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JPH1087700A - Ｃ３ａ受容体およびＣ３ａを用いる治療およびスクリーニング方法 - Google Patents

Ｃ３ａ受容体およびＣ３ａを用いる治療およびスクリーニング方法

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JPH1087700A
JPH1087700A JP9156514A JP15651497A JPH1087700A JP H1087700 A JPH1087700 A JP H1087700A JP 9156514 A JP9156514 A JP 9156514A JP 15651497 A JP15651497 A JP 15651497A JP H1087700 A JPH1087700 A JP H1087700A
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JP
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receptor
polypeptide
disease
cells
amino acid
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JP9156514A
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Robert S Ames Jr
ロバート・エス・アメス・ジュニア
Derk John Bergsma
ダーク・ジョン・バーグスマ
James J Foley
ジェイムズ・ジェイ・フォーリー
Chandrika Kumar
チャンドリカ・クマー
Harry M Sarau
ヘンリー・エム・サロー
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SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｃ３ａ受容体の重要な用途ならびにＣ３ａ受
容体機能の作用をする化合物およびそれに拮抗する化合
物を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のアミノ酸１から４８２に
対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含
んでなるポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】本発明は、一部には、新たに同定
されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ポリヌク
レオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらの変
種および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのアゴニス
トおよびアンタゴニスト；さらにはポリヌクレオチド、
ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびアンタ
ゴニストの使用に関する。詳細には、これらの点および
他の点において、本発明は、ヒト・補体３ａ受容体（以
後、Ｃ３ａ受容体という）のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】補体活性化の間、７４ないし７７個のア
ミノ酸のアナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５
ａが放出される。それらは、強力な炎症メディエイタで
あり、細胞脱顆粒、平滑筋収縮、アラキドン酸代謝、サ
イトカイン放出、細胞化学走性を誘導し（Gerard,C.,an
d Gerard,N.P.(1994)Annu.Rev.Immunol.12,775-808;Hug
li,T.E.(1984)Springer Semin.Immunopathol.7,193-21
9;Bitter-Suermann,D.TheComplement System,Ed.K.Roth
ar & G.Till,Springer Verlag,Heidelberg 367-395(198
8)）、種々の炎症性疾病の発生に関与している（Vogt,
W.(1986)Complement 3,177-188;Morgan,B.P.(1994)Euro
pean J Clin Investigation 24,219-228）。研究によ
り、モルモット血小板、ラット肥満細胞、ヒト好中球、
好酸球および血小板上のＣ３ａ受容体（Ｃ３ａ−Ｒ）の
存在が示されている（Bitter-Suermann,D.(1988) The C
omplement System,Ed.K.Rothar & G.Till,Springer Ver
lag,Heidelberg 367-395）。高いアフィニティーＣ３ａ
結合部位のただ１つのクラスがヒト好中球および分化し
たＵ９３７細胞上で特徴づけられている（Klos,A.,Blan
k,S.,Geitz,C.,Bautsch,W.,Kohl,J.,Burg,M.,and Kretz
schmar,T.(1992)Biochemistry 31,11274-11282）。競争
的結合および機能的脱感作の研究は、Ｃ５ａ−Ｒとは異
なるＣ３ａに対する受容体の存在と矛盾しない（Bitter
-Suermann,D.(1988) The Complement System,Ed.K.Roth
ar & G.Till,Springer Verlag,Heidelberg367-395;Klo
s,A.,Bank,S.,Gietz,C.,Bautsch,W.,Kohl,J.,Burg,M.,a
nd Kretzschmar,T.(1992)Biochemistry 31,11274-1128
2）。しかしながら、Ｃ３ａおよびＣ４ａが、２種のア
ナフィラトキシンと同じ受容体に結合してモルモット・
回腸組織を交差脱感作するという証拠があるが（Hugli,
T.E.(1984)Springer Semin.Immunopathol.7,193-219;Bi
tter-Suermann,D.The Complement System,Ed.K.Rothar&
G.Till,Springer Verlag,Heidelberg 367-395(198
8)）、モルモット・マクロファージを用いている他の研
究者は別個の受容体の存在を示している（Murakami,Y.,
Yamamoto,T.,Imamichi,T.,Nagasawa,S.(1993)Immunol.L
ett.36,301-304）。Ｃ３ａ−Ｒの機能的活性は百日咳ト
キシンに対して感受性があり、ＧＰＣＲから構成される
結合部位と矛盾しない（Klos,A.,Bank,S.,Gietz,C.,Bau
tsch,W.,Kohl,J.,Burg,M.,and Kretzschmar,T.(1992)Bi
ochemistry 31,11274-11282）。
【０００３】炎症性応答の疾病発生におけるＣ３ａの役
割についての完全な理解は、クローン化された受容体の
リガンドの特徴付けを欠いているために妨げられてい
る。本発明は、ヒト・Ｃ３ａ受容体の使用方法および機
能についての特徴付けを提供する。最近、この受容体
は、ｆＭｅｔＬｅｕＰｈｅ受容体プローブとの低厳密性
スクリーニングにより、ＨＬ−６０ライブラリーからク
ローンされた（Roglic,A.,Prossnitz,E.R.,et al.(196
6)Biochimica et Biophysica Acta 1305,39-43）。この
受容体についての報告はＣ３ａ受容体としての特徴付け
がされていなかった。この重要で有用な特徴に関する機
能についてのデータが報告にはなかった。それは、孤立
受容体（ＡＺ３Ｂ）として特徴づけられる。ＡＺ３Ｂを
発現するマウス・Ｌ細胞は、試験したアゴニストに結合
せず、応答しなかったが、Ｃ３ａは試験されなかった
（Roglic,A.,Prossnitz,E.R.,et al.(1966)Biochimica
et Biophysica Acta 1305,39-43）。本発明は、Ｃ３ａ
受容体の重要な用途ならびにＣ３ａ受容体機能の作用を
する化合物およびそれに拮抗する化合物を提供する。
【０００４】この受容体のＣ３ａ受容体としての明確化
およびこの重要な特徴付けを行う方法および化合物が本
発明において提供される。明確には、炎症を媒介する因
子ならびに機能不全および疾病におけるそれらの役割に
対する必要性がある。それゆえ、炎症を媒介し、また、
機能不全または疾病の予防、改善または修正において役
割を果たしうるかかる受容体の同定およびさらなる特徴
付けに対する必要性がある。
【０００５】本発明方法に用いるポリペプチドは、保存
的な補体受容体残基を有しており、既知補体受容体に対
して相同的なアミノ酸配列を有する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記事情に鑑みれば、
ポリペプチド、特に、図１および２に示すアミノ酸配列
と図３に示すような他の蛋白の既知アミノ酸配列との間
の相同性により新規Ｃ３ａ受容体として同定されたポリ
ペプチドを用いる方法を提供することが本発明の目的と
なる。
【０００７】そのうえ、Ｃ３ａ受容体をコードしている
ポリヌクレオチド、詳細には、本明細書でＣ３ａ受容体
と命名されたポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチドを提供することが本発明のさらなる目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明のこの態様の特に好ましい具体例において、ポリ
ヌクレオチドは、図１および２に示す配列中のヒト・Ｃ
３ａ受容体をコードしている領域を含んでなる。
【０００９】本発明のこの態様によれは、ＡＴＣＣ受託
番号７５９８２中に含まれるヒト・ｃＤＮＡにより発現
される成熟ポリペプチドをコードしている単離核酸分子
を用いる方法が提供される。
【００１０】本発明のこの態様によれば、ヒト・Ｃ３ａ
受容体をコードしている単離核酸分子（ｍＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡを包含）を用いる方法が提供され、
本発明のこの態様のさらなる具体例において、生物学的
に、診断において、臨床的にまたは治療的に有用なそれ
らの変種、アナログまたは誘導体、あるいはそれらのフ
ラグメント（変種、アナログおよび誘導体のフラグメン
トを包含）を用いる方法が提供される。
【００１１】また、本発明のこの態様の好ましい具体例
はヒト・Ｃ３ａ受容体の天然に存在する対立遺伝子変種
を用いる方法である。
【００１２】Ｃ３ａおよびＣ３ａ受容体の相互作用のア
ゴニストを提供することも本発明の目的である。
【００１３】もう１つの本発明の目的は、Ｃ３ａおよび
Ｃ３ａ受容体の相互作用に対する抗体である。
【００１４】本発明のさらなる目的は、Ｃ３ａおよびＣ
３ａ受容体の相互作用を阻害するアンタゴニストであ
る。
【００１５】治療上有効量のＣ３ａ受容体を患者に投与
することを特徴とする、Ｃ３ａ受容体を必要とする患者
の治療方法であって、患者が、急性炎症性疾患、アテロ
ーム性動脈硬化、慢性多発性関節炎、全身性血管炎、多
発性硬化症、アルツハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾患、ク
ローン病、食物アレルギー、非気管支アレルギー、骨関
節炎、骨粗鬆症、甲状腺疾患、心臓冠状動脈疾患からな
る群より選択される疾病にかかっているものである方法
を提供することも本発明の目的である。
【００１６】Ｃ３ａ受容体ポリペプチドをコードしてい
る核酸配列中の変異を決定することを特徴とするＣ３ａ
受容体の発現に関連した疾病またはかかる疾病の対する
感受性の診断方法であって、疾病が、急性炎症性疾患、
アテローム性動脈硬化、慢性多発性関節炎、全身性血管
炎、多発性硬化症、アルツハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾
患、クローン病、食物アレルギー、非気管支アレルギ
ー、骨関節炎、骨粗鬆症、甲状腺疾患、心臓冠状動脈疾
患からなる群より選択されるものである方法を提供する
ことも本発明の目的である。
【００１７】急性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化、
慢性多発性関節炎、全身性血管炎、多発性硬化症、アル
ツハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾患、クローン病、食物ア
レルギー、非気管支アレルギー、骨関節炎、骨粗鬆症、
甲状腺疾患、心臓冠状動脈疾患からなる群より選択され
る疾病を有する疑いのある宿主から得た試料中のＣ３ａ
受容体の存在を分析することを特徴とする診断方法を提
供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１８】Ｃ３ａ受容体に結合し、Ｃ３ａとＣ３ａ受
容体との相互作用を活性化または阻害する化合物を同定
する方法であって、受容体との結合を可能にする条件下
にて、スクリーニングすべき化合物と接触させ、受容体
が、受容体への化合物の結合に応答して検出可能シグナ
ルを発することのできる第２の成分に結合したものであ
るり；次いで、Ｃ３ａとＣ３ａ受容体との相互作用によ
り発生したシグナルの存在または不存在を検出すること
により、化合物がＣ３ａ受容体に結合し、Ｃ３ａとＣ３
ａ受容体との相互作用を活性化するかどうかを決定する
ことを特徴とする方法を提供することがさらにもう１つ
の本発明の目的である。
【００１９】本発明のさらなる具体例によれば、本発明
受容体ポリペプチドを刺激してＣ３ａ受容体の発現低下
に関連した症状を治療するために、かかる活性化化合物
を用いる方法が提供される。
【００２０】本発明のさらなる具体例によれば、Ｃ３ａ
受容体の過剰発現に関連した症状を治療するために、か
かる阻害化合物を用いる方法が提供される。
【００２１】本発明のさらなる態様によれば、本発明Ｃ
３ａ受容体のトランスメンブランドメインの少なくとも
１つについてのフラグメント、コンセンサスフラグメン
トおよび／または保存的アミノ酸置換を有する配列であ
る非天然合成、単離および／または組み換えＣ３ａ受容
体ポリペプチドが提供され、その結果、受容体がＣ３ａ
受容体リガンドに結合するか、あるいはＣ３ａ受容体リ
ガンド結合が定量的または定性的に転調させられる。
【００２２】本発明のもう１つの態様によれば、予想さ
れる生物学的特性からリガンドに結合あるいはリガンド
結合を転調させることによりＣ３ａ受容体機能のモジュ
レーターとして使用されうる合成または組み換えＣ３ａ
受容体ポリペプチド、その保存的置換体および誘導体、
抗体、抗−イディオタイプ抗体、組成物および方法が提
供され、それらは診断、治療および／または研究用途に
おいて用いられうる。
【００２３】本発明のもう１つの態様によれば、Ｃ３ａ
受容体アゴニストが提供される。Ｃ３ａ受容体を模倣
し、Ｃ３ａまたは受容体分子に結合し、Ｃ３ａにより誘
導される応答を誘発または増大させる分子は好ましいア
ゴニストである。また、好ましいアゴニストは、Ｃ３ａ
受容体またはＣ３ａ受容体ポリペプチドと、あるいはＣ
３ａ受容体活性に対する他のモジュレーターと相互作用
して、そのことによりＣ３ａ受容体の効果またはＣ３ａ
受容体の１つよりも多い効果を強力にし、あるいは増大
させる分子である。
【００２４】本発明のさらにもう１つの態様によれば、
Ｃ３ａ受容体アンタゴニストが提供される。Ｃ３ａ受容
体を模倣してＣ３ａ受容体または結合分子に結合する
が、Ｃ３ａ受容体により誘導される応答または１つより
も多いＣ３ａ受容体により誘導される応答を誘発しない
分子は好ましいアンタゴニストである。また、Ｃ３ａ受
容体と結合または相互作用してＣ３ａ受容体の効果また
は１つよりも多いＣ３ａ受容体および効果を阻害し、あ
るいはＣ３ａ受容体の発現を防止する分子は好ましいア
ンタゴニストである。
【００２５】以下の説明から、本発明の他の目的、利点
および態様は当業者に明らかであろう。しかしながら、
以下の説明および特定の実施例は本発明の好ましい具体
例を示すものであるが、説明のためだけに記載されるも
のであることが理解されるべきである。開示された発明
の精神の範囲内での種々の変更および修飾は、以下の説
明および本発明開示の他の部分を読めば、当業者に明ら
かであろう。
【００２６】用語の説明等下記の説明は本明細書、特に
実施例における特定の用語の理解を容易にするためのも
のである。
【００２７】「ＤＮＡの消化」とは、ＤＮＡ中の特定配
列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的開裂をい
う。本明細書の種々の制限酵素は市販されており、それ
らの反応条件、コファクターおよび使用される他の必要
物は知られており、当業者にとり日常的である。
【００２８】分析目的には、典型的には、２０μｌの反
応バッファー中で１μｇのＤＮＡフラグメントを約２ユ
ニットの酵素で消化する。プラスミド構築用のＤＮＡフ
ラグメントの単離目的には、典型的には、反応規模に応
じて反応体積を増加させて５ないし５０μｌのＤＮＡを
２０ないし２５０ユニットの酵素で消化する。
【００２９】個々の制限酵素に適するバッファーおよび
基質量は標準的な研究室用マニュアル、例えば、後に引
用する文献に記載されており、それらは市販業者により
詳述されている。
【００３０】３７℃で１時間のインキュベーション時間
を通常使用するが、標準的手順、販売者の指示および個
々の反応に応じて条件を変化させてもよい。消化後、反
応物を分析することができ、当業者にとり日常的な既知
方法を用いてアガロースまたはポリアクリルアミドゲル
ゲルによりフラグメントを精製することができる。
【００３１】「遺伝学的エレメント」とは、一般的に
は、ポリペプチドをコードしている領域、あるいは転写
または翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現
にとり重要な他のプロセスを調節する領域を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味し、あるいはポリペプチドをコ
ードしている領域および発現調節領域に作動可能に連結
された領域の両方を含んでなるポリヌクレオチドを意味
する。
【００３２】遺伝学的エレメントはベクター中に含まれ
ていてもよく、ベクターはエピソームエレメントとして
複製するものであり、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物
理的に独立した分子として複製するものである。遺伝学
的エレメントは、真核細胞におけるメトトレキセート選
択によりトランスフェクションされたＤＮＡの増幅期間
中に生じるようなミニ染色体に含まれていてもよい。遺
伝学的エレメントは宿主細胞ゲノムに含まれていてもよ
く、それらは天然の状態でなないが、特に、精製ＤＮＡ
またはベクター中の形態で単離、クローニングおよび宿
主細胞中へ導入される。
【００３３】当該技術分野で知られた用語である、２つ
のポリペプチド間の「同一性」または「類似性」は、１
のポリペプチドアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸
置換をもう１つのポリペプチドの配列と比較することに
より決定される。そのうえ、当該技術分野で知られた用
語である「同一性」とは、２つのポリペプチドまたは２
つのポリヌクレオチド間の配列関連性の程度を意味し、
かかる２つの配列間の合致により決定される。同一性お
よび類似性は両方とも容易に計算されうる（Computatio
nal Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford Univers
ity Press,NewYork,1988;Biocomputing Informations a
nd Genome Projects,Smith,D.W.,ed,Academic Press,Ne
w York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Par
t I,Griffin,A.M.and Griffin,H.G.,eds,Humana Press,
New Jersey,1994;Srquence Analysis in Molecular Bio
logy,von Heinje,G.,Academic Press,1987；およびSequ
ence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.ed
s.,M Stockton Press,NewYork,1991）。２つのポリヌク
レオチドまたはポリペプチド間の同一性および類似性の
多くの測定方法が存在するが、用語「同一性」および
「類似性」は当業者によく知られている（Sequence Ana
lysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic
Press,1987;Sequence Analysis Primer, Gribskov,M.an
d Devereux,J.eds.,M Stockton Press,New York,1991；
およびCarillo,H.,and Lipmn,D.,SIAMJ.Applied Math.,
48:1073(1988)）。２つの配列間の同一性または類似性
の決定に広く用いられる方法は、Carillo,H.,and Lipm
n,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に開示され
たものを包含するが、これに限らない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験される２つの配列間の合
致が最大となるように設計される。同一性および類似性
を決定する方法はコンピュータープログラムにおいて集
成されている。２つの配列間の同一性および類似性の決
定に好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプ
ログラムパッケージ（Devereux,J.,et al.,Nucleic Aci
ds Research 12(1):387(1984)）、BLASTP,BLASTAN,FAST
A（Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990)）
を包含するが、これらに限らない。
【００３４】「単離」とは、「人の手」による天然状態
からの変更を意味し、すなわち、天然において単離され
る場合には、本来の環境から変化または除去されるこ
と、あるいはその両方を意味する。
【００３５】例えば、天然状態の生きた動物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、天然状態における共存物質から分
離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書の用語によれば「単離」されたものであ
る。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、用語「単
離」は、それが天然において存在している染色体および
細胞から分離されていることを意味する。
【００３６】単離の一部として、あるいは単離後に、例
えば、突然変異により融合蛋白を得るために、そして宿
主中での増殖または発現のために、かかるポリヌクレオ
チドをＤＮＡのごとき他のポリヌクレオチドに結合させ
ることができる。単離ポリヌクレオチドは、単独または
ベクターのごとき他のポリヌクレオチドと結合されて、
培養細胞または生物そのものに導入されうる。培養宿主
細胞または生物そのものへ導入された場合、本明細書の
用語によれば、かかるＤＮＡはやはり単離されるもので
ある。なぜなら、それらは天然に存在する形態でなく、
あるいは天然環境に存在するものでないからである。同
様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例え
ば、培地処方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
例えば細胞中への導入のための溶液、化学反応または酵
素反応のための組成物または溶液（それらは天然には存
在しない組成のものであり、その中で単離ポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは本明細書にいう単離された状
態となっている）の中に存在しうる。
【００３７】「連結」とは、しばしば２本鎖ＤＮＡであ
る２個またはそれ以上のポリヌクレオチド間のホスホジ
エステル結合形成プロセスをいう。連結方法は当該分野
においてよく知られており、連結プロトコールは標準的
な研究室用マニュアルおよび文献に記載されており、例
えば、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATO
RY MANUAL,2nd Ed;Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Cold Spring Harbor,New York(1989)（「Sambrook」
という）および下で引用するManiatis et al.,の１４６
頁に記載されている。
【００３８】「オリゴヌクレオチド」とは比較的短いポ
リヌクレオチドをいう。しばしば、該用語は１本鎖デオ
キシリボヌクレオチドをいうが、１本鎖または２本鎖リ
ボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびと
りわけ２本鎖ＤＮＡも指すことがある。
【００３９】１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド
のごときオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動オリゴ
ヌクレオチド合成のごとき化学的方法により合成され
る。しかしながら、オリゴヌクレオチドを種々の方法に
より製造することができ、それらはインビトロ組み換え
ＤＮＡによる方法ならびに細胞および生物におけるＤＮ
Ａ発現による方法を包含する。
【００４０】化学合成されたＤＮＡは、典型的には最初
に５’リン酸を欠く形で得られる。かかるオリゴヌクレ
オチドの５’末端は、典型的には組み換えＤＮＡ分子を
得るためにＤＮＡリガーゼを用いる連結反応によるホス
ホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌ
クレオチドの連結が所望の場合には、キナーゼおよびＡ
ＴＰを用いるような標準的方法によりリン酸を付加する
ことができる。
【００４１】一般的には本明細書において「プラスミ
ド」は、当業者によく知られた慣用的銘々法により、大
文字および／または数字が前および／または後に続く小
文字のｐにより命名される。
【００４２】本明細書開示の出発プラスミドは市販のも
の、制限なく公的に利用可能なものであるか、あるいは
よく知られた公表された方法を用いて利用可能なプラス
ミドから日常的に構築可能なものである。本発明により
使用可能な多くのプラスミドならびに他のクローニング
および発現ベクターはよく知られており、当業者が容易
に入手できるものである。そのうえ、当業者は、本発明
における使用に適するどのような数のプラスミドであっ
ても容易に構築することができる。本発明におけるかか
るプラスミドならびに他のベクターの特性、構築および
使用は、本開示から当業者に容易に明らかとなろう。
【００４３】一般的には、「ポリヌクレオチド」とはポ
リリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチ
ドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはあ修飾Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡであってよい。よって、本明細書の用
語ポリヌクレオチドは、特に、１本鎖および２本鎖ＤＮ
Ａ、１本鎖および２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、１本鎖
および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の
混ざったＲＮＡをいい、より典型的には、２本鎖のもの
または１本鎖および２本鎖領域の混ざったものをいう。
【００４４】さらに、本明細書の用語ポリヌクレオチド
は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの
両方を含んでなる３本鎖をいう。かかる領域中の鎖は同
じ分子由来であってもよく、また異なる分子由来であっ
てもよい。その領域は１つまたはそれ以上の分子の全体
を含みうるが、典型的には、いくつかの分子の１の領域
を含む。３本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、
１のオリゴヌクレオチドである。
【００４５】本明細書の用語ポリヌクレオチドは、１個
またはそれ以上の修飾塩基を含む上記ＤＮＡまたはＲＮ
Ａを包含する。よって、安定性または他の理由のために
修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細
書にいう「ポリヌクレオチド」である。そのうえ、例え
ばイノシンまたはトリチウム化されたような修飾塩基の
ごとき普通でない塩基を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ
も本明細書にいうポリヌクレオチドである。
【００４６】当業者に知られた多くの有用な目的の非常
に多くの修飾がＤＮＡおよびＲＮＡについて行われてい
ることが認識されよう。本明細書の用語ポリヌクレオチ
ドは、かかる化学的に、酵素的、あるいは代謝的に修飾
された形態のポリヌクレオチド、ならびに、特にウイル
スの特徴および単一・複合細胞を包含する細胞の特徴を
示すＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００４７】本明細書の用語「ポリペプチド」を以下に
説明する。ポリペプチドの基本的構造はよく知られてお
り、当該分野の多数の教科書および他の刊行物に記載さ
れている。この点からすると、用語ポリペプチドは、ペ
プチド結合により互いに直鎖状に結合した２個またはそ
れ以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたは蛋白をい
うために用いられる。本明細書において該用語は短鎖
（当該分野において通常にはペプチド、オリゴペプチド
およびオリゴマーという）および長鎖（当該分野におい
て一般的には蛋白といい、種々のタイプがある）の両方
をいう。
【００４８】ポリペプチドは、しばしば２０個の天然ア
ミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含み、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスのみ
ならず当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても
末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸を一定のポリペ
プチド中で修飾できることが理解されよう。ポリペプチ
ドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも、ここに挙
げるには膨大すぎるが、それらは基本的な教科書および
さらに詳細な研究論文に記載されており、さらには膨大
な研究文献にも記載されており、それら当業者によく知
られている。
【００４９】本発明ポリペプチド中に存在してもよい知
られている修飾のうち、少しの例を挙げると、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共
有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタ
ミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、
グリコシレーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解的プロセッシング、ホスホリレーション、プレニ
レーション、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、
アルギニン化のごとき転移−ＲＮＡにより媒介される蛋
白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがあ
る。
【００５０】かかる修飾は当業者によく知られており、
科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特
によく行われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質
付加は、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIE
S,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Company,Ne
w York(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載されて
いる。多くの詳細なレビューがこの問題について利用で
き、例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIO
N OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New Y
ork(1983)中、Wold,F.,Posttranslational Protein Mod
ifications:Prespectives and Prospects,pgs.1-12；Se
ifter et al.,Analysis for protein modifications an
d nonprotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(19
90)およびRattman et al.,Protein Synthesis:Posttran
slational Modifications and Aging.Ann.N.Y.Acad.Sc
i.663:48-62(1992)にある。
【００５１】よく知られ、上記したように、ポリペプチ
ドはつねに完全に直鎖状であるとは限らないことが理解
されよう。例えば、一般的には、天然に起こるプロセッ
シングおよび自然には起こらない人間による操作を包含
する翻訳後の出来事の結果として、ポリペプチドは至る
所で分枝しており、また、分枝ありまたはなしで環状で
あったりする。非翻訳的天然プロセスおよび全くの合成
法によっても、環状、分枝および分枝つき環状のポリペ
プチドが合成されうる。
【００５２】ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびア
ミノ末端およびカルボキシル末端を包含するポリペプチ
ドのいずれの場所においても修飾が起こり得る。実際、
ポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるい
はそれら両方の共有結合によるブロックは、天然および
合成ポリペプチドにおいてよく起こるものであり、かか
る修飾が本発明ポリペプチド中に存在してもよい。例え
ば、蛋白分解プロセッシングの前にE.coliにおいて作ら
れるポリペプチドのアミノ末端残基はほとんど例外なく
Ｎ−ホルミルメチオニンである。
【００５３】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、それがいかにして作られるのかという機能であろ
う。例えば、宿主中でクローンされた遺伝子を発現する
ことにより作られるポリペプチドは、宿主細胞翻訳後修
飾能およびポリペプチドのアミノ末端に存在する修飾シ
グナルによって、修飾の性質および程度の大部分が決定
される。例えば、よく知られているように、グリコシレ
ーションは、しばしば、E.coliのごとき細菌細胞におい
ては起こらない。したがって、グリコシレーションが望
まれる場合には、ポリペプチドをグリコシレーションす
る宿主中、一般的には真核細胞中で発現すべきである。
昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後グリコシ
レーションを行うので、昆虫細胞発現系は、特に無傷の
グリコシレーションパターンを有する哺乳動物蛋白を効
率よく発現するために開発されてきた。
【００５４】同じタイプの修飾が一定のポリペプチドに
おいて同じ部位またはいくぶん異なった部位においてい
くつか存在しうることが理解されよう。また、一定のポ
リペプチドは多くのタイプの修飾を含みうる。
【００５５】一般的には本明細書の用語「ポリペプチ
ド」は、かかる修飾すべてを含み、詳細には、宿主細胞
中でポリヌクレオチドを発現させることにより合成され
るポリペプチド中に存在する修飾を含む。
【００５６】本明細書の用語ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの「変種」とは、もとのポリヌクレオチドま
たはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドをいう。この意味において変種は以下に説明
され、より詳細に本開示中に現れる。
【００５７】（１）他のもの、すなわちもとのポリヌク
レオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチ
ド。一般的には、相違は、もとのヌクレオチド配列と変
種ヌクレオチド配列が全体的に極めて類似し、多くの領
域において同一であるようなものに限られる。下記のご
とく、変種におけるヌクレオチド配列の変化がサイレン
トであってもよい。すなわち、それらは、ポリヌクレオ
チドによりコードされるアミノ酸を変化させなくてもよ
い。変化がこのタイプのサイレント変化に限定される場
合、変種はもとのポリペプチドと同じアミノ酸配列をコ
ードしているであろう。また、下記のごとく、変種にお
けるヌクレオチド配列の変化が、もとのポリヌクレオチ
ドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変
化させたものであってもよい。下記のごとく、かかるヌ
クレオチド変化は、もとの配列によりコードされるポリ
ペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切
断を引き起こし得る。
【００５８】（２）他のもの、すなわちもとのポリペプ
チドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般的に
は、相違は、もとのアミノ酸配列と変種アミノ酸配列が
全体的に極めて類似し、多くの領域において同一である
ようなものに限られる。変種ともとのポリペプチドと
は、１個またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合およ
び切断によりアミノ酸配列が異なっていてもよく、それ
らはいずれの組み合わせにおいて存在してもよい。
【００５９】本明細書の用語「受容体分子」とは、本発
明のＣ３ａポリペプチドと特異的に結合または相互作用
する分子をいい、古典的受容体のみを包含するのではな
く、好ましくは、本発明ポリペプチドと特異的に結合ま
たは相互作用する他の分子も包含する（それらをそれぞ
れ「結合分子」および「相互作用分子」、「Ｃ３ａ結合
分子」および「Ｃ３ａ相互作用分子」という）。本発明
ポリペプチドとかかる分子（受容体または結合もしくは
相互作用分子を包含）との間の結合は本発明ポリペプチ
ドにもに生じるものであってもよく、あるいは非常に好
ましくは本発明ポリペプチドに対して非常に特異的であ
ってもよく、あるいは非常に好ましくは本発明ポリペプ
チドを包含する蛋白のグループに非常に特異的であって
もよく、あるいは好ましくは、本発明ポリペプチドがそ
の蛋白グループの少なくとも１つであるいくつかの蛋白
グループに対して特異的であってもよい。また、受容体
は、本発明ポリペプチドに特異的に結合する抗体および
抗体により誘導される物質のごとき非天然のものであっ
てもよい。
【００６０】発明の説明 本発明は、新規Ｃ３ａ受容体ポリペプチドおよびポリヌ
クレオチド、特に、以下に非常に詳細に説明するものを
使用する方法に関する。詳細には、本発明は、新規ヒト
・Ｃ３ａ受容体のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
を使用する方法に関し、該ポリペプチドは、アミノ酸配
列相同性によりＣ５ａ受容体ポリペプチドと関連があ
る。本発明は、図１および２に示すヌクレオチド配列お
よびアミノ酸配列を有するＣ３ａ受容体を用いる方法、
およびＡＴＣＣ受託番号７５９８２中のヒト・ｃＤＮＡ
（本明細書では「寄託クローン」または「寄託クローン
のｃＤＮＡ」という）のＣ３ａ受容体ヌクレオチド配列
およびアミノ酸配列に関する。図１および２に示すヌク
レオチド配列およびアミノ酸配列を用いる方法は、寄託
クローンのｃＤＮＡを配列決定することにより得られる
ことが理解されよう。それゆえ、寄託クローンの配列
は、２つの配列間の矛盾を調製するものであり、図１お
よび２の配列に対する参照は寄託クローンのヒト・ｃＤ
ＮＡの配列への参照を包含する。
【００６１】ポリヌクレオチド 本発明の１の態様によれば、図１および２の推定アミノ
酸配列を有するＣ３ａ受容体ポリペプチドをコードする
単離ポリヌクレオチドを用いる方法が提供される。
【００６２】図１および２に示すポリヌクレオチド配列
のごとき本明細書の情報を用いれば、毛細血管内皮組織
由来の細胞を出発物質として得られるｍＲＮＡを用いる
ｃＤＮＡクローニングのための方法のごとき標準的クロ
ーニングおよびスクリーニング法を用いてヒト・Ｃ３ａ
受容体ポリペプチドをコードしている本発明ポリヌクレ
オチドを得ることができる。本発明の説明として、図１
および２に示すポリヌクレオチドは、ヒト・毛細血管内
皮組織の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーにおい
て見いだされたものである。
【００６３】寄託クローン中のヒト・Ｃ３ａ受容体をコ
ードしているｃＤＮＡの配列決定結果から示されるよう
に、本発明方法のヒト・Ｃ３ａ受容体は、構造的に他の
補体受容体ファミリーの蛋白と関連がある。かくして得
られたｃＤＮＡ配列を図１および２に示す。それは、約
４８２個のアミノ酸残基からなる蛋白をコードしている
読み枠を含んでいる。該蛋白は既知のＣ５ａ受容体蛋白
に対して有意な相同性を示す。図１および２のＣ３ａ受
容体は、Ｃ５ａ受容体のアミノ酸配列について約２６％
の同一性および約５８％の類似性を有する。Ｃ３ａ受容
体を発現する卵細胞およびＲＢＬ−２Ｈ３細胞は、Ｃ３
ａおよびＣ３ａアナログ合成ペプチドに応答する（下記
実施例参照）。この遺伝子を発現する哺乳動物細胞はＣ
３ａおよびペプチドアナログに特異的に結合する。組織
分配の分析結果とともにこれらのデータを見れば、本発
明はヒト・Ｃ３ａ受容体を提供するものである。Ｃ３ａ
受容体発現は骨髄細胞に限らないが、それらは全身の種
々の非骨髄細胞においても発現され、それらは中枢神経
系において多く発現されるという本発明における示唆
は、これらの受容体が炎症性および自己免疫性疾病の発
生において重要な役割を果たしていることを示すもので
ある。
【００６４】本発明方法に用いられるポリヌクレオチド
は、ｍＲＮＡのごときＲＮＡ形態であってもよく、ある
いは例えばクローニングまたは化学合成法またはそれら
の組み合わせにより得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮ
Ａを包含するＤＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡは２本
鎖または１本鎖であってよい。１本鎖ＤＮＡはコーディ
ング鎖（センス鎖としても知られる）であってもよく、
あるいは非コーディング鎖（アンチ−センス鎖としても
知られる）であってもよい。
【００６５】ポリペプチドをコードしているコーディン
グ鎖は、図１および２に示すポリヌクレオチドのコーデ
ィング鎖と同じであってもよい。コーディング鎖は別の
配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、それ
は、遺伝コードの縮重の結果として図１および２のＤＮ
Ａのポリペプチドをコードしているものであってもよ
い。
【００６６】図１および２のポリペプチドをコードして
いる本発明方法に用いられるポリヌクレオチドは、それ
らにより示されるポリペプチドに関するコーディング配
列；当該ポリペプチド配列およびリーダー配列または分
泌配列（プレ−またはプロ−またはプレプロ−蛋白配
列）をコードしているような付加的配列に関するコーデ
ィング配列；さらなる非コーディング配列（例えば、イ
ントロンおよび転写されるが翻訳されない非コーディン
グ５’−３配列（転写、ｍＲＮＡプロセッシング−スプ
ライシングおよびポリアデニレーションシグナルを包含
−リボソーム結合およびｍＲＮＡ安定性において役割を
果たす）；さらなる官能基を提供するさらなるようなア
ミノ酸をコードしているさらなるコーディング配列）を
伴った上記の付加的配列を有するあるいは有していない
ポリペプチドに関するコーディング配列（これらに限ら
ない）を包含してもよい。よって、例えば、ポリペプチ
ドがペプチドのごときマーカー配列に融合していてもよ
く、該マーカー配列は融合ポリペプチドの精製を容易に
するものであってよい。本発明のこの態様の特定の好ま
しい具体例において、マーカー配列は、特にｐＱＥベク
ター（Qiagen,Inc）中のタグのごときヘキサヒスチジン
ペプチドであり、それらの多くが市販されている。例え
ば、Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86,821-82
4(1989)に記載のごとく、ヘキサヒスチジンは融合蛋白
の精製を便利にする。ＨＡタグはインフルエンザ・ヘマ
グルチニン蛋白に対応するものであり、例えば、Wilson
et al.,Cell 37:767(1984)に記載されている。
【００６７】上記によれば、本明細書の用語「ポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポ
リペプチド、詳細には、図１および２に示すアミノ酸配
列を有するヒト・Ｃ３ａ受容体をコードしている配列を
含むポリヌクレオチドを包含する。該用語は、さらなる
領域（コーディングおよび／または非コーディング配列
を含んでいてもよい）を伴ったポリペプチド（例えば、
イントロンにより分断されている）をコードしている単
一の連続領域または不連続領域を含むポリヌクレオチド
を包含する。
【００６８】さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドの
変種に関する。該変種は図１および２の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチドのフラグメント、アナログおよ
び誘導体をコードしている。ポリヌクレオチドの変種
は、天然に存在する対立遺伝子変種のごとき天然に存在
する変種であってもよく、あるいは天然に存在すること
が知られていない変種であってもよい。かかるポリヌク
レオチドの非天然変種を、ポリヌクレオチド、細胞また
は生物に適用される突然変異法を包含する突然変異法に
より作成してもよい。
【００６９】この点において、ヌクレオチド置換、欠失
または付加によって変種は上記ポリヌクレオチドと異な
る。置換、欠失または付加には１個またはそれ以上のヌ
クレオチドが関与しうる。変種はコーディング配列また
は非コーディング配列あるいはそれらの両方において変
化していてもよい。コーディング配列の変化が保存的ま
たは非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じるも
のであってもよい。
【００７０】この点において本発明の特に好ましい具体
例は、図１および２に示すＣ３ａ受容体のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ド；その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、
ならびにその変種、アナログおよび誘導体のフラグメン
トである。
【００７１】この点において、Ｃ３ａ受容体の変種、ア
ナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフラ
グメントの変種、アナログおよび誘導体をコードしてい
るポリヌクレオチドであって、図１および２のＣ３ａポ
リペプチドのアミノ酸配列を有するものがさらに特に好
ましく、該アミノ酸中、いくつかの、少数の、５ないし
１０個、１ないし５個、１ないし３、２、１個または０
個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されており、
あるいはそれらが組み合わされている。これらのうち特
に好ましいのは、サイレント置換、付加および欠失であ
り、それらはＣ３ａ受容体の特性および活性を変化させ
ない。また、この点において、保存的置換が特に好まし
い。置換を有しない図１および２のアミノ酸配列を有し
ているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
が最も好ましい。
【００７２】本発明のさらに好ましい具体例は、図１お
よび２に示すアミノ酸配列を有するＣ３ａ受容体ポリペ
プチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少な
くとも７０％同一であるポリヌクレオチド、およびかか
るポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであ
る。あるいはまた、本明細書記載のライブラリーから得
られるヒト・ｃＤＮＡのＣ３ａ受容体ポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも８０
％同一である領域を含んでなるポリヌクレオチドおよび
それに相補的なポリヌクレオチドが非常に好ましい。こ
の点において、上記ポリペプチドに対して少なくとも９
０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、これ
らのうちでも特に好ましいのは、少なくとも９５％同一
のものである。さらにそのうえ、少なくとも９５％同一
のものの中でも少なくとも９７％同一のものが非常に好
ましく、その中でも少なくとも９８％同一のものおよび
少なくとも９９％同一のものが特に非常に好ましく、少
なくとも９９％のものがより好ましい。
【００７３】そのうえ、この点において特に好ましい具
体例は、図１および２のｃＤＮＡによりコードされるポ
リペプチドのいずれかと実質的に同じ生物学的機能また
は活性を保持しているポリペプチドをコードしているポ
リヌクレオチドである。
【００７４】さらに本発明は、本明細書において上で述
べた配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドに関する。この点において本発明は、特に、厳密な条
件下で本明細書において上で述べた配列とハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書の
用語「厳密な条件」とは、少なくとも９５％、好ましく
は少なくとも９７％同一である配列間においてのみハイ
ブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００７５】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てさらに本明細書で議論するように、例えば、上記本発
明ポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用の
ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、Ｃ３ａ
受容体をコードしている全長のｃＤＮＡおよびゲノムク
ローンを単離してもよく、また、ヒト・Ｃ３ａ遺伝子に
対して高度の配列類似性を有するｃＤＮＡおよび他の遺
伝子のゲノムクローンを単離してもよい。一般的には、
かかるプローブは少なくとも１５個の塩基を含んでな
る。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０個の
塩基を有し、少なくとも５０個の塩基を有していてもよ
い。特に好ましいプローブは少なくとも３０個の塩基を
有し、５０個またはそれ以下の塩基を有するであろう。
【００７６】例えば、オリゴヌクレオチドプローブを合
成するための既知ＤＮＡ配列を用いてＣ３ａ受容体遺伝
子のコーディング領域を単離することができる。次い
で、本発明遺伝子配列に対する配列相補性を有する標識
オリゴヌクレオチドを用いてヒト・ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングして
ライブラリーのどのメンバーがプローブにハイブリダイ
ゼーションするのかを決定する。
【００７７】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドを、ヒトの疾病の治療および診断のための研究試薬お
よび材料として用いてもよい（特に、ポリヌクレオチド
アッセイに関して本明細書でさらに議論する）。
【００７８】ポリヌクレオチドは、当該蛋白およびさら
なるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸、あるい
はポリペプチドに対するさらなる内部アミノ酸（ペプチ
ド形態が１種よりも多いポリペプチド鎖を有する場合）
であるポリペプチドをコードしていてもよい。かかる配
列は、前駆体から個々の形態への蛋白のプロセッシング
において役割を果たしている可能性があり、蛋白輸送を
容易にする可能性があり、蛋白半減期を延長または短縮
する可能性があり、あるいは特に、アッセイまたは製造
のために蛋白の取り扱いを容易にする可能性もある。in
situにおける一般的な場合には、細胞酵素により、さ
らなるアミノ酸がプロセッシングにより蛋白から除去さ
れうる。
【００７９】１またはそれ以上のプロ配列に融合した特
別の形態のポリペプチドを有する前駆体蛋白は、そのポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去される場合、一般的にはかかる不活性前駆体が活性化
される。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化前に
除去される。一般的にはかかる前駆体はプロ蛋白と呼ば
れる。
【００８０】まとめると、本発明方法のポリヌクレオチ
ドは、成熟蛋白、成熟蛋白＋リーダー配列（プレ蛋白と
呼ぶこともある）、プレ蛋白のリーダー配列でない１個
またはそれ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、
あるいはリーダー配列および１個またはそれ以上のプロ
配列（一般的には、ポリペプチドの活性および成熟形態
を生じるプロセッシング工程の間に除去される）を有す
るプロ蛋白に対する前駆体であるプレプロ蛋白をコード
していてもよい。
【００８１】寄託材料 上記のごとく、ヒト・Ｃ３ａ受容体 ｃＤＮＡを含んで
いる寄託物をAmericanType Culture Collectionに寄託
してある。さらに上記のごとく、ヒト・ｃＤＮＡ寄託物
を、本明細書においては「寄託クローン」または「寄託
クローンのｃＤＮＡ」という。
【００８２】寄託クローンは、American Type Culture
Collection,12301 Park Lawn Drive,Rockville,Marylan
d 20852,USAに、１９９４年１２月１６日に寄託され、
ＡＴＣＣ受託番号７５９８２を与えられた。
【００８３】寄託材料は、全長のＣ３ａ受容体ｃＤＮＡ
を含んでいるpBluescript SK(-)プラスミド（Stratagen
e,La Jolla,CA）である。
【００８４】寄託物はブダペスト条約に従って行われ
た。
【００８５】ポリペプチドさらに本発明は、図１および
２の推定アミノ酸配列を有するヒト・Ｃ３ａ受容体ポリ
ペプチドに関する。
【００８６】また本発明は、これらのポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図３
のポリペプチドについていう場合、かかるポリペプチド
と本質的に同じ生物学的機能または活性を保持している
ポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋
白部分の開裂により活性化されて活性ポリペプチドを生
じうるプロ蛋白を包含する。
【００８７】本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであって
もよい。特定の好ましい具体例において、本発明ポリペ
プチドは組み換えポリペプチドである。
【００８８】図１および２のポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログは、（ｉ）１個またはそれ以
上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基
（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されてお
り、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコード
されているものであっても、コードされていないもので
あってもよく、あるいは（ｉｉ）１個またはそれ以上の
アミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）
ポリペプチドの半減期を延長させるような別の化合物に
ポリペプチドが融合しているもの、あるいは（ｉｖ）リ
ーダーまたは分泌配列、またはポリペプチドの精製に用
いられる配列、またはプロ蛋白配列のごときさらなるア
ミノ酸がポリペプチドに融合しているものである。かか
るフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００８９】この点において、図１および２に示すＣ３
ａ受容体のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該
フラグメントの変種、アナログおよび誘導体は本発明の
特に好ましい具体例に属する。あるいはまた、この点に
おいて、本発明の特に好ましい具体例は、Ｃ３ａ受容体
のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナ
ログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメ
ントの変種、アナログおよび誘導体である。
【００９０】保存的アミノ酸置換によって元のものとは
異なる変種も好ましい変種に属する。かかる置換は、ポ
リペプチド中のあるアミノ酸を同様の特性の別のアミノ
酸で置換するものである。典型的に見られるのは、脂肪
族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での
相互置換；水酸基を有するＳｅｒおよびＴｈｒの相互置
換、産生残基ＡｓｐおよびＧｌｕの相互置換、アミド残
基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基Ｌｙｓおよ
びＡｒｇの置換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間
の置換である。
【００９１】この点において、いくつかの、少数の、５
ないし１０個の、１ないし５個の、１ないし３、２、１
個の、または０個のアミノ酸残基が置換、欠失または付
加されている（あるいはそれらのいずれかの組み合わ
せ）図１および２のＣ３ａ受容体ポリペプチドのアミノ
酸配列を有する変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび
誘導体がさらに特に好ましい。Ｃ３ａ受容体の特性およ
び活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失
がこれらのうちで特に好ましい。また、この点におい
て、保存的置換が特に好ましい。置換のない図１および
２のアミノ酸配列を有するポリペプチドがもっとも非常
に好ましい。
【００９２】好ましくは、本発明方法のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましく
は均一にまで精製されている。
【００９３】本発明方法のポリペプチドは、配列番号：
２のポリペプチド（詳細には成熟ポリペプチド）ならび
に配列番号：２のポリペプチドに対して少なくとも８０
％同一性を有し、より好ましくは配列番号：２のポリペ
プチドに対して少なくとも９０％の類似性を有し、さら
により好ましくは配列番号：２のポリペプチドに対して
少なくとも９５％の類似性を有するポリペプチド（さら
により好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有す）
を包含し、また、かかるポリペプチドの部分も包含する
（ポリペプチドに対するかかる部分は一般的には少なく
とも３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０
個のアミノ酸を含む）。
【００９４】本発明ポリペプチドのフラグメントまたは
部分を、ペプチド合成による対応する全長のポリペプチ
ドの合成に使用してもよい。それゆえ、フラグメントを
全長のポリペプチドの製造のための中間体として使用し
てもよい。本発明ポリペプチドのフラグメントまたは部
分を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成して
もよい。
【００９５】フラグメント Ｃ３ａ受容体ポリペプチドのフラグメント、最も詳細に
は図１および２に示すアミノ酸配列を有するＣ３ａ受容
体ポリペプチドのフラグメントを含んでなるポリペプチ
ド、および図１および２のＣ３ａ受容体ポリペプチドの
変種および誘導体のフラグメントを含んでなるポリペプ
チドも、本発明のこの態様の好ましい具体例に含まれ
る。
【００９６】この点において、フラグメントは、上記Ｃ
３ａ受容体ポリペプチドおよびその変種または誘導体の
アミノ酸配列の一部（全部ではない）と完全に同じアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００９７】かかるフラグメントは「フリー−スタンデ
ィング（free-standing）」、すなわち、他のアミノ酸
またはポリペプチドの一部でなく、それらに融合してい
ないものであってよく、あるいはかかるフラグメントが
大きなポリペプチド中に含まれていて、その一部分また
は領域となっていてもよい。大きなポリペプチド中に含
まれている場合、現在議論中のフラグメントは、最も好
ましくは単一の連続した領域を形成する。しかしなが
ら、いくつかのフラグメントが単一のより大きなポリペ
プチド中に含まれていてもよい。例えば、特定の好まし
い具体例は、宿主における発現のために設計された前駆
体ポリペプチド中に含まれていて、Ｃ３ａ受容体フラグ
メントのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポ
リペプチド領域ならびに該フラグメントのカルボキシル
末端に融合したさらなる領域を有している本発明Ｃ３ａ
受容体ポリペプチドのフラグメントに関する。それゆ
え、本明細書における意味の１の態様において、フラグ
メントは、Ｃ３ａ受容体由来の融合ポリペプチドまたは
融合蛋白の一部または部分をいう。
【００９８】本発明ポリペプチドフラグメントの典型例
として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０個、
１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし７５
個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし
１００個および７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。
【００９９】この文脈において、特に列挙した範囲、な
らびに数個、少数、５、４、３、２、１個のアミノ酸の
分だけ大きいまたは小さい範囲（上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において）を包含する。例え
ば、この文脈において、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスマイナス数個、少数、５、４、３、２、
１個から、９０プラスマイナス数個、少数、５、４、
３、２、１個までのポリペプチドフラグメントを意味
し、すなわち、広くは４０マイナス数個から９０プラス
数個のアミノ酸、狭くは４０プラス数個から９０マイナ
ス数個のアミノ酸の範囲である。
【０１００】この点において、列挙した範囲プラスまた
はマイナス５個程度のアミノ酸（上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において）が非常に好ましい。
列挙した範囲プラスまたはマイナス３個程度のアミノ酸
（上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲におい
て）が特に非常に好ましい。列挙した範囲プラスまたは
マイナス１個程度のアミノ酸（上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において）または列挙した範囲そ
のものが特に非常に好ましい。この点において、約５な
いし１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３
０ないし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０
個、４１ないし９０個、５０ないし１００個および７５
ないし１００個、９０ないし１１５個、１００ないし１
２５個、および１１０ないし１１３個のアミノ酸の長さ
のフラグメントが最も好ましい。
【０１０１】Ｃ３ａ受容体の切断された変異種は本発明
の特に好ましいフラグメントに含まれる。切断された変
異種は、図１および２のアミノ酸配列を有するＣ３ａポ
リペプチド、あるいはその変種または誘導体を包含する
が、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわち、
連続した領域、部分または一部分）の欠失、あるいはカ
ルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠失、ある
いは二重切断変異種中にあるような２つの連続した残基
の欠失（１つはアミノ末端を含み、もう１つはカルボキ
シル末端を含む）は除く。上に示したサイズ範囲のフラ
グメントも切断されたフラグメントの好ましい具体例で
あり、一般的にはそれらはフラグメントのなかでも特に
好ましいものである。
【０１０２】本発明のこの態様において、Ｃ３ａポリペ
プチドの構造的または機能的属性によって特徴づけられ
るフラグメントも好ましい。この点において本発明の好
ましい具体例は、Ｃ３ａ受容体ポリペプチドのアルファ
−ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス形成領域
（「アルファ−領域」）、ベータ−シートおよびベータ
−シート形成領域（「ベータ−領域」）、ターンおよび
ターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイ
ル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性
領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フ
レキシブル領域、表面形成領域および高抗原性インデッ
クス領域を含んでなるフラグメントを包含する。
【０１０３】これらの点において、特定の好ましい領域
を図４に示す。それは図１および２に示すアミノ酸配列
の分析により同定される上記タイプの領域を包含する
が、これに限らない。図４に示すように、かかる好まし
い領域は、Garnier-Robsonアルファ領域、ベータ領域、
ターン領域およびコイル領域、Chou-Fasmanアルファ領
域、ベータ領域およびターン領域、Kyte-Doolittle親水
性領域およびEisenbergアルファ領域およびベータ両親
媒性領域、Karplus-Schulzフレキシブル領域、Emini表
面形成領域ならびにJameson-Wolf抗原性インデックス領
域を包含する。
【０１０４】この点において、いくつかの上記特徴のご
ときいくつかの構造的特徴を合わせたＣ３ａ受容体の領
域を含んでなるフラグメントは、非常に好ましいフラグ
メントに属する。この点において、図１および２の、約
１０ないし約２０個、約４０ないし約５０個、約７０な
いし約９０個および約１００ないし約１１３個の残基に
より決定される領域（そのすべてが、ターン領域、親水
性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原
性インデックス領域の特徴を顕著に有するアミノ酸組成
により特徴づけられる）は特に非常に好ましい領域であ
る。かかる領域は大きなポリペプチド中に含まれていて
もよく、あるいは上記のごとくそれら自体本発明の好ま
しいフラグメントでありうる。この段落の用語「約」は
一般的なフラグメントに関して上で説明した意味を有す
る。
【０１０５】さらに好ましい領域はＣ３ａ受容体の活性
を媒介する領域である。この点において、Ｃ３ａ受容体
の化学的、生物学的活性または他の活性（類似活性また
は改善された活性を包含、望ましくない活性は減じられ
ている）を有するフラグメントが最も好ましい。この点
において、図３に示す関連ポリペプチド（Ｃ５ａ受容体
を包含）のごとき関連ポリペプチドの活性領域に対して
配列または位置、あるいは両方が相同的である領域を含
むフラグメントは非常に好ましい。これらの点におい
て、上記の切断された変異種は特に好ましいフラグメン
トに含まれる。
【０１０６】さらに本発明は、特に、上記フラグメント
をコードしているポリヌクレオチド、該フラグメントを
コードしているポリヌクレオチドにハイブリダイゼーシ
ョンするポリヌクレオチド、詳細には厳密な条件下でハ
イブリダイゼーションするもの、および該フラグメント
をコードしているポリペプチドを増幅するためのＰＣＲ
プライマーのごときポリヌクレオチドに関することが理
解されよう。これらの点において、好ましいポリヌクレ
オチドは上記のような好ましいフラグメントに対応する
ポリヌクレオチドである。
【０１０７】ベクター、宿主細胞、発現 また、本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞
および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関
する。
【０１０８】宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチ
ドを含むようにして、本発明ポリペプチドを発現させる
ことができる。例えば、感染、形質導入、トランスフェ
クション、トランスベクションおよび形質転換のよく知
られた方法を用いてポリヌクレオチドを宿主細胞中に導
入してもよい。ポリヌクレオチドを単独または他のポリ
ヌクレオチドとともに導入してもよい。かかる他のポリ
ヌクレオチドを本発明ポリヌクレオチドとは別個に、同
時に、あるいは本発明ポリヌクレオチドと結合して導入
してもよい。
【０１０９】よって、例えば、哺乳動物細胞において同
時トランスフェクションおよび選択のための標準的方法
を用いて、例えば、本発明ポリヌクレオチドを選択可能
マーカーをコードしているもう１つの別個のポリペプチ
ドとともに宿主細胞中にトランスフェクションしてもよ
くい。この場合、一般的には、ポリヌクレオチドは宿主
細胞ゲノム中に安定に取り込まれるであろう。
【０１１０】別法として、宿主中での増殖のための選択
可能マーカーを含むベクターにポリヌクレオチドを結合
させてもよい。上記方法によりベクター構築物を宿主細
胞中に導入してもよい。一般的には、プラスミドベクタ
ーを、リン酸カルシウム沈殿のごとき沈殿中、あるいは
荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入する。エレク
トロポレーションを用いてポリヌクレオチドを細胞中に
導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、それ
をインビトロでパッケージングし、あるいはパッケージ
ング細胞中に導入することができ、パッケージングされ
たウイルスを細胞中にトランスダクションすることがで
きる。本発明によるポリヌクレオチドの製造および細胞
中へのポリヌクレオチドの導入に適した広範囲の方法は
当業者によく知られており、日常的なものである。かか
る方法は上記Sambrook et al.の文献にようやく記載さ
れたものであり、その文献はこれらの方法を詳述する多
くの研究室マニュアルの説明である。本発明のこの態様
によれば、ベクターは、例えばプラスミドベクター、１
本鎖もしくは２本鎖のファージベクター、１本鎖もしく
は２本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであっ
てよい。細胞中へのＤＮＡおよびＲＮＡ導入のためのよ
く知られた方法によって、かかるベクターをポリヌクレ
オチドとして、好ましくはＤＮＡとして細胞中に導入す
ることができる。ファージおよびウイルスベクターの場
合、感染および形質導入のためのよく知られた方法によ
って、ベクターを、好ましくは、パッケージングされ、
あるいはカプセル封入されたウイルスとして細胞中に導
入する。ウイルスベクターは複製可能であってもよく、
複製欠損であってもよい。後者の場合、一般的にはウイ
ルス増殖は相補的宿主細胞においてのみ起こるであろ
う。
【０１１１】特定の態様において、本発明ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの発現用ベクターが特に好まし
い。一般的には、かかるベクターは、発現されるべきポ
リヌクレオチドに作動可能に連結された宿主中での発現
に効果的なシス−作用性制御領域を含んでなる。適当な
トランス−作用性因子は宿主によっても提供され、ある
いは相補的ベクターによっても提供され、あるいは宿主
中への導入によりベクター自身により提供される。
【０１１２】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、あるいはある
種のタイプの細胞においてのみ起こる発現であってもよ
く、あるいは誘導可能および細胞特異的の両方であって
もよい。温度および栄養添加物のごとき操作容易な環境
因子による発現に関して誘導されうるベクターが、特に
好ましい誘導可能ベクターである。原核細胞および真核
細胞において使用される構成的発現ベクターおよび誘導
可能発現ベクターを包含する本発明のこの態様に適した
種々のベクターは当業者によく知られており、日常的に
使用されている。
【０１１３】遺伝子操作された宿主細胞を慣用的な培地
で培養することができ、特にプロモーターの活性化、形
質転換体の選択または遺伝子の増幅に関して、適宜、培
地を修飾してもよい。発現用に選択された宿主細胞に関
して以前使用されていた温度、ｐＨ等の培養条件は、一
般的には、当業者に明らかであるように、本発明ポリペ
プチドの発現に適するであろう。
【０１１４】非常に多種にわたる発現ベクターを用いて
本発明ポリペプチドを発現させることができる。かかる
ベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来の
ベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バ
クテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来
のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、バ
クイロウイルスのごときウイルス、類人猿ウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のごときパポーバウイルス、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイル
ス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のも
の、ならびにコスミドおよびファージミドのごときプラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメント由来
のベクターのごときそれらの組み合わせ由来のベクター
を包含し、それらすべてを本発明のこの態様による発現
に使用できる。この点において、一般的には、宿主細胞
中でのポリヌクレオチドの維持、増殖または発現に適し
たベクターを発現に用いることができる。
【０１１５】種々のよく知られた日常的方法のいずれに
よっても適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入すること
ができる。一般的には、発現させるＤＮＡ配列および発
現ベクターを１種またはそれ以上の制限酵素で開裂し、
次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限フラグメン
トを結合させることにより、発現させるＤＮＡ配列を発
現ベクターに結合させる。この目的に用いることのでき
る制限的開裂および連結の手順は当業者によく知られて
おり、日常的なものである。この点において、別法を用
いる発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者に
よく知られており、本明細書の他の場所で引用している
Sambrook et al.の文献に非常に詳細に説明されてい
る。
【０１１６】発現ベクター中のＤＮＡ配列を適当な発現
制御配列（例えば、ｍＲＮＡ転写を指令するプロモータ
ーを包含）に作動可能に連結する。かかるプロモーター
の典型例は、ファージラムダＰＬプロモーター、E.coli
lac、trpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期および
後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲｓのプ
ロモーターを包含するが、それらは当業者によく知られ
ているもののほんの例示に過ぎない。ここで述べなかっ
た多くのプロモーターも本発明のこの態様に適し、それ
らは当業者によく知られており、本明細書で説明され、
実施例に示されたようにして容易に使用されうることが
理解されるであろう。
【０１１７】一般的には、発現構築物は、転写される領
域に転写開始部位および終止部位を有し、さらに翻訳の
ためのリボソーム結合部位を含むであろう。構築物によ
り発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳さ
れるべきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧ
を、さらに終わりの部分に適当に位置している終止コド
ンを含むであろう。
【０１１８】さらに、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般的には、多
くの通常行われる手順によれば、かかる領域は、特に、
リプレッサー結合部位およびエンハンサーのごとき転写
調節により作動するものであろう。
【０１１９】一般的には、増殖および発現のためのベク
ターは選択可能マーカーを含むであろう。かかるマーカ
ーも増殖に適するものであってよく、あるいはベクター
がこの目的のためにさらなるマーカーを含んでいてもよ
い。この点において、好ましくは、発現ベクターは１個
またはそれ以上の選択可能マーカー遺伝子を有しており
形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を
提供するものである。好ましいマーカーは、真核細胞用
のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、
E.coliおよび他の細菌用のテトラサイクリンまたはアン
ピシリン耐性遺伝子を包含する。
【０１２０】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の既知方法を用いて、上記のような適当なＤＮＡ
配列ならびに適当なプロモーター、さらに他の適当な制
御配列を含むベクターを適当な宿主中に導入することが
できる。適当な宿主の典型例は、E.coli、Streptomyces
およびSalmonella typhimurium細胞のごとき細菌細胞；
酵母細胞のごとき真菌細胞；Drosophila S2およびSpodo
ptera Sf9細胞のごとき昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよ
びBowesメラノーマ細胞のごとき動物細胞；ならびに植
物細胞を包含する。多種の発現構築物用宿主がよく知ら
れており、当業者は本開示により本発明のこの態様にお
けるポリペプチドの発現のための宿主を容易に選択する
ことができよう。
【０１２１】より詳細には、本発明は、発現構築物のご
とき組み換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の上記配列を含んでなる。構築物は、本発明のかか
る配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベクター
のごときベクターを含む。配列を順方向または逆方向に
挿入することができる。この点において、特定の好まし
い具体例において、構築物はさらに、例えば該配列に作
動可能に連結されたプロモーターを包含する調節配列を
含んでなる。多数の適当なベクターおよびプロモーター
が当業者に知られており、本発明における使用に適した
多くのベクターが市販されている。
【０１２２】市販されている下記ベクターを例示する。
それらのうち、細菌での使用に適するのはｐＱＥ７０、
ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Qiagenから市販）；ｐＢ
Ｓベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクタ
ー、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ
４６Ａ（Stratageneから市販）；ならびにｐｔｒｃ９９
ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４
０、ｐＲＩＴ５（Pharmaciaから市販）である。それら
のうち、好ましい真核細胞ベクターはｐＷＬＮＥＯ、ｐ
ＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（St
ratageneから市販）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Pharmaciaから市販）であ
る。これらのベクターは多くの市販ベクターの例示のた
めにのみ挙げたのであり、それらは本発明のこの態様に
より使用するために当業者によく知られたものである。
例えば、宿主中における本発明ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適する他
のプラスミドまたはベクターを本発明のこの態様に使用
してもよいことが理解されよう。
【０１２３】制限部位または候補プロモーターフラグメ
ント（すなわち、プロモーターを含み得るフラグメン
ト）導入部位の下流のクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニットのごとき、プ
ロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含むベ
クターを用いてプロモーター領域をいずれの所望遺伝子
からも選択できる。よく知られているように、プロモー
ター含有フラグメントのベクター中のｃａｔ遺伝子上流
の制限部位への導入はＣＡＴ活性の生成を発生させ、そ
れを標準的ＣＡＴアッセイにより検出することができ
る。この目的に適するベクターはよく知られており、容
易に入手できる。２種のかかるベクターはｐＫＫ２３２
−８およびｐＣＭ７である。よって、本発明ポリヌクレ
オチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容易
に入手できるものを包含するだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。
【０１２４】E.coli lacIおよびlacZおよびT3およびT7
プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモ
ーターならびにtrpプロモーターは、本発明によるポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知細
菌プロモーターに属する。
【０１２５】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期
プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、
初期および後期ＳＶ４０プロモーター、例えばRousサル
コーマウイルス（ＲＳＶ）のごときレトロウイルスＬＴ
Ｒｓのプロモーター、ならびにマウス・メタロチオネイ
ン−Ｉプロモーターのごときメタロチオネインプロモー
ターは、この点において適する知られている真核細胞プ
ロモーターに含まれる。
【０１２６】宿主細胞中での発現に適するベクターおよ
びプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発現
ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿主
における発現に関する精妙な方法は当業者にとり日常的
なものである。
【０１２７】また本発明は、上記構築物を含む宿主細胞
に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核細
胞であってもよく、あるいは酵母細胞のごとき下等真核
細胞であってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごと
き原核細胞であってもよい。
【０１２８】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェ
クション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、トランスダクシ
ョン、感染または他の方法により宿主細胞中への構築物
の導入を行うことができる。かかる方法は多くの標準的
研究室マニュアル、例えばDavis et al.BASIC METHODS
IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)に記載されている。
【０１２９】宿主中の構築物を慣用的方法で使用して、
組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を得ること
ができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により
本発明ポリペプチドを合成的に得ることもできる。
【０１３０】適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において成熟蛋白を
発現させることができる。本発明ＤＮＡ構築物由来のＲ
ＮＡを用いる無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を得るこ
ともできる。原核宿主および真核宿主についての使用に
適するクローニングおよび発現ベクターは上で引用した
Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANU
AL,2nd Ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,N.Y.(1989)により記載されている。
【０１３１】一般的には、組み換え発現ベクターは、複
製開始点、下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子
由来のプロモーター、およびベクターに細胞を曝露した
後のベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能マー
カーを含むであろう。特に、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）のごとき糖分解酵素、ａ−ファクタ
ー、ホスファターゼ、および熱ショック蛋白をコードし
ている遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーター
である。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐
性遺伝子およびS.cerevisiaeのｔｒｐ１遺伝子を包含す
る。
【０１３２】ベクター中にエンハンサー配列を挿入する
ことにより、本発明ポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａの高等真核細胞による転写を増大させることができ
る。エンハンサーはＤＮＡのシス−作用性エレメントで
あり、通常には、約１０ないし３００ｂｐであり、特定
の宿主細胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増
大するように作用する。エンハンサーの例は、複製開始
点の後期側１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０
エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータ
ー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【０１３３】一般的には、本発明ポリペプチドの異種構
造配列をコードしている本発明ポリヌクレオチドを標準
的方法を用いてベクター中に挿入してそれが発現用プロ
モーターに作動可能に連結されるようにする。転写開始
部位がリボソーム結合部位の５’付近に位置するように
ポリヌクレオチドを置く。リボソーム結合部位は、発現
されるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５’であ
る。一般的には、開始コドン（通常にはＡＵＧ）から始
まる他の読み枠は存在せず、他の読み枠はリボソーム結
合部位と開始ＡＵＧとの間には存在しないであろう。ま
た、一般的には、ポリペプチド末端に翻訳終止コドンが
存在し、転写される領域の３’末端に適当に分散して存
在するポリアデニレーションシグナルおよび転写終止シ
グナルが存在するであろう。
【０１３４】翻訳された蛋白の小胞体ルーメン中、ペリ
プラスム空間中または細胞外環境中への分泌のために、
適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチド中に含ま
せることができる。シグナルはポリペプチドに対する内
在性のものであってもよく、あるいは異種シグナルであ
ってもよい。
【０１３５】ポリペプチドを、融合蛋白のごとき修飾形
態で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみならず
さらなる異種機能領域を含んでいてもよい。よって、例
えば、さらなるアミノ酸の領域、詳細には荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して宿主細胞中、
精製中またはさらなる取り扱いおよび保存中の安定性お
よび維持を改善してもよい。また、精製を容易にする領
域をポリペプチド付加してもよい。最終的なポリペプチ
ドの調製の前にかかる領域を除去することができる。特
に、分泌または外分泌を引き起こすための、安定性を改
善するための、そして精製を容易にするためのペプチド
部分のポリペプチドへの付加は当業者によく知られてい
る日常的方法である。この望ましい融合蛋白は、受容体
を可溶化させるのに有用な免疫グロブリン由来の異種領
域を含んでなる。例えばＥＰ−Ａ−０ ４６４ ５３３
（カナダ対応出願２０４５８６９）には、免疫グロブリ
ン分子の不変領域の種々の部分と別のヒト・蛋白または
その一部とを含んでなる融合蛋白が開示されている。多
くの場合、融合蛋白のＦｃ部分は、治療および診断にお
いて非常に有利であり、よって、例えば、改善された薬
物動力学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０ ２３２ ２６
２）。他方では、いくつかの用途には、融合蛋白が発現
され、検出され、記載された有利な方法で精製された後
にＦｃ部分を欠失させうることが望ましいであろう。こ
れは、Ｆｃ部分が治療および診断における使用を妨げる
場合、例えば、融合蛋白が免疫するための抗原として使
用される場合である。薬剤の発見において、例えば、ｈ
ＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理量ス
クリーニングアッセイを目的としてｓｈＩＬ−５のごと
きヒト・蛋白がＦｃ部分と融合させられている。例え
ば、D.Bennett et al.,Journal of Molecular Recognit
ion,Vol.8 52-58(1995)およびK.Johanson et al.,The J
ournal of Biological Chemistry,Vol.270,No.16,pp.94
59-9471(1995)参照。
【０１３６】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、Escher
ichia coli、Bacillus subtilisおよびSalmonella typh
imuriumを包含する。Pseudomonas、Streptomycesおよび
Staphylococcusの種々の種はこの点において適当な宿主
である。そのうえ、この点において当業者に知られてい
る他の多くの宿主も使用可能である。
【０１３７】典型的であるが限定的でない例として、細
菌用途の有用発現ベクターは、選択可能マーカーおよび
市販プラスミド（よく知られたクローニングベクターｐ
ＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝学的エレメン
トを含んでなる）由来の細菌の複製開始点を含んでな
る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３
（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）および
ＧＥＭ１（Promega Biotec,Madison,WI,USA）を包含す
る。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモ
ーターおよび発現すべき構造配列と結合する。
【０１３８】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが
誘導可能である場合には、適当な手段（例えば、温度シ
フトまたは化学誘導剤への曝露）によりそれを誘導し、
適当時間細胞を培養する。
【０１３９】典型的には、次いで、細胞を遠心分離によ
り集め、物理的または化学的手段により破壊し、得られ
た粗抽出物をさらなる精製に供する。
【０１４０】凍結−融解繰り返し、ソニケーション、機
械的破壊を包含する慣用的方法、あるいは当業者によく
知られた細胞溶解剤の使用により、蛋白発現に使用する
微生物細胞を破壊することができる。
【０１４１】同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現
に使用することができる。哺乳動物発現系の例は、Gluz
man et al.,Cell 23:175(1981)に記載されたサル・腎臓
線維芽細胞ＣＯＳ−７細胞系を包含する。適合するベク
ターを発現させうる他の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ヒト・腎臓２９３およびＢ
ＨＫ細胞を包含する。
【０１４２】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプ
ライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、
および発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んで
なる。この点において、特定の好ましい具体例におい
て、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、および
ＳＶ４０ポリアデニレーション部位が、これらのタイプ
の所望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。
【０１４３】硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られ
た方法により、Ｃ３ａ受容体ポリペプチドを組み換え細
胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ま
しくは、高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を
精製に用いる。単離または精製中にポリペプチドが変性
している場合には、蛋白の再生のためのよく知られた方
法を用いて活性コンホーメーションを再生することがで
きる。
【０１４４】本発明ポリペプチドは、天然の精製産物、
化学合成法による産物、細菌、酵母、高等植物、昆虫お
よび哺乳動物細胞を包含する原核細胞または真核細胞か
ら組み換え法により得られた産物を包含する。組み換え
法に使用する宿主によっては、本発明ポリペプチドはグ
リコシレーションされていてもよく、されていなくても
よい。さらに、いくつかの場合、宿主によるプロセスの
結果として本発明ポリペプチドは最初の修飾されたメチ
オニン残基を含みうる。
【０１４５】本発明に従って、Ｃ３ａ受容体ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳細にはＣ
３ａ受容体の化学的および生物学的特性を用いる適用例
に使用することができる。さらなる適用例は、細胞、組
織および器官の疾病の診断および治療に関する。本発明
のこれらの態様を以下の議論によってさらに説明する。
【０１４６】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオ
チドの検出のためのＣ３ａ受容体ポリヌクレオチドの使
用に関する。機能不全に関連した変異形態のＣ３ａ受容
体の検出は、Ｃ３ａ受容体の発現低下、発現過剰または
変化した発現から生じる疾病の診断またはかかる疾病に
対する感受性に関する診断を付加し、あるいは明確化し
うる診断道具を提供するであろう。ヒト・Ｃ３ａ受容体
遺伝子における変異を有する個体を、種々の方法によ
り、ＤＮＡレベルにおいて検出することができる。診断
のための核酸を、患者の細胞、体液（例えば、血液、
尿、唾液）、生検および剖検材料から得ることができ
る。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使用してもよく、ある
いは分析前にＰＣＲ（Saiki et al.,Nature,324:163-16
6(1986)）を用いることにより酵素的に増幅してもよ
い。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じように使用してもよ
い。一例として、Ｃ３ａ受容体をコードしている核酸に
相補的なＰＣＲプライマーを用いてＣ３ａ受容体の発現
および変異を同定および分析することができる。例え
ば、正常遺伝子型との比較における増幅生成物のサイズ
の変化により、欠失および挿入を検出することができ
る。増幅したＤＮＡを標識Ｃ３ａ受容体 ＲＮＡとハイ
ブリダイゼーションさせることにより、あるいは別法と
して放射性標識Ｃ３ａ受容体アンチセンスＤＮＡ配列と
ハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を
同定することができる。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消
化または融点温度の相違により、マッチした配列とミス
マッチ２本鎖とを識別することができる。
【０１４７】直接ＤＮＡ配列決定により、もとの遺伝子
と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとな
りうる。さらに、クローンされたＤＮＡセグメントをプ
ローブとして用いて特定のＤＮＡ配列を検出してもよ
い。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適当に用いることによ
り、かかる方法の感度をおおいに向上させることができ
る。例えば、配列決定プライマーを、２本鎖ＰＣＲ生成
物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型分子とと
もに使用する。放射性標識を用いる慣用的手順により、
あるいは蛍光タグを用いる自動配列決定法により配列決
定を行う。
【０１４８】変性剤有りまたは無しにおけるゲル中のＤ
ＮＡの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことがで
きる。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠
失および挿入を可視化することができる。個々の融点ま
たは部分的に融解する温度によってＤＮＡフラグメント
がゲル中の異なる位置において移動が阻止される変性ホ
ルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡフ
ラグメントを識別することができる（例えば、Myers et
al.,Science,230:1242(1985)参照）。
【０１４９】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-44-1(198
5)）。
【０１５０】よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａ
ｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限
酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦ
ＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うこと
ができる。
【０１５１】より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定以外にも、in situ分析によって突然変異を検出
することができる。
【０１５２】本発明のさらなる態様によれば、急性炎症
性疾患、アテローム性動脈硬化、慢性多発性関節炎、全
身性血管炎、多発性硬化症、アルツハイマー症、ＣＮＳ
炎症性疾患、クローン病、食物アレルギー、非気管支ア
レルギー、骨関節炎、骨粗鬆症、甲状腺疾患、心臓冠状
動脈疾患（これらに限らない）を包含する疾病、または
上記疾病に対する感受性の決定のための方法が提供され
る。よって、Ｃ３ａ受容体における変異またはＣ３受容
体の発現は、急性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化、
慢性多発性関節炎、全身性血管炎、多発性硬化症、アル
ツハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾患、クローン病、食物ア
レルギー、非気管支アレルギー、骨関節炎、骨粗鬆症、
甲状腺疾患、心臓冠状動脈疾患（これらに限らない）を
包含する疾病に対する感受性を示すものとなり、上記核
酸配列をかかる感受性の確認のためのアッセイに使用し
てもよい。よって、例えば、該アッセイを用いて本明細
書記載のヒト・Ｃ３ａ蛋白の変異、例えば欠失、切断、
挿入、フレームシフト等を検出することができ、かかる
変異は、急性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化、慢性
多発性関節炎、全身性血管炎、多発性硬化症、アルツハ
イマー症、ＣＮＳ炎症性疾患、クローン病、食物アレル
ギー、非気管支アレルギー、骨関節炎、骨粗鬆症、甲状
腺疾患、心臓冠状動脈疾患（これらに限らない）を包含
する疾病に対する感受性を示すものである。かかる方法
は腎臓疾患、例えば、全身性エリトマーデス現象、ＳＬ
Ｅ関連腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎炎、リュー
マチ性疾患、例えばリューマチ性関節炎、ＳＬＥ、ベー
チェット症候群、若年性リューマチ性関節炎、ショーグ
レン症候群、神経学的疾患、例えば筋無力症、多発性硬
化症、脳の狼瘡、ギラン−バーレ症候群、アルツハイマ
ー症、皮膚病、例えば天疱瘡／類天疱瘡、光毒性反応、
血管炎、生体適合性／ショック疾患、例えばバイパス後
症候群、カテーテル反応、敗血症、ＡＲＤＳ、アナフィ
ラキシー、移植拒絶反応、子かん前症、ならびに他の疾
病、例えばアテローム、腸の炎症、甲状腺炎、および不
妊症、化膿性感染に対する感受性、糸球体腎炎、ネイセ
リア感染に対する感受性、再発性皮下腫および粘膜浮
腫、および再発性血栓症／溶血の決定にも有用である。
【０１５３】例えば、ＤＮＡ配列決定アッセイにより変
異を確認することができる。血液試料（これに限らな
い）を包含する組織試料をヒト患者から得る。当該分野
で知られた方法により試料を処理してＲＮＡを捕捉す
る。ｍＲＮＡに存在するポリアデノシン伸長部分にハイ
ブリダイゼーションするポリチミジン残基からなるオリ
ゴヌクレオチドプライマーを添加することにより、第１
鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から合成する。逆転写酵素およ
びデオキシリボヌクレオチドを添加して第１鎖ｃＤＮＡ
を合成する。本発明ＤＮＡ修復蛋白のＤＮＡ配列に基づ
いてプライマー配列を合成する。一般的には、プライマ
ー配列は少なくとも１５個の連続した塩基を含んでな
り、少なくとも３０個またはちょうど５０個の連続した
塩基を含んでいてもよい。
【０１５４】ＲＴ−ＰＣＲを用いて変異を検出すること
もできる。ＲＴ−ＰＣＲを、自動検出システム、例え
ば、GeneScanのごときシステムと組み合わせて用いるこ
とが特に好ましい。一例として、Ｃ３ａ受容体をコード
している核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて変異
を同定し分析することができる。典型的なプライマーの
例を下表１に示す。例えば、正常遺伝子型との比較にお
ける増幅生成物のサイズの変化により、欠失および挿入
を検出することができる。増幅したＤＮＡを放射性標識
ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより、あ
るいは別法として放射性標識アンセンスＤＮＡとハイブ
リダイゼーションさせることにより点突然変異を同定す
ることができる。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消化また
は融解温度の相違によりミスマッチした２本鎖と完全に
マッチした配列とを識別することができる。
【０１５５】本明細書に示した配列を用いて、当業者は
ポリヌクレオチド増幅プライマーを容易に調製すること
ができよう。
【０１５６】ポリヌクレオチドプライマーを、患者から
得た試料より単離したＣ３ａ受容体ｃＤＮＡの増幅に用
いてもよい。プライマーを用いて患者から単離した遺伝
子を増幅して、次いで、遺伝子を種々の方法に供してＤ
ＮＡ配列を調べることができる。このようにして、ＤＮ
Ａ配列における変異を診断することができる。
【０１５７】もとの遺伝子と変異を有する遺伝子との間
の配列の相違を、ＤＮＡ配列決定法により明らかにする
ことができる。さらに、クローンされたＤＮＡセグメン
トをプローブとして用いて特定のＤＮＡ配列を検出する
こともできる。ＰＣＲ法と組み合わせた場合にこの方法
の感度はおおいに上昇する。例えば、配列決定プライマ
ーを２本鎖ＰＣＲ生成物またはＰＣＲ変法により得られ
た１本鎖鋳型分子とともに用いる。放射性標識を用いる
慣用的手順または蛍光タグを用いる自動配列決定法によ
り配列決定を行う。
【０１５８】変性剤有りまたは無しにおけるゲル中のＤ
ＮＡの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことがで
きる。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠
失および挿入を可視化することができる。個々の融点ま
たは部分的に融解する温度によってＤＮＡフラグメント
がゲル中の異なる位置において移動が阻止される変性ホ
ルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡフ
ラグメントを識別することができる（例えば、Myers et
al.,Science,230:1242(1985)参照）。
【０１５９】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(198
5)）。
【０１６０】よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａ
ｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限
酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦ
ＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出および配列
レベルの定量を行うことができる。本発明は、患者由来
の試料から、図１および２（配列番号：１）の配列を有
するポリヌクレオチドの低下した発現レベルを決定する
ことを特徴とする、疾患、詳細には急性炎症性疾患、ア
テローム性動脈硬化、慢性多発性関節炎、全身性血管
炎、多発性硬化症、アルツハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾
患、クローン病、食物アレルギー、非気管支アレルギ
ー、骨関節炎、骨粗鬆症、甲状腺疾患、心臓冠状動脈疾
患、全身性エリトマーデス現象、ＳＬＥ関連腎炎、膜性
増殖性糸球体腎炎、膜性腎炎、リューマチ性疾患、例え
ばリューマチ性関節炎、ＳＬＥ、ベーチェット症候群、
若年性リューマチ性関節炎、ショーグレン症候群、神経
学的疾患、例えば筋無力症、多発性硬化症、脳の狼瘡、
ギラン−バーレ症候群、アルツハイマー症、皮膚病、例
えば天疱瘡／類天疱瘡、光毒性反応、血管炎、生体適合
性／ショック疾患、例えばバイパス後症候群、カテーテ
ル反応、敗血症、ＡＲＤＳ、アナフィラキシー、移植拒
絶反応、子かん前症、ならびに他の疾病、例えばアテロ
ーム、腸の炎症、甲状腺炎、および不妊症、化膿性感染
に対する感受性、糸球体腎炎、ネイセリア感染に対する
感受性、再発性皮下腫および粘膜浮腫、および再発性血
栓症／溶血（これらに限らない）を包含する疾病の診断
方法を提供する。ポリヌクレオチド定量について当該分
野でよく知られた方法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび他
のハイブリダイゼーション法を用いて、低下したポリヌ
クレオチドの発現を測定することができる。
【０１６１】例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓ
ｅ保護、ノーザンブッティングおよび他のハイブリダイ
ゼーション法のごとき当業者によく知られたポリヌクレ
オチド定量法のいずれかを用いてポリヌクレオチドの発
現低下を測定することができる。
【０１６２】より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定以外にも、in situ分析により変異を検出するこ
とができる。
【０１６３】ポリペプチドアッセイ 本発明は、細胞および組織中のＣ３ａ受容体蛋白レベル
の検出のための定量および診断アッセイのごとき診断ア
ッセイにも関し、正常および異常なレベルの決定を包含
する。よって、例えば、正常対照組織試料と比較して本
発明Ｃ３ａ受容体蛋白の過剰発現を検出するための本発
明診断アッセイを用いて、例えば腫瘍の存在を検出して
もよい。宿主由来の試料中の本発明Ｃ３ａ受容体蛋白の
ごとき蛋白のレベルを決定するのに用いることのできる
アッセイ法は当業者によく知られている。かかるアッセ
イ法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウ
ェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含
する。これらのうち、ＥＬＩＳＡがしばしば好ましい。
ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、Ｃ３ａ受容体に対して特
異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する
ことを特徴とする。さらに、一般的には、モノクローナ
ル抗体に結合するレポーター抗体を調製する。レポータ
ー抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または酵素試薬検のご
とき検出可能試薬に結合しているが、この実施例ではセ
イヨウワサビ・ペルオキシダーゼ酵素に結合している。
【０１６４】ＥＬＩＳＡを行うために試料を宿主から取
り、試料中の蛋白を結合する固体支持体、例えば、ポリ
スチレンディッシュ上でインキュベーションする。次い
で、ウシ・血清アルブミンのごとき非特異的蛋白ととも
にインキュベーションすることによりディッシュ上の遊
離の蛋白結合部位を被覆する。次に、モノクローナル抗
体をディッシュ中でインキュベーションし、その間にモ
ノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合し
ているＣ３ａ受容体蛋白に結合する。未結合モノクロー
ナル抗体をバッファーで洗浄除去する。セイヨウワサビ
・ペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体をディ
ッシュ中に置き、レポーター抗体とＣ３ａ受容体に結合
しているモノクローナル抗体との結合を生じさせる。次
いで、未結合レポーター抗体を洗浄除去する。次いで、
発色基質を包含するペルオキシダーゼ活性のための試薬
をディッシュに添加する。１次抗体および２次抗体によ
りＣ３ａ受容体に結合され固定化されているペルオキシ
ダーゼは着色反応生成物を生じる。一定時間の発色量は
試料中のＣ３ａ受容体蛋白量を示す。典型的には、標準
曲線に対する参照により定量結果を得る。
【０１６５】固体支持体に結合したＣ３ａ受容体特異的
抗体および標識Ｃ３ａ受容体および宿主由来の試料が固
体支持体上に通され、固体支持体に結合した検出標識量
と試料中のＣ３ａ受容体量とが相関関係を有するもので
ある競争アッセイを用いてもよい。
【０１６６】抗体 ポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導
体、あるいはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現
する細胞を免疫原として用いてそれらに対する抗体を得
ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクロー
ナルまたはモノクローナルであってよい。本発明は、キ
メラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラ
グメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も包
含する。当該分野において知られた種々のプロデューサ
ーを、かかる抗体およびフラグメントの製造に用いても
よい。
【０１６７】動物へのポリペプチドの直接注射により、
あるいは動物、好ましくは非ヒトへのポリペプチドの投
与により、本発明配列に対応したポリペプチドに対して
生成した抗体を得ることができる。次いで、そのように
して得られた抗体はポリペプチド自体に結合するであろ
う。このようにして、無傷のポリペプチド全体に結合す
る抗体を得るために、ポリペプチドのフラグメントのみ
をコードしている配列でさえも用いることができる。次
いで、かかる抗体を用いてポリペプチドを発現する組織
からポリペプチドを単離することができる。
【０１６８】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞系の培養により得られる抗体を製造する方法を
用いることができる。例は、ハイブリドーマ法（Kohler
andMilstein Nature 1975 256:495-497）、トリオーマ
法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.,Im
munology Today 1983 4:72）およびヒト・モノクローナ
ル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Co
le et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.
Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985)）を包含する。
【０１６９】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を
製造することができる。また、トランスジェニックマウ
スを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対
するヒト化抗体を発現させてもよい。
【０１７０】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、あるいはアフ
ィニティークロマトグラフィーによる単離および／また
は精製のための固体支持体への抗体の結合により本発明
ポリペプチドを精製してもよい。
【０１７１】よって、特に、Ｃ３ａ受容体に対する抗体
を用いて、急性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化、慢
性多発性関節炎、全身性血管炎、多発性硬化症、アルツ
ハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾患、クローン病、食物アレ
ルギー、非気管支アレルギー、骨関節炎、骨粗鬆症、甲
状腺疾患、心臓冠状動脈疾患、腎臓疾患、例えば、全身
性エリトマーデス現象、ＳＬＥ関連腎炎、膜性増殖性糸
球体腎炎、膜性腎炎、リューマチ性疾患、例えばリュー
マチ性関節炎、ＳＬＥ、ベーチェット症候群、若年性リ
ューマチ性関節炎、ショーグレン症候群、神経学的疾
患、例えば筋無力症、多発性硬化症、脳の狼瘡、ギラン
−バーレ症候群、アルツハイマー症、皮膚病、例えば天
疱瘡／類天疱瘡、光毒性反応、血管炎、生体適合性／シ
ョック疾患、例えばバイパス後症候群、カテーテル反
応、敗血症、ＡＲＤＳ、アナフィラキシー、移植拒絶反
応、子かん前症、ならびに他の疾病、例えばアテロー
ム、腸の炎症、甲状腺炎、および不妊症、化膿性感染に
対する感受性、糸球体腎炎、ネイセリア感染に対する感
受性、再発性皮下腫および粘膜浮腫、および再発性血栓
症／溶血を抑制してもよい。
【０１７２】Ｃ３ａ受容体結合分子およびアッセイ さらに本発明は、Ｃ３ａ受容体に結合する受容体分子の
ごとき分子の同定方法も提供する。当業者に知られた多
くの方法、例えば、結合アッセイ、競争アッセイ、リガ
ンドパンニング（panning）およびＦＡＣＳソーティン
グにより、受容体蛋白のごときＣ３ａ受容体に結合する
蛋白をコードしている遺伝子を同定することができる。
かかる方法は多くの研究室用マニュアル、例えば、Coli
gan et al.,Current Protocoles in Immunology 1(2)：
第５章（１９９１年）に記載されている。
【０１７３】例えば、発現クローニングをこの目的に用
いてもよい。この目的のために、Ｃ３ａ受容体に応答す
る細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡラ
イブラリーをこのＲＮＡから作成し、ライブラリーをプ
ールに分割し、Ｃ３ａ受容体に応答しない細胞中に各プ
ールをトランスフェクションする。次いで、形質転換細
胞を標識Ｃ３ａ受容体に曝露する（放射性ヨウ素化また
は部位特異的プロテインキナーゼ認識部位を含めること
といった標準的方法を包含する種々のよく知られた方法
によりＣ３ａ受容体を標識することができる）。曝露
後、細胞を固定し、Ｃ３ａ受容体の結合を測定する。便
利には、これらの手順をスライドガラス上で行う。
【０１７４】Ｃ３ａ受容体結合細胞を作り出すｃＤＮＡ
についてプールを同定する。これらの陽性物からサブ−
プール（sub-pool）を調製し、宿主細胞中にトランスフ
ェクションし、上記のごとくスクリーニングする。反復
サブ−プーリングおよび再スクリーニングプロセスを用
いて、推定上受容体分子のごとき結合分子をコードして
いる１種またはそれ以上のクローンを単離することがで
きる。
【０１７５】別法として、受容体分子のごとき結合分子
を発現する細胞から調製された膜または膜抽出物のごと
き細胞抽出物に標識リガンドを光アフィニティー結合さ
せることもできる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）により架橋材料を分離し、Ｘ線フィルムに
曝露する。Ｃ３ａ−Ｃ３ａ受容体を含む標識複合体を切
断し、ペプチドフラグメントにまで分解し、蛋白微小配
列決定に供することができる。微小配列決定から得られ
たアミノ酸配列を用いて、受容体と推定される分子をコ
ードしている遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするためのユニークなオリゴヌク
レオチドプローブまたは縮重オリゴヌクレオチドプロー
ブを設計することができる。
【０１７６】本発明方法に用いるポリペプチドを用い
て、細胞中または無細胞調製物中において、受容体分子
のごときＣ３ａ受容体結合分子を評価することもでき
る。
【０１７７】本発明Ｃ３ａ受容体を、Ｃ３ａによる受容
体活性化を活性化（アゴニスト）または活性化阻害（ア
ンタゴニスト）する化合物をスクリーニングするプロセ
スに使用してもよい。
【０１７８】一般的には、かかるスクリーニング法は、
本発明Ｃ３ａ受容体ポリペプチドをその表面に発現する
適当な細胞を提供することを包含する。かかる細胞は、
哺乳動物、酵母、ショウジョウバエまたはE.coli由来の
細胞を包含する。詳細には、本発明Ｃ３ａ受容体をコー
ドしているポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフ
ェクションし、そのことによりＣ３ａ受容体を発現させ
る。次いで、発現した受容体を試験試料およびＣ３ａと
接触させて、機能的応答の結合、刺激または阻害を観察
する。
【０１７９】１のかかる方法は、本発明Ｃ３ａ受容体を
発現するようにトランスフェクションされている黒色素
胞の使用を包含する。かかるスクリーニング法は１９９
２年２月６日公開のＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０に記
載されている。
【０１８０】よって、例えば、受容体をコードしている
黒色素胞をＣ３ａおよびスクリーニングすべき化合物の
両方に接触させることにより、本発明受容体ポリペプチ
ドの活性化を阻害する化合物のスクリーニングにかかる
アッセイを用いてもよい。Ｃ３ａにより発生されたシグ
ナルの阻害は、化合物が受容体に対するアンタゴニスト
でありうること、すなわち、Ｃ３ａによる受容体の活性
化を阻害することを示す。
【０１８１】かかる細胞をスクリーニングすべき化合物
に接触させ、次いで、かかる化合物がシグナルを発生す
るかどうか、すなわち、受容体を活性化するかどうかを
決定することにより、受容体を活性化する化合物を決定
するためにスクリーニングを用いてもよい。
【０１８２】他のスクリーニング法は、受容体活性化に
より引き起こされた細胞外ｐＨ変化（例えば、Scienc
e，第２４６巻，１８１−２９６頁（１９８９年１０
月）に記載）を測定する系におけるＣ３ａ受容体を発現
する細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ
細胞）の使用を包含する。例えば、本発明受容体ポリペ
プチドを発現する細胞に化合物を接触させ、第２のメッ
センジャー応答、例えば、シグナル変換またはｐＨ変化
を測定して化合物が受容体を活性化または阻害しうるか
どうかを測定してもよい。
【０１８３】もう１つのかかるスクリーニング法は、Ｃ
３ａ受容体をコードしているＲＮＡをXenopus卵母細胞
中に導入して一時的に受容体を発現させることを包含す
る。次いで、受容体卵母細胞を受容体リガンドおよびス
クリーニングすべき化合物に接触させ、次いで、Ｃ３ａ
による受容体の活性化を阻害すると考えられる化合物を
スクリーニングする場合のシグナルの阻害または活性化
を検出することができる。
【０１８４】もう１つのスクリーニング法はＣ３ａ受容
体を発現させることを包含し、受容体はシグナル変換
系、例えば、ホスホリパーゼＣまたはＤ、あるいは他の
蛋白に結合している。かかる細胞の典型例としては、内
皮細胞、平滑筋細胞、胚の腎細胞、２９３細胞、および
本明細書実施例記載の細胞が挙げられる。例えばホスホ
リパーゼまたは他の活性化／発現蛋白のごとき第２のシ
グナルから受容体活性化または受容体活性化に対する阻
害を検出することにより上記のごとくスクリーニングを
行ってもよい。
【０１８５】もう１つの方法は、Ｃ３ａ受容体を表面に
有する細胞への標識Ｃ３ａの結合に対する阻害を調べる
ことにより、本発明アンタゴニストの受容体ポリペプチ
ドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングすること
を包含する。かかる方法は、真核細胞をＣ３ａ受容体を
コードしているＤＮＡでトランスフェクションして細胞
が受容体を表面に発現するようにし、次いで、Ｃ３ａの
標識形態の存在下で細胞を化合物に接触させることを包
含する。例えば放射活性によりリガンドを標識すること
ができる。受容体に結合した標識Ｃ３ａ量を、例えば、
受容体の放射活性を測定することにより測定することが
できる。受容体に結合する標識Ｃ３ａの減少により決定
されるように、化合物が受容体に結合する場合には、標
識Ｃ３ａの受容体への結合は阻害される。
【０１８６】さらなるスクリーニング法は、Ｃ３ａ受容
体に対する化合物の影響により細胞内カルシウムイオン
もしくは他のイオンを可動化し、あるいは膜電荷を変化
させる試験化合物を高処理量スクリーニングするための
よく知られたＦＬＩＰＲ装置の使用を包含する。検出す
べき好ましいイオンは色素により検出されうるものであ
る。
【０１８７】さらにもう１つのスクリーニング法は、Ｃ
３ａとＣ３ａとの受容体の相互作用に影響することによ
り細胞内カルシウムイオンもしくは他のイオンの可動化
を阻害する試験化合物を高処理量スクリーニングするた
めのＦＬＩＰＲ装置の使用を包含する。
【０１８８】本明細書記載のごとく、Ｃ３ａは天然およ
び組み換え型Ｃ３リガンドおよびＣ３ａアナログを意味
する。
【０１８９】Ｃ３ａ受容体は哺乳動物宿主に遍在し、多
くの病因を包含する多くの生物学的機能の原因となって
いる。したがって、一方ではＣ３ａ受容体またはＣ３ａ
とＣ３ａ受容体との相互作用を刺激し、他方ではＣ３ａ
受容体の機能を阻害しうる化合物および薬剤を見出すこ
とが望ましい。
【０１９０】例えば、Ｃ３ａ受容体またはＣ３ａとＣ３
ａ受容体との相互作用を活性化する化合物を、急性炎症
性疾患、アテローム性動脈硬化、慢性多発性関節炎、全
身性血管炎、多発性硬化症、アルツハイマー症、ＣＮＳ
炎症性疾患、クローン病、食物アレルギー、非気管支ア
レルギー、骨関節炎、骨粗鬆症、甲状腺疾患、心臓冠状
動脈疾患、腎臓疾患、例えば、全身性エリトマーデス現
象、ＳＬＥ関連腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎
炎、リューマチ性疾患、例えばリューマチ性関節炎、Ｓ
ＬＥ、ベーチェット症候群、若年性リューマチ性関節
炎、ショーグレン症候群、神経学的疾患、例えば筋無力
症、多発性硬化症、脳の狼瘡、ギラン−バーレ症候群、
アルツハイマー症、皮膚病、例えば天疱瘡／類天疱瘡、
光毒性反応、血管炎、生体適合性／ショック疾患、例え
ばバイパス後症候群、カテーテル反応、敗血症、ＡＲＤ
Ｓ、アナフィラキシー、移植拒絶反応、子かん前症、な
らびに他の疾病、例えばアテローム、腸の炎症、甲状腺
炎、および不妊症、化膿性感染に対する感受性、糸球体
腎炎、ネイセリア感染に対する感受性、再発性皮下腫お
よび粘膜浮腫、および再発性血栓症／溶血（これらに限
らない）を包含する疾病の治療のごとき治療目的に用い
てもよい。本明細書のごく「Ｃ３ａとＣ３ａとの相互作
用」は、細胞中および無細胞系におけるＣ３ａにより接
触される細胞または無細胞系に対するＣ３ａ受容体の物
理的応答ならびに機能的または生理学的応答を包含す
る。
【０１９１】一般的には、Ｃ３ａ受容体の活性化を阻害
する化合物を、種々の治療目的、例えば、急性炎症性疾
患、アテローム性動脈硬化、慢性多発性関節炎、全身性
血管炎、多発性硬化症、アルツハイマー症、ＣＮＳ炎症
性疾患、クローン病、食物アレルギー、非気管支アレル
ギー、骨関節炎、骨粗鬆症、甲状腺疾患、心臓冠状動脈
疾患、腎臓疾患、例えば、全身性エリトマーデス現象、
ＳＬＥ関連腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎炎、リ
ューマチ性疾患、例えばリューマチ性関節炎、ＳＬＥ、
ベーチェット症候群、若年性リューマチ性関節炎、ショ
ーグレン症候群、神経学的疾患、例えば筋無力症、多発
性硬化症、脳の狼瘡、ギラン−バーレ症候群、アルツハ
イマー症、皮膚病、例えば天疱瘡／類天疱瘡、光毒性反
応、血管炎、生体適合性／ショック疾患、例えばバイパ
ス後症候群、カテーテル反応、敗血症、ＡＲＤＳ、アナ
フィラキシー、移植拒絶反応、子かん前症、ならびに他
の疾病、例えばアテローム、腸の炎症、甲状腺炎、およ
び不妊症、化膿性感染に対する感受性、糸球体腎炎、ネ
イセリア感染に対する感受性、再発性皮下腫および粘膜
浮腫、および再発性血栓症／溶血（これらに限らない）
を包含する疾病の治療に用いてもよい。
【０１９２】抗体は、本発明Ｃ３ａ受容体と拮抗する可
能性があり、あるいはいくつかの場合には、Ｃ３ａ受容
体に結合するが第２のメッセンジャー応答を誘発しない
オリゴペプチドと拮抗してＣ３ａ受容体の活性を妨害す
る可能性がある。一般的には、抗体はその抗原結合部位
に結合したユニークな決定基を認識する抗−イディオタ
イプ抗体を包含する。アンタゴニストである可能性のあ
る化合物は、Ｃ３ａ受容体のリガンドに密接に関連した
蛋白、すなわち、生物学的機能を失っており、Ｃ３ａ受
容体に結合しても応答を誘発しないリガンドのフラグメ
ントを包含する。
【０１９３】アンチセンス法を用いることにより調製さ
れるアンチセンス構築物を用いて、３重らせん形成また
はアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ（両方の方法はＤ
ＮＡもしくはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づ
く）により遺伝子発現を制御してもよい。例えば、本発
明成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
配列の５’コーディング部分を用いて約１０ないし４０
塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
を設計する。転写に関与する遺伝子の領域に相補的であ
るようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し（３重ヘリ
ックス−Lee etal.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Coo
ney et al.,Science,241:456(1988);およびDervan et a
l.,Science,251:1360(1991)参照）、それによりＣ３ａ
受容体に転写および生産を防止する。アンチセンスＲＮ
ＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡに結合し、
ｍＲＮＡ分子のＣ３ａ受容体への翻訳をブロックする
（アンチセンス−Okano,J.Neurochem.,56:560(1991);Ol
igonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Exp
ression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)）。上記オリ
ゴヌクレオチドを細胞に送達してアンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡがインビボで発現されてＣ３ａ受容体の生成
を阻害できるようにしてもよい。
【０１９４】Ｃ３ａ受容体に結合し、Ｃ３ａへのアクセ
スを不可能にし、あるいはＣ３ａとＣ３ａ受容体との相
互作用を阻害して正常な生物学的活性を妨げるようにす
るする小型分子、例えば、小型ペプチドまたはペプチド
様分子を用いて本発明受容体ポリペプチドの活性化を阻
害してもよい。
【０１９５】可溶性形態のＣ３ａ受容体、例えば、受容
体フラグメントを用いて、これをＣ３ａに結合させ、Ｃ
３ａとＣ３ａ受容体との相互作用を妨害することにより
受容体の活性化を阻害してもよい。
【０１９６】さらに本発明は、Ｃ３ａ受容体へのＣ３ａ
の結合をブリックすることにより、あるいはＣ３ａ受容
体とＣ３ａとの相互作用を阻害することにより、あるい
は第２のシグナルを阻害することにより活性化を阻害し
て、そのことにより異常な症状を改善するに十分な量の
上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象
に投与することを特徴とする、Ｃ３ａ受容体活性過剰に
関連した異常な症状の治療方法を提供する。
【０１９７】また本発明は、上記本発明受容体ポリペプ
チドを活性化させる治療上有効量の化合物を医薬上許容
される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常
な症状を改善することを特徴とする、Ｃ３ａ受容体活性
の発現不足に関連した異常な症状の治療方法を提供す
る。
【０１９８】可溶性形態のＣ３ａ受容体、およびかかる
受容体を活性化または阻害する化合物を適当な医薬担体
と組み合わせて使用することができる。かかる組成物
は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合物、ならび
に医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。か
かる担体は、緩衝化セイライン、デキストロース、水、
グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物を包
含するが、これらに限らない。処方は投与モードに適す
るべきである。
【０１９９】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 また本発明は、受容体分子のごときＣ３ａ受容体結合分
子との相互作用のような、細胞に対するＣ３ａ受容体ポ
リペプチドの作用を促進またはブロックする化合物をス
クリーニング法を提供する。アゴニストは、Ｃ３ａ受容
体の本来の生物学的機能を増大させ、あるいはＣ３ａ受
容体と同様の様式で機能するか、あるいはＣ３ａとＣ３
ａ受容体との相互作用を促進する化合物であるが、アン
タゴニストはかかる機能を低下または除去する。
【０２００】例えば、膜標品のごとき膜またはその調製
物のような細胞コンパートメントを、Ｃ３ａ受容体によ
り転調されたシグナリングもしくは調節経路の分子であ
ってＣ３ａ受容体に結合する分子を発現する細胞から調
製してもよい。Ｃ３ａ受容体アゴニストまたはアンタゴ
ニスト候補分子の存在下または不存在下において調製物
を標識Ｃ３ａ受容体とともにインキュベーションする。
結合分子に結合する候補分子の能力は、標識リガンドの
結合低下に反映される。不必要に、すなわちＣ３ａ受容
体結合分子への結合に対するＣ３ａ受容体の効果を誘導
せずに結合する分子は、良好なアンタゴニストである可
能性が最も高い。よく結合し、Ｃ３ａ受容体と同じ効果
またはＣ３ａ受容体に密接に関連した効果を誘導する分
子はアゴニストである。
【０２０１】例えば、候補分子と細胞または適当な細胞
調製物との相互作用後に第２の伝達系の活性を測定し、
Ｃ３ａ受容体およびＣ３ａ受容体と同じ効果を誘導する
分子の効果と比較することにより、潜在的にアゴニスト
およびアンタゴニストである物質のＣ３ａ受容体様効果
を測定することができる。この点において有用でありう
る第２の伝達系は、ＡＭＰグアニレートシクラーゼ、イ
オンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解第２伝
達系を包含するが、これらに限らない。
【０２０２】Ｃ３ａ受容体アンタゴニストを探すアッセ
イのもう１つの例は、競争的阻害アッセイに適した条件
下でＣ３ａ受容体と潜在的アゴニストを膜結合Ｃ３ａ受
容体受容体分子または組み換えＣ３ａ受容体受容体分子
と結合させる競争アッセイである。受容体分子に結合し
ているＣ３ａ受容体分子数を正確に決定して潜在的アン
タゴニストに有効性を評価できるように、例えば放射活
性によりＣ３ａ受容体を標識することができる。
【０２０３】潜在的アンタゴニストは、本発明ポリペプ
チドに結合し、そのことによりその活性を阻害または消
失させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび
抗体を包含する。また潜在的アンタゴニストは、小型有
機分子、ペプチド、密接に関連した蛋白のごときポリペ
プチド、または受容体分子のごとき結合分子と同じ部位
に結合し、そのことによりＣ３ａ受容体を結合から排除
してＣ３ａ受容体の作用を防止する抗体であってもよ
い。
【０２０４】潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの
結合部位に結合し、これを占領し、そのことにより受容
体分子のごとき細胞性結合分子の結合を防止して正常な
生物学的活性を妨げる小型分子を包含する。小型分子の
例は、小型有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子を
包含するが、これらに限らない。
【０２０５】他の潜在的アンタゴニストはアンチセンス
分子を包含する。アンチセンス法を用いて、アンチセン
スＤＮＡまたはＲＮＡにより、あるいは３重ヘリックス
形成により遺伝子発現を制御することができる。アンチ
センス法は、例えば、Okano,J.Neurochem.56:560(199
1)；OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GE
NE EXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)におい
て議論されている。３重ヘリックス形成は、例えば、Le
e et al.,Nucleic Acids Research 6:3073(1979)；Coon
ey et al., Science 241:456(1988)；およびDervan et
al.,Science 251:1360(1991)において議論されている。
該方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオ
チドの結合に基づく。例えば、本発明ポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチドの５’コーディング部分
を用いて、長さ約１０ないし４０塩基対のアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計してもよい。転写に関
与する遺伝子の領域に相補的であるようにＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドを設計し、そのことによりＣ３ａ受容体の
転写および生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴ
ヌクレオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡにハイブリ
ダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のＰＢＨ１ポリペプチ
ドへの翻訳をブロックする。上記オリゴヌクレオチドを
細胞に送達して、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがイ
ンビボにおいて発現されてＣ３ａ受容体の生成を阻害す
るようにすることもできる。
【０２０６】アンタゴニストを、例えば下記のような医
薬上許容される担体を伴った組成物中に用いてもよい。
【０２０７】アンタゴニストを用いて、例えば、治療目
的で、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アルツハイマ
ー症、卒中、炎症（慢性および急性）、ＣＮＳ炎症、喘
息、アレルギー、神経変性疾患、頭部損傷により誘導さ
れる神経変性疾患、良性前立腺肥大ならびに心理学的お
よび神経学的疾患（分裂症、躁病、鬱病、せん妄、痴呆
または重度の精神遅滞を包含）、特にハンチントン病ま
たはGilles dela Toutrett症候群のごとき運動障害の治
療のために、Ｃ３ａによるＣ３ａの活性化を阻害しても
よい。Ｇ−蛋白結合受容体を阻害する化合物は、内因性
食欲不振の逆転および大食の抑制にも有用である。
【０２０８】アゴニストを、例えば下記のような医薬上
許容される担体を伴った組成物中に用いてもよい。
【０２０９】アゴニストを、例えば、喘息、パ−キンソ
ン病、急性心不全、低血圧、尿の滞留、および骨粗鬆症
の治療ごとき治療目的に用いてもよい。
【０２１０】組成物 また本発明は、上記ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを含んで
なる組成物に関する。よって、対象への投与に適した医
薬担体のごとき細胞、組織または生物について使用され
る未滅菌または滅菌担体と組み合わせて本発明ポリペプ
チドを用いてもよい。かかる組成物は、例えば、媒体、
添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチドおよび
医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。かか
る担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロ
ース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの混
合物を包含するが、これらに限らない。処方は投与モー
ドに適合すべきである。
【０２１１】キット さらに本発明は、上記本発明組成物の１種またはそれ以
上の成分を充填した１個またはそれ以上の容器を含んで
なる医薬パックおよびキットに関する。かかる容器につ
いては、医薬または生物学的製品の製造、使用または販
売を規制している政府当局により指示された形態であ
り、ヒトへの投与のための製品の製造、使用または販売
に対する当局による認可を反映したものである。
【０２１２】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。
【０２１３】効果的で便利な方法、例えば、特に、局
所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
鼻腔内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医
薬組成物を投与してよい。
【０２１４】一般的には、医薬組成物を、個々の徴候ま
たは徴候（複数）の治療または予防の有効な量で投与す
る。一般的には、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量
で組成物を投与する。大部分の場合、１日につき約８ｍ
ｇ／ｋｇ体重をこえない量で組成物が投与されるであろ
う。好ましくは、大部分の場合、１日につき用量は約１
０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。症
状、その重さ、投与経路、合併症等を考慮して、各治療
様式についての標準的方法および症状により最適用量が
決定されることが理解されよう。
【０２１５】遺伝子治療 インビボにおいて、すなわちしばしば「遺伝子治療」と
呼ばれる治療様式においてポリペプチドを発現させるこ
とにより、Ｃ３ａ受容体ポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニス
トを本発明に従って使用することができる。
【０２１６】よって、例えば、ポリペプチドをコードし
ているＤＮＡまたはＲＮＡのごときポリヌクレオチドで
患者からの細胞をエクスビボで処理し、次いで、ポリペ
プチドで治療すべき患者に処理細胞を与えてもよい。例
えば、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含
むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により細胞
をエクスビボで処理してもよい。かかる方法は当該分野
においてよく知られており、本発明におけるそれらの使
用は本明細書の教示から明らかである。
【０２１７】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、上記のようにレプ
リコン欠損レトロウイルスベクター中での発現のために
本発明ポリヌクレオチドを処理してもよい。次いで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞
中に導入し、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮ
Ａを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入
して、今度はパッケージング細胞が対象遺伝子を含有す
る感染性ウイルス粒子を産生するようにすることができ
る。インビボでの細胞の処理およびインビボでのポリペ
プチドの発現のためにこれらのプロデューサー細胞を患
者に投与することができる。かかる方法により本発明ポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかなはずである。
【０２１８】本明細書において上で述べたレトロウイル
スプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モ
ロニーマウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラ
ウスサルコーマウイルス、ハーベイサルコーマウイル
ス、トリ・白血病ウイルス、ギボンサル・白血病ウイル
ス、ヒト・免疫不全ウイルスのごときレトロウイルス、
アデノウイルス、ミエロプロリファレイティブサルコー
マウイルス（Myeloproliferative Sarcomavirus）、お
よび哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限ら
ない。１の具体例において、レトロウイルスプラスミド
ベクターはモロニーマウス・白血病ウイルス由来のもの
である。
【０２１９】かかるベクターは、本発明ポリペプチド発
現のための１個またはそれ以上のプロモーターを十分に
含むであろう。使用できる適当なプロモーターは、レト
ロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびMill
er et al.,Biotechniques 7:980-990(1989)に記載され
たＣＭＶプロモーター、または他のいずれかのプロモー
ター（例えば、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、
およびβ−アクチンプロモーター（これらに限らない）
を包含する真核細胞プロモーターのごとき細胞プロモー
ター）を包含するが、これらに限らない。使用できる他
のウイルスのプロモーターは、アデノウイルスプロモー
ター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、および
Ｂ１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これ
らに限らない。適当なプロモーターの選択は、本明細書
に含まれる教示から当業者に明らかであろう。
【０２２０】本発明ポリペプチドをコードしている核酸
配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろ
う。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス
大後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒト・グロビンプロモー
ター；単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモ
ーターのごときウイルスのチミジンキナーゼプロモータ
ー；レトロウイルスのＬＴＲｓ（本明細書で上で述べた
修飾レトロウイルスＬＴＲｓを包含）；β−アクチンプ
ロモーター；およびヒト・成長ホルモンプロモーターを
包含するが、これらに限らない。プロモーターは、本発
明ポリペプチドをコードしている遺伝子を制御する無傷
のプロモーターであってもよい。
【０２２１】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッキング細胞系に形質導入してプロデューサー細胞
系を得る。トランスフェクションされうるパッキング細
胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−Ａ
Ｍ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ
２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅ
ｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.,Human Gene Therapy
1:5-14(1990)に記載されたＤＡＮ細胞系を包含するが、
これらに限らない。当該分野で知られたいずれかの手段
によりベクターをパッケージング細胞中に形質導入して
もよい。かかる手段は、エレクトロポレーション、リポ
ソームの使用、ＣａＰＯ4沈殿を包含するが、これらに
限らない。１の別法において、レトロウイルスベクター
をリポソーム中に封入し、あるいは脂質と結合させ、次
いで、宿主に投与してもよい。
【０２２２】プロデューサー細胞系は感染性レトロウイ
ルスベクター粒子を生じるであろうし、該粒子はポリペ
プチドをコードしている核酸配列を含んでいる。次い
で、かかるレトロウイルスベクター粒子を用いて、イン
ビトロまたはインビボのいずれかにおいて真核細胞に形
質導入してもよい。形質導入された真核細胞はポリペプ
チドをコードしている核酸配列を発現するであろう。形
質導入されうる真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ
細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細
胞を包含するが、これらに限らない。
【０２２３】
【実施例】下記実施例により本発明をさらに説明する。
実施例は、個々の具体例を参照することにより、本発明
の説明のためだけに提供される。これらの例示は、本発
明の特定の態様を説明するが、開示された発明の範囲を
何ら限定するものでない。
【０２２４】本明細書に用いる特定の用語はすでに上で
説明してある。特記しない限り、すべての実施例は、当
業者によく知られた日常的な標準的方法を用いて行われ
たものである。Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING:A
LABORATORY MANUAL,2nd Ed.;Cold Spring Harbor Labor
atory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)（以後、
「Sambrook」という）のごとき標準的な研究室用マニュ
アルに記載されているようにして下記実施例の日常的な
分子生物学の方法を行うことができる。特記しないかぎ
り、下記実施例に示すすべての部または量は重量による
ものである。特記しないかぎり、Sambrookおよび多くの
他の文献、例えば、Goeddel et al.,Nucleic Acids Re
s.,8:4057(1980)による文献に記載のアガロースおよび
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の標準的
方法を用いて下記実施例におけるフラグメントのサイズ
による分離を行った。特記しない限り、標準的バッファ
ー、インキュベーション温度および時間、ほぼ等モル量
の連結すべきＤＮＡフラグメント、ならびに０．５μｇ
のＤＮＡにつき約１０ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて連結反応を行った。
【０２２５】実施例１ ｃＤＮＡクローニング 以前に記載されたようにして（Jelinek,L.J.,Lock,S.,R
osenberg,G.B.,Smith,R.A.,Grant,F.J.,Biggs,S.,Bensc
h.P.A.,Kuijper,J.L.,Sheppard,P.O.,Sprecher,C.A.,O'
Hara,P.J.,Foster,D.,Walker,K.M.,Chen,L.H.J.,McKerm
an,P.A.,and Kindsvogel,W.(1993)Science 259,1614-16
16）ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング
を行い、ＡＢＩシークエンサー（Adams,M.D.,et al(199
1)Science 252,1651-1656）を用いてＤＮＡ配列を決定
した。ヒト・好中球（ＬＰＳ活性化）ｃＤＮＡライブラ
リー（オリゴｄＴプライムされ、ラムダUni-ZAP XRベク
ター（Stratagene）中に構築されている）由来のｃＤＮ
Ａクローンに関する発現配列タグ（ＥＳＴ）分析（Adam
s,M.D.,et al(1991)Science 252,1651-1656;Adams,M.
D.,et al(1992)Nature 355,632-634;Adams,M.D.,et al
(1995)Nature 377(suppl.)3-174）により、Ｃ５ａ−Ｒ
（Gerard,N.P.& Gerard,C.(1991)Nature 349,614-617;B
oulay,F.,et al(1991)Biochemistry 30,2993-2999）に
より有意な相同性（約４０％のアミノ酸同一性）を示す
クローンが同定された。このｃＤＮＡクローンは不完全
な読み枠（ＯＲＦ）を含んでおり、それゆえ、これを用
いて好中球ｃＤＮＡライブラリーを再プローブして全長
のｃＤＮＡを得た。Wisconsin Package,Version 8,Sept
ember 1994,Genetics Computer Group,575 Science Dri
ve,Madison,Wisconsin,USA 53711のGap比較プログラム
を用いるNeedlemanおよびWunschの方法によりＣ３ａ受
容体とＣ５ａ−Ｒとの並置比較を行った。
【０２２６】ヒト・好中球（ＬＰＳ活性化）ｃＤＮＡラ
イブラリー由来のｃＤＮＡクローンについての発現配列
タグ（ＥＳＴ）分析（Adams,M.D.,et al(1991)Science
252,1651-1656;Adams,M.D.,et al(1992)Nature 355,632
-634;Adams,M.D.,et al(1995)Nature 377(suppl.)3-17
4）により、Ｃ５ａ−Ｒに対して有意な相同性（約４０
％のアミノ酸同一性）を示すクローンが同定された。こ
のＥＳＴは不完全な読み枠を含んでおり、それゆえ、こ
れを用いて好中球ｃＤＮＡライブラリーを再プローブし
て、４８２個のアミノ酸（コーディング領域全体にわた
り３７％のヌクレオチドをＣ５ａ−Ｒと共有）の完全な
独立ＧＰＣＲをコードしている２０４０塩基対のｃＤＮ
Ａを得た（図１）。Ｃ５ａ−Ｒに類似しているが、この
ｃＤＮＡは予想される２つの細胞外Ｎ−結合グリコシレ
ーション部位およびトランスメンブラン４と５の間に異
常に大きな（１６０個以上のアミノ酸から構成される）
細胞外ドメインを含んでいる（図１）。Ｃ５ａ−ＲとＣ
３ａ受容体との間の同一残基の大部分は予想されるトラ
ンスメンブランにまたがるドメインに存在し、それは第
２の細胞内ループ中にある（図２）。
【０２２７】実施例２ ノーザンブロット分析 次いで、１レーンあたり約２μｇのポリＡ ｍＲＮＡを
含む、商業的に調製された（Clontech,Palo Alto,CA）
複数の組織ブロットを、Ｃ５ａおよびＣ３ａ受容体のコ
ーディング領域にまたがるランダムプライマー32Ｐ標識
ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた。Ｃ５ａ−Ｒ
は分化したＵ９３７のＲＮＡからＰＣＲによりクローン
化された。０．５Ｘ ＳＳＣ，１％ ＳＤＳ中、６５℃で
２０分間、２回最終洗浄工程を行った。
【０２２８】ノーザンブロット分析により、ヒト・組織
および細胞系におけるＣ３ａ受容体の発現は、Ｃ５ａ−
Ｒの発現とは異なっている。２．２キロベース（ｋｂ）
未満のＣ５ａ−Ｒ転写物は、末梢血白血球（ＰＢＬ）、
肺、脾臓、心臓、胎盤、脊髄および脳全体において豊富
に発現された。２．１ｋｂ未満のＣ３ａ受容体転写物
は、肺、脾臓、卵巣、胎盤、小腸、脳全体において優先
的に発現されたが、心臓およびＰＢＬにおいてはＣ５ａ
−Ｒよりもずっと発現が少なかった。ノーザンブロット
分析によりＣ５ａ−ＲおよびＣ３ａ受容体を発現してい
る種々の試験組織中の個々の細胞を調べることができな
いが、これらのデータは、これらの受容体が身体全体に
おいて豊富に発現されていることを示唆するものであ
る。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはマルト
ース結合蛋白および細胞外ループから構成される融合蛋
白に対して生成したポリクローナル抗体を用いる蛍光活
性化細胞ソーティングにより、この受容体はＵ９３７、
ＨＬ−６０、ＰＢＬおよびヒト・好中球および単球を包
含する数種のタイプの細胞上で発現されることが示され
ている（Rogic,A.,et al(1996)Biochimica et Biophysi
ca Acta 1305,39-43）。
【０２２９】実施例３ Xenopus卵母細胞における受容
体発現および機能の研究 すでに記載されているようにして（Kumar,C.S.,et al(1
989)J.Biol.Chem.264,17939-17946）、直鎖状にされた
Ｃ３ａ受容体およびＣ５ａ−ＲプラスミドＤＮＡからキ
ャップしたｃＲＮＡ転写物を得て、０．２μｇ／μｌの
濃度で滅菌水に懸濁した。成体メスXenopus laevisの卵
巣葉を外科的に切り取り、脱卵胞（defolliculated）段
階Ｖの卵母細胞を手で切開（Smith,L.D.,et al(1991)Me
thods inCell Biology,36,45-54（B.K.KayおよびH.B.Pe
ng編、Academic Press Inc.,NewYork））することによ
り集めた。Drummondマイクロインジェクション器具を用
いて、５０ｎｌの体積のＣ３ａ受容体またはＣ５ａ−Ｒ
のｃＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞１個）（Ｕ９３
７の全ＲＮＡ（２５ｎｇ／卵母細胞１個）を伴って、あ
るいは伴わずに）を卵母細胞にマイクロインジェクショ
ンし、１８℃の修飾Barthのセイライン（Power,C.A.,et
al(1995)J.Biol.Chem.,270,19495-19500）中に維持し
た。４８時間後、２個の電極電位クランプ（Warner Ins
truments）法を用いて室温にて１０個の卵母細胞の平均
についての電気生理学的記録を行った。膜蛋白を−６０
ｍＶにおいてルーチンにクランプした。結果は、３つの
別個の実験において決定された平均応答を示す。
【０２３０】Ｃ５ａに対する化学走性受容体およびｆＭ
ＬＦ−ＲはXenopus laevisの卵母細胞において機能的に
発現されており（Kroll.,et al(1991)FEBS Lett.291,20
8-210;Murphy,P.M.& McDermott,D.(1991)J.Biol.Chem.2
66,12560-12567;Murphy,P.M.,Gallin,E.K.,and Tiffan
y,H.L.(1990)J.Immunol.145,2227-2234;Schultz,P.,eta
l(1992)Cellular Signalling 4,153-161）、この系にお
いて試験された他のすべてのＧＰＣＲとは異なり、クロ
ーン化された化学走性受容体に関するｃＲＮＡの注入の
みではリガンド結合に応答したシグナル変換を刺激する
には不十分である（Kroll,B.,et al(1991)FEBS Lett.29
1,208-210;Murphy,P.M.& McDermott,D.(1991)J.Biol.Ch
em.266,12560-12567）。Ｃａ2+により媒介されるクロラ
イド電流の誘導によりモニターされるこれらの化学走性
受容体双方の機能的発現には、骨髄細胞または肝細胞由
来の全ＲＮＡにより供給されうる相補的なヒト・因子を
同時注入することを必要とする（Kroll.,et al(1991)FE
BS Lett.291,208-210;Murphy,P.M.& McDermott,D.(199
1)J.Biol.Chem.266,12560-12567）。コ−ファクターは
受容体により媒介されるシグナル変換に必要であるが、
卵母細胞表面上のＣ５ａ−ＲまたはｆＭＬＦ−Ｒの発現
には不要である（Murphy,P.M.et al(1990)J.Immunol.14
5,2227-2234）。コ−ファクターの性質は不明である
が、Ｇi1、Ｇi2またはＧi3のアルファサブユニットであ
るとは思えない。なぜなら、ｆＭＬＦ−Ｒに関するｃＲ
ＮＡのみをこれらのアルファサブユニットと同時注入し
た場合に機能的応答が誘導されなかったからである（Mu
rphy,P.M.& McDermott,D.(1991)J.Biol.Chem.266,12560
-12567）。独立別個の研究において、コ−ファクターは
約３−３．５キロベースの転写物によりコードされてい
ることが示されている（Murphy,P.M.& McDermott,D.(19
91)J.Biol.Chem.266,12560-12567;Schultz,P.,Stannek,
P.,Voigt,M.,Jakobs,K.H.,& Gierschik,P.(1992)Bioche
m.J.284,207-212）。最近の報告は、Ｇα−１６はＣ５
ａ−ＲおよびｆＭＬＦ−Ｒ双方のシグナル変換カスケー
ドを補うものであり、ＨＬ−６０およびＵ９３７中に存
在する相補的コファクターである可能性があることを示
した（Schultz,P.,et al(1992)Biochem.J.284,207-21
2）。Xenopus卵母細胞を用いてＣ３ａ受容体が機能的に
特徴づけられた。Ｃ３ａカルボキシ末端アナログ合成ペ
プチド［ＷＷＧＫＫＹＲＡＳＫＬＧＬＡＲ］および程度
は低いがｒＣ５ａは、Ｃ３ａ受容体に関するｃＲＮＡを
注入された卵母細胞における電気生理学的応答を誘発し
たが、血小板活性化因子または化学走性ペプチドｆＭＬ
Ｆは誘発しなかった（図３Ａ）。Ｃ５ａ−ＲおよびｆＭ
ＬＦ−Ｒと同様に、応答は、全ＨＬ−６０またはＵ９３
７ＲＮＡに存在するコファクターの同時注入に依存し
た。コファクターの正確な性質は不明であるが、Ｃ３ａ
受容体およびＵ９３７のＲＮＡと同時注入された卵母細
胞のＣ３ａペプチドに対する応答は百日咳トキシンによ
り停止させられるので（データ示さず）、それは、百日
咳トキシンＡＤＰ−リボシル化部位を欠くＧα−１６
（Amatruda,T.T.,et al(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
88:5587-5591）であるとは思われない。Ｃ３ａ受容体の
ｃＲＮＡまたはＵ９３７のＲＮＡは、単独で注入された
場合には、Ｃ３ａ合成ペプチドまたはｒＣ５ａに対する
応答を誘発しなかった（図３Ａ）。同様のやりかたで、
ｒＣ５ａは、Ｃ５ａ−ＲのｃＲＮＡおよびＵ９３７のＲ
ＮＡを同時注入された卵母細胞におけるクロライド電流
の迅速な活性化を誘導した。さらに、Ｃ３ａに対する小
さな応答があった（図３Ｂ）。Ｃ５ａ−ＲならびにＣ３
ａ受容体の両方は、卵母細胞において、２種のアナフィ
ラトキシンに対する乱雑な応答を誘発した。無傷のリガ
ンドはいずれかの受容体を注入された卵母細胞において
より小さな応答を誘発した（データ示さず）ので、Ｃ３
ａ合成ペプチドに関して検出された応答はアナログペプ
チドを用いたことによる人工物ではなかった。
【０２３１】実施例４ ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における安
定発現 哺乳動物細胞において発現されるＣ３ａ受容体を調製す
るために、Ｃ３ａ受容体読み枠全体にわたるＰＣＲ増幅
により１．６ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを得た。この
フラグメントを、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮ（Aiya
r,N.,et al(1994)Mol.Cell.Bio.131,75-86）のＫｐｎＩ
／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローンした。ＰＣＲ増幅
に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＧＡ
ＡＧＴＧＧＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＴＣ−３’
および５’−ＧＣ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＡ
ＣＡＣ ＡＧＴ ＴＧ−３’であった（翻訳開始および
停止コドンに下線を付した）。以前に記載されている通
りに（DeMartino,J.A.,et (1994)J.Biol.Chem.269,1444
6-14450）、ｐＣＤＮ哺乳動物発現ベクター（Aiyar,N.,
et al(1994)Mol.Cell.Bio.131,75-86）中のＣ３ａ受容
体またはＣ５ａ−ＲのいずれかとともにＲＢＬ−２Ｈ３
細胞をエレクトロポレーションした。各Ｇ４１８耐性コ
ロニーを単離し、増殖させた。Ｃ３ａ受容体またはＣ５
ａ−Ｒのいずれかを発現するクローン細胞系をさらなる
機能および結合アッセイのために選択した。
【０２３２】ラット・好塩基球細胞系ＲＢＬ−２Ｈ３
（Siraganian,R.P.,et al(1982)Fed.Proc.41,30-34）
は、Ｃ５ａ−Ｒをコードしている発現プラスミドでトラ
ンスフェクションした場合、機能的に活性のある受容体
を発現する（DeMartino,J.A.et al(1994)J.Biol.Chem.2
69,14446-14450）。Ｃ５ａ−ＲまたはＣ３ａ受容体をコ
ードしている哺乳動物発現プラスミドでＲＢＬ−２Ｈ３
細胞を安定にトランスフェクションし、Ｆｕｒａ２負荷
細胞を、Ｃ５ａまたはＣ３ａにより誘導される細胞内Ｃ
ａ2+の可動化について試験した。Ｃ５ａ−Ｒを発現する
がＣ３ａ受容体を発現しない細胞は、ｒＣ５ａに応答し
た（図４Ａおよび４Ｂ）。Ｃ３ａ受容体発現細胞におい
てはＣ３ａ合成ペプチドに対するはっきりとした応答
（ＥＣ50＝３．９ｎＭ）が検出されたが、Ｃ５ａ−Ｒ発
現細胞については応答が得られなかった（それぞれ、図
４Ｄおよび４Ｄ）。同様に、Ｃ３ａ受容体を発現するが
Ｃ５ａ−Ｒを発現しないＲＢＬ−２Ｈ３細胞は無傷のヒ
ト・Ｃ３ａにも応答した（ＥＣ50＝０．３ｎＭ、データ
示さず）。
【０２３３】実施例５ カルシウム可動化 Ｃ５ａ−ＲまたはＣ３ａ受容体を発現するＨｕｒａ２負
荷クローン細胞系を、以前記載されたようにして（Saus
sy,D.L.Jr.,et al(1989)J.Biol.Chem.264,19845-1985
5）機能的応答、Ｃａ2+可動化についてアッセイした。
【０２３４】実施例６ 結合アッセイ Ｃ３ａカルボキシ末端アナログ合成ペプチド［ＷＷＧＫ
ＫＹＲＡＳＫＬＧＬＡＲ］を、Bachem Bioscience,In
c.,King of Prussia,PAから得た。Ｃ３ａをAdvanced Re
search Technologies,San Diego,CAから購入した。ヒト
・ｒＣ５ａをE.coliにおいて発現させ、均一にまで精製
した。他のアゴニストをSigma,St Louis,MOから得た。I
odobeads（Pierce,Rockford IL）を用いてＣ３ａを放射
性標識して比活性１００ Ｃｉ／ｍｍｏｌとした。125Ｉ
−Ｃ３ａ（２．３ｎＭ）の存在下でコールド競争物質の
濃度を増加させつつ１ｘ１０6個の細胞に添加し、本質
的には記載されているようにして（Klos,A.,et al(199
2)Biochemistry 31,11274-11282）アッセイを行った。
【０２３５】Ｃ３ａを放射性標識し、全細胞ブレンディ
ングアッセイに使用してさらにＣ３ａ受容体を特徴づけ
た。Ｃ３ａ受容体を発現しているＲＢＬ−２Ｈ３細胞へ
の125Ｉ−Ｃ３ａの結合は、Ｃ３ａ（ＩＣ50＝３．０ｎ
Ｍ）およびＣ３ａアナログ合成ペプチド（ＩＣ50＝１５
５ｎＭ）の濃度を増加させることにより競争されたが、
ｒＣ５ａによっては競争されなかった（図５）。飽和結
合およびスキャッチャード（Scatchard）分析により、
単一クラスのＣ３ａ結合部位が同定され、評価されたＫ
ｄは０．３ｎＭでありＢｍａｘは細胞１個あたり受容体
３２０００個であった（データ示さず）。奇妙なこと
に、Ｃ３ａ受容体ｍＲＮＡを安定に発現するＨＥＫ２９
３細胞は、ノーザンブロットによれば、Ｃ３ａに結合せ
ず、しかもこれに応答しなかった（データ示さず）。
【０２３６】上記説明および実施例に特に記載したのと
は異なるようにして本発明を実施できることが明らかで
あろう。上記教示を参照すれば、本発明についての多く
の修飾および変更が可能であり、それゆえ、それらは添
付した請求の範囲の範囲内である。
【０２３７】
【配列表】
【０２３８】（１）一般的情報 （ｉ）出願人：アメス，ロバート・エス・ジュニア バーグスマ，ダーク・ジョン フォーリー，ジェイムズ・ジェイ クマー，チャンドリカ サロー，ヘンリー・エム （ｉｉ）発明の名称：Ｃ３Ａ受容体およびＣ３Ａを用い
る治療およびスクリーニング方法 （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９ （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−２７９９ （ｖ）コンピューター読み込み可能形式： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＦａｓｔＳＥＱ バージョン１.
５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Gimmi,Edward R （Ｂ）登録番号：３８８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５０１Ｐ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−４０２６ （Ｃ）テレックス：
【０２３９】（２）配列番号：１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４４９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメント型： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGGCGTCTT TCTCTGCTGA GACCAATTCA ACTGACCTAC TCTCACAGCC ATGGAATGAG 60 CCCCCAGTAA TTCTCTCCAT GGTCATTCTC AGCCTTACTT TTTTACTGGG ATTGCCAGGC 120 AATGGGCTGG TGCTGTGGGT GGCTGGCCTG AAGATGCAGC GGACAGTGAA CACAATTTGG 180 TTCCTCCACC TCACCTTGGC GGACCTCCTC TGCTGCCTCT CCTTGCCCTT CTCGCTGGCT 240 CACTTGGCTC TCCAGGGACA GTGGCCCTAC GGCAGGTTCC TATGCAAGCT CATCCCCTCC 300 ATCATTGTCC TCAACATGTT TGCCAGTGTC TTCCTGCTTA CTGCCATTAG CCTGGATCGC 360 TGTCTTGTGG TATTCAAGCC AATCTGGTGT CAGAATCATC GCAATGTAGG GATGGCCTGC 420 TCTATCTGTG GATGTATCTG GGTGGTGGCT TTTGTGATGT GCATTCCTGT GTTCGTGTAC 480 CGGGAAATCT TCACTACAGA CAACCATAAT AGATGTGGCT ACAAATTTGG TCTCTCCAGC 540 TCATTAGATT ATCCAGACTT TTATGGAGAT CCACTAGAAA ACAGGTCTCT TGAAAACATT 600 GTTCAGCCGC CTGGAGAAAT GAATGATAGG TTAGATCCTT CCTCTTTCCA AACAAATGAT 660 CATCCTTGGA CAGTCCCCAC TGTCTTCCAA CCTCAAACAT TTCAAAGACC TTCTGCAGAT 720 TCACTCCCTA GGGGTTCTGC TAGGTTAACA AGTCAAAATC TGTATTCTAA TGTATTTAAA 780 CCTGCTGATG TGGTCTCACC TAAAATCCCC AGTGGGTTTC CTATTGAAGA TCACGAAACC 840 AGCCCACTGG ATAACTCTGA TGCTTTTCTC TCTACTCATT TAAAGCTGTT CCCTAGCGCT 900 TCTAGCAATT CCTTCTACGA GTCTGAGCTA CCACAAGGTT TCCAGGATTA TTACAATTTA 960 GGCCAATTCA CAGATGACGA TCAAGTGCCA ACACCCCTCG TGGCAATAAC GATCACTAGG 1020 CTAGTGGTGG GTTTCCTGCT GCCCTCTGTT ATCATGATAG CCTGTTACAG CTTCATTGTC 1080 TTCCGAATGC AAAGGGGCCG CTTCGCCAAG TCTCAGAGCA AAACCTTTCG AGTGGCCGTG 1140 GTGGTGGTGG CTGTCTTTCT TGTCTGCTGG ACTCCATACC ACATTTTTGG AGTCCTGTCA 1200 TTGCTTACTG ACCCAGAAAC TCCCTTGGGG AAAACTCTGA TGTCCTGGGA TCATGTATGC 1260 ATTGCTCTAG CATCTGCCAA TAGTTGCTTT AATCCCTTCC TTTATGCCCT CTTGGGGAAA 1320 GATTTTAGGA AGAAAGCAAG GCAGTCCATT CAGGGAATTC TGGAGGCAGC CTTCAGTGAG 1380 GAGCTCACAC GTTCCACCCA CTGTCCCTCA AACAATGTCA TTTCAGAAAG AAATAGTACA 1440 ACTGTGTGA 1449
【０２４０】（２）配列番号：２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８２アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Ala Ser Phe Ser Ala Glu Thr Asn Ser Thr Asp Leu Leu Ser Gln 1 5 10 15 Pro Trp Asn Glu Pro Pro Val Ile Leu Ser Met Val Ile Leu Ser Leu 20 25 30 Thr Phe Leu Leu Gly Leu Pro Gly Asn Gly Leu Val Leu Trp Val Ala 35 40 45 Gly Leu Lys Met Gln Arg Thr Val Asn Thr Ile Trp Phe Leu His Leu 50 55 60 Thr Leu Ala Asp Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu Pro Phe Ser Leu Ala 65 70 75 80 His Leu Ala Leu Gln Gly Gln Trp Pro Tyr Gly Arg Phe Leu Cys Lys 85 90 95 Leu Ile Pro Ser Ile Ile Val Leu Asn Met Phe Ala Ser Val Phe Leu 100 105 110 Leu Thr Ala Ile Ser Leu Asp Arg Cys Leu Val Val Phe Lys Pro Ile 115 120 125 Trp Cys Gln Asn His Arg Asn Val Gly Met Ala Cys Ser Ile Cys Gly 130 135 140 Cys Ile Trp Val Val Ala Cys Val Met Cys Ile Pro Val Phe Val Tyr 145 150 155 160 Arg Glu Ile Phe Thr Thr Asp Asn His Asn Arg Cys Gly Tyr Lys Phe 165 170 175 Gly Leu Ser Ser Ser Leu Asp Tyr Pro Asp Phe Tyr Gly Asp Pro Leu 180 185 190 Glu Asn Arg Ser Leu Glu Asn Ile Val Gln Pro Pro Gly Glu Met Asn 195 200 205 Asp Arg Leu Asp Pro Ser Ser Phe Gln Thr Asn Asp His Pro Trp Thr 210 215 220 Val Pro Thr Val Phe Gln Pro Gln Thr Phe Gln Arg Pro Ser Ala Asp 225 230 235 240 Ser Leu Pro Arg Gly Ser Ala Arg Leu Thr Ser Gln Asn Leu Tyr Ser 245 250 255 Asn Val Phe Lys Pro Ala Asp Val Val Ser Pro Lys Ile Pro Ser Gly 260 265 270 Phe Pro Ile Glu Asp His Glu Thr Ser Pro Leu Asp Asn Ser Asp Ala 275 280 285 Phe Leu Ser Thr His Leu Lys Leu Phe Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ser 290 295 300 Phe Tyr Glu Ser Glu Leu Pro Gln Gly Phe Gln Asp Tyr Tyr Asn Leu 305 310 315 320 Gly Gln Phe Thr Asp Asp Asp Gln Val Pro Thr Pro Leu Val Ala Ile 325 330 335 Thr Ile Thr Arg Leu Val Val Gly Phe Leu Leu Pro Ser Val Ile Met 340 345 350 Ile Ala Cys Tyr Ser Phe Ile Val Phe Arg Met Gln Arg Gly Arg Phe 355 360 365 Ala Lys Ser Gln Ser Lys Thr Phe Arg Val Ala Val Val Val Val Ala 370 375 380 Val Phe Leu Val Cys Trp Thr Pro Tyr His Ile Phe Gly Val Leu Ser 385 390 395 400 Leu Leu Thr Asp Pro Glu Thr Pro Leu Gly Lys Thr Leu Met Ser Trp 405 410 415 Asp His Val Cys Ile Ala Leu Ala Ser Ala Asn Ser Cys Phe Asn Pro 420 425 430 Phe Leu Tyr Ala Leu Leu Gly Lys Asp Phe Arg Lys Lys Ala Arg Gln 435 440 445 Ser Ile Gln Gly Ile Leu Glu Ala Ala Phe Ser Glu Glu Leu Thr Arg 450 455 460 Ser Thr His Cys Pro Ser Asn Asn Val Ile Ser Glu Arg Asn Ser Thr 465 470 475 480 Thr Val
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｃ３ａ受容体のヌクレオチド配列お
よび推定アミノ酸配列を示す。Ｃ３ａ受容体の予想され
る７つの膜通過ドメインを太字で示し、グリコシレーシ
ョン部位をイタリックおよび下線で示す。
【図２】 図２は、Ｃ３ａ受容体の予想膜トポロジーを
示す。Ｃ５ａ受容体およびＣ３ａ受容体間で共通するア
ミノ酸残基を黒丸で示し、大きな細胞外ループおよびア
ミノ末端付近の２つの予想グリコシレーション部位を灰
色の丸で示す。
【図３】 図３は、Ｃ３ａ受容体およびヒト・Ｃ５ａの
アミノ酸配列間の類似領域を示す。
【図４】 図４は、Ｃ５ａ受容体およびＣ３ａ受容体の
転写物が中枢神経系および身体全体において豊富に発現
されることを示す。Ｃ５ａ受容体およびＣ３ａ受容体の
組織分配をノーザンブロットにより調べた。ＲＮＡの組
織源を各レーン上方に示す。
【図５】 図５は、Ｃ３ａ受容体またはＣ５ａ受容体を
発現する卵母細胞がＣ３ａおよびＣ５ａ両方に応答する
ことを示す。（Ａ）Ｃ３ａ受容体に関するｃＲＮＡ（１
０ｎｇ）、全Ｕ９３７ＲＮＡ（２５ｎｇ）、あるいはＣ
３ａ受容体（１０ｎｇ）およびＵ９３７ ＲＮＡ（２５
ｎｇ）の混合物を注入したXenopus卵母細胞の、１０ｎ
Ｍ ｒＣ５ａ、１０ｎＭ Ｃ３ａアナログペプチド、１０
ｎＭ 血小板活性化因子（ＰＡＦ）、１０ｎＭ ｆＭｅｔ
ＬｅｕＰｈｅに対する電気生理学的応答。挿入図は、Ｃ
３ａ受容体 ｃＲＮＡ＋Ｕ９３７ ＲＮＡを同時注入した
卵母細胞の、１０ｎＭ Ｃ３ａに対する典型的な応答を
示す。（Ｂ）Ｃ５ａ−ＲｃＲＮＡ（１０ｎｇ）、Ｕ９３
７ ＲＮＡ（２５ｎｇ）あるいはＣ５ａ−ＲおよびＵ９
３７ ＲＮＡの混合物を注入した卵母細胞の、１０ｎＭ
ｒＣ５ａまたは１０ｎＭ Ｃ３ａアナログペプチドに対
する電気生理学的応答を示す。（Ｃ）、（Ｄ）は、Ｃ３
ａ受容体を発現するがＣ５ａ受容体を発現しない細胞が
Ｃ３ａに結合し、応答することを示す。ｒＣ５ａ（１０
ｎＭ（Ａ）または１００ｎＭ（Ｂ）またはＣ３ａアナロ
グペプチド（１μＭ（ＣおよびＤ）に応答した、Ｃ５ａ
受容体発現（ＡおよびＣ）またはＣ３ａ受容体発現（Ｂ
およびＤ）Ｆｕｒａ２負荷細胞によるカルシウム可動化
を示す。
【図６】 図６は、Ｃ３ａアナログ合成ペプチド（白四
角）、Ｃ３ａ（黒丸）またはｒＣ５ａ（白三角）の濃度
を増加させることによる、Ｃ３ａ受容体発現ＲＢＬ−２
Ｈ３細胞への125Ｉ−Ｃ３ａ結合に対する競争。
【図７】 図７は、Ｃ３ａ受容体のｃＤＮＡ配列を示
す。
【図８】 図８は、Ｃ３ａ受容体のアミノ酸配列を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＦ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ ＡＢＮ ＡＢＡ ＡＣＪ ＡＢＢ ＡＣＶ ＡＢＥ 39/395 ＡＢＸ ＡＢＦ 45/00 ＡＢＥ ＡＢＮ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＡＣＪ 16/28 ＡＣＶ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ダーク・ジョン・バーグスマ アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州ベ ルウィン、アイリッシュ・ロード271番 (72)発明者 ジェイムズ・ジェイ・フォーリー アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ラ ドナー、ティモシー・サークル117番 (72)発明者 チャンドリカ・クマー アメリカ合衆国08512ニュージャージー州 ウエスト・ウィンザー、ウィルソン・ウェ イ・ノース31番 (72)発明者 ヘンリー・エム・サロー アメリカ合衆国19438ペンシルベニア州ハ ーレーズビル、メイプル・アベニュー348 番

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｃ３ａ受容体が配列番号：２のアミノ酸
    １から４８２までに対して少なくとも７０％の同一性が
    あるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである場合
    の、Ｃ３ａとＣ３ａ受容体との相互作用のアゴニスト。
  2. 【請求項２】 Ｃ３ａ受容体が配列番号：２のアミノ酸
    １から４８２までに対して少なくとも７０％の同一性が
    あるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである場合
    の、Ｃ３ａとＣ３ａ受容体との相互作用に対する抗体。
  3. 【請求項３】 Ｃ３ａ受容体が配列番号：２のアミノ酸
    １から４８２までに対して少なくとも７０％の同一性が
    あるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである場合
    の、Ｃ３ａとＣ３ａ受容体との相互作用を阻害するアン
    タゴニスト。
  4. 【請求項４】 治療上有効量の請求項３のアンタゴニス
    トを患者に投与することを特徴とする、Ｃ３ａ受容体ポ
    リペプチドを阻害する必要のある患者の治療方法。
  5. 【請求項５】 治療上有効量の請求項２の抗体を患者に
    投与することを特徴とする、Ｃ３ａ受容体ポリペプチド
    を阻害する必要のある患者の治療方法。
  6. 【請求項６】 治療上有効量の請求項１のアゴニストを
    患者に投与することを特徴とする、Ｃ３ａ受容体ポリペ
    プチドを活性化する必要のある患者の治療方法。
  7. 【請求項７】 配列番号：２のアミノ酸１から４８２ま
    でに対して少なくとも７０％の同一性があるアミノ酸配
    列を含んでなるポリペプチドの発現に関連した疾病また
    はかかる疾病に対する感受性の診断方法であって、該ポ
    リペプチドをコードしている核酸配列中の変異を決定す
    ることを特徴とし、該疾病が急性炎症性疾患、アテロー
    ム性動脈硬化、慢性多発性関節炎、全身性血管炎、多発
    性硬化症、アルツハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾患、クロ
    ーン病、食物アレルギー、非気管支アレルギー、骨関節
    炎、骨粗鬆症、甲状腺疾患、心臓冠状動脈疾患、全身性
    エリトマーデス現象、ＳＬＥ関連腎炎、膜性増殖性糸球
    体腎炎、膜性腎炎、リューマチ性関節炎、ベーチェット
    症候群、若年性リューマチ性関節炎、ショーグレン症候
    群、筋無力症、脳の狼瘡、ギラン−バーレ症候群、天疱
    瘡／類天疱瘡、光毒性反応、血管炎、バイパス後症候
    群、カテーテル反応、敗血症、ＡＲＤＳ、アナフィラキ
    シー、移植拒絶反応、子かん前症、アテローム、腸の炎
    症、甲状腺炎、および不妊症、化膿性感染に対する感受
    性、糸球体腎炎、ネイセリア感染に対する感受性、再発
    性皮下腫および粘膜浮腫、および再発性血栓症／溶血で
    ある方法。
  8. 【請求項８】 急性炎症性疾患、アテローム性動脈硬
    化、慢性多発性関節炎、全身性血管炎、多発性硬化症、
    アルツハイマー症、ＣＮＳ炎症性疾患、クローン病、食
    物アレルギー、非気管支アレルギー、骨関節炎、骨粗鬆
    症、甲状腺疾患、心臓冠状動脈疾患、全身性エリトマー
    デス現象、ＳＬＥ関連腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜
    性腎炎、リューマチ性関節炎、ベーチェット症候群、若
    年性リューマチ性関節炎、ショーグレン症候群、筋無力
    症、脳の狼瘡、ギラン−バーレ症候群、天疱瘡／類天疱
    瘡、光毒性反応、血管炎、バイパス後症候群、カテーテ
    ル反応、敗血症、ＡＲＤＳ、アナフィラキシー、移植拒
    絶反応、子かん前症、アテローム、腸の炎症、甲状腺
    炎、および不妊症、化膿性感染に対する感受性、糸球体
    腎炎、ネイセリア感染に対する感受性、再発性皮下腫お
    よび粘膜浮腫、および再発性血栓症／溶血からなる群よ
    り選択される疾病を有する疑いのある宿主から得た試料
    中の配列番号：２のアミノ酸１から４８２までに対して
    少なくとも７０％の同一性があるアミノ酸配列を含んで
    なるポリペプチドの存在を分析することを特徴とする診
    断方法。
  9. 【請求項９】 配列番号：２のアミノ酸１から４８２ま
    でに対して少なくとも７０％の同一性があるアミノ酸配
    列を含んでなるポリペプチドに結合してポリペプチドに
    対するＣ３ａの相互作用を活性化する化合物の同定方法
    であって、受容体との結合を可能にする条件下にて、ポ
    リペプチドに対する受容体を表面に発現する細胞をスク
    リーニングすべき化合物と接触させ、ここに受容体は、
    それに対する化合物の結合に応答して検出可能シグナル
    を発することのできる第２の成分に結合したものであ
    り；次いで、Ｃ３ａとＣ３ａ受容体との相互作用により
    発生したシグナルの存在または不存在を検出することに
    より、化合物がＣ３ａ受容体に結合し、Ｃ３ａとＣ３ａ
    受容体との相互作用を活性化するかどうかを決定するこ
    とを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】 配列番号：２のアミノ酸１から４８２
    までに対して少なくとも７０％の同一性があるアミノ酸
    配列を含んでなるポリペプチドに結合してポリペプチド
    に対するＣ３ａの相互作用を阻害する化合物の同定方法
    であって、受容体との結合を可能にする条件下にて、ポ
    リペプチドに対する受容体を表面に発現する細胞をスク
    リーニングすべき化合物と接触させ、ここに受容体は、
    それに対する化合物の結合に応答して検出可能シグナル
    を発することのできる第２の成分に結合したものであ
    り；次いで、Ｃ３ａとＣ３ａ受容体との相互作用により
    発生したシグナルの存在または不存在を検出することに
    より、化合物がＣ３ａ受容体に結合し、Ｃ３ａとＣ３ａ
    受容体との相互作用を阻害するかどうかを決定すること
    を特徴とする方法。
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