active therapeutic agent, Would also show benefits for starting. However, this intermediate has the formula III Preferably, it is converted to a biologically active protein. Most unexpectedly, the conversion of this intermediate into a biologically active protein is extremely Efficient, little or no sedimentation of aggregated protein, covalent dimer Or the formation of higher multimers was minimal. Due to mixed disulfide formation Disulfide by protection of cysteine residues and formation of intermediates The formation of a tertiary structure which is almost independent of the bond formation becomes possible. This condition is Works favorably on the formation of intramolecular disulfide bonds in the acidic monomeric protein. In solution Dilute this intermediate by reducing the concentration of all reducing reagents and denaturant. A sulfide bond is formed to convert to a biologically active protein of Formula II. Reduction of thiols and denaturants can be achieved by dilution, dialysis, diafiltration or other art May be performed by a technique recognized in. Preferably, the solubilization of the inclusion body After formation of the intermediate, the solution was adjusted to a protein concentration of about 0.05 mg / mL to about 5.0 mg / mL. mL and thiol from about 1 mM to 20 mM, then dialyzed or dialyzed Overtake. Preferably, the buffer used for dialysis or diafiltration is PBS (about 5 m M to about 10 mM phosphate and 50 mM to 500 mM NaCl phosphate buffered diet Salt water), the pH is about 7.0 to 12.0, more preferably 7.5 to 9.0. Other suitable buffers include, but are not limited to, 4- (2-hydro (Xyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), or Tris (Hydroxymethyl) aminomethane (TRIS). Preferably, thiol The concentration of reducing and denaturing agents is relative to PBS or about 5 mM to 10 mM TRIS. Decrease by diafiltration or dialysis. Conversion of this intermediate to the biologically active conformation is the most significant advantage. Close to quantitative conversion. Thus, by going through this intermediate, the organism of formula II Biologically active protein is produced in high yield. In the formation of this intermediate, directly from the free SH Folding can be performed at a higher protein concentration than the performed folding. The preferred range is 0.05 to 5 mg / mL, preferably 0.1 to 3 mg / mL, most preferably Is from 1.0 to 2 mg / mL. Folding at high concentration is low volume (small tank) And reduced downstream operation. This fold is glycerin for preventing protein aggregation. Alternatively, it may be carried out in the absence of other added reagents. Such reagents, especially glycemic Phosphorus must be removed in downstream purification, so fold in the absence of this reagent. The ability to fold is a significant advantage in mass production. Thus, by working through this intermediate, the present invention provides a compound of formula II It further provides an efficient method for producing proteins. That is: (A) a denaturant at a concentration sufficient to solubilize the protein; Thiol reducing reagent with a pH of about 7 to about 12 and a concentration of 1 mM to 100 mM Solubilizing the obesity protein inclusion bodies in a solution comprising: (B) reducing the concentration of thiol and denaturing agent in this solution to form a disulfide bond Forming a Consists of Preferably, about 6 to 8 M-urea and about 3 to 7 mM-cysteine added 8 m M to 12 mM in Tris buffer, pH about 8 to 12, more preferably about pH 12 At 8 to 10, the inclusion body is added and solubilized. Under these conditions the mixed disulfide intermediate Formed and, if desired, purified by filtration and / or chromatography. You. A notable advantage is that the efficiency of the formation of a single intrachain disulfide from this intermediate is dilute, It is increased by diafiltration or the addition of a thiol reducing reagent before dialysis. Preferably overequivalent thiol-preferably 1 to 6000 fold, more preferably Is added in a 3- to 6000-fold excess. Most preferably, 5 mM thiol, Preferably, cysteine is added. After conversion to a biologically active protein, the protein is removed from the reaction mixture, e.g. On-exchange chromatography, size exclusion chromatography, reversed-phase chromatography Purify by art-recognized techniques such as Raffy and others. The intermediate of formula (I) is stable in the presence or absence of a denaturing agent. this The intermediate is soluble in PBS, suggesting the formation of the correct tertiary structure. If desired This intermediate can be used for size exclusion chromatography, ion exchange, Purification may be by techniques known in the art, including luffy. In this Intercalation was characterized by HPLC. FIG. 1 shows a chromatogram of a typical intermediate of the present invention. Shown in Furthermore, this intermediate is SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate). -Polyacrylamide gel electrophoresis) migrates slower than biologically active proteins Confirmed as molecular species. The following examples are provided to further illustrate the invention described herein. It should not be understood that the scope of the present invention consists solely of the following examples. Comparative Example 1 A protein represented by SEQ ID NO: 14, wherein Xaa at position 28 is Gln; Those with Met-Arg-N-terminal extensions were produced as granules (inclusion bodies). The granules were separated by standard procedures using fractional centrifugation. Granules 6M-guanidine HCl, 10 mM-sodium acetate (pH 5.0), 1 mM- Solubilized in DTT at room temperature for 1 hour. The mixed disulfide of the present invention can be used under these conditions. Could not be detected. The cysteine of the obesity protein is protonated under these conditions. (-SH) is formed. Clarify the dissolved protein by centrifugation, mix well. While 20% glycerin, 5 mM-sodium acetate (pH 5.0), 5 mM-C aCl_TwoTo a final protein concentration of 0.025 mg / mL with a dilution factor of 1: 150 0) The regeneration of the protein solution which became transparent by the above procedure was started. This solution is diluted Immediately after the release, it became cloudy and protein aggregation was observed. Mix the diluted protein solution at room temperature for 8 hours. After standing without matching, the pH of the solution was adjusted to 8.68 by adding solid Tris base to 10 mM. Raised. The solution was clarified by centrifugation and subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions. Analyzed by reverse phase HPLC and ESI-mass spectrometry. Analysis results show that this protein Shows a total recovery of 68%, of which 7% is a covalent dimer, 63% protein was recovered and 32% protein was lost. Comparative Example 2 A protein represented by SEQ ID NO: 14, wherein Xaa at position 28 is Gln; Those with Met-Arg-N-terminal extensions were produced as granules (inclusion bodies). The granules were separated by standard procedures using fractional centrifugation. Granules 6M-guanidine HCl, 10 mM sodium acetate (pH 4.5), 1 mM- DTT was solubilized at a protein concentration of 1.3 mg / mL at room temperature for 1 hour. The blend of the present invention No combined disulfide was detectable under these conditions. Cysteine under these conditions Protonated to form (-SH). Clarify the solubilized protein by centrifugation and mix well with 20% glycerol. Phosphorus, 20 mM Tris (pH 8.4), 2.5 mM CaCl_TwoAt the final protein concentration Diluted to 0.025mg / mL (dilution ratio 1:55) The regeneration of the no longer protein solution was started. Do not mix the diluted protein solution for 18 hours at room temperature Left. The solution was clarified by centrifugation and subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions. Analyzed by reverse phase HPLC and ESI-mass spectrometry. Analysis results show that this protein Shows a total recovery of quality> 95%, of which 16% are covalent dimers, 80% of the monomeric protein was recovered. Example 1 A protein represented by SEQ ID NO: 14, wherein Xaa at position 28 is Gln; Those with Met-Arg-N-terminal extensions were produced as granules (inclusion bodies). The granules were separated by standard procedures using fractional centrifugation. Granules Protein concentration in 8M-urea, 10mM-Tris (pH 8.0), 5mM-cysteine Solubilized at a concentration of 0.1 mg / mL. Dialysis of this protein solution against PBS To remove excess denaturant and cysteine. Centrifuge the solution SDS-PAGE, reverse phase HPLC, and ESI-mass for clear, non-reducing conditions Analyzed by analysis. The analysis results showed that the recovery of this protein was> 95%, of which <1% was a covalent dimer, and a total recovery of monomer protein of 94% was obtained. Example 2 A protein represented by SEQ ID NO: 11, wherein Xaa at position 28 is Gln; Those with Met-Asp-N-terminal extensions were produced as granules (inclusion bodies). Granules were separated by standard procedures using differential centrifugation. This granule It was used as a starting material for the following purification. The granules were treated with buffer A (8 M-urea, 10 mM Tris (PH 8.0), 5mM-cysteine, and suspended at a high concentration (40mg). (To protein / mL). Centrifuge the solubilized protein or Was clarified by filtration. This protein is doubletd on a non-reducing SDS-PAGE gel. Band as a single band on a reducing SDS-PAGE gel. Was. This is a system of a certain amount of protein and buffer with internal disulfide bonds. Protein with cysteine residues present as mixed disulfides with ynes Attributed to the presence of This protein is first subjected to DEAE anion exchange in the presence of buffer A. Purified by chromatography. 0.250 m protein bound to DEAE resin Eluted with a NaCl gradient up to M. Most fractions were analyzed by non-reducing SDS-PAGE analysis of each fraction. It was found that any contaminating protein was present at the tip of the main Ob peak. DEAE Conservative collection of fractions yielded relatively pure Ob protein for regeneration. This protein in PBS Initiate refolding of this protein by diluting the protein to 0.1 mg / mL Was. This example was performed using denaturing agent and thiol by dilution in buffer A and dialysis against PBS. This was repeated by removal of the tool. After dialysis, the protein remains soluble and non-reducing SDS-P AGE showed a single band. When this protein is reduced, it is slightly reduced by SDS-PAGE. Shows a single band with very slow mobility and complete disulfide bonds during regeneration It shows that it was formed in. Final protein purification is size exclusion chromatography (Superdex 75 column, PBS) and purified Ob protein is SDS -Migrated as a single band on PAGE and single N-terminal by ESI-mass spectrometry It was confirmed to have a terminal amino acid sequence. Example 3 The protein represented by SEQ ID NO: 12 was produced by a method similar to that of Example 1. Example 4 The protein represented by SEQ ID NO: 13 was produced by a method similar to that of Example 1. Example 5 Partially purified protein represented by SEQ ID NO: 14 and having Met-Asp-N-terminal extension At 4 ° C. in 8 M urea, 10 mM Tris, 5 mM cysteine, pH 8.0 Incubation for 48 hours resulted in a mixture of each type of this protein. Non-reducing SDS-PAGE shows that about half of the proteins have internal disulfide bonds and the other half Indicated that they do not have. This protein solution is separated with sulfhydryl reagent DTNB. Upon analysis, no free sulfhydryl was present in the solution. This is the solution in the solution. 2 shows that stain formed mixed disulfide with cysteine of the Ob protein. Thus, the folding intermediate to the biologically active Ob protein was captured. A predetermined amount of this solution was diluted to 0.1 mg / mL with PBS. The second predetermined amount is 2 The mixture was diluted to 0.1 mg / mL with PBS containing 0 mM-DTT. 100 of both diluted samples Dialysis was performed for 24 hours against a 00-fold excess of PBS. Non-reducing each sample following dialysis Analysis was performed by SDS-PAGE. Samples diluted in PBS have internal disulfide bonds. Ob protein with and without an internal disulfide bond (soluble intermediate Body). Samples diluted in PBS / DTT have internal disulfide bonds Contained only the Ob protein. Once formed, the mixed disulfide between the Ob protein and cysteine is a denaturant It was stable after removal. This mixed disulfide Ob protein is soluble in PBS To suggest the formation of a correct secondary structure. When thiol reagent is added in excess, The sulfide exchange is stimulated, and the thiol reagent gradually disengages to form internal disulfide bonds. The formation of an Ob molecule is advantageous. Example 6 A protein represented by the formula (III) (SEQ ID NO: 1), wherein Xaa at position 28 is G: ln, the Trp at position 100 is replaced with Glu, and the Met-Arg-N-terminal Those with extensions were produced as granules (inclusion bodies). Separate the granules by centrifugation Separated by standard procedures using. Starting the granules for the following purification Material. This inclusion body was treated with 8M-urea, 10mM-Tris (pH 8.0), 5m Solubilized in M-cysteine and mixed disulfide protein was subjected to anion exchange chromatography. Purified by luffy. Incubate the purified protein with buffer A for 48 hours at 4 ° C. Was done. Cysteine is a mixed disulfide (R₁= SCH_TwoC (COOH) (N H_Two)) Was confirmed by 0.1 M Tris containing 10 mM DTNB, p Performed using H8 (value measured in the absence of free-SH). Of solubilized protein Regeneration was carried out by using 0.1 M / urea of this protein at 8 M-urea, 10 mM Tris, pH 8.0. Diluted to mL and started with dialysis against PBS. 24 hours later, 1 mL of sample is 18. 30-70% linear CH from HPLC_ThreeElution was with a CN gradient of 1 mL / min. Pipes that migrate as two separate bands on a SDS-PAGE gel in non-reducing buffer Two stakes were collected. Peaks that elute earlier move slower on SDS-PAGE, That E is the expected mass of the mixed disulfide-containing intermediate of the present invention. Confirmed by SI-mass spectrometry. Late eluting peaks move faster by SDS-PAGE did. Confirm the expected mass of the intrachain disulfide-containing protein represented by Formula II. Was. The results of this analysis indicate that the protein was converted to a disulfide-containing protein before the It was confirmed that a mixed disulfide intermediate had formed. Example 7 A protein represented by the formula (III) (SEQ ID NO: 1), wherein Xaa at position 28 is G: ln, the Trp at position 100 is replaced with Glu, and the Met-Arg-N-terminal Those with extensions were produced as granules (inclusion bodies). Separate the granules by centrifugation Separated by standard procedures using. Starting the granules for the following purification Material. The granules were treated with 8M-urea, 10mM-Tris (pH 8.0), 5m Solubilized in M-cysteine. This protein was diluted to 0.1 mg / mL and Dialysis against S to remove excess denaturants and cysteine to initiate protein regeneration Started. Example 8 A protein represented by the formula (III) (SEQ ID NO: 1), wherein Xaa at position 28 is G: ln, the Trp at position 100 is replaced with Ala, and the Met-Arg-N-terminal Those with extensions were produced as granules (inclusion bodies). Separate the granules by centrifugation Separated by standard procedures using. Starting the granules for the following purification Material. The granules were treated with 8M-urea, 10mM-Tris (pH 8.0), 5m Suspended in M-cysteine. Dilute this protein to 0.1 mg / mL and add PBS By removing excess denaturants and cysteine by dialysis against Started playing. The N-terminal Met-Arg dipeptide is dipeptidyl aminopeptidase (dD (AP) was removed by an art-recognized technique. This protein Was purified by cation exchange chromatography. Example 9 A protein represented by the formula (III) (SEQ ID NO: 1), wherein Xaa at position 28 is G: ln, the Trp at position 100 is replaced with Ala, and the Met-Arg-N-terminal Those with extensions were produced as granules (inclusion bodies). Separate the granules by centrifugation Using standard procedures. The starting material for the following purification is Fee. The granules were treated with 10 mM glucose with addition of 7 M urea and 5 mM cysteine. The squirrel was solubilized by the addition of about pH 8.0. Filter solubilized sample to clear I made it. Under these conditions, the cysteine residues of this protein were reduced and As a combination with what resulted in mixed disulfides. Dissolve in urea 7M-urea, 10 mM-Tris, 5 mM-cysteine In a pH of about 8, a Big Bead Q-Sepharose column (Pharmac ia ・ Fine ・ Chemicals) Anion exchange chromatography Made. The product was eluted with a linear NaCl gradient. Anion exchange purified intermediate The pH was adjusted to about 9 by adding cysteine. This intermediate is then treated with 7M-urea Diluted to about 2 mg / mL. Folding and intra-chain disulfide bond formation are p Urea and cis using membrane ultrafiltration / membrane diafiltration against 10 mM Tris with about 9 H The removal of the tein was performed. Nominal 10,000 dalton molecular weight cut-off ultrafiltration membrane Was used. The N-terminal Met-Arg dipeptide is an art-recognized technique. It was surgically removed using dipeptidyl diaminopeptidase (dDAP). The protein is administered at a dose between about 1 and 1000 μg / kg. Suitable dose Is from about 10 to 100 μg / kg of active compound. A typical day for adults Dosages are from about 0.5 to 100 mg. In performing this method, the expression The compounds of formula (I) can be administered once or multiple times daily. Long-term dosing regimen Sometimes it is necessary. The dose per dose or the total dose is determined by the physician. For example, the nature and severity of the disease, the patient's age and general health And the compound's tolerance to the compound. The foregoing has described the principles, preferred embodiments and modes of operation of the present invention. However These descriptions are for illustrative purposes but not for limiting purposes. It is not to be understood that the invention for which protection is sought is limited by the particular type of disclosure. Various modifications and alterations may be made by one skilled in the art without departing from the essence of the invention. Is what you can do.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡＣ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI C07K 14/47 ZNA C07K 14/47 ZNA C12P 21/02 C12P 21/02 C // (C12P 21/02 C12R 1:19) ( 81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ) , MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, G B, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. Formula (I): Wherein A is a polypeptide consisting essentially of amino acid residues 1 to 95 of an obesity protein or an analog thereof. B is a polypeptide consisting essentially of amino acid residues 97 to 145 of this protein. R ₁ and R ₂ are independently H or form a mixed disulfide with the sulfur to which it is attached. Provided that R ₁ and R ₂ are not both H.] 2. A is a formula: (SEQ ID NO: 2) Wherein R ₃ is absent, Met, Met-R ₄ , or a leader sequence. R ₄ is any amino acid other than Pro. Xaa at position 28 is Gln or absent. Gln at position 4 is replaced with Glu if desired. Gln at position 7 is replaced with Glu if desired. Asn at position 22 is replaced with Gln or Asp if desired. Thr at position 27 is replaced with Ala if desired. Xaa at position 28 is replaced with Glu if desired. Gln at position 34 is replaced with Glu if desired. Met at position 54 is replaced with methionine sulfoxide, Leu, Ile, Val, Ala, or Gly if desired. Gln at position 56 is replaced with Glu if desired. Gln at position 62 is replaced with Glu if desired. Gln at position 63 is replaced with Glu if desired. Met at position 68 is substituted with methionine sulfoxide, Leu, Ile, Val, Ala, or Gly if desired. Asn at position 72 is replaced with Gln, Glu, or Asp, if desired. Gln at position 75 is replaced with Glu if desired. Ser at position 77 is replaced with Ala if desired. Asn at position 78 is replaced with Gln or Asp if desired. Or Asn at position 82 is substituted with Gln or Asp if desired]. 3. A is a formula: (SEQ ID NO: 2) [Wherein, Xaa at position 28 is Gln or absent]. 4. B is a formula: (SEQ ID NO: 3) [Wherein His at position 97 is replaced by Gln, Asn, Ala, Gly, Ser, or Pro, if desired. The Trp at position 100 is replaced with Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val, or Leu if desired. Ala at position 101 is replaced with Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr or Val, if desired. Ser at position 102 is replaced with Arg if desired. Gly at position 103 is replaced with Ala if desired. Glu at position 105 is replaced with Gln if desired. Thr at position 106 is replaced with Lys or Ser if desired. Leu at position 107 is replaced with Pro if desired. Asp at position 108 is replaced with Glu if desired. Gly at position 111 is replaced with Asp if desired. Gly at position 118 is replaced with Leu if desired. Gln at position 130 is replaced with Glu if desired. Gln at position 134 is replaced with Glu if desired. Met at position 136 is replaced with methionine sulfoxide, Leu, Ile, Val, Ala, or Gly if desired. Trp at position 138 is replaced with Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val, or Leu if desired. Or Gln at position 139 is substituted with Glu if desired]. 5. B is a formula: (SEQ ID NO: 3) The protein according to claim 4, which is a polypeptide represented by the formula: 6. B is a formula: (SEQ ID NO: 3) [Wherein Trp at position 100 is replaced with Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val, or Leu]. 4 protein. 7. R ₃ is (SEQ ID NO: 4) Gly-Ser-His-Met, (SEQ ID NO: 5) Met-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser-Gly-Leu-Val -Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met, (SEQ ID NO: 6) Leu-Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala, (SEQ ID NO: 7) Glu-Ala-Glu-Ala, (SEQ ID NO: 8) Leu-Glu-Lys-Arg-, (SEQ ID NO: 9) Met-Gly-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg- Gly-Ser-Pro, or (SEQ ID NO: 10) Lily selected from the group consisting of Gly-Ser-Pro- 7. The protein according to any one of claims 2 to 6, which is a DNA sequence. 8. R ₃ is (SEQ ID NO: 4) Gly-Ser-His-Met, (SEQ ID NO: 5) Met-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser-Gly-Leu-Val -Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met, (SEQ ID NO: 6) Leu-Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala, (SEQ ID NO: 7) Glu-Ala-Glu-Ala, (SEQ ID NO: 8) Leu-Glu-Lys-Arg-, (SEQ ID NO: 9) Met-Gly-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg- Gly-Ser-Pro, or (SEQ ID NO: 10) Lily selected from the group consisting of Gly-Ser-Pro- 7. The protein according to any one of claims 2 to 6, which is a DNA sequence. 9. The protein according to any one of claims 2 to 6, wherein R ₃ is Met-Arg. 10. 10. The protein of any one of claims 1 to 9, comprising mixing the obesity protein or analog thereof with a solution containing a denaturing agent and a thiol reducing agent at a thiol concentration of about 1 to 100 mM, at a pH of about 7 to about 12. Recipe. 11. 10. The protein according to any one of claims 1 to 9, comprising mixing the obesity protein or analog thereof with a solution comprising a denaturing agent and a thiol reducing agent at a thiol concentration of about 1 to 100 mM, at a pH of about 8 to about 12. Recipe. 12. Formula (II): Wherein A is a polypeptide consisting essentially of amino acid residues 1 to 95 of an obesity protein or an analog thereof. B is a polypeptide consisting essentially of amino acid residue 96 to amino acid residue 145 of the protein.] A method for producing a biologically active protein represented by the following formula: Solubilizing a solution containing a denaturing agent at a concentration sufficient to solubilize the protein, and a thiol at a pH of about 7 to about 12 and a thiol concentration of about 1 to 100 mM; (b) thiol and denaturation of the solution. Lowering the concentration of the agent to form a disulfide bond. 13. A is a formula: (SEQ ID NO: 2) Wherein R ₃ is absent, Met, Met-R ₄ , or a leader sequence. R ₄ is any amino acid other than Pro. Xaa at position 28 is Gln or absent.]. 14． B is a formula: (SEQ ID NO: 3) The method according to claim 13, wherein 15. B is a formula: (SEQ ID NO: 3) 14. The method according to claim 13, wherein the Trp at position 100 is replaced with Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gln, Val, or Leu. 16. The method according to any one of claims 12 to 15, wherein the concentration of the thiol and the denaturing reagent is reduced by dialysis. 17． The method according to any one of claims 12 to 15, wherein the concentration of thiol and denaturing reagent is reduced by diafiltration. 18. 16. The method according to claim 12, wherein the concentration of the thiol and the denaturing reagent is reduced by dilution. 19. Formula (II): Wherein A is a polypeptide consisting essentially of amino acid residues 1 to 95 of an obesity protein or an analog thereof. B is a polypeptide basically consisting of amino acid residue 97 to amino acid residue 145 of this protein.] A method for producing a biologically active protein represented by the following formula: (B) solubilizing the protein in a solution comprising a denaturant at a concentration sufficient to solubilize the protein, and a thiol reducing agent at a pH of from about 7 to about 12 and a concentration of 1 to 100 mM; Adjusting the protein concentration of the solution from about 0.05 mg / mL to 5.0 mg / mL by adding a thiol reducing agent, (c) lowering the thiol and denaturant concentrations of the solution until disulfide bond formation occurs Making a process consisting of: 20. A protein produced by any one of the production methods according to claims 10 to 19.