JPH0356425A - 制癌性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、β配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸に
対して特異性を有するモノクロナール抗体を有効成分と
して含む制癌性組戊物に関する。

〔従来の技術〕

１９７５年にケーラーほか（　Ｋ６ｈｌｏｒ　ａｎｄＭ
ｉｌｌｓｔｅｉｎ　）は均一な特異性及び性質を有する
抗体のはり無限量の生或を可能にする雑種細胞（ハイブ
リドーマ）を用いる単クａ−ン性抗体を製造する方法を
導入した。

抗体は、抗原として知られる他の分子との桔合およびそ
れを認識する能力を有するタンパク質である．単クロー
ン性抗体は他の抗体と異ならないが、しかしそれらはそ
の性質が非常に均一であり、ただ１種の抗原または抗原
決定基を認識する。この様な単クローン性抗体およびハ
イブリドーマを生或させる多くの技術は、「単クローン
性ハイブリドーマ抗体：技術および適用（Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　：　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃ
ａＬｉｏｎｓ）　Ｊ　　（　ハレル（　Ｊｏｈｎ　　Ｇ
．　Ｈｕｒｒｅ目）編、１９８３）により証明されるよ
うに今日普通である。

一方、Ｎ−アセチルノイラミン酸は複合糖質の糖鎖末端
に存在し、種々の重要な生物学的機能を担っている事が
知られている．近年、悪性腫瘍にβ配位を有するＮ−ア
セチルノイラミン酸を含む新規な糖鎖性癌抗原の存在が
示唆されその意義が注目されている． したがって、β配位Ｎ−アセチルノイラミン酸に対して
特異性を有するモノクロナール抗体を含む組成物が、癌
治療等の目的から期待されていた．これら複合糖質に対
するモノクロナール抗体のうち、これまでにＮ−アセチ
ルノイラミン酸を含む部位をエピトープとするモノクロ
ーナル抗体が多く得られているが、これらはいずれもα
配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸と反応するもの
のβ配位を有する．Ｎ−アセチルノイラミン酸と反応し
ないので、これらはいずれもβ配位を有するＮ−アセチ
ルノイラミン酸をＦ！　！Ｉｉ結合する能力を持たず、
癌治療の目的で使用することはできなかった． 〔発明が解決しようとする課題〕 したがって本発明の目的は、β配位Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸をエピトーブ（抗原決定基）とするモノクロナー
ル抗体を有効成分として含む制癌性組威物を提供するこ
とにある． （問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記問題点に鑑み、β配位のシアル酸化
合物を化学合成し、これを免疫原としてモノクロナール
抗体を作成し、該モノクロナール抗体が癌細胞に対して
特異的に反応し、正常細胞とは反応しないことを明らか
にし、本発明を完戒するに至った。

すなわち、本発明は、エピトープ（抗原決定基）として
β配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸に対して特異
性を有するモノクロナール抗体を有効戒分として含む制
癌性ｍ戒物を提供するものである。

本発明についてさらに詳細に説明する。

本発明の組戒物に含まれるモノクロナール抗体を産生ず
るハイブリドーマは、ケーラー等の方法、すなわち、抗
原を動物に免疫して得られるＢ細胞（リンパ球）と骨髄
腫細胞とを細胞融合させることにより調製される。ここ
で、本発明のＭｉ戊物に含まれるモノクローナル抗体を
作成するための「抗原」としては、β配位を有するＮ−
アセチルノイラミン″酸誘導体である， 以下、それらの化合物の具体例を挙げる。

丑Δど肘 一鳳ニュＬ二え− （Ｂ） （Ｃ） 次に本発明の組底物に含まれるモノクローナル抗体に抗
原特異性を示さないα配位を有するＮ−アセチルノイラ
ミン酸誘導体の具体例を以下に示す． （Ｈ） ０Ｈ （Ｊ） ０Ｈ υ目 該ハイブリドーマから産生されるモノクロナール抗体は
上記β配位のシアル酸をエピトープ（抗原決定基）とし
て認識し、特異的に反応する。したがって、該ハイブリ
ドーマから産生されるモノクロナール抗体はβ配位を有
するＮ−アセチルノイラミン酸およびその誘導体であれ
ばいずれのものでも高い特異性を有する． まず、上記した抗原をマウスの筋肉、皮下、腹腔内に免
疫する。この免疫の際、アジュバント、すなわち免疫増
強剤としては、不完全アジェバントまたは完全アジュバ
ントのいずれも使用でき、例えば、油、乳化剤、結核死
菌、サルモネラ死菌およびこれらの混合物、好ましくは
サルモネラ・ミネソタ死菌が使用できる． 次に、上記で得られたＢ細胞とミエローマ細胞とを細胞
融合する。

ここで、融合剤としては、ポリエチレングリコール、Ｈ
ＶＪ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール
４０００である． また、培養液としては、ハイブリドーマ細胞とミエロー
マ細胞とを選択するためＨＡＴ培地を使用するのが好ま
しい。さらに、得られたハイブリドーマをクローニング
？去、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、ま
たは限界希釈法を用いて単一クローンを分離する。

かくして得られたモノクロナール抗体産生ハイプリドー
マについて、常法にて抗体価をチェノクし、抗体価の大
きいハイプリドーマを選択して保存する．＝亥ハイフ′
リドーマはアメリカンタイフ゜カルチャー　コレクショ
ンに寄託されており　（受託番号ＨＢ９６１９　　ＡＴ
ＣＣ）、何人も入手可能である。

この様にして得られたモノクローナル抗体は、癌細胞を
抗原として認識することができ、その結果制癌作用を有
する。癌細胞と該モノクローナル抗体の反応は癌細胞、
例えばＰＣ−１０（肺癌由来の可移植性腫瘍株’）　、
ＹＴＳ−１　　（ヒト膀胱癌）等を用いたＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ法（酵素免疫測定法）、抗体依存性、細胞障害試験、
免疫吸着試験等により明らかにされた。

本発明の制癌性組戒物は上記のモノクローナル抗体を有
効成分として含む。該モノクローナル抗体を乾燥粉末状
とした後、種々の添加剤、例えばｐＨ調節剤、キレート
剤、安定剤、溶解補助剤等を加えて本発明の組成物を得
てもよいが、これらを添加した該モノクローナル抗体溶
液を凍結乾燥等の手段により粉末状の組成物としてもよ
い。これらの添加剤は通常２０〜９０重量％で含まれる
．本発明の制癌剤組成物を癌治療の目的で患者に投与す
るには、動脈内、静脈内注射、筋肉内、皮下注射、及び
点滴による全身投与の他、癌Ｍｉ織内あるいはその近傍
に局所投与してもよい。

本組成物は胃癌、肺癌等の固型癌の他、白血病等の血液
癌にも有効である。投与量は投与経路、治療目的とする
癌の種類により異なるが、該モノクローナル抗体として
１回０．　１〜５００■、１日０．　１〜２０００■で
ある． （発明の効果） 本発明の制癌性Ｕ或物に含まれるモノクローナル抗体は
、β配位Ｎ−アセチルノイラミン酸に特異的に反応する
ことができるので、癌細胞に対して極めて特異的に集合
して制癌作用を発揮することができる。又、他の制癌剤
等と結合させて夕一ゲソティング療法に利用することも
可能である。

参考例 （１１ヒム　（Ａ）の合　法 ３−０−（メチル（５−アセタシド−４．７８，９−テ
トラー０−アセチルー３．５−ジデオキシーβ−Ｄ−グ
リセローＤ−ガラクトー２−ノ二二ロピラノシル）オネ
ート）−１．２−ジー○−テトラデシルーＳｎ−グリセ
ロールをメタノールに溶解後、室温下ＩＮ一水酸化ナト
リウムで加水分解した．得られた反応生戒物をアンバー
ライトにて中和後、逆相カラムクロマトグラフィーによ
り精製を行い化合物（Ａ）を得て免疫原とした。（特開
昭５９−１６４７９８号参照） （２）大狡勉貰 ５匹のメスの６週令Ｂａｌｂ／ｃマウスを空調室にて７
日間飼育したものを実験に使用した。

（３）五見五艷四Ｕ乳裂 化合物（Ａ）１■とアジュバントとして酢酸処理したサ
ルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａｍｉｎｅ
ｓｏｔａ）　　Ｒ　５　９　５　　４　ｍｇとをリン酸
緩ｉＪｉ生理食塩水（ＰＢＳ　（−）　）　　ｌ　　に
て混合して抗原冫容冫夜とした。

（４）培　地 培地：ニノスイＲＰＭＩ１６４０を使用した。

使用時にペニシリンＧカリウム１　０　０　Ｕ／ストレ
プ１−マイシン硫酸塩ｔｍｇ力価／　、ヒ゛ルビン酸ナ
１・リウム１ｍＭ、牛胎児血清（Ｆｌ３Ｓ）を１０％と
ずる様添加した。

ＨＡＴ培地：チξジン０．　０　３　８　８　ｇとヒボ
キサンチン０．　１　３　６　１　ｇとを蒸留水１００
　　に加熱融解し、１００倍濃度の保存溶液とし−２０
℃で保存した。同様に０．０１７６ｇのアミノプテリン
を蒸留水１００　　に少量のＩＮ水酸化ナトリウム水溶
液を加えて溶かし、これをＲＰ旧１６４０培地にて１０
培に希釈し、１００倍濃度の保存液として−２０’Ｃで
遮光して保存した。

使用時には、１０％ＦＢＳＲＰＭ＋　１　６　４　０培
地にそれぞれ１／１００量ずつ加え、ＨＡＴ培地とした
。

また、ＨＴ培地としては、チミジンおよびピボキサンチ
ン保存液のみをｌ／ｌｏｏｆｆｉ加え使用した． 《５》葺豊胆 細胞融合を行う際の親細胞としては、Ｂａｌｂ／Ｃマウ
ス由来のミエローマ細胞であるＸ６３＾ｇ　８−６．５
．３細胞を使用した。この細胞をｌＯ％ＦＢＳ添加ＲＰ
ＭＩ　　１６４０培地により継代を行い、培地に６−チ
オグアニンを３μｇ／の濃度となる様に加える事により
突然変異体の出現を阻止した。

（実施例） （イ）ハイブリドーマの製造 （１）免炎広 メスの６週令Ｂａｌｂ／ｃマウスを、免疫原として化合
物（Ａ）１■とアジュバントとしてサルモネラ・ミネソ
タ４■とをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ　（−）　、
Ｃａ　．．Ｍｇを除いた）１ｍｌにて混合し、適宜希釈
したのち、前記マウスの腹腔内に初日５μｇ、１２日目
１０μｇ、１６日目１０μｇ、２６日目１５μｇ，３５
日目１５μｇの免疫スケジュールで免疫した。３回目の
免疫後、牌細胞リンパ球をマウスから取り出し、次に単
一細胞の懸濁液をつくった。

（２）旦艷紋金広 上記で得られた牌細胞リンパ球と前記親細胞のマウスミ
エローマ細胞との細胞融合をケーラーおよびミルシュタ
イン（　Ｋ６ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ）の方法
に従って実施した。すなわち、最終免疫してから３日後
にｌＯｓ個の牌細胞リンパ球を、培地中で５０％のポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ４０００）の存在下で、１
０’個の骨髄腫細胞と融合した。

（３）ハイブリドーマの　　および 細胞融合後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ保存
液及び１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地
中で１５日間培養した。

１５日間培養した後、この培養液の上清を酵素抗体法を
用いて化合物（Ａ）に対する抗体産生についてスクリー
ニングした。

伍 （１１酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法） ９６穴平底プレート（ファルコン社製）をエタノールで
前処理して実験に使用した。濃度２％としたＮ−アセチ
ルノイラミン酸誘導体のエタノール溶岐５０μｌを各プ
レートに分注し華発させたｊ麦、０．２％カゼインｐＢ
ｓ　（−ｚ容冫反２００μｌを加え２時間室温に放置し
た。溶液を吸引除去後、一次抗体としてハイブリドーマ
培養上清を５０μｌ加え室温に１時間放置した。

同様にしてプレートから一次抗体を除きＰＢＳ（−１／
８液１５０μｌを加え３回ウェルを洗浄した後に０．　
２％カゼインＰＢＳ（−）瘤液２００μｌを加え３０分
間放置した。この溶液を除いた後に０，２％カゼインＰ
ＢＳ　（−）にて至ｉ！！濃度に希釈した２次抗体５０
，ｃｌ！を加え室温で１時間３０分放置した。一次抗体
と同様二二ＰＢＳ（＝）で３回ウェルを７先浄し反応｝
容液１００μｅをウェルに注ぎ暗所にて反応させた。反
応冷ｃ夜はクエン酸−リン酸緩衝Ｍ（ｐ｝Ｉ＝５）にオ
ルトフェニレンジアミン、過酸化水素水の最Ｐ：？７５
　度が０．４■／　　、０．０１％となる様調製し実験
に使用した。反応は８Ｎ硫酸を３０μｅ加えて停止させ
、４９０ｎｍの吸収波長にて比色測定を行った。２次抗
体としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ　Ｒ　Ｐ）
標識ヤギ抗マウスＩｇ　　Ｇ、Ｍ，Ａ抗体を使用した。

この方法により、β配位を有する化合物Ａ〜Ｆおよびα
配位を有する化合物Ｈ−Ｊについて調べ、第ｌ図〜第３
図の結果を得た。

第１図および第２図はそれぞれβ配位を有するＮ−アセ
チルノイラミン酸を含有する化合物を抗原として使用し
、抗化合物（Ａ）抗体との交叉反応について調べたもの
である。

この結果からβ配位を有する化合物はすべて陽性である
ことが判る。

また第３図はα配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸
を含有する化合物を抗原として使用し、同様に交叉反応
性について調べたものである。

この結果からα配位を有する化合物はすべて陰性である
ことが判る。

（ハ）制癌性組成物の調製 上記の様にして得られたハイブリドーマを培養後Ｂ　Ａ
　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス腹腔に移植し、腹水を採取した。そ
の腹水から該モノクローナル抗体をカラムクロマトグラ
フィーで単離精製した。

精製されたモノクローナル抗体を１０ｍｇ／ｓ＋１とな
る様にＰＢＳに溶解し本発明の制癌性組或物を得た。

（二〉癌細胞を抗原としたＥＬＩＳＡ法９６大のマイク
ロプレートに１．ＯＸ１０’／ウエルの細胞をコートし
、ＲＰＭＩ　　１６４０＋ＥＣＳ　１　０％培地中で２
日間培養した。その後ＰＢＳ　（−）で２回ウエルの洗
浄を行った。

０．２５％グルタルアルデヒド（ＰＢＳ　（−）中）を
１００ｍｌ／ウエルで添加し、室温で２時間処理した。

ＰＢＳ　（−）で２回洗浄した後、０．２％カゼインー
ＰＢＳ（−）を２００μｌ／ウエル加え、４℃でｌ晩処
理した。上記の抗体をｉｏ−ｔｏｈの１０倍希釈を行な
い５０μｌ／ウエルで添加し、３７℃で１時間インキユ
ベートした。その後０．２％力ゼイン−ＰＢＳ　（−）
で３回洗浄した。ベルオキシダーゼ標識２次抗体（ヤギ
抗マウスＩ　ｇＧ，Ｍ．Ａ）を２０００倍に希釈し、５
０μｌ／ウエルで添加し１時間インキユヘートした。そ
の後０．２％力ゼインーＰＢＳ　（−）で３回洗浄した
。基質溶液（ｏ−フエニレンジアミン４　０　０　μｇ
／ｍｌ，　０．　０　１％Ｈ２０，、クエン酸緩衝液中
：ｐ｝ｌ＝５．０）を１００μｆｌ／ウエルで添加し、
５分間反応後４　Ｎ　ＬＳＤ４を加えて反応を止め、４
９５ｎｍにおけるＯＤを測定した。

抗体価の判定方法は、まず細胞（＋〉及び（一）のウエ
ル毎に一次抗体なしのウエルを設定しくバックグラウン
ド〉、このバックグラウンドを細胞（＋）、（−）ごと
にそれぞれ全ウエルから差し引いた。その後に、細胞（
＋）ウエルー細胞（一）ウエルの値が０．　１以上を有
意差とみなし、この有意差を持つ最大希釈倍率を当該細
胞に対する抗体価とした。結果を第４図及び第５図に示
す。本結果から該抗体が癌細胞と反応することが明らか
である。

（ホ）正常細胞との反応性 ９６穴Ｕ底プレート上で、上記モノクローナル抗体を１
０〜３１２５００倍に５段階希釈した。各希釈抗体の入
った上記のウェルに正常ヒト赤血球０．５％（ｖ／ｖ）
（ＰＢＳ溶液）を添加した。４℃で１時間静置した後、
肉眼にて凝集性の反定を行った。結果を第１表に示す。

本モノクローナル抗体はいずれもｌＯ倍希釈した場合に
各細胞との親和性を示さなかった。この結果より本モノ
クローナル抗体は癌細胞に特異的に反応し、正常細胞に
は反応しないことがわかった。

第１表

【図面の簡単な説明】

第ｌ図〜第３図は酵素抗体法によるβ配位Ｎ一アセチル
ノイラミン酸各種誘導体との交叉反応を示し、第４図は
本発明の制癌性組戊物に含まれる抗体と癌細胞ｐｃ−ｔ
ｏの反応を示し、第５図は 同様に癌細胞ＹＴＳ−１との反応を示す。 第 １ 図 （ｕ９） Ｏ，Ｄ 第２図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. エピトーブ（抗原決定基）としてβ配位を有するＮ−ア
   セチルノイラミン酸に対して特異性を有するモノクロナ
   ール抗体を有効成分として含む制癌性組成物。