JPH1090169A - 顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の特定領域のみに分解光を照射して光
分解性試薬を光分解し、その特定領域のみを解析するこ
とができる顕微鏡装置を提供する。 【解決手段】 分解用光源１０から出力された分解光Ａ
および励起用光源２０から出力された励起光Ｂそれぞれ
は、スライドガラス４２と試料７０との境界面で全反射
して、試料７０中にエバネセント波を生じさせる。分解
光Ａのエバネセント波は、スライドガラス４２近傍の試
料７０中の光分解性試薬を光分解し、一方、励起光Ｂの
エバネセント波は、スライドガラス４２近傍の試料７０
を励起して蛍光Ｃを発生させ、この試料７０から発生し
た蛍光Ｃは、光検出器５３により検出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光分解性試薬を使
用して試料（例えば、細胞）内の反応などを解析する顕
微鏡装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】光分解性試薬（光ケージド試薬）は、活
性物質の活性部位がニトロベンジル基等でブロックされ
不活性化された試薬であって、所定波長の分解光が照射
されると光分解して活性部位のブロックが解除され、活
性物質が活性を持つようになるものである。したがっ
て、この光分解性試薬は、分解光の照射により活性物質
の量を変化させることができる。例えば、光分解性試薬
を予め細胞中に導入しておき、その後その細胞の所定領
域に分解光を照射することにより、その所定領域におい
てのみ活性物質の量を急激に増加させることができる。
このことから、光分解性試薬は、細胞の特定領域のみを
観察する場合に用いられている。

【０００３】従来より、このような光分解性試薬が導入
された試料の特定領域のみに分解光を照射する方法とし
て、顕微鏡の対物レンズを使用して微小領域に集光照射
する方法や、分解光の光路中にピンホールを配し対物レ
ンズ視野中の特定領域を照射する方法が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来例による分解光の照射では、分解光は、その集光点に
おいては微小領域に集光されるものの、光軸に沿って集
光点以外の領域にも照射され、さらに集光点以外の領域
ではビーム径が拡がる。したがって、分解光の集光点だ
けでなく集光点の周辺においても光分解性試薬が光分解
され活性物質の量が増加するので、集光点のみの試料観
察を行うことができない。

【０００５】また、試料が細胞である場合、細胞で重要
な働きをしている細胞膜付近における反応を解析したい
という要求がある。しかし、従来の分解光の照射方法で
は、細胞膜付近のみに分解光を照射することはできない
ため、細胞膜付近における反応のみを解析することがで
きない。

【０００６】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、試料中の特定領域のみに分解光を照射
して光分解性試薬を光分解し、その特定領域のみを解析
することができる顕微鏡装置を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明に係る顕微鏡装置
は、光分解性試薬が導入された試料に分解光を照射して
光分解性試薬を光分解し、試料に励起光を照射して発生
した蛍光を検出する顕微鏡装置であって、(1) 分解光を
出力する分解用光源部と、(2) 励起光を出力する励起用
光源部と、(3) 試料が接して配される透明部材を備え、
分解光および励起光それぞれを透明部材の側から照射し
て試料との境界面で全反射させて、分解光および励起光
それぞれのエバネセント波を試料中に発生させる照射光
学系と、(4) 励起光のエバネセント波が試料に照射され
て発生した蛍光を検出する検出手段と、を備えることを
特徴とする。

【０００８】この顕微鏡装置によれば、分解用光源部か
ら出力された分解光および励起用光源部から出力された
励起光それぞれは、照射光学系により透明部材と試料と
の境界面で全反射して、試料中にエバネセント波を生じ
させる。分解光のエバネセント波は、透明部材近傍の試
料中の光分解性試薬を光分解し、一方、励起光のエバネ
セント波は、透明部材近傍の試料を励起して蛍光を発生
させ、この試料から発生した蛍光は、検出手段により検
出される。

【０００９】また、分解光のエバネセント波の照射の前
および後それぞれにおいて励起光のエバネセント波の照
射により発生し検出手段により検出された蛍光それぞれ
の間の強度比を演算する処理手段を更に備えることを特
徴とする。この場合、分解光のエバネセント波の照射の
前後における蛍光の強度比が演算され、これに基づい
て、分解光のエバネセント波の試料により光分解した光
分解性試薬の量が解析される。

【００１０】また、試料に照射すべき照明光を出力する
照明用光源部を更に備え、検出手段は照明光が試料に照
射されて発生した透過光を更に検出する、ことを特徴と
する。この場合、照明用光源部から出力された照明光は
試料に照射され、これに伴い試料から発生した透過光が
検出手段により検出される。したがって、透過光により
試料を観察しながら、分解光および励起光を試料に照射
することができ、蛍光を観察することができる。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。

【００１２】先ず、第１の実施形態について説明する。
図１は、第１の実施形態に係る顕微鏡装置の構成図であ
る。

【００１３】分解用光源１０は、試料７０に導入された
光分解性試薬を光分解する分解光Ａを出射するための光
源である。例えば、パルスＹＡＧレーザ光源が分解用光
源１０として用いられ、これから出力されるレーザ光の
第三高調波（波長：３５５ｎｍ、パルス幅：例えば５ｎ
ｓ）が分解光Ａとして用いられる。また、分解用光源１
０および分解光Ａとして、アルゴンレーザ光源から出力
される紫外レーザ光、モード同期チタンサファイアレー
ザ光源から出力されるレーザ光の第二高調波、モード同
期レーザ励起色素レーザ光源から出力されるレーザ光の
第二高調波、モード同期ルビーレーザ光源から出力され
るレーザ光の第二高調波、および、エキシマレーザ光源
からのレーザ光等も用いられる。

【００１４】この分解用光源１０の出射口の前方には、
分解光照射時間制御部１１が配されている。この分解光
照射時間制御部１１は、分解用光源１０から出射された
分解光Ａが試料７０に照射される時間を制御するもので
あり、例えばシャッタや光音響素子が用いられ、制御部
６１により開閉タイミングが制御される。なお、分解用
光源１０からの分解光Ａの出力タイミングが外部からト
リガ信号により制御することができるものである場合に
は、分解光照射時間制御部１１を設けることなく、制御
部６１により直接に分解用光源１０からの分解光Ａの出
力タイミングを制御してもよい。

【００１５】一方、励起用光源２０は、分解光Ａにより
光分解された光分解性試薬による試料の反応を検出する
蛍光色素や分解光Ａにより光分解された光分解性蛍光色
素を励起して、蛍光を発生させる励起光Ｂを出射するた
めの光源である。例えば、アルゴンイオンレーザ光源が
励起用光源２０として用いられ、これから出力されるレ
ーザ光（波長：４８８ｎｍ、連続発振）が励起光Ｂとし
て用いられる。この励起用光源２０の出射口の前方に配
されている励起光照射時間制御部２１は、励起用光源２
０から出射された励起光Ｂが試料７０に照射される時間
を制御するものであり、例えばシャッタや光音響素子が
用いられ、制御部６１により開閉タイミングが制御され
る。

【００１６】分解光照射時間制御部１１から出力された
分解光Ａは、ダイクロイックミラー３１で反射され、励
起光照射時間制御部２１から出力された励起光Ｂは、反
射鏡３０で反射されダイクロイックミラー３１を透過す
る。そして、分解光Ａおよび励起光Ｂそれぞれは照射光
学系を得て試料７０に照射される。すなわち、分解光Ａ
および励起光Ｂそれぞれは、反射鏡３２により反射さ
れ、ビームエクスパンダ等からなる光束整形光学系３３
により適当な光束径と形状に整形され、反射鏡３４およ
び３５により順次反射され、集光レンズ３６により集光
され、プリズム４０に入射し、グリセリン４１を経てス
ライドガラス４２に入射し、そのスライドガラス４２と
試料７０との境界面で全反射する。

【００１７】ここで、集光レンズ３６は、分解光Ａおよ
び励起光Ｂそれぞれを、スライドガラス４２と試料７０
との境界面上の所定位置に集光するためのものであり、
この集光レンズ３６を移動させることにより、その境界
面上の照射位置を移動させることができる。また、プリ
ズム４０とスライドガラス４２との間のグリセリン４１
の層は、プリズム４０の下面（分解光Ａおよび励起光Ｂ
それぞれがプリズム４０から出射する面）において分解
光Ａおよび励起光Ｂそれぞれが全反射することを防止す
るために設けられている。また、分解光Ａおよび励起光
Ｂがスライドガラス４２中において同一光軸上を進みス
ライドガラス４２の下面の同一位置で全反射するよう
に、プリズム４０、グリセリン４１およびスライドガラ
ス４２それぞれの波長分散を考慮して、反射鏡３０およ
びダイクロイックミラー３１から集光レンズ３６に到る
までの光学系を調整する。

【００１８】スライドガラス４２はカバーガラス４４と
ともにスペーサ４３を挟んで試料チャンバ７１を形成し
ており、これらは、中央部に孔部が形成されたステージ
４５の上に置かれている。そして、試料チャンバ７１内
の試料７０で発生した蛍光Ｃは検出手段により検出され
る。すなわち、蛍光Ｃは、そのステージ４５の孔部を通
過した後、対物レンズ５０を通過し、反射鏡５１により
反射され、光検出器５２の受光面上に結像され撮像され
る。

【００１９】この光検出器５２により撮像された蛍光Ｃ
の像は、処理部６０により信号解析または画像処理され
る。この処理部６０では、分解光Ａのエバネセント波の
照射の前および後それぞれにおいて励起光Ｂのエバネセ
ント波を試料７０に照射したときに光検出器５２により
撮像された蛍光Ｃの像それぞれの間の強度比を求める。
これにより、分解光Ａのエバネセント波を試料７０へ照
射した効果を解析することができる。

【００２０】次に、本実施形態に係る顕微鏡装置の作用
の１例について説明する。ここでは、試料チャンバ７１
は生理塩溶液で満たされており、その生理塩溶液の中で
あってスライドガラス４２の下面に試料７０として細胞
が培養されているものとする。また、その細胞には予
め、分解光Ａの照射によりカルシウムイオンを放出する
ケージドカルシウム（nitro-5） が光分解性試薬として
導入され、放出されたカルシウムイオンを検出するため
にカルシウムイオン濃度検出用蛍光色素（fluo-3）が導
入されているものとする。

【００２１】試料（細胞）７０に分解光Ａを照射する前
に、試料（細胞）７０に励起光Ｂを照射し、これにより
生じた蛍光Ｃを撮像する。すなわち、制御部６１からの
指示により分解光照射時間制御部１１を閉じたままにし
て、励起光照射時間制御部２１を所定時間に亘って開
き、励起用光源２０から出射した励起光Ｂを、反射鏡３
０、ダイクロイックミラー３１、反射鏡３２、光束整形
光学系３３、反射鏡３４および３５、ならびに、集光レ
ンズ３６を経て、プリズム４０に入射させ、スライドガ
ラス４２の下面で全反射させる。この全反射のときに、
試料チャンバ７１内の生理塩溶液に励起光Ｂのエバネセ
ント波が生じる。このエバネセント波は、スライドガラ
ス４２の下面からの距離に対して指数関数的に強度が減
衰する光波であって、スライドガラス４２の下面の直下
における光強度に対して光強度が１／ｅ（ｅは自然対数
の底数）になる位置は、スライドガラス４２および生理
塩溶液それぞれの屈折率にも依るが、スライドガラス４
２の下面からの距離が２００ｎｍ以下である。この励起
光Ｂのエバネセント波の照射により試料（細胞）７０が
照射されて発生した蛍光Ｃは、対物レンズ５０および反
射鏡５１を経て光検出器５２により撮像され、処理部６
０に記憶される。

【００２２】続いて、試料（細胞）７０に分解光Ａを照
射し、光分解性試薬を光分解する。すなわち、制御部６
１からの指示により、分解光照射時間制御部１１を所定
時間に亘って開き、分解用光源１０から出射した分解光
Ａを、ダイクロイックミラー３１、反射鏡３２、光束整
形光学系３３、反射鏡３４および３５、ならびに、集光
レンズ３６を経て、プリズム４０に入射させ、スライド
ガラス４２の下面で全反射させる。この全反射のときに
も、試料チャンバ７１内の生理塩溶液に分解光Ａのエバ
ネセント波が生じる。この分解光Ａのエバネセント波の
照射により、試料（細胞）７０に予め導入されていた光
分解性試薬であるケージドカルシウムのうち、スライド
ガラス４２の下面近傍の領域にあるものが光分解され、
カルシウムイオンが放出される。

【００２３】そして、試料（細胞）７０に励起光Ｂを照
射し、これにより生じた蛍光Ｃを撮像する。この撮像方
法は、分解光Ａ照射前の撮像方法と同様である。ただ
し、分解光Ａ照射後においては、カルシウムイオンが増
加しているので、その増加したカルシウムイオンがカル
シウムイオン濃度検出用蛍光色素（fluo-3）により感知
され、発生する蛍光の強度は大きい。したがって、処理
部６０における演算により、分解光Ａ照射の前後それぞ
れにおける蛍光Ｃの強度比から、カルシウムイオン濃度
の上昇を見積もることができる。

【００２４】なお、ここで用いる光分解性試薬として
は、分解光Ａの照射により光分解されると蛍光を発する
ようになるケージド試薬である膜導入型ケージドフルオ
レセインを使用してもよい。また、分解光Ａにより光分
解されるとＩＰ３（イノシトール三リン酸）を放出する
ケージド試薬であるケージドＩＰ３を使用してもよく、
この場合も、カルシウムイオン濃度検出用色素によりカ
ルシウムイオンの増加を検出することができる。

【００２５】次に、第２の実施形態について説明する。
図２は、第２の実施形態に係る顕微鏡装置の構成図であ
る。本実施形態では、第１の実施形態と比較して、分解
用光源１０および励起用光源２０それぞれからプリズム
４０に到るまでの光学系を互いに別のものとした点で異
なる。

【００２６】分解用光源１０から出力された分解光Ａ
は、分解光照射時間制御部１１により照射時間が制御さ
れて出射され、反射鏡３０Ａおよび３２Ａにより順次反
射され、光束整形光学系３３Ａにより光束の形状および
径が調整され、反射鏡３４Ａおよび３５Ａにより順次反
射され、集光レンズ３６Ａにより集光されてプリズム４
０に入射し、スライドガラス４２の下面で全反射する。
同様に、励起用光源２０から出力された励起光Ｂは、励
起光照射時間制御部２１により照射時間が制御されて出
射され、反射鏡３０Ｂおよび３２Ｂにより順次反射さ
れ、光束整形光学系３３Ｂにより光束の形状および径が
調整され、反射鏡３４Ｂおよび３５Ｂにより順次反射さ
れ、集光レンズ３６Ｂにより集光されてプリズム４０に
入射し、スライドガラス４２の下面で全反射する。

【００２７】なお、分解光Ａは集光レンズ３６Ｂを通過
しておらず、また、励起光Ｂは集光レンズ３６Ａを通過
しておらず、したがって、分解光Ａおよび励起光Ｂそれ
ぞれは、互いに独立に、集光レンズ３６Ａおよび３６Ｂ
それぞれの移動により、スライドガラス４２の下面で全
反射する位置を移動させることができる。

【００２８】なお、分解用光源１０、分解光照射時間制
御部１１、励起用光源２０、励起光照射時間制御部２
１、プリズム４０、グリセリン４１、スライドガラス４
２、スペーサ４３、カバーガラス４４、ステージ４５、
対物レンズ５０、反射鏡５１、光検出器５２、処理部６
０および制御部６１それぞれの構成・作用は、第１の実
施形態の場合と同様である。また、この実施形態に係る
顕微鏡装置の作用も、第１の実施形態の場合と同様であ
る。

【００２９】次に、第３の実施形態について説明する。
図３は、第３の実施形態に係る顕微鏡装置の構成図であ
る。本実施形態では、第１の実施形態と比較して、照明
用光源８０が追加されている点で異なる。

【００３０】この照明用光源８０は、例えばキセノンラ
ンプや水銀ランプが用いられ、照明用光源８０から出射
された照明光Ｄは、スライドガラス４２を透過して試料
チャンバ７１内の試料７０に照射される。そして、試料
を透過した透過光Ｅは、カバーガラス４４を透過し、対
物レンズ５０および反射鏡５１を経て、光検出器５２の
受光面上に結像され、光検出器５２により撮像される。

【００３１】このように、照明用光源８０から出射され
た照明光Ｄを試料７０に照射して、これにより発生した
透過光Ｅにより試料７０を観察しながら、分解光Ａを照
射すれば、試料７０の所定の位置に分解光Ａを照射する
ことができる。また、透過光Ｅにより試料７０を観察し
ながら、励起光Ｂを照射すれば、試料７０内のどの部位
から蛍光Ｃが発生したかを確認することができ、また、
試料７０から発生した蛍光Ｃの強度分布を解析すること
ができる。

【００３２】次に、エバネセント波による照明の効果に
ついての確認実験の結果について説明する。図４乃至図
６は、蛍光色素（5-(N-hexadecanoyl)aminofluorescei
n）が導入された試料（ＮＧ：神経細胞）の顕微鏡写真
であり、いずれも、対物レンズの倍率は４０倍である。
この蛍光色素は、細胞膜に選択的に導入される性質を有
する。図４は、アルゴンレーザ光源（励起用光源）から
出力されたレーザ光（波長４８８ｎｍ）のエバネセント
波で照明したときの神経細胞の蛍光像の顕微鏡写真であ
る。図５は、ＹＡＧレーザ光源（分解用光源）から出力
されたレーザ光の第三高調波（波長３５５ｎｍ）のエバ
ネセント波で照明したときの神経細胞の蛍光像の顕微鏡
写真である。図６は、キセノンランプから出力された励
起光で落射照明したときの神経細胞の蛍光像の顕微鏡写
真である。

【００３３】これらの写真から判るように、キセノンラ
ンプ光で落射照明したときの蛍光像（図６）では、神経
細胞の周辺部（輪郭）からの蛍光の強度は、神経細胞の
内部からの蛍光よりも強い。これは、蛍光色素が神経細
胞の膜だけに導入されていて、励起光の光軸方向につい
て神経細胞の広い領域に励起光が照射されて蛍光が発生
するために、神経細胞の周辺部から生じた蛍光が強く観
察されるからである。これに対して、エバネセント波に
より照明したときの蛍光像（図４、図５）では、全反射
面の近傍の神経細胞の膜のみから蛍光が発生するため、
神経細胞の周辺部からの蛍光が強く観察されることはな
い。

【００３４】次に、本発明に係る顕微鏡装置を用いた細
胞観察の結果について説明する。図７乃至図１２は、光
分解性試薬としてのケージドカルシウム（nitro-5） 、
および、ケージドカルシウムが分解光の照射により光分
解されて放出されたカルシウムイオンの濃度を検出する
カルシウムイオン濃度検出用蛍光色素（fluo-3）が導入
された試料（ＮＧ：神経細胞）の顕微鏡写真であり、い
ずれも、対物レンズの倍率は４０倍である。ここで用い
られたケージドカルシウムおよびカルシウムイオン濃度
検出用蛍光色素は共に、細胞の内部にも導入される性質
を有する。

【００３５】図７は、キセノンランプから出力された励
起光で落射照明したときの神経細胞の蛍光像の顕微鏡写
真である。図８は、アルゴンレーザ光源（励起用光源）
から出力されたレーザ光（波長４８８ｎｍ）のエバネセ
ント波で照明したときの神経細胞の蛍光像の顕微鏡写真
である。これらの写真から判るように、キセノンランプ
光で落射照明したときの蛍光像（図７）では、神経細胞
の中央付近からの蛍光の強度は、神経細胞の周辺部から
の蛍光よりも強く、細胞の形を反映したものとなってい
る。これは、蛍光色素が神経細胞の全体に導入されてい
て、励起光の光軸方向について神経細胞の広い領域に励
起光が照射されて蛍光が発生するために、神経細胞の中
央付近から生じた蛍光が強く観察されるからである。こ
れに対して、エバネセント波により照明したときの蛍光
像（図８）では、全反射面の近傍の神経細胞の膜のみか
ら蛍光が発生するため、神経細胞の中央付近からの蛍光
が強く観察されることはなく、拡がって見える。

【００３６】図９は、分解光を照射する前に神経細胞を
アルゴンレーザ光源（励起用光源）から出力されたレー
ザ光（波長４８８ｎｍ）のエバネセント波で照明したと
きの神経細胞の蛍光像の顕微鏡写真であり、図１０は、
分解光を照射した後に同様にして得た神経細胞の蛍光像
の顕微鏡写真である。これらの写真から判るように、分
解光を照射して光分解性試薬を分解してカルシウムイオ
ンを放出した後の蛍光の強度は増加している。

【００３７】図１１および図１２は、分解光照射による
光分解性試薬の光分解の前および後それぞれにおける励
起光（アルゴンレーザ光源から出力された波長４８８ｎ
ｍのレーザ光のエバネセント波）の照射により得られた
蛍光の強度比を示すものである。ここで、時刻０（分解
光照射前）における蛍光強度を１とし、時刻４５秒から
時刻５５秒にかけて分解光を試料に照射した場合におい
て、分解光照射前後の各時刻における蛍光強度を時刻０
における蛍光強度で規格化して求めた。図１１は、時刻
４０秒（分解光照射前）における規格化された蛍光像の
写真であり、図１２は、時刻６０秒（分解光照射後）に
おける規格化された蛍光像の写真である。図１２の写真
で明るく見えているところは、分解光のエバネセント波
の照射によりケージドカルシウムが光分解されてカルシ
ウムイオンの濃度が増加し、そのカルシウムイオンがカ
ルシウムイオン濃度検出用蛍光色素に検知されて、励起
光のエバネセント波の照射により発生する蛍光の強度が
強くなった領域を表している。

【００３８】また、図１３は、図１１および図１２の場
合と同じ条件の下に、分解光照射の前後において励起光
のエバネセント波で照明したときの神経細胞の規格化さ
れた蛍光強度変化のグラフである。このグラフには、蛍
光像中の６点それぞれにおける蛍光強度変化を示してい
る。このグラフから判るように、分解光照射前に比べ分
解光照射後においては、ケージドカルシウムが光分解さ
れてカルシウムの濃度が増加するため、励起光照射によ
る蛍光強度は強くなる。しかし、その後、蛍光強度は漸
減している。この蛍光強度の漸減は、カルシウムイオン
を検知したカルシウムイオン濃度検出用蛍光色素が、神
経細胞中で拡散するために、励起光のエバネセント波が
到達する領域において減少すること、および、細胞から
カルシウムが排出されることに因るものであると考えら
れる。

【００３９】以上のように、本発明に係る顕微鏡装置に
よれば、神経細胞の膜中の光分解性試薬が分解光のエバ
ネセント波の照射により光分解され、励起光のエバネセ
ント波が照射されると、その光分解性試薬が光分解され
た神経細胞膜付近から発生する蛍光像を検出することが
できる。したがって、神経細胞膜付近の機能の解析する
ことができる。

【００４０】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、試料中に分
解光および励起光それぞれのエバネセント波を試料中に
生じさせる照射光学系として光導波路を用いてもよい。
この場合、光導波路の一方の側のクラッド層が試料とな
り、分解光および励起光それぞれが光導波路を導波する
ときのエバネセント波により、光分解または励起を行
う。

【００４１】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、分解用光源部から出力された分解光および励起用
光源部から出力された励起光それぞれは、照射光学系に
より透明部材と試料との境界面で全反射して、試料中に
エバネセント波を生じさせる。分解光のエバネセント波
は、透明部材近傍の試料中の光分解性試薬を光分解し、
一方、励起光のエバネセント波は、透明部材近傍の試料
を励起して蛍光を発生させ、この試料から発生した蛍光
は、検出手段により検出される。このような構成とした
ので、試料に導入された光分解性試薬のうち分解光のエ
バネセント波が生じる透明部材近傍の部分のみが光分解
され、かつ、その部分のみ励起光のエバネセント波によ
り励起されて蛍光が発生するので、透明部材近傍にある
試料部分のみを観察することができる。特に、試料とし
て細胞を観察しようとする場合には、細胞の機能に重要
な働きをしている細胞膜付近のみに分解光および励起光
を照射することができ、この細胞膜付近における反応を
解析することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施形態に係る顕微鏡装置の構成図であ
る。

【図２】第２の実施形態に係る顕微鏡装置の構成図であ
る。

【図３】第３の実施形態に係る顕微鏡装置の構成図であ
る。

【図４】膜に蛍光色素が導入された神経細胞をアルゴン
レーザ光源から出力されたレーザ光（波長４８８ｎｍ）
のエバネセント波で照明したときの蛍光像を顕微鏡で観
察しディスプレイ上に表示した中間調画像の写真であ
る。

【図５】膜に蛍光色素が導入された神経細胞をＹＡＧレ
ーザ光源から出力されたレーザ光の第三高調波（波長３
５５ｎｍ）のエバネセント波で照明したときの蛍光像を
顕微鏡で観察しディスプレイ上に表示した中間調画像の
写真である。

【図６】膜に蛍光色素が導入された神経細胞をキセノン
ランプから出力された励起光で落射照明したときの蛍光
像を顕微鏡で観察しディスプレイ上に表示した中間調画
像の写真である。

【図７】全体に光分解性試薬およびカルシウムイオン濃
度検出用蛍光色素が導入された神経細胞をキセノンラン
プから出力された励起光で落射照明したときの神経細胞
の蛍光像を顕微鏡で観察しディスプレイ上に表示した中
間調画像の写真である。

【図８】全体に光分解性試薬およびカルシウムイオン濃
度検出用蛍光色素が導入された神経細胞をアルゴンレー
ザ光源（励起用光源）から出力されたレーザ光（波長４
８８ｎｍ）のエバネセント波で照明したときの神経細胞
の蛍光像を顕微鏡で観察しディスプレイ上に表示した中
間調画像の写真である。

【図９】分解光を照射する前にアルゴンレーザ光源（励
起用光源）から出力されたレーザ光（波長４８８ｎｍ）
のエバネセント波で照明したときの神経細胞の蛍光像を
顕微鏡で観察しディスプレイ上に表示した中間調画像の
写真である。

【図１０】分解光を照射した後にアルゴンレーザ光源
（励起用光源）から出力されたレーザ光（波長４８８ｎ
ｍ）のエバネセント波で照明したときの神経細胞の蛍光
像を顕微鏡で観察しディスプレイ上に表示した中間調画
像の写真である。

【図１１】分解光を照射する前にアルゴンレーザ光源
（励起用光源）から出力されたレーザ光（波長４８８ｎ
ｍ）のエバネセント波で照明したときの神経細胞の規格
化された蛍光像をディスプレイ上に表示した中間調画像
の写真である。

【図１２】分解光を照射した後にアルゴンレーザ光源
（励起用光源）から出力されたレーザ光（波長４８８ｎ
ｍ）のエバネセント波で照明したときの神経細胞の規格
化された蛍光像をディスプレイ上に表示した中間調画像
の写真である。

【図１３】分解光照射の前後におけるアルゴンレーザ光
源（励起用光源）から出力されたレーザ光（波長４８８
ｎｍ）のエバネセント波で照明したときの神経細胞の規
格化された蛍光強度変化のグラフである。

【符号の説明】

１０…分解用光源、１１…分解光照射時間制御部、２０
…励起用光源、２１…励起光照射時間制御部、３０，３
０Ａ，３０Ｂ…反射鏡、３１…ダイクロイックミラー、
３２，３２Ａ，３２Ｂ…反射鏡、３３，３３Ａ，３３Ｂ
…光束整形光学系、３４，３４Ａ，３４Ｂ…反射鏡、３
５，３５Ａ，３５Ｂ…反射鏡、３６，３６Ａ，３６Ｂ…
集光レンズ、４０…プリズム、４１…グリセリン、４２
…スライドガラス、４３…スペーサ、４４…カバーガラ
ス、４５…ステージ、５０…対物レンズ、５１…反射
鏡、５２…光検出器、６０…処理部、６１…制御部、７
０…試料、７１…試料チャンバ、８０…照明用光源、Ａ
…分解光、Ｂ…励起光、Ｃ…蛍光、Ｄ…照明光、Ｅ…透
過光。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光分解性試薬が導入された試料に分解光
   を照射して前記光分解性試薬を光分解し、前記試料に励
   起光を照射して発生した蛍光を検出する顕微鏡装置であ
   って、 前記分解光を出力する分解用光源部と、 前記励起光を出力する励起用光源部と、 前記試料が接して配される透明部材を備え、前記分解光
   および前記励起光それぞれを前記透明部材の側から照射
   して前記試料との境界面で全反射させて、前記分解光お
   よび前記励起光それぞれのエバネセント波を前記試料中
   に発生させる照射光学系と、 前記励起光のエバネセント波が前記試料に照射されて発
   生した蛍光を検出する検出手段と、 を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
2. 【請求項２】 前記分解光のエバネセント波の照射の前
   および後それぞれにおいて前記励起光のエバネセント波
   の照射により発生し前記検出手段により検出された蛍光
   それぞれの間の強度比を演算する処理手段を更に備え
   る、ことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
3. 【請求項３】 前記試料に照射すべき照明光を出力する
   照明用光源部を更に備え、 前記検出手段は、前記照明光が前記試料に照射されて発
   生した透過光を更に検出する、 ことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。