JPH10503083A

JPH10503083A - Light-regulated promoter for the production of heterologous proteins in filamentous fungi

Info

Publication number: JPH10503083A
Application number: JP7529155A
Authority: JP
Inventors: カトー，エリー・ケイ; スチュアート，ダブリュー・ドーセイ
Original assignee: University of Hawaii
Current assignee: University of Hawaii
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1995-05-09
Publication date: 1998-03-24
Also published as: AU2475995A; KR970702914A; EP0759975A1; CA2188453A1; AU700399B2; WO1995030739A1; US5741665A; EP0759975A4

Abstract

(57)【要約】ａｌ−３および関連プロモーターは、糸状菌類の異種タンパク質の光調節された組換え体生産を提供するのに用いることができる。これらのプロモーターを用いる発現系は、場合により選択可能なマーカー手段を更に含むベクター中に置くことができる。 (57) [Summary] al-3 and related promoters can be used to provide light regulated recombinant production of heterologous proteins of filamentous fungi. Expression systems using these promoters can optionally be placed in a vector that also contains selectable marker means.

Description

【発明の詳細な説明】糸状菌類の異種タンパク質生産用の光調節プロモーター技術分野本発明は、糸状菌類宿主における異種、特に、真核性タンパク質の組換え体生産に関する。特に、本発明は、光調節菌類プロモーターを用いる発現構築物に関する。背景技術光に対する暴露が、一般的なパンカビであるアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の多数の遺伝子の転写を活性化することは長年知られてきた。これらの遺伝子のいくつかは、カロテノイドの合成経路に不可欠な酵素である生産物を生じる。この経路における多数の異なる遺伝子突然変異体（アルビノ−１、−２および−３またはａｌ−１、ａｌ−２およびａｌ−３と称される）は、ハーディング（Ｈａｒｄｉｎｇ），Ｒ．Ｗ．らによる論文、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（１９８１）６８：７４５〜７４９中に記載された。これらの突然変異に関係した遺伝子は光調節されるが、ａｌ−１、ａｌ−２およびａｌ−３突然変異体の３種類全部に関係した遺伝子はクローン化された（ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），Ｍ．Ａ．ら、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ（１９８９）９：１２７１〜１２７６；シュミットハウザー（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ），Ｔ．Ｊ．ら、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ（１９９０）１０：５０６４〜５０７０）。ａｌ−３遺伝子は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンテターゼの生産を調節する。ゲラニルゲラニルピロリン酸は、カロテノイドおよびキサントフィルの前駆体である。従来の研究は、この中間体の合成が転写レベルで調節されること、および光の３０分間パルスがカロテノイド生合成における３種類の遺伝子の転写を１５〜４５倍に同調的に増加させることを示した。光を用いてａｌ−３プロモーターを活性化させるための条件は、例えば、ベイマ（Ｂａｉｍａ），Ｓ．ら、ＪＰｈｏｔｏｃｈｅｍＰｈｏｔｏｂｉｏｌＢ：Ｂｉｏｌ（１９９２）１５：２３９〜２５１によって記載のように知られている。組換え体生産系において異種タンパク質をコードしている遺伝子の発現を調節することはしばしば好都合であるので、適切なコーディング配列を光調節プロモーターの制御下に置くことは、発現を制御する簡単で且つ有効な方法を与えるであろうし、そしてそのタイミングを宿主の生理学的状態に適合させるであろう。従来、糸状菌類宿主に関係した発現系においてこの調節手段が用いられたことはなかった。本発明は、このような調節系を提供する。発明の開示本発明は、光の存在または不存在によって調節されうる糸状菌類の異種タンパク質の発現系を提供する。これらの発現系は、異種タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を、ａｌ−１、ａｌ−２またはａｌ−３遺伝子に関係したプロモーターの制御下に置く。好都合に、発現系は、用いられる菌類宿主の関係において選択可能なマーカー機能を与えるであろうヌクレオチド配列を更に含む核酸分子上に含まれる。したがって、一つの態様において、本発明は、ａｌ−１、ａｌ−２またはａｌ −３プロモーターに対して機能的に結合した異種タンパク質をコードしている第一ヌクレオチド配列を含み、そして場合により、選択された菌類において選択可能なマーカー手段を与える第二ヌクレオチド配列を更に含む。他の態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含むように修飾された糸状菌類およびこれらの菌類を培養することによって異種タンパク質を製造する方法に関する。図面の簡単な説明図１は、本発明のプラスミドを構築するのに用いられるａｌ−３プロモーターインサートのヌクレオチド配列を示す。図２は、ａｌ−３プロモーターの制御下のｍｔｒ遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）を含む種々のプラスミドによって形質転換されたアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）培養物の増殖に対する光の作用を示す。図３は、暗中の増殖が基準化されている図２のデータの別の形態を示す。図４は、形質転換されていない菌株の新鮮培養による、図２で図示されたのと同様の実験で得られたデータを示す。図５は、暗中の増殖が基準化されている図４のデータの別の形態を示す。図６は、ｐＬＲＣの構築を示す略図である。図７は、キモシン読み取り枠のヌクレオチド配列を示す。発明の実施態様本発明は、糸状菌類を組換え体宿主として用いる場合に有用な発現系を提供する。「糸状菌類」とは、分岐状の重なり合う糸状体の塊によって菌糸体を形成しうる菌類を意味する。これらの枝は横壁によって中断されているかもしれないが、小室間の細胞質の通過は可能である。これらの菌類では有性生殖および無性生殖両方が起こる。無性生殖の場合、分生子として知られる胞子が、糸状体に沿った様々な位置に形成される出芽突起の先端の外側に生じる。糸状菌類で表わされる科には、藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）および不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）がある。最も一般的な科は、アカパンカビ属、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）を含む子嚢菌類である。特に好ましい宿主としては、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、黒色アスペルギルス（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびアカパンカビ、特に、アカパンカビがある。光調節発現系本発明の核酸分子は、異種タンパク質をコードしているヌクレオチド配列に対して機能的に結合したａｌ−１、ａｌ−２またはａｌ−３プロモーターを用いる発現系を含む。発現系は、典型的に、選択可能なマーカー手段と一緒に与えられる。選択可能なマーカー手段は、更に別のベクター上に存在していてよいしまたは発現系を含む核酸分子中に含まれていてよい。選択可能なマーカー手段の性状は、宿主の性状および培養条件に依るであろう。発現系自体は、当該技術分野において理解されるように、必要なプロモーターのみならず、所望ならば、発現の調節を助ける他の特徴、例えば、エンハンサー、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むであろう。既知の配列の核酸からこのような発現系を構築するための手段は十分に理解されており、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８２）；ガバー（Ｇｏｖｅｒ），Ｄ．Ｎ．ら、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）第ＩおよびＩＩ巻並びに専門家に一般的に入手可能な他の標準的な教本で前に記載されたような慣用的な技法を用いる。概して、ａｌ−１、ａｌ−２またはａｌ−３プロモーターは、発現のための望ましいコーディング配列と機能的に結合した状態に置かれている。適当なコーディング配列は、酵素、例えば、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子またはコラゲナーゼ；ホルモン、例えば、ヒト、ウシまたはニワトリ成長ホルモン、ろ胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺剌激ホルモンまたはヒト絨毛性性腺剌激ホルモンなどのゴナドトロピン、ヒト、ブタまたはウシインスリンを含めたインスリン、ＡＣＴＨ、プロラクチン等；生理学的機能を媒介するペプチド、例えば、心房性ナトリウム利尿性ペプチド、エリトロポエチン、ブラジキニンおよび脳ナトリウム利尿性ペプチド；サイトカイン、例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子；免疫グロブリンおよびそれらのフラグメント；若干の毒素、例えば、リシンまたはジフテリア毒素；産業上重要な酵素、例えば、プロテアーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ等；受容体タンパク質、例えば、トロンビン受容体、カルシウム受容体等；栄養的および構造的タンパク質、例えば、硫黄の多いタンパク質またはコラーゲン；成長因子、例えば、ＴＧＦαおよびＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ並びにＦＧＦ；そして概して、組換え体生成が望まれ且つコーディングヌクレオチド配列を得ることができる任意のタンパク質を含めた種々のタンパク質に対するものである。所望のタンパク質の多くはヘテロ二量体であってよく；この場合、本発明のプロモーターに関与する多数の発現系が用いられるであろう。ヘテロ二量体のサブユニットをどちらも単一ベクターによって生産してよいし、または多数のベクターを形質転換に用いてよい。構築物は、一般的に認められているように、所望のタンパク質を培地中に分泌するためのシグナル配列を与えるように設計されてよいし、またはタンパク質は細胞内で生産されてよい。所望ならば、タンパク質は、融合タンパク質の一部分として設計されてよく、それを後で切断して所望の生成物を生成することができる。上述の状況において本発明のプロモーターを所望のコーディング配列に対して機能的に結合するための方法は、概して、当該技術分野において理解される。選択可能なマーカー糸状菌類宿主は、本発明の発現系を調節するように修飾される必要があるので、形質転換プロトコル中に選択可能なマーカーを含むことが望ましい。選択可能なマーカーは、本発明の発現系を含んでいるのと同様のベクター上に置かれることができるし、または宿主を同時形質転換するのに用いられる更に別のベクターの一部分であってよい。選択可能なマーカーの適切な選択は、宿主の性状に依るであろう。端的な選択は、例えば、宿主が感受性であるベノミルなどの抗生物質に対する耐抗生物質性の原因となる酵素を生じる発現系でありうる。或いは、例えば、栄養的欠乏によって宿主が選択される場合、野生型遺伝子を用いて欠乏を補充することができる。しかしながら、そのようにするには適当な突然変異体が必要である。突然変異体は概ね製造することができるが、糸状菌類のより良く研究された種は、選択のための手段を含む形質転換ベクターの設計をより多様にする多数の突然変異体が容易に入手可能であるので好ましい。例えば、選択のための一つの極めて簡単な方法は、特定の栄養素に対して要求がある突然変異体宿主を用い、そこでは、この栄養要求の原因である欠失遺伝子を補充することによって選択可能なマーカー手段が与えられる。例として、ヒスチジンの不存在下で増殖することができない突然変異体を宿主として用いる場合、成功した形質転換細胞は、突然変異体において欠けている遺伝子の野生型を含み且つ最少培地上で形質転換細胞を増殖させる核酸を「マーカー」として用いて選択することができる。成功した形質転換細胞だけがヒスチジン不存在下で増殖することができるであろう。培地中の他のアミノ酸または他の栄養素の存在に依存した状態を引き起こす同様の突然変異もまた知られている。例えば、アカパンカビの場合、既知の突然変異体としては、独特の栄養要求を有する突然変異体がある。有用な栄養要求およびそれに関連した突然変異体の例としては、（１）アミノ酸、例えば、ヒスチジン（ｈｉｓ−１〜−７突然変異体）、プロリン（ａｇａ突然変異体）、アルギニン（ａｒｇ−１１突然変異体）、シトルリン（ａｒｇ−１１突然変異体）、アスパラギン（ａｓｎ突然変異体）、コリン（ｃｈｏｌ−１およびｃｈｏｌ−２突然変異体）、システイン（ｃｙｓ−１突然変異体）、グルタミン（ｇｌｎ−１突然変異体）、ロイシン（ｌｅｕ−１〜−４）、リシン（ｌｙｓ−２、−４および−５）、メチオニン（ｍａｃ突然変異体並びにｍｅｔ−６、−９および−１０突然変異体）およびトレオニン（ｔｈｒ−２および−３突然変異体）；（２）芳香族アミノ酸の混合物、例えば、ｐ−アミノ安息香酸、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンの混合物（ａｒｏ−６、ａｒｏ−７およびａｒｏ−８以外の全ａｒｏ菌株によって必要とされる）、トリプトファンおよびフェニルアラニンの混合物（ａｒｏ−突然変異体に必要とされる）、イソロイシンおよびバリンの混合物（ｉｌｖ−１、−２および−３に必要とされる）並びにフェニルアラニンおよびチロシンの混合物（ｐｔ突然変異体に必要とされる）；（３）ビタミン、例えば、パントテン酸（ｐａｎ−１突然変異体）およびチアミン（ｔｈｉ−２およびｔｈｉ−４突然変異体）；（４）プリン塩基、例えば、アデニン（ａｄ−２〜ａｄ−４およびａｄ−８突然変異体）、ヒポキサンチン（ａｄ−２およびａｄ−３突然変異体）、イノシンおよびグアニンまたはグアノシン（ｇｕａ−１または−２突然変異体）；（５）ピリミジン塩基、例えば、ウラシル（ｐｙｒ−１〜ｐｙｒ−６）；（６）飽和脂肪酸（ｃｅｌ突然変異体）または不飽和脂肪酸、例えば、９位かまたは１１位にシス立体配座の二重結合を有するＣ₁₆またはＣ₁₈脂肪酸、９位にトランス立体配置の二重結合を有する脂肪酸、およびメチレン架橋によって中断された多数のシス二重結合を有する脂肪酸（ｕｆａ−１および−２）；（７）生理学的に重要なイオン、例えば、カリウム（ｔｒｋ）；（８）糖アルコール、例えば、イノシトール（ａｃｕ突然変異体およびｉｎｌ突然変異体）およびグリセロール；および（９）他の有機物、例えば、酢酸塩（ａｃｅ突然変異体）、α−ケトグルタル酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩またはホルムアルデヒド（ｆｏｒ突然変異体）、ｐ−アミノ安息香酸（ｐａｂ−１、−２および−３突然変異体）およびスルホンアミド（３５℃でｓｆｏ突然変異体）がある。栄養要求に基く一つの具体的な例は、酵素オルニチントランスカルバミラーゼをコードするＡｒｇＢ⁺遺伝子である。この酵素は、野生型黒色アスペルギルスに存在する。この酵素を欠いた突然変異体（ＡｒｇＢ^-菌株）は、通常の非特異的技法、例えば、紫外線による処理の後、アルギニン含有培地上で増殖する能力と共に、最少培地上で増殖することができないことに基いてスクリーニングすることによって製造することができる。このゲノムを含む菌類は、それらがＡｒｇＢ⁺核を更に含むならば、最少培地上で増殖するであろう。他の選択可能なマーカーは、毒素に対してまたは高温などの他の不利な培養条件に対して耐性を与える。毒性作用を働かせることができる有害な化学薬品の具体的な例としては、アクリフラビン（概して、ａｃｒ−４およびａｃｒ−６による耐性に必要とされるｓｈｇ遺伝子の存在と共に、ａｃｒによって与えられる耐性）；３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（ａｃｒ−２、ａｔｒ−１、ｃｐｃ、ｌｅｕ−１またはｌｅｕ−２によって与えられる耐性）；染料、例えば、マラカイトグリーン（ａｃｒ−３によって与えられる耐性）；カフェイン（ｃａｆ −１によって与えられる耐性）；プリン類似体（ａｚａ−１によって与えられる８−アザアデニンおよび２，６−ジアミノプリンに対する耐性；ａｚａ−２によって与えられる８−アザアデニンおよび８−アザグアニンに対する耐性；ａｚａ −３によって与えられる８−アザグアニンおよび６−メルカプトプリンに対する耐性；ｍｅｐ（３）およびｍｅｐ（１０）によって与えられる６−メチルプリンに対する耐性）；シアニド（増殖の最初の２４時間にｃｎｉ−１によって与えられる非感受性）；テトラゾリウム（ｃｙａ−６およびｃｙａ−７によって与えられる耐性）；シクロヘキシイミド（ｃｙｈ−１、−２および−３によって与えられる耐性）；クロム酸塩（ｃｙｓ−１３によって与えられる耐性）；２−デオキシ−Ｄ−グルコース（ｄｇｒによって与えられる耐性）；エデイン（ｅｄｒ−１および−２によって与えられる耐性）；エチオニン（ｅｔｈ−１によって、ｐ− フルオロフェニルアラニンの存在下においてｎａｐによって、およびエチオニンがＤ型の場合にｏｘＤによって与えられる耐性）；フルオロ化合物、例えば、５ −フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシルおよび５−フルオロウリジン（ｆｄｕ−２によって与えられる３種類全部に対する耐性；アンモニア不含最小培地中においてｕｃ−５によって与えられる５−フルオロウラシルに対する耐性；ｕｄ−１によって与えられる５−フルオロデオキシウリジンおよび５−フルオロウリジンに対する耐性）、およびフルオロフェニルアラニン（ある種の条件下においてｆｐｒ−１〜−６によって与えられる耐性）；８−アザアデニン（ｍｔｓによって与えられる耐性）；メタンスルホン酸メチル（ｕｐｒ−１に非感受性または最低限に感受性）；界面活性剤、例えば、塩化デクアリニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化ベンズアルコニウム（ｓｕｒ−１によって与えられる耐性）；並びに金属イオン、例えば、バナジン酸塩（ｖａｎによって与えられる耐性）がある。更に有用なのは、様々な環境条件、例えば、高または低温、酸素の不足（ａｎによって与えられる耐性）、一定の光（ｌｉｓ−１、−２および−３によって与えられる耐性）または光の不存在、紫外線、電離線および高または低浸透圧の極端な状態に対して耐性を与える遺伝子である。多数の菌株は、ファンガル・ジェネティクス・ストック・センター（ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ）（ＦＧＳＣ）から入手することができる。他の有用な菌株は、既知の技法を用いて製造することができる。例えば、黒色アスペルギルス（ＡＴＣＣ４６９５１）の特性を有する菌株は、紫外線によって突然変異を誘発させて、規定の最少培地中での増殖にオルニチンまたはアルギニンを必要とする単離物を生成することによって製造することができる。この菌株はオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを欠いていて、ａｒｇＢ（３５０（−）５２）と称された。黒色アスペルギルスまたはアスペルギルス・ニドゥランスを増殖させるための培地は、コーブ（Ｃｏｖｅ）、ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ（１９６６）１１３：５１〜５６によって記載されている。しかしながら、毒性物質または他の有害な培養条件に対する耐性を与える遺伝子の包含などの他の選択可能なマーカー系もまた用いることができる。例えば、抗生物質に対する耐性を与えるタンパク質をコードしている遺伝子は、抗生物質を含む培地上で選択が行われる場合に用いることができる。糸状菌類の場合、このような抗生物質としてはベノミルがある。選択の更に複雑な系は、毒物に対して感受性を与える内因性遺伝子の失活に関係する。例えば、本明細書中で例証されるのは、ｐ−フルオロフェニルアラニン（ｐｆｐａ）または４−メチルトリプトファン（４−ＭＴ）に対する感受性を与える内因性ｍｔｒ遺伝子座の失活による選択である。失活は、ｍｔｒ遺伝子座中への相同的組換えによってその機能を破壊するように起こる。糸状菌類での相同的組換えは十分に確立されている。例えば、アッシュ（Ａｓｃｈ），Ｄ．Ｋ．ら、ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ（１９９０）２２１：３７〜４３；アッシュ，Ｄ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９２）１３０：７３７〜７４８を参照されたい。別のアプローチは、カナバニンに対する感受性を与える内因性ｐｍｂ遺伝子座の失活を用いることであった。これらの選択方法に対して、形質転換のためのホモカリオンの宿主のみを選択する。糸状菌類は、本質的に単一細胞質であることにおいて多数の核を含むことができるので、核のいずれか一つが、感受性を与える自然のままの遺伝子を含むならば、その菌類は毒素の存在下において生存することができないであろう。したがって、一つの特に好ましい実施態様において、本発明の発現系は、ｍｔｒ遺伝子座への相同的組換えを行うベクター中に挿入することができる。この場合、好ましくは、ｍｔｒ遺伝子の生産物を与えるのには不十分であるが、相同的組換えを促進するのに十分であるｍｔｒ遺伝子の部分は、本発明の発現系とまたは所望の異種タンパク質をコードしているヌクレオチド配列と隣接している。このようなｍｔｒ配列を与えるベクターおよびこれらのベクターを用いて相同的組換えを行う手段、そしてそれによるｐｆｐａに対する耐性は、１９９３年８月１２日出願の同時係属出願第０８／１０５，４４８号明細書に記載されており、その内容は、現在、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５６６３号明細書で公開され且つ本明細書中に援用されている。この出願で記載されているのは、所望のタンパク質のコーディング配列若しくはタンパク質の発現系かまたは両方に、ｍｔｒ遺伝子中の挿入部位を与えて、内因性ｍｔｒによるベクターの相同的組換えがこの毒素に対して耐性を与えるようにするベクターであり、そこではｐＸｐｒｅｓｓと称されている。それらの設計において更に巧妙である選択の系もまた用いることができる。例えば、非機能性ｍｔｒ遺伝子（ｍｔｒ）を含み、そして更に、トリプトファンを合成することができない二重突然変異体の形質転換について、機能性ｍｔｒ遺伝子をマーカーとして用い且つ高濃度のアルギニンをトリプトファンと一緒に含む培地中で形質転換細胞を培養することによって選択することができる。該突然変異体は、増殖のためにトリプトファンを必要とするので、それはトリプトファンを培地から運ぶ必要がある。トリプトファンの輸送を可能にする二つの可能な遺伝子産物があり、すなわち、ｍｔｒ遺伝子産物およびｐｍｇ遺伝子産物である。しかしながら、アルギニンはｐｍｇに対して競合するので、トリプトファンは、機能性ｍｔｒ遺伝子が存在する場合にのみ有効に輸送されることができる。したがって、成功した形質転換細胞だけが、高濃度のアルギニンと一緒にトリプトファン追加を含む最少培地上で増殖するであろう。したがって、この計画を用いると、ｍｔｒ遺伝子配列はまた、規定の条件下で栄養的欠乏を修復する生産物をコードすることによって選択を行うことができる。上記で論評された同時係属出願第０８／１０５，４４８号明細書およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５６６３号明細書で記載されたベクターはまた、このような選択法のためのｍｔｒ生産物を与えるように操作することができる。形質転換および培養糸状菌類の形質転換および該菌類の培養のための標準的な技法は当該技術分野において周知である。アカパンカビに対して用いられたような技法の広範囲にわたる論評は、例えば、デービスおよびデ・セル（ｄｅＳｅｒｒｅｓ）、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９〜１４３で見られる。標準法は、概して、菌株の維持および分生子の製造に用いられる。菌糸体は、典型的に、ランボウィツ（Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ）ら、ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ（１９７９）８２：１７〜３１に記載のように、液体培養中で約１４時間（２５℃）増殖させる。宿主菌株は、概して、適当な１種類または複数の栄養素、例えば、ヒスチジン；アルギニン；ｐｈｅ、ｔｙｒおよび／またはｔｒｐ（それぞれ約８０μ ｇ／ｍｌ）；ｐ−アミノ安息香酸（約２μｇ／ｍｌ）；およびイノシトール（約０．２ｍｇ／ｍｌ）を補足したフォーゲル（Ｖｏｇｅｌ′ｓ）かまたはフリース（Ｆｒｉｅｓ）最少培地中で増殖することができる。本発明のプロモーターは光によって調節されるので、発現が望まれるまで、培養物を暗条件下で増殖させることができる。発現系は、上記に引用されたハーディング，Ｒ．Ｗ．およびターナー（Ｔｕｒｎｅｒ），Ｒ．Ｖ．、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ（１９８１）６８：７４５〜７４９によって記載のように、このような活性化に適当な青色波長を含む光線を用いて培養物に照明することによって活性化することができる。発現が活性化され且つ所望のタンパク質が生じたら、当該技術分野において一般的に認められた技法を用いてタンパク質を培養物から回収することができる。タンパク質が細胞内に生成されている場合、細胞を溶解させ、そして溶解産物に適当な分離および精製手順を施す。タンパク質が培地中に分泌されている場合、培地を取出し、そして慣用的な技法、例えば、サイズ排除、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分画遠心法等を用いて分泌されたタンパク質を精製することができる。適当なプロトコルは、タンパク質生成物の性状に依るであろう。タンパク質が融合タンパク質として与えられる場合、プロテアーゼ部位は、成熟タンパク質の遊離が適当なプロテアーゼによる処理上の簡単な問題であるように配列中に挿入されることが好ましい。実施例以下の実施例は、本発明を例証するためのものであり、制限するものではない。実施例１発現系の構築およびモデル遺伝子の発現モデル系として、ｍｔｒアカパンカビ遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）を、ｐＬＲＮおよびｐＡＬＮと称するプラスミド中のａｌ−３プロモーターの制御下に置き、そしてｍｔｒ遺伝子それ自体が選択可能なマーカー機能を与えることを可能にする条件下でアカパンカビ中に形質転換させた。これらのベクターによるアカパンカビの形質転換は、光の存在下において優れた増殖を引き起こし且つｍｔｒ遺伝子生産物をコードしているｍＲＮＡの生成を促進させた。以下は、構築および発現を記載する。シアトルのワシントン大学のＤ．Ｄ．スタドラー（Ｓｔａｄｌｅｒ）から得られたアカパンカビ菌株８２−５９（ｔｒｐ−２、ｍｔｒ、ｃｏｔ−１、ｙｌｏ− ａ）を宿主として用いた。この菌株は、増殖のためにトリプトファンを必要とし且つｍｔｒＯＲＦ中の部位１５３６に小さい欠失がある非復帰性ｍｔｒ表現型を有する。したがって、この突然変異体は、トリプトファン不存在下で増殖することができないし、そして過剰のアルギニンが存在する場合、ｍｔｒ機能性が修復されなければ、トリプトファン存在下でも増殖することができない。宿主菌株は、１Ｘフォーゲル培地、２％スクロース、トリプトファン０．０５ｍｇ／ｍｌを含む培地中の分生子増殖斜面上で維持された。２種類のプラスミドを構築して、ｍｔｒＯＲＦをａｌ−３プロモーターの制御下に置いた。ｐＬＲＮは、ローマ大学のギセッペ・マチノ（ＧｕｉｓｅｐｐｅＭａｃｉｎｏ）によって提供されたＭ１３ｍｐ１８ベクター１．０μｇから回収され、そしてジーン・クリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）ＩＩキット（バイオ（Ｂｉｏ）１０１１）を用いてゲル精製されたａｌ−３プロモーターを含む１．２ｋｂＰｓｔＩ／ＳａｌＩフラグメントを、上記に引用された１９９３年８月１２日出願の米国特許出願第０８／１０５，４４８号明細書およびＰＣＴＷＯ９３／２５６６３号明細書に詳細に記載された１μｇのプラスミドｐＮ８４６のＰｓｔＩ／ＳａｌＩ消化物に連結することによって構築された。ａｌ−３プロモーター含有インサートの完全な配列を図１に示す。マチノ博士は、転写開始部位から−５５位〜−２２５位にある光誘導の原因となる部分を既に同定している。消化された物質をＴ４リガーゼ４００Ｕと一緒に１５℃で一晩中インキュベートした。連結反応混合物を、塩化カルシウムによる処理によって適格にされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５Ａに形質転換され、そして形質転換されたコロニーのインサートについて、制限消化分析を用いてスクリーニングした。ｐＮ８４６のＰｓｔＩ／ＳａｌＩ消化物によって得られた線状ベクターは、ｍｔｒプロモーターの一部分、ＯＲＦ全体およびターミネーター配列を与える。このフラグメントと１．２ｋｂａｌ−３プロモーターフラグメントとの連結反応は、ｍｔｒＯＲＦをａｌ−３プロモーターの制御下に置く。得られたベクターをｐＬＲＮと称した［光調節された中立（light regulated neutral）から命名した］。類似体ベクターもまた、ａｌ−３プロモーターをｐＮ８４６の完全なｍｔｒインサートの５′に、従って、天然のｍｔｒプロモーターの５′に効果的に置いて製造した。このプラスミドにおいて、完全なｍｔｒプロモーターは、１３３６位〜１６６０位のＳａｌＩ部位間に、すなわち、ａｌ−３プロモーターとｍｔｒＯＲＦとの間に位置している。このプラスミドをｐＡＬＮと称した。菌株８２−５９のスフェロプラストは、ヴォルマー（Ｖｏｌｌｍｅｒ），Ｓ．Ｊ．ら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９８６）８３：４８６９〜４８７３によって記載された方法を用いて製造された。形質転換は、ステュアート（Ｓｔｕａｒｔ），Ｗ．Ｄ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ（１９８８）３０：１８８〜２０３によって記載のように行われた。選択は、フォーゲル培地およびＦＩＧＳ（０．５％フルクトース、０．２％イノシトール、０．５％グルコース、２０％ソルボース）を炭素源として用いて製造された下層プレートを用い且つアルギニン０．１ｍｇ／ｍｌおよびトリプトファン０．０１ｍｇ／ｍｌの存在下で行われた。培養物を、光を遮断した２８℃のインキュベーター中においてインキュベートした。光条件の調節は、ミクロンタ・プログラマブル・タイマー（ＭｉｃｒｏｎｔａＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＴｉｍｅｒ）（ラジオ・シャック（ＲａｄｉｏＳｈａｃｋ）カタログ番号６３ −８６４）を用いて行われて、２時間ごとに光を周期化させた。コロニーを２日後に評点し、そして斜面上の高選択分生子増殖培地に移した。ソルボースの存在下において、アカパンカビは、単一の形質転換細胞の単離を可能にするコロニー表現型をとる。最少上層寒天（１Ｍソルビトール、１Ｘフォーゲル塩および２．８％バクト寒天）を、アルギニン０．１ｍｇ／ｍｌと一緒に更に追加した。細胞４．６ｘ１０⁶個あたりの形質転換頻度は、ｐＬＲＮおよびｐＡＬＮについてそれぞれ約２０および７０であった。ホモカリオン形質転換細胞は、追加のｐｆｐａ０．０５ｍｇ／ｍｌおよびアントラニル酸０．０５ｍｇ／ｍｌを含む斜面に分生子を移すことによって得られた。（アントラニル酸は、ｔｒｐ−２突然変異を防ぐために加えられた；トリプトファンの添加は、輸送系に対するｐｆｐａとの競合を引き起こしたと考えられる。）これらの、光の存在下でのｐｆｐａに対する感受性を検査した。光感受性を示したコロニーの分生子懸濁液を、ａｒｇ０．１ｍｇ／ｍｌおよびｔｒｐ０．０１ｍｇ／ｍｌを含む上記の高選択培地上で平板培養して、ホモカリオン形質転換細胞を単離した。平板培養および再ストリークは、光中でのｐｆｐａに対する１００％の感受性が得られるまで繰り返され、そして高選択培地上で成功した増殖が観察された。これは、ホモカリオンの単離を確実にする。得られたホモカリオンを、分生子増殖に対する光の作用について調べた。ｐｆｐａ０．０１５ｍｇ／ｍｌおよびアントラニル酸０．０５ｍｇ／ｍｌを補足した液体フォーゲル最少培地（１Ｘフォーゲル塩および２％スクロース）に、分生子３０，０００個かまたは６０，０００個を接種し、そして光中および暗中において２８℃で５日間培養した。次に、菌類を濾過によって集め、そして細胞質量の乾量を測定した。野生型菌株７４ａを対照として用いた。結果を図２に示す。光中の増殖が１ｍｇまで基準化されている場合のこれらの結果の別の形態を図３に示す。予想されるように、野生型菌株７４ａは、ｐｆｐａに対して常に感受性であり、したがって増殖しない。非形質転換菌株８２−５９は、それが非復帰性ｍｔｒ表現型を有するので、ｐｆｐａに対して比較的耐性である。選択されたホモカリオンは、暗中ではそれらのｍｔｒ表現型が保持されるが、光中ではｍｔｒ遺伝子が発現されて、ｐｆｐａ毒性に対してそれらを感受性にするので、光増殖と暗増殖との間により大きな差を示す。したがって、示されたように、多数の形質転換菌株は、親菌株８２−５９と比較したところ、より大きな光感受性を示した。この実験を、非形質転換菌株８２−５９の新鮮な培養物を用いて繰り返して、図４で示されたのと同様の結果を得；図４で得られた基準化された結果を図５に示す。形質転換されたｐＬＲＮ１３−１は、それが光および暗条件間の最も大きい差を示したので、更に別の研究用に選択された。ｐＬＲＮ１３−１および８２−５９からのメッセンジャーＲＮＡは、ノーザン・ブロット分析を施され且つｍｔｒＯＲＦの１０５０ｂｐによって精査された。ｐＬＲＮ１３−１の結果は、光存在下においてプローブとのｍＲＮＡハイブリッド形成の高水準の生成を示したが、暗中では極めて少なかった。菌株８２−５９は、どちらの条件下においてもｍｔｒｍＲＮＡの生成を示さなかった。したがって、ｍｔｒコーディング配列をモデル系として用いて、ａｌ−３がこのＯＲＦの発現系を光存在下の機能として調節することができることを実証する。実施例２哺乳動物遺伝子の発現キモシンをコードしている哺乳動物遺伝子を、図６で示されたようなａｌ−３プロモーターと機能的に結合した状態に置いた。６．６ｋｂプラスミドｐＬＲＮの１μｇ試料を、ＳａｌＩによって消化し且つ精製した。ＳａｌＩは、ａｌ−３プロモーターとｍｔｒＯＲＦとの間を切断する。キモシン遺伝子は、ベルレクス・バイオサイエンシズ（ＢｅｒｌｅｘＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得られたｃＤＮＡキモシンクローンからＸｈｏＩおよびＳａｌＩによって放出され且つゲル精製された。キモシンをコードしているＤＮＡ配列を図７に示す。ＯＲＦは、７２位のＡＴＧから１２１８位のＴＧＡまで広がっている。キモシンＯＲＦは、キモシンＯＲＦを直ぐ下流に有する中間体ｐＣＬＲＮを与える切断されたベクター中の適当な配向で、並びにａｌ−３プロモーターに対しておよびｍｔｒＯＲＦの直ぐ上流に機能的に結合した状態で連結された。適切な挿入は、制限分析によって実証された。ｐＣＬＲＮをＨｉｎｃＩＩによって消化し、そしてＴ４リガーゼ４００Ｕと一緒に再度環化させた。これは、ｍｔｒＯＲＦの約１．１ｋｂを欠失している。得られた６．６ｋｂプラスミドをｐＬＲＣと称した。したがって、ｐＬＲＣは、相同的組換えを行うのに十分なｍｔｒＯＲＦの非機能性部分と隣接したａｌ−３プロモーターの制御下のキモシンの発現系を含む。宿主スフェロプラストは、菌株Ｈｉｓ−３ＴＭ４２８Ａ、ＦＧＳＣ４４３８から得られた。この突然変異体は、ヒスチジンの存在下でのみ増殖するであろうし、そしてｈｉｓ遺伝子を含み且つＦＧＳＣから得られたヒスチジン生合成を修復することができるプラスミドｐＮＨ６０は、同時形質転換選択に用いられた。形質転換は、上記のようにｐＬＲＣＤＮＡ１０μｇおよびｐＮＨ６０ＤＮＡ２μｇを用いて行われた。形質転換細胞は、上記のように、アミノ酸補充物の不存在下においてフォーゲル培地およびＦＩＧＳを用いて製造された下層プレートおよび上層寒天を用いて選択された。この結果、４４個の形質転換細胞が単離された。それぞれを、２％スクロース液体培地を含む１Ｘフォーゲル中に接種し、そして培養物を一定の２時間光周期において２８℃で７日間インキュベートした。４１個の形質転換細胞に対して、液体培地１ｍｌを、ミニフォルド（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）−ＩＩスロットブロットシステムを用いてＭＳＩ装填ナイロン膜上にブロッティングした。フィルターをＴＢＳ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭＮａＣｌ）および１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０によって処理し、そして７０℃で３０分間インキュベートして、内因性アルカリ性ホスファターゼを失活させた。フィルターをＴＢＳ中で濯ぎ洗浄し、そしてＴＢＳ中１０％脱脂粉乳を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。ブロックを除去し、５％脱脂乳ＴＢＳ中の１：５０００希釈の一次抗体（ウサギ抗プロキモシン）を加え、そして混合物を３７℃で１時間インキュベートした。フィルターを除去し、０．０５％トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）ＴＢＳ（ＴＴＢＳ）中で２回（５分間）洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ複合体）を最終濃度０．２４ｐｇ／ｍｌで加え且つ３７℃で１時間インキュベートした。フィルターを洗浄し、そして製造者の指示にしたがって色基質を加えた（ベーリンガー・マンハイム・ジニアスキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｅｎｉｕｓＫｉｔ））（７５ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム塩４５μｌ、１００ｍＭトリス− ＨＣＬ１０ｍｌ中で希釈された５０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３ −インドリルリン酸３５μｌ、１００ｍＭＮａＣｌおよび５０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、ｐＨ９．５）。結果は、４１個の形質転換細胞の内２７個がキモシンを生成したことを示した。しかしながら、これらの生産細胞から６個を選択し、そしてＳＤＳＰＡＧＥ（ウェスタンブロット）によって検定した場合、キモシンは検出されなかった。実験は、選択された菌株３個を用い且つ上記のように周期化された光中において２８℃で９日間培養して繰り返した。液体培地４５０μｌを、種々の濃度の０．５〜２ＭＫＣｌによって処理して、タンパク質を細胞壁から放出させ、そして上記のスロット・ブロット法によって分析した。更に、いくつかの培養物をリゾチーム５０μｇ／ｍｌによって処理して、菌糸体の頂点の膨潤および溶解を引き起こした。処理されたこれらの培養物それぞれのスロットブロット分析は、キモシンのより高い検出を示した。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Light-regulated promoter for the production of heterologous proteins in filamentous fungiTechnical field The invention relates to recombinant production of heterologous, in particular eukaryotic, proteins in a filamentous fungal host. About birth. In particular, the invention relates to expression constructs using light-regulated fungal promoters. I do.Background art Exposure to light is caused by the common bread mold, Neurospora (Neurosp. Activating the transcription of many genes of ora) has been known for many years. these Some genes produce products that are enzymes essential to the carotenoid synthesis pathway. I will. A number of different gene mutants in this pathway (albino-1, -2 and And -3 or al-1, al-2 and al-3) are Hardin Harding, R.A. W. Et al.Plant Physiol. (1981)68: 745-749. Related to these mutations Genes are light-regulated, but 3 of the al-1, al-2 and al-3 mutants Genes related to all species have been cloned (Nelson, M . A. Et al.,Mol Cell Biol(1989)9: 1271-1276; Schmidhauser, T.W. J. Et al.,Mol Ce ll biol (1990)10: 5064-5070). The al-3 gene regulates the production of geranylgeranyl pyrophosphate synthetase You. Geranylgeranyl pyrophosphate is a precursor of carotenoids and xanthophylls Body. Previous studies have shown that the synthesis of this intermediate is regulated at the transcriptional level, And 30-minute pulse of light trigger transcription of three genes in carotenoid biosynthesis It was shown to increase synchronously by a factor of 15-45. Al-3 promotion using light Conditions for activating the promoter are described, for example, in Baima, S .; Et al.,J Photochem Photobiol B: Biol (1992)Fifteen: 239-251 are known as described. Regulates expression of genes encoding heterologous proteins in recombinant production systems It is often convenient to use appropriate coding sequences for the light-regulating promoter. Putting it under the control of a protein provides a simple and effective way to control expression. And will adapt its timing to the physiological condition of the host. Heretofore, this regulation has been used in expression systems associated with filamentous fungal hosts. Did not. The present invention provides such a regulation system.Disclosure of the invention The present invention relates to a heterologous fungal fungal protein that can be modulated by the presence or absence of light. And a protein expression system. These expression systems encode heterologous proteins Nucleotide sequence can be determined by pro-related to the al-1, al-2 or al-3 gene. Place under motor control. Advantageously, the expression system is dependent on the fungal host used. And further comprising a nucleotide sequence that will provide a selectable marker function Contained on the molecule. Thus, in one embodiment, the invention relates to al-1, al-2 or al. Coding for a heterologous protein operably linked to the -3 promoter Contains one nucleotide sequence and is optionally selectable in the selected fungus Further comprising a second nucleotide sequence that provides an efficient marker means. In another aspect, the present invention provides a filamentous form modified to include a nucleic acid molecule of the present invention. Fungi and methods for producing heterologous proteins by culturing these fungi About.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the al-3 promoter used to construct the plasmid of the present invention. 2 shows the nucleotide sequence of the insert. FIG. 2 shows the open reading frame (ORF) of the mtr gene under the control of the al-3 promoter. ) Transformed with various plasmids, including N. cras sa) shows the effect of light on the growth of cultures. FIG. 3 shows another form of the data of FIG. 2 in which dark growth is normalized. FIG. 4 shows the fresh culture of the untransformed strain as shown in FIG. The data obtained in a similar experiment is shown. FIG. 5 shows another form of the data of FIG. 4 in which dark growth is normalized. FIG. 6 is a schematic diagram showing the construction of pLRC. FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the chymosin open reading frame.Embodiment of the Invention The present invention provides an expression system useful when a filamentous fungus is used as a recombinant host. You. A "filamentous fungus" is a form of mycelium formed by a mass of overlapping, overlapping filamentous bodies. Means fungi. These branches may be interrupted by side walls, The passage of cytoplasm between the compartments is possible. Sexual and asexual reproduction in these fungi Both breeding occur. In asexual reproduction, spores known as conidia grow along the filamentous body. It occurs outside the tips of sprouting processes formed at various locations. Represented by filamentous fungi The families include algal fungi (Phycomycetes) and ascomycetes (Ascomycete). tes), Basidiomycetes and Incomplete Fungi (De uteromycetes). The most common families are Neurospora, Ko Aspergillus and Penicillium m). Particularly preferred hosts are Aspergillus nido ゥ Lance (A. nidulans), black Aspergillus (A. niger) and And Neurospora, especially Neurospora.Light-regulated expression system The nucleic acid molecules of the present invention can bind to nucleotide sequences encoding a heterologous protein. Using the functionally linked al-1, al-2 or al-3 promoter Includes expression system. Expression systems are typically provided with selectable marker means. You. The selectable marker means may be on a further vector or May be included in the nucleic acid molecule containing the expression system. Properties of selectable marker means Will depend on the nature of the host and the culture conditions. The expression system itself, as understood in the art, contains the necessary promoter Not only, but if desired, other features that assist in regulating expression, such as enhancers , Terminator sequences, polyadenylation sequences, and the like. Nucleus of known sequence The means for constructing such expression systems from acids are well understood and are well-known in the art. Maniatis et al.Molecular Cloning; AL ab oral Manual (1982); Gover, D .; N. Et al.,DNA Cloning: A Practical Approach(1 985) Volumes I and II and other standard textbooks generally available to experts Use conventional techniques as previously described in. Generally, the al-1, al-2, or al-3 promoter is the desired promoter for expression. It is operatively linked to a good coding sequence. Suitable coordinates The signaling sequence is an enzyme such as urokinase, tissue plasminogen activator Or collagenases; hormones such as human, bovine or chicken growth form , Follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, thyroid-stimulating hormone or human villi Gonadotropins such as gonadotropin, human, porcine or bovine insulin Insulin, ACTH, prolactin, etc .; pepti which mediates physiological functions E.g., atrial natriuretic peptide, erythropoietin, bradykini And brain natriuretic peptides; cytokines such as interleukin Immunoglobulins and their fragments; some poisons Elements such as ricin or diphtheria toxin; industrially important enzymes such as protein Enzymes, oxidases, peroxidases, etc .; receptor proteins such as toro Nutritional and structural proteins, such as Sulfur-rich proteins or collagen; growth factors such as TGFα and T GFβ, PDGF, EGF, IGF and FGF; and, generally, recombinant production Any protein for which a coding nucleotide sequence is desired For various proteins, including quality. Many of the desired proteins may be heterodimers; Numerous expression systems involving the promoter will be used. Heterodimer sub Both units may be produced by a single vector, or multiple vectors May be used for transformation. The construct secretes the desired protein into the medium, as is generally accepted. May be designed to provide a signal sequence to It may be produced intracellularly. If desired, the protein may be part of a fusion protein It can be later cut to produce the desired product You. In the situation described above, the promoter of the present invention is added to the desired coding sequence. Methods for functionally coupling are generally understood in the art.Selectable markers Since the filamentous fungal host needs to be modified to regulate the expression system of the present invention. It is desirable to include a selectable marker during the transformation protocol. chooseable Markers can be placed on the same vector as that containing the expression system of the present invention. Or another vector used to co-transform the host May be a part of. Proper selection of a selectable marker depends on the nature of the host. Will. A straightforward choice is, for example, antibiotics such as benomyl, to which the host is susceptible. Expression system that produces an enzyme that is responsible for antibiotic resistance to E. coli. Or an example For example, if a host is selected for nutritional deficiency, the deficiency can be Can be replenished. However, a suitable mutant to do so is is necessary. Mutants can generally be produced, but better studied species of filamentous fungi Has a number of projections that make the design of transformation vectors more diverse, including means for selection. Of course, mutants are preferred because they are readily available. For example, one pole for choice The easiest method is to use a mutant host that has a requirement for a particular nutrient, Here you can select by supplementing the deleted gene responsible for this nutritional requirement New marker means are provided. For example, growing in the absence of histidine When a mutant that cannot be used is used as a host, successful transformed cells Transformed cells containing the wild type of the gene missing in the mutant and on minimal medium Can be selected as a "marker" using a nucleic acid that causes the growth of Successful Only transformed cells will be able to grow in the absence of histidine. Culture medium Similar spikes that cause conditions dependent on the presence of other amino acids or other nutrients in the Naturally, mutations are also known. For example, in the case of Neurospora crassa, with a known mutant Thus, there are mutants with unique nutritional requirements. Useful nutritional requirements and it Examples of mutants related to (1) amino acids, for example, histidine (his-1 to -7 mutant), Phosphorus (aga mutant), arginine (arg-11 mutant), citrulli (Arg-11 mutant), asparagine (asn mutant), choline ( chol-1 and chol-2 mutants), cysteine (cys-1 mutation) Variant), glutamine (gln-1 mutant), leucine (leu-1 to -4) Lysine (lys-2, -4 and -5), methionine (mac mutant and Met-6, -9 and -10 mutants) and threonine (thr-2 and And -3 mutants); (2) a mixture of aromatic amino acids, for example, p-aminobenzoic acid, tyrosine, Mixtures of leptophane and phenylalanine (aro-6, aro-7 and required by all aro strains except aro-8), tryptophan and A mixture of phenylalanine (required for aro-mutants), isoleucine And valine mixtures (required for ilv-1, -2 and -3) and A mixture of phenylalanine and tyrosine (required for pt mutants); (3) Vitamins such as pantothenic acid (pan-1 mutant) and thia Min (thi-2 and thi-4 mutants); (4) Purine bases such as adenine (ad-2 to ad-4 and ad-8 Mutant), hypoxanthine (ad-2 and ad-3 mutants), inosine And guanine or guanosine (gua-1 or -2 mutant); (5) a pyrimidine base, for example, uracil (pyr-1 to pyr-6); (6) Saturated fatty acids (cel mutant) or unsaturated fatty acids, for example, Or C having a cis conformational double bond at position 11₁₆Or C₁₈Fatty acids in 9th place Fatty acids with double bonds in trans configuration and interrupted by methylene bridge Fatty acids with multiple cis double bonds (ufa-1 and -2); (7) physiologically important ions such as potassium (trk); (8) Sugar alcohols such as inositol (acu mutant and inl Mutant) and glycerol; and (9) Other organic substances, for example, acetate (ace mutant), α-ketoglutar Acid, succinate, malate, formate or formaldehyde (for sudden Variants), p-aminobenzoic acid (pab-1, -2 and -3 mutants) and There is a sulfonamide (sfo mutant at 35 ° C.). One specific example based on nutritional requirements is the enzyme ornithine transcarbamylase Arg B encoding⁺Is a gene. This enzyme is wild-type black aspergill Exist in Mutants lacking this enzyme (Arg B^-Strains) are usually non- Grow on arginine-containing media after specific techniques, for example, treatment with ultraviolet light Screen based on inability to grow on minimal media, along with ability It can be manufactured by doing. Fungi containing this genome are rgB⁺If it contains additional nuclei, they will grow on minimal medium. Other selectable markers include other disadvantageous culture conditions such as for toxins or high temperatures. Gives resistance to the matter. Harmful chemical ingredients that can exert toxic effects A specific example is acriflavine (generally acr-4 and acr-6). Together with the presence of the shg gene required for resistance, 3-amino-1,2,4-triazole (acr-2, atr-1, cp c, leu-1 or leu-2); dyes, e.g. Racite green (resistance conferred by acr-3); caffeine (caf -1); purine analogs (conferred by aza-1) Resistance to 8-azaadenine and 2,6-diaminopurine; by aza-2 To 8-azaadenine and 8-azaguanine given by Against 8-azaguanine and 6-mercaptopurine provided by -3 6-methylpurine conferred by mep (3) and mep (10) Cyanide (given by cni-1 during the first 24 hours of growth) Insensitive); tetrazolium (provided by cya-6 and cya-7) Resistance provided by cycloheximide (cyh-1, -2 and -3) Chromate (resistance provided by cys-13); 2-deoxy S-D-glucose (resistance provided by dgr); Edein (edr-1 And -2); ethionine (by eth-1, p- By nap in the presence of fluorophenylalanine and ethionine Is the D-form, the resistance conferred by oxD); -Fluorodeoxyuridine, 5-fluorouracil and 5-fluorouridine (Tolerance to all three types provided by fdu-2; ammonia-free small Resistance to 5-fluorouracil conferred by uc-5 in medium 5-fluorodeoxyuridine and 5-fluoro provided by ud-1; Resistance to Louridine, and fluorophenylalanine (under certain conditions) 8-azaadenine (mt conferred by fpr-1 to -6 in s); methyl methanesulfonate (insensitive to upr-1) Or minimally sensitive); surfactants, eg, dequalinium chloride, cetirium bromide Rutrimethylammonium and benzalkonium chloride (by sur-1 Conferred resistance); and metal ions such as vanadate (by van Given resistance). Further useful are various environmental conditions such as high or low temperatures, lack of oxygen (an Resistance given by lis-1, -2 and -3) Resistance, or absence of light, UV, ionizing radiation and high or low osmotic pressure poles A gene that confers resistance to extreme conditions. A number of strains are available from Fangal Genetics Stock Center (Fung) al Genetics Stock Center) (FGSC) Can be Other useful strains can be produced using known techniques. . For example, a strain having the characteristics of Black Aspergillus (ATCC 46951) Mutagenesis is induced by UV light to induce growth in defined minimal media. Can be produced by producing an isolate requiring arginine or arginine. it can. This strain lacks ornithine carbamoyltransferase, arg B (350 (-) 52). Black Aspergillus or Aspe The medium for growing Lugilus nidulans is Cove,Bi ochim Biophys Acta (1966)113: According to 51-56 It is described. However, genetics that confer resistance to toxic substances or other harmful culture conditions Other selectable marker systems, such as inclusion of offspring, can also be used. For example, Genes encoding proteins that confer antibiotic resistance are antibiotics Can be used when selection is performed on a medium containing. In the case of filamentous fungi, One such antibiotic is benomyl. A more complex system of selection involves the inactivation of endogenous genes that sensitize to toxicants. Be involved. For example, exemplified herein is p-fluorophenylalanine Confers sensitivity to (pfpa) or 4-methyltryptophan (4-MT) Selection by inactivation of the resulting endogenous mtr locus. Inactivation is in the mtr locus Homologous recombination occurs to disrupt its function. Homology in filamentous fungi Targeted recombination is well established. For example, Ash, D.A. K. La ,Mol Gen Genet(1990)221: 37-43; Ash, D . K. Et al.,Genetics(1992)130: 737-748 No. Another approach is to use an endogenous pmb gene that confers sensitivity to canavanine. Was to use the inactivation of the locus. For these selection methods, Select only homokaryon hosts. Filamentous fungi must be essentially single cytoplasmic. And any one of the nuclei may confer sensitivity. Fungi can survive in the presence of toxins if they contain Will not be able to. Thus, in one particularly preferred embodiment, the expression system of the invention comprises a mt It can be inserted into a vector that performs homologous recombination at the r locus. This place If not sufficient to provide a product of the mtr gene, The portion of the mtr gene that is sufficient to facilitate recombination is Is adjacent to the nucleotide sequence encoding the desired heterologous protein. This That provide mtr sequences such as The means for performing the exchange, and thereby the resistance to pfpa, are described in August 1, 1993. It is described in co-pending application Ser. Is currently published in PCT application WO 93/25663 and disclosed herein. Incorporated in the handbook. This application describes the desired protein In the coding system or protein expression system or both, in the mtr gene Homologous recombination of the vector with endogenous mtr to this toxin Vector that confers resistance to it, designated pXpress. Have been. Alternative systems that are more sophisticated in their design can also be used. An example For example, it contains a non-functional mtr gene (mtr) and additionally contains tryptophan. Functional mtr inheritance for transformation of double mutants that cannot be synthesized Using pups as markers and high concentration of arginine with tryptophan The selection can be made by culturing the transformed cells in a medium. Sudden change It is tryptophan because the variant requires tryptophan for growth. Must be transported from the medium. Two possible remains enabling transport of tryptophan There are gene products, ie, the mtr gene product and the pmg gene product. However, because arginine competes for pmg, tryptophan is It can be effectively transported only when a functional mtr gene is present. did Therefore, only successfully transformed cells were tryptophan with high concentrations of arginine. Will grow on minimal medium containing the supplements. So use this plan And the mtr gene sequence also co-products that repair nutrient deficiencies under defined conditions. You can make a selection by loading the code. Co-pending application reviewed above No. 08 / 105,448 and PCT Publication WO93 / 25663 The vector described herein also provides an mtr product for such a selection method. Can be operated as follows.Transformation and culture Standard techniques for transformation and cultivation of filamentous fungi are known in the art. Is well known. Extensive coverage of techniques such as those used for Neurospora crassa Barrel reviews are, for example, Davis and de Serres,Met hods Enzymol (1971)17A: 79-143. standard The method is generally used for strain maintenance and conidia production. Mycelium is typical Lambowitz et al.J Cell Biol(197 9)82: Propagation in liquid culture for about 14 hours (25 ° C.) as described in 17-31 Let it. The host strain generally comprises one or more suitable nutrients, for example, Thydin; arginine; phe, tyr and / or trp (each about 80μ g / ml); p-aminobenzoic acid (about 2 μg / ml); and inositol (about Vogel's or fleece supplemented with 0.2 mg / ml) (Fries) Can grow in minimal medium. Since the promoter of the present invention is regulated by light, culture is continued until expression is desired. The nourishment can be grown under dark conditions. The expression system is based on the harde cited above. Ring, R .; W. And Turner, R.A. V. ,Plant P hysiol (1981)68: 745-749, as described by By illuminating the culture with light containing blue wavelengths appropriate for such activation Can be activated. Once expression has been activated and the desired protein has been produced, one of skill in the art The protein can be recovered from the culture using generally accepted techniques. If the protein is produced intracellularly, lyse the cells, and Appropriate separation and purification procedures are followed. If the protein is secreted into the medium, Remove the medium and use conventional techniques such as size exclusion, ion exchange chromatography. Proteins secreted by chromatography, reverse phase chromatography, fractional centrifugation, etc. Can be purified. The appropriate protocol depends on the nature of the protein product. Will depend. If the protein is provided as a fusion protein, the protease site Release of mature protein appears to be a simple matter of treatment with the appropriate protease Is preferably inserted into the sequence.Example The following examples are intended to illustrate, but not limit, the invention. . Example 1 Construction of expression system and expression of model gene As a model system, the open reading frame (ORF) of the mtr Neurospora crassa gene was Placed under control of the al-3 promoter in plasmids designated RN and pALN. And the mtr gene itself can provide a selectable marker function Was transformed into Neurospora crassa under the following conditions. Red vectors using these vectors Transformation of P. mold results in excellent growth in the presence of light and mtr Enhanced production of mRNA encoding the gene product. The following is the construction and And expression. D. of Washington University in Seattle D. Obtained from Stadler Isolated strain of Neurospora crassa 82-59 (trp-2, mtr, cot-1, ylo- a) was used as host. This strain requires tryptophan for growth. And non-revertive mtr phenotype with a small deletion at site 1536 in the mtr ORF Having. Thus, this mutant grows in the absence of tryptophan Mtr functionality is not possible if there is excess arginine If it is not restored, it cannot grow in the presence of tryptophan. The host strain was 1X Vogel medium, 2% sucrose, 0.05 tryptophan. It was maintained on a conidial growth slope in medium containing mg / ml. By constructing two types of plasmids, the mtr ORF is controlled by the al-3 promoter. I've put it below you. pLRN is from Guisepppe of the University of Rome. From the M13mp18 vector provided by Macino, Inc. And Gene Clean II kit (Bio (Bio) 1011) containing the al-3 promoter gel purified. The 2 kb PstI / SalI fragment was replaced with the August 1993 cited above. US patent application Ser. No. 08 / 105,448 filed on the 12th and PCT WO Of 1 μg of plasmid pN846 described in detail in WO 93/25663. It was constructed by ligating to a PstI / SalI digest. al-3 promo The complete sequence of the insert containing the rotor is shown in FIG. Dr. Matino, transcription start site From -55 to -225, the portion responsible for light induction has already been identified. Incubate digested material with 400 U of T4 ligase at 15 ° C. overnight did. The ligation reaction mixture was treated with calcium chloride for colon Transformed into E. coli DH5A, and Inserts were screened using restriction digest analysis. The linear vector obtained from the PstI / SalI digest of pN846 contains m It provides a portion of the tr promoter, the entire ORF and the terminator sequence. This Ligation reaction of the fragment of E. coli with the 1.2 kb al-3 promoter fragment Puts the mtr ORF under the control of the al-3 promoter. The resulting vector Was named pLRN [named from light regulated neutral did]. Analogous vectors also incorporate an al-3 promoter with the complete mtr plasmid of pN846. Effectively placed 5 'of the insert, and thus 5' of the native mtr promoter. Manufactured. In this plasmid, the complete mtr promoter is at position 1336 Between the SalI site at positions １６1660, ie, the al-3 promoter and mtr It is located between the ORF. This plasmid was called pALN. Spheroplasts of strains 82-59 were prepared by the method of Volmer, S. et al. J. Et al.,Proc Natl Acad Sci USA (1986)83: 4 869-4873. Transformation Stuart, W.C. D. Et al.,Genome(1988)30: 1 88-203. Selection was performed with Vogel medium and FIGS (0.5% fructose, 0.2% Nositol, 0.5% glucose, 20% sorbose) as carbon sources. Arginine 0.1 mg / ml and tryptophan The reaction was performed in the presence of 0.01 mg / ml. Cultures were grown at 28 ° C. in the dark Incubated in incubator. Light conditions can be adjusted ・ Programmable timer (Micron Programmable) Timer) (Radio Shack, catalog number 63) -864) to cycle the light every 2 hours. Colony for 2 days Later scored and transferred to the high selection conidia growth medium on the slope. The existence of sorbose Below, Neurospora crassa is a colony that allows the isolation of single transformed cells. Take the phenotype. Minimum top agar (1 M sorbitol, 1X Vogel salt and 2. 8% Bacto agar) was added along with arginine 0.1 mg / ml. 4.6 x 10 cells⁶Transformation frequency per individual is based on pLRN and pALN. About 20 and 70, respectively. The homokaryon transformed cells were supplemented with an additional pfpa 0.05 mg / ml and Obtained by transferring conidia to a slope containing 0.05 mg / ml tranylic acid . (Anthranilic acid was added to prevent the trp-2 mutation; tryptophan Addition of the fan may have caused competition with pfpa for the transport system . ) These were tested for sensitivity to pfpa in the presence of light. Light sensitivity Show The conidia suspension of the colonies that were grown was arg 0.1 mg / ml and trp 0.0 Plating on the above high selection medium containing 1 mg / ml for homokaryon transformation Cells were isolated. Plating and re-streaks are one to pfpa in light. Repeated until a sensitivity of 00% is obtained and successful growth on high selective medium Was observed. This ensures homokaryon isolation. The resulting homokaryon was examined for the effect of light on conidial growth. pf supplemented with 0.015 mg / ml pa and 0.05 mg / ml anthranilic acid Conidia in liquid Vogel minimal medium (1X Vogel salt and 2% sucrose) Inoculate 30,000 or 60,000 and in light and dark And cultured at 28 ° C. for 5 days. The fungi are then collected by filtration and the cell mass The dry weight was measured. Wild type strain 74a was used as a control. The results are shown in FIG. If growth in light is normalized to 1 mg, these Another form of the result is shown in FIG. As expected, wild-type strain 74a has a pfp a is always sensitive and therefore does not proliferate. Non-transformed strain 82-5 9 is relatively resistant to pfpa because it has a non-revertive mtr phenotype It is. The selected homokaryons retain their mtr phenotype in the dark However, in light, the mtr genes are expressed and are sensitive to pfpa toxicity. To show greater differences between light and dark growth. Therefore, shown As can be seen, a large number of transformed strains showed a greater increase when compared to the parent strain 82-59. It showed great light sensitivity. This experiment was performed using fresh culture of non-transformed strain 82-59. Iterative repetition was used to obtain a result similar to that shown in FIG. 4; FIG. 5 shows the standardized results. Transformed pLRN13-1 has the largest difference between light and dark conditions. Was selected for further studies. Messenger RNAs from pLRN13-1 and 82-59 were found in Northern -Blot analysis was performed and probed with 1050 bp of mtr ORF . The result of pLRN13-1 shows that the mRNA hybridized with the probe in the presence of light. It showed a high level of formation of padding, but very little in the dark. Strain 82-5 9 showed no production of mtr mRNA under either condition. Therefore, using the mtr coding sequence as a model system, ORF expression system can be regulated as a function in the presence of light . Example 2 Expression of mammalian genes The mammalian gene encoding chymosin was transformed into al-3 as shown in FIG. It was placed in an operably linked state with the promoter. A 1 μg sample of the 6.6 kb plasmid pLRN was digested with SalI and Purified. SalI cuts between the al-3 promoter and the mtr ORF You. The chymosin gene was obtained from Berlex Biosciences (Berlex Bi). XhoI and cDNA chymosin clones obtained from And released by Sail and gel purified. D encoding chymosin The NA sequence is shown in FIG. ORFs range from 72nd ATG to 1218th TGA It has spread. The chymosin ORF is an intermediate p with the chymosin ORF immediately downstream. In the appropriate orientation in the truncated vector to give CLRN, as well as the al-3 promoter. Linked functionally to and directly upstream of the mtr ORF Was done. Proper insertion was demonstrated by restriction analysis. pCLRN to HincI I and digested again with 400 U of T4 ligase. this Lacks about 1.1 kb of the mtr ORF. The obtained 6.6 kb plus The mid was designated pLRC. Therefore, pLRC is not sufficient for performing homologous recombination. Under the control of the al-3 promoter adjacent to the non-functional portion of the mtr ORF Includes chymosin expression system. Host spheroplasts were strains His-3 TM428A, FGSC4438. Obtained from. This mutant will only grow in the presence of histidine And modifies histidine biosynthesis containing the his gene and obtained from FGSC. The reversible plasmid pNH60 was used for co-transformation selection. Transformations were performed as described above with 10 μg of pLRC DNA and pNH60 DN A2 μg was used. Transformed cells may be supplemented with amino acid supplements as described above. Lower layer plate made using Vogel's medium and FIGS in the absence And upper layer agar. As a result, 44 transformed cells were isolated. Was done. Each was inoculated into 1X Vogel containing 2% sucrose broth. And incubating the culture for 7 days at 28 ° C. in a constant 2 hour photoperiod Was. For 41 transformants, 1 ml of the liquid medium was added to a minifold (Mini). fold) -II slot blot system on MSI-loaded nylon membrane Blotted. Filter with TBS (20mM Tris-HCl, 500m M NaCl) and 10 mM EDTA, pH 8.0, and Incubate for 30 minutes at 70 ° C to inactivate endogenous alkaline phosphatase I let it. The filter is rinsed in TBS and washed with 10% nonfat dry milk in TBS Blocking was performed at 37 ° C. for 1 hour. Remove the blocks and remove the 1 in 5% skim milk TBS : Add primary antibody (rabbit anti-prochymosin) at 5000 dilution and mix 3 times Incubated for 1 hour at 7 ° C. Remove the filter, 0.05% tween (TWEEN) Washed twice (5 minutes) in TBS (TTBS). Secondary antibody (Y (Rabbit anti-rabbit alkaline phosphatase conjugate) at a final concentration of 0.24 pg / ml. And incubated for 1 hour at 37 ° C. Wash and manufacture filters The color substrate was added according to the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim Zinniaski) (Boehringer Mannheim Genius Kit)) 45 μl of 75 mg / ml nitro blue tetrazolium salt, 100 mM Tris- 50 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3 diluted in 10 ml HCL -35 μl of indolyl phosphate, 100 mM NaCl and 50 mM MgCl_Two PH 9.5). The results showed that 27 out of 41 transformed cells produced chymosin. . However, six of these producer cells were selected and SDS PAGE No chymosin was detected when assayed by (Western blot). The experiments were performed using the three selected strains and in the light cycled as described above. The culture was repeated at 28 ° C. for 9 days and repeated. 450 μl of liquid medium was added to various concentrations of 0. Treatment with 5-2 M KCl to release the protein from the cell wall, and Analysis was performed by the slot blot method described above. In addition, some cultures Treated with 50 μg / ml team to reduce swelling and dissolution of the mycelium apex Awake. Slot blot analysis of each of these treated cultures It showed higher detection of syn.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:66） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続き Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI (C12P 21/02 C12R 1:66) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES) , FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD) , TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, FI, GE, HU, JP, KG, KP, KR, KZ, LK, LT, LV, MD, MG, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SI, SK, TJ, TT, UA, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. First nucleotide sequence encoding a heterologous protein in filamentous fungi A nucleic acid molecule for expression of a sequence, comprising the al-1, al-2 or al-3 promoter. The first coding sequence operably linked to the A second nucleotide sequence that provides a selectable marker means in the fungus The nucleic acid molecule as described above. 2. The second nucleotide sequence is present and this is a part of the fungal chromosome By altering the chromosome to provide a selectable marker means 2. The nucleic acid molecule of claim 1, which promotes homologous recombination of said nucleic acid molecule. 3. 3. The nucleic acid molecule of claim 2, wherein said second sequence is adjacent to said first sequence. . 4. 3. The method of claim 2, wherein said second sequence corresponds to at least a portion of an mtr locus. 3. The nucleic acid molecule according to claim 1. 5. The second nucleotide sequence is present and is selected for the fungus. 2. The nucleic acid molecule of claim 1, which encodes a protein that confers selectable properties. 6. Claims wherein said selectable property is provided by a product of the mtr gene. Item 6. A nucleic acid molecule according to Item 5. 7. 2. The method of claim 1, wherein said first sequence encodes chymosin or relaxin. A nucleic acid molecule as described. 8. A filamentous fungus modified to include the nucleic acid molecule of claim 1. 9. The method according to claim 8, which is a species of Neurospora. Fungi. 10. A method for producing a heterologous protein for a filamentous fungus, comprising the steps of: Culturing the host fungus according to 1. under conditions in which said heterologous protein is produced; and Such a method, comprising recovering the heterologous protein from the culture.