JPH0349685A - 新規ｄｎａ鎖およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く技術分野〉 本発明は、有用生理活性物質等の細菌宿主による菌体外
分泌生産を可能にする新規なＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ
鎖を用いた有用生理活性物質の分泌生産法に関する。

く先行技術〉 現在、組替えＤＮＡ技術によって遺伝子Ｔ学的に有用生
理活性物質を生産する際に、宿主微生物に該生理活性物
質を分泌生産させるための方法が種々考案されている。

特に、大腸菌等を宿主とする場合には、遺伝子産物に大
腸菌の内膜を透過させるために各種のシグナル配列を利
用する試みがなされているが（特開昭６１−３７０９９
、特開昭６１−１３５５９９、特開昭６１−１４９０８
９、特開昭６１−２８２０８４、特開昭６２−５５０８
７および特開昭６２−１５１１９３号各公報参ｊｊ４０
、多くの場合遺伝子産物はべりプラズム画分にとどまり
、完全な菌体外分泌が達成される例はまれである。ペリ
ブラズム画分の遺伝子産物に外膜を透過させるためには
、大腸菌のコリシン遺伝子鮮の一つであるｋｉｌ遺伝子
を利用する方法が考えられている（特開昭６１−１５８
７９０号公報、日本農芸化学会誌６２巻、１１号、１６
１９−１６２８頁、１９８８）。ｋｉｌ遺伝子の完全な
発現は、宿主に致死的効果を及ぼすことが知られており
、耐性変異株の取得が試みられている（特開昭６３−２
０２３７５号公％ｌ）。

〔発明の概要〕

く要　旨〉 本発明は、細菌宿主が生産する蛋白質もしくはポリペプ
チドを菌体外に分泌する能力を与えるような新規のＤＮ
Ａ鎖を提供すること、およびこのＤ　Ｎ　Ａ　＃ｊｌを
用いて所望の蛋白質もしくはポリペプチドを菌体外（培
地中）に分泌させる所望の蛋白質もしくはポリペプチド
の分泌生産法を堤供することを目的とし、大腸菌等の細
菌宿主に対して遺伝子産物の菌体外分泌生産を促進する
因子を広く（ＮＣＩ８　１１０３８）由来のＤＮＡ断片
がこの目的を可能とすることを見出し、この知見をもと
に本発明を完或するに至った。

すなわち、本発明によるＤＮＡ鎖は、アミノ酸配列が実
質的に第１図に示されているＡからＢまでのものである
ポリペプチドをコードする塩基配列を有すること、を特
徴とするものである。

また、本発明による所望の蛋白質もしくはポリペプチド
の分泌生産法は、宿主細菌細胞の内股透過のためのシグ
ナル配列をコードする部分および所望の蛋白質もしくは
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分を含むＤ
　Ｎ　Ａ　ｆｌ、ならびに請求項１記載のＤＮＡｖｉに
より宿主細曲を形質転換し、該形質転換体を培養するこ
とにより所望の蛋白質もしくはポリペプチドを培地中に
分ｌ必させること、を特徴とするものである。

〈効　果〉 本発明によるＤＮＡ鎖は、これを細菌中て允現させるこ
とにより、宿主細菌のべリプラズム蛋白質を菌体外に分
泌生産させることができる。

従って、本発明ＤＮＡ鎖および有用生理活性物質の遺伝
子（宿主細菌細胞の内膜透過のためのシグナル配列をコ
ードする部分を備えたもの）を、細菌宿主中で発現させ
ることにより、従来細曲細胞のべリブラズムまでは分泌
されても菌体外にほとんどあるいは少量しか分泌される
ことがなかった所望の種々の有用生理活性物質も、菌体
外に分泌生産されるようになり、これらの生理活性物質
を培養液中に得ることが可能となる。

〔発明の具体的説明〕

ＤＮＡ鎖 く本発明ＤＮＡ鎖〉 本発明によるＤＮＡ鎖は、アミノ酸配列が丈質的にｍｌ
図に示されているＡからＢまでのものであるポリペプチ
ドをコードする塩基配列を有するものであり、本発明Ｄ
ＮＡｆｉの遺伝子発現産物は、宿主細菌細胞においてベ
リプラズムまで分泌されたタンパク質の菌体外への分泌
促進作用（以後、菌体外分泌促進作用ともいう）を有し
ている。

ここでｒＤＮＡ鎖」とは、ある長さを有するボリデオキ
シリボ核酸鎖を意味するものである。そして、本発明で
は、このｒＤＮＡ鎖」は、それがコードするポリペプチ
ドのアミノ酸配列によって特定されているところ、この
ポリペプチドは上記のように有限の長さのものであるか
ら、このＤＮＡ鎖も有限の長さである。しかし、このＤ
ＮＡ鎖は、上記菌体外分泌促進作用を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含んでいてこの遺伝子の発現が
菌体外分泌促進に有用なものであるところ、この有限の
長さのＤ　Ｎ　Ａ　Ｍｉのみによってこの遺伝子が発現
するわけではなく、その５′−側上流および（または）
３′　〜側下流に適当な長さのＤＮＡ鎖が結合した状態
でこの遺伝子の発現が可能となる訳である。従って、本
発明で「ＤＮＡ鎖」というときは、この特定の長さのも
の（第１図の対応アミノ酸配列でいえば、Ａ−８の長さ
）の外にこの特定の長さのＤ　Ｎ　Ａ　給を構成員とす
る鎖状または環状Ｄ　Ｎ　Ａ　饋の形態にあるものを包
含するものとする。

本発明によるＤＮＡ鎖の存在形態のうち代表的なものは
、このＤＮＡ鎖を構或員の一部とするプラスミドの形態
ならびにプラスミドとして細菌、特に大腸菌、中に存在
する形態、である。本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい存
在形態の一つとしてのブラスミドは、パッセンジャーな
いし外来遺伝子としての本発明のＤＮＡ鎖と、細菌中で
安定に存在して複製可能なプラスミドベクターとプロモ
ーターとを一体に結合させたものである。プラスミドベ
クターおよびプロモーターとしては公知のものを適宜組
み合わせて用いることができる。適当なプラスミドベク
ターおよびプロモーターとしては、後記したところを参
照されたい。

くこの遺伝子がコードするポリペプチド〉上記のように
、本発明によるＤ　Ｎ　Ａ　ｊｆｌは、これがコードす
るアミノ酸配列によって特定されている。このポリペプ
チドは、宿主細菌細胞のべリプラズムタンパク質の菌体
外分泌促進作用を灯していて、アミノ酸配列が実質的に
第１図に示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまで
のものである。ここで「アミノ酸配列が実質的に第１図
に示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでのもの
」ということは、このペブチドが該分泌促進作用を有す
る限りアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加な
どがあってもよいことを示すものである。

本発明での典型的な菌体外分泌促進作用を６゛するポリ
ペプチドは、第１図のアミノ酸配列のうちＡからＢのも
のであって、７６個のアミノ酸からなるものであり、従
来そのアミノ酸配列は知られていなかったものである。

なお、本発明において菌体外分泌促進が起こる機構は明
らかではないが、少なくとも、ＡからＢのアミノ酸配列
のポリペプチドが発現すれば曲体外分泌促進が起こると
言える（後記参考丈験例参照〉。

＜ＤＮＡ鎖の塩基配列〉 本発明ＤＮＡ鎖は、第１図のＡ−Ｈの塩基配列を持つも
のまたはその縮重異性体並びに上記のような菌体外分泌
促進作用を有するポリペプチドのアミノ酸配列の変化に
対応する塩基配列を持つものまたはその縮重異性体、で
ある。ここで「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいて
のみ異なっている同一のポリペプチドをコードすること
のできるＤＮＡ鎖を意味する。たとえば第１図のＡ−８
の塩基配列を持つＤＮＡ鎖に対して、そのアミノ酸のど
れかに対応するコドンたとえばＣ一末端から２番目のＥ
に対応するコドン（ＧＡＧ）が、これと縮重関係にある
たとえば（ＧＡＡ）に変わったものを本発明では縮重異
性体と呼ぶものとする。

本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具体例は、３′−末端
に接して停止コドン（例えばＴＡＡ）を少なくとも１個
を持つものである。さらに、本発明の５′　一側上流お
よび（または）３′　一側下流には、非翻訳領域として
のＤＮＡ鎖（３′　一側下流の最初の部分は、ＴＡＡの
ような停ＩＬコドンであることがふつうである）がある
長さで続いていてもよい。

なお、第１図に示したＤＮＡ鎖の塩基配列は、Ａｃｈｒ
ｏｍｏｂａｃｔｏｒ　　ｌｏｐｈａｇｕｓ（ＮＣＩＢ　
１１０３８）より分離した菌体外分泌促進作用を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子について、ダイデオキ
シ法によって決定したものである。

＜ＤＮＡ鎖の取得〉 本発明によるＤＮＡ鎖、すなわち上記菌体外分泌促進作
用を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有するＤ　Ｎ　Ａ　消を取ｉリする一つの手段
は、核酸合戊の方広に従ってその消長の少なくとも一部
を化学含戊することである。

＾ｃｈｒｏｓｏｂａｅｔｏｒ　　Ｉｏｐｈａｇｕｓ（Ｎ
ＣＩＢ　１１０３８）の東位体遺伝子のライブラリーか
ら逍Ｕ−１’−上学の分！１ｌｆで慣用されている方法
、例えば適当なブローブによるハイブリダイゼイション
注、により取得することもできるが、結合アミノ酸が７
６個であるということを考えれば、化学合成法のみで全
合成する方が簡単である。

本発明ＤＮＡ鎖の用途 本発明によるＤＮＡ鎖は、この遺伝子を細菌中で有用生
理活性物質の遺伝子（宿主細菌細胞の西膜透過のための
シグナル配列コードする部分を備えたもの）と共に発現
させることにより、訓菌による該生理活性物質の菌体外
分泌生産が可能であり、種々の有用生理活性物質の菌体
外分泌中産に適している。

所望の蛋白質もしくはポリペプチドの分泌生産法く概　
要〉 本発明による所望の蛋白質もしくはポリペプチドの分泌
生産法は、宿主細菌細胞の内膜透過のためのシグナル配
列をコードする部分および所望の蛋白質もしくはポリペ
プチドのアミノ酸配列をコードする部分を含むＤＮＡ鎖
、ならびに請求項１記載のＤＮＡ鎖により宿主細菌を形
質転換し、該形質転換体を培養することにより所望の蛋
白質もしくはポリペプチドを培地中に分泌させること、
を特徴とするものであることは前記したところである。

具体的には、例えば、 ■　上記のシグナル配列をコードする部分及び所望の蛋
白質もしくはポリペプチドをコードする部分を含むＤＮ
Ａ鎖 並びに ■　本発明ＤＮＡ鎖 の両者を一つの発現ベクターに揮人した組換えＤＮＡを
作成し、これにより細菌宿主を形質転換し、この形質転
換体を適当な条件で培養することにより、所望の蛋白質
もしくはポリペプチドを培養液中に分泌生産させること
ができる。また、上記■のＤＮＡ鎖及び■の本発明ＤＮ
Ａ鎖を、宿主細菌中で共存可能な別の発現ベクターにそ
れぞれ挿入し、両ベクターにより細菌宿主を形質転換し
てもよい。さらに、上記■のＤＮＡ鎖、■の本発明ＤＮ
Ａ鎖の一方あるいは両方を、宿主細菌細胞の染色体に組
み込んで発現させてもよい。

く発現ベクターの構築〉 （１）宿主細菌細胞の内膜透過のためのシグナル配列を
コードする部分及び所望の蛋白質もし《はボリペブチド
のアミノ酸配列をコードする部分を含むＤＮＡ鎖 分泌蛋白質や、膜内在性蛋白質においては、Ｎ末端部位
に細胞膜透過のために必要なシグナル配列が存在するこ
とが一般に知られている。シグナル配列は細胞膜透過の
際に特異的な酵素によって切断され、成熟蛋白質が生じ
ることがわかっている。

本発明において、前記■Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌ’ｌは、宿主細
菌細胞において蛋白質の膜透過を可能とするシグナル配
列をコードするＤ　Ｎ　Ａ　＃Ｊ’ｌと所望の蛋白質も
しくはポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖とを含むＤＮ
Ａ鎖である。シグナル配列をコードする部分と所望の蛋
白質をコードする部分は読み取り砕を合せる必要がある
。また、好ましくは、シグナル配列のＣ末端と所望の蛋
白質のＮ末端との間でシグナルペプチドの切断が起こる
よう、不要な塩基配列を含まないように両部分を連結さ
せるのがよい。この場合の方法としては、合成オリゴヌ
クレオチドを用いた部位指定変異の技法により余分なヌ
クレオチドを除去する方法などが知られている。

また、近年ＤＮＡ合成の技術が進歩してきており、シグ
ナル配列部分から構造遺伝子まで、すべて含成してしま
うという方法も可能である。

シグナル配列としては、使用する細菌宿主において機能
するものであれば、いずれも使用ｉｊｌ能である。宿主
が大腸菌の場合、例えば、大腸曲外膜蛋白質であるＯｍ
ｐＡ　（特開昭６３−２３７７９０）　、ＯｍｐＦ　（
特開昭６１−２８２０８４）、ペリプラズム蛋白質であ
るアルカリフォスフ７夕一ゼ（特開昭６１−３７０９９
）などのシグナル配列の利用が可能である。

所望の蛋白質もしくはポリペプチドとしては特に制限は
ないが、その由来する細胞で本来分泌されているものが
好ましい。例としては、ヒト由来の成長ホルモン、ヒト
由来のＧＭ−ＣＳＦ等があげられる。

（２）発現ベクターの構築 発現ベクター構築のための手順ないし方法は、分子生物
学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用され
ているものを用いればよく、例えばｓ　Ｔ．　Ｍａｎｌ
ａｔｌｓ，　Ｅ．Ｆ．［’ｒｌＬｓｃｈ．　Ｊ．Ｓａａ
ｂｒｏｏｋｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ　Ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊ　，Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｉｏ
ｒｙ．（１９ｇ２）、ｈ（を参照することができる。

用いられるベクターの例としては、大腸曲に対してはｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８のようなプラスミドベクター
、ザイモモナス属細菌に対してはｐＺＡ２２　（特開昭
６２−２２８２７８号公報参照）等がある。

プロモーターの例としては、ｆｌａｃ，Ｔｃ’ＣＡＴ，
Ｔｒｐ，ｔａｃ　（以上、大腸菌用）、Ｔｃ　ｒＳＣＡ
Ｔ　（以上、ザイモモナス屈細菌用）等がある。

なお、前記した■ＤＮＡ鎖および■の本発明ＤＮＡ鎖の
両者が挿入された発現ベクターを横築する場合には、両
ＤＮＡ鎖の並ぶ順序および方向は、その遺伝情報が発現
可能な状態、すなわち、宿主内で各々の遺伝子が適切に
転写、翻訳される状態、でありさえすれば、どのような
順序、どのような方向であっても構わない。また、プロ
モーターに関しては、両ＤＮＡ鎖に八通して働くように
一つノフロモーターを使用してもよいし、両ＤＮＡｆｌ
ｆｉ各々にプロモーターをつけてもよい。リポソームが
ｍＲＮＡに結合するために必要な配列（大腸薗ではＳＤ
配列）については両ＤＮＡ鎖につける必要がある。

く形質転換〉 宿主としては細菌、特に、ダラム陰性細菌が用いられる
。このような好ましい細菌宿主の具体例としては、例え
ば、大腸菌があげられる。

形質転換の方法は、この分野で慣用されているものを用
いればよく、例えば、前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ　Ａ　ｔ，ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎａｌ
等を参照することができる。

本発明のＤＮＡ鎖ならびにシグナル配列をコードする部
分および所望の蛋白質をコードする部分を含むＤＮＡ鎖
を含む発現ベクターによって形質転換した一例として、
Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈ１ａ　ｃｏ１１　ｅ（ｉｏＯ（ｐＡ
Ｓ２３）微工研条寄２５０５号（ＰＩＥｌ？Ｍ　ＢＰ−
２５０５）が寄託されている。

く蛋白質の分泌生産〉 上記のようにして得られる形質転換体、すなわち菌体外
分泌促進作用を有するポリペプチドの遺伝子とシグナル
配列をコードする部分を備えた所望の蛋白質の遺伝子と
を含むＤＮＡ鎖によって１１５質転換された細菌は、こ
れを培養すれば山体外（すなわち培養液中）、に所望の
蛋白質を産生蓄積する。

形質転換体の培養ないし培養条件は、使用宿主細菌に対
するそれと本質的には変わらない。また、培養液からの
所望の蛋白質の回収、精製も常法に従って行うことがで
きる。

く実験例〉 以下の実験例において、ＤＮＡの取り扱いは特に明示し
ない限り常法（Ｍａｎｉａ口ｓ　ｅＬ　ａｌ，Ｍｏｌｅ
ｅｕ−ｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　ｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９ｇ２
））により行なった。

実験例１　：　Ａｃｈｒｏｍｏｂａｅｔｏｒ由来ＤＮＡ
断片の取得Ａｅｈｒｏｓｏｂａｃｔｏｒ　　１ｏｐｈａ
ｇｕｓ（ＮＣＩＢ　１１０１ｇ）の薗体を、斜面培地（
普通寒天培地、日水製）より液体培地（Ｂａｃｔｏ　Ｔ
ｒｙｐｔｏｎｃ（Ｄｉｒｃｏ）　２．　０％、Ｂａｅｔ
ｏＹｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｒｃｏ）０．　　
５％、ＮａＣｌ２．　４％、ＰＨ７。０）に植菌し、３
０℃で２０時間振盪培養を行なった後、菌体を集菌し、
三浦の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１ｏ
ｇｙ．ｌ２，ｐｐ．５４３−５４５．Ａｃａｄｅｓｌｃ
　Ｐｒｅｓｓ）で染色体ＤＮＡを抽出、精製した。この
染色体ＤＮＡＩＯμＫに制限酵素ＥｃｏＲ１（盲酒造製
）を加え、３７℃で５分、１０分、２０分、３０分、６
０分反応させて、部分分解を行なった。一方、クローニ
ングベクターｐ　Ａ　Ｔ　３　２　５　（Ｎａｋａｓｕ
ｒａ　ａｔ　ａｌ　．Ｊ．Ｂｌｏｔｃｃｈ’．３．２３
９−２４８（１９８８）　）　１　ｕ　ｇを制眼酵素Ｅ
ｃｏＲＩで完全分Ｍした後、大腸菌アルカリ性ホスファ
ターゼ（１！酒造製）を１μｌ加え、６５℃で１　１１
ｆ問処理した後、フェノール抽出により酊素を失活させ
た。このベクターＤＮＡを前記の染色体ＤＮＡ部分分解
物と混合し、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー●マンハイム冫Ｉ製）によって１２℃、１８時
間反応を行なった。？１｝られた組換えＤＮＡ混合物を
用いて、大賜菌Ｃ６００株に対して形質転換を行なった
。得られた形質転換体を５０μｇ　／　ｍｌのアンピシ
リンを含む寒天培地（Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（
Ｄ１ｆｃｏ）　１．　　０％、Ｂａｃ　ｔ　ＯＹｅａｓ
ｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｒｃｏ）０．　　５％、Ｎａ
Ｃｌ１．　　０９６、Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｃｏｌｌａｇｅ
ｎ（ＳＥＲＶＡ）　０、５％、Ｓｉｒｉｕｓ　ｌ？ｃｄ
（ＢＤＩＩ）　１　５　０■／ｌ）上に塗沫し、コロニ
ーの周囲に色素の抜けが見られるものを選抜した。この
コロニーを５０μｇ　／　ｍｌのアンビシリンを含むＬ
Ｂ培地（ＢａｃＬｏ　ＴｒｙｐＬｏｎｅ（Ｄｉｌ’ｃｏ
）　１％、ＢａｅｔｏＹｅａｓｔ　ＥｘｔｒａｃＬ　（
Ｄｌｆｃｏ）　０．　５％、ＮａＣｌ　１　９（；　）
で３７℃で一夜培養の後、常法によりブラスミドＤＮＡ
を単離し、プラスミドｐＡｓ２０を得た。

ｐＡｓ２０は、第２図に示される構造をしており、クロ
ーニングベクターｐＡＴ３２５のクロラムフエニコール
耐性領域のＥｃｏＲ１部位にＡｃｈｒｏｓｏｂａｃｔｏ
ｒ由来の６．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が挿入されたもの
である。次に、各種制阻酵索を用いてｐＡｓ２０の欠失
変異体を作製し、培養を行い培養液上清の蛋白量を調べ
ることにより、宿主のタンパク質分泌を促進する活性に
必須な領域が第２図中のＭｌｕｌ−Ｐｓｔｌ間にあるこ
とを特定した。Ｍｌｕｌ−Ｐｓｔｌ断片をＭ１３ｍｐｌ
９ベクター（ベーリンガー・マンハイム１１製）にクロ
ーニングし、ジデオキシ法により塩基配列の決定を行な
った。

第１図に、得られた塩基配列及び図中ＡからＢまでで表
わされるオープンリーディングフレームを示した。

実験例２：大腸菌によるβ−ラクタマーゼの分泌生産 第１図に示されたＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ酵素処理に
より両端を平滑化し、プラスミドベクターｐＡＴ３２５
のテトラサイクリン耐性領域のＥｃｏＲＶ部位に挿入し
た。得られたプラスミドをｐＡＳ２３とした（第３図）
。プラスミドｐＡＳ２３、対照としてｐＡＴ３２５を用
いて大ｍ菌Ｃ６００株を形質転換し、得られた形質転換
体を、３０μｇ　／　ｍｌのクロラムフエニコールを含
むＬＢ培地に接種し、３７℃で２４峙間振とぅ培養の後
、菌の生育、培養液上演のタンパク質量を常法により測
定した。菌体を超音波により破砕し菌体抽出液を得て、
培養液上清及び菌体抽出液の酵素活性（β−ラクタマー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ）を測定した。β−ラクタマ
ーゼは澤井らの方法（Ａｎｔ１ｓ１ｃｒｏｂ．Ａｇｅｎ
Ｌｓ　ＣｈｅｓｏＬｈｅｒ．．１３．９１０−９１３（
１９７８）　）　、β−ガラクトシダーゼ活性はＸｉ　
Ｉ　ｌｅｒらの方法（ＥｘｐｅｒｉｓｅｎＬｓ　Ｉｎ　
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｅｓ．ｐ　３５２−３
５５，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　ＨａｒｂｏｕｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ（ｆ９７２））に従ってＩ１−１定した
。結果は第１表に示したとおりであり、ｐＡＳ２３を保
持する大腸菌は、培養２４時間後において、対照と差の
無い生育を示し、本来ペリプラズムに蓄積されるタンパ
ク質であるβ−ラクタマーゼを、培養波上清中に放出し
た。一方、本来細胞質に存在することが知られているβ
−ガラクトシダーゼ活性はｐＡＳ２３を保持する大腸閑
においても、その大半が細胞抽出液中に見いだされたこ
とから、前連のβ−ラクタマーゼの菌体外分泌が＋１１
なる溶菌の結果ではないことがわかる。以上の結里は、
大腸菌における有用生理活性物質の菌体外分泌生産に関
する本発明ＤＮＡ鎖の６用性を示すものである。

第１表 ｐＡｓ２３によるβ−ラクタマーゼの菌体外分泌（参考
実験例：リンカー神大による閑体外分泌促進作用の喪失
） 本ＤＮＡ断片の菌体外分泌促進作用が、第１図Ａ−Ｂに
示されるポリペプチドの発現によってもたらされるもの
であるかどうかを確認するために、以下の実験を行った
。第１図の塩基配列の西２０１番目から２０６番目にか
けての配列ＣＡＧＣＴＧは、制限酵素Ｐｖｕ［Ｉにより
認識される部位となっている。ブラスミドｐＡＳ２３の
２２８ｂｐ中のＰｖｕＩ１部位にＰｓＬ夏リンヵーＧＣ
ＴＧＣＡＧＣを挿入し、プラスミドｐＡＳ２３−Ｐｓ　
ｔを作成した。ｐＡＳ２３Ｐｓｔにおいては、上記Ｐｖ
ｕＩ１部位以降のアミノ酸配列が本来のもの（第１図Ａ
−Ｂのアミノ酸配列）とは全く異なったものとなってし
まうことになる。ｐＡＳ２３−Ｐｓ　ｔを大腸菌Ｃ６０
０に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ培地中で３７℃、２４時間培養の後、土清の蛋白質
量をｎ１定し、ｐＡ３２３を保持する大腸菌、ｐＡＴ３
２５を保持する大腸菌の場合とを比較した。結果は第２
表に示した通りであり、ｐＡ３２３−Ｐｓ　ｔにおいて
は、ｐＡＴ３２５の場合と同様、蛋白質の分泌は起らな
かった。以上により、本ＤＮＡ断片においては、第１図
Ａ−Ｂに示されるポリペプチドの発現によって菌体外分
泌促進作用がもたらされることが明らかとなった。

第２表　リンカー挿入による分泌機能の喪失プラスミド
　　　　　　　　培養土清への蛋白質の分泌ｐＡＴ３２
５ ｐＡＳ２３−Ｐｓ　ｔ ｐＡＳ２３　十 微生物の寄託 本発明に関係する微坐物は、工業技術院微生物工業技術
研究所に下記の通りに寄託されている。

微　生　物　　　　　　受託番号　　　　受託年月日Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｌ１１ａ　ｃｏｔ　Ｉ　　　微工研条寄
　　平或元年７ノ１６口０８００　（ｐＡＳ２３）　　
　　　第２５０５号（１’ＥＲＭ　ＢＰ−２５０５　）

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるＤＮＡ鎖の塩扛配列およびコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を示すものである
。各アミノ酸は１文字表示で７』ｋシてあり、対応する
コドンの最初の塩旦のドに表・Ｊミされている。 第２図は、ブラスミドｐＡｓ２０の構造を小すものであ
る。 第３図はブラスミドｐＡＳ２３の堝遣をク宝ずものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ酸配列が実質的に第１図に示されているＡか
   らＢまでのものであるポリペプチドをコードする塩基配
   列を有するＤＮＡ鎖。 ２、宿主細菌細胞の内膜透過のためのシグナル配列をコ
   ードする部分および所望の蛋白質もしくはポリペプチド
   のアミノ酸配列をコードする部分を含むＤＮＡ鎖、なら
   びに請求項１記載のＤＮＡ鎖により宿主細菌を形質転換
   し、該形質転換体を培養することにより所望の蛋白質も
   しくはポリペプチドを培地中に分泌させることを特徴と
   する、所望の蛋白質もしくはポリペプチドの分泌生産法
   。