JPH03277287A - Ｍｅｔ―アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換え技法を用いて、Ｎ一末端のメチオニン
を欠失するタンパク質、特に外来性タンパク質の細菌系
における製造に関する．さらに詳しくは、それは、旦　
ビトロで使用され又はこれらのシステムにおいて成熟タ
ンパク嘗の完全なプロセシングのために高いレベルのベ
ブチダーゼを含む卓越した細菌宿主を製造するために使
用され得る、Ｎ一末端のメチオニンに対して特異的なベ
ブチダーゼに関する。

〔従来の技術〕

細菌宿主での外来性タンパク質の製造は、現在十分に確
立されている．比較的に標準の方法においては、目的と
するタンパク質をコードする遺伝子配列が、宿主生来の
又は宿主と適合する調節配列の制御下に配置され、そし
て宿主細菌中に形質転換される．一般的に、これを達成
できる３つの主な方法が存在する： （１）目的とするタンパク賞をコードするＤＮＡが、細
菌の調節配列の制御下ですでに細菌の遺伝子と読み枠を
合わせて融合され、゜゛融合タンパク譬゜゛を得ること
ができ； （２）目的とするコード配列が、分泌タンパク質をもた
らす作用可能なリーダー配列と読み枠を合わせて融合さ
れ；又は （３）目的とするコード配列が、゛直接的な”発現をも
たらすＡＴＧ開始コドンのすぐ下流に配置され、“成熟
”タンパク質を得ることができる。

この最後の場合においては、成塾タンパク質は分泌され
ないが、しかししばしば封入体として細胞内域に見出さ
れる。

ＡＴＧ一先行のコード配列の直接的な発現によって形成
される成熟タンパク質が、ＡＴＧの翻訳生成物であるＮ
一末端のメチオニンを担持することは、言明されていな
いが、しかし当業者によっては良く認識されている．特
定の組換え体タンパク質及びその生成の状況に依存して
、このＮ一末端のＭｅｔ残基を除くことが多少、細胞内
でプロセシングされるが、しかし、−船釣にほんのいく
らかであり、そして普通、生成された組換え体タンパク
質の実質的な部分は、この所望としない外来性残基を担
持する。その存在は完全無害である。この得られるタン
パク質が治療上、使用される場合、通常、受容体に対す
る自己由来のタンパク質〔たとえば、ヒトに投与される
ようなヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）　）であろうものが
、該受容体に対してよく知られていないペプチド配列を
含んでいる。その結果は予想できる。免疫反応は、その
よく知られていない配列に対しで生まれることができ、
そして治療上重要なペプチドが、今、免疫原になる。

外来性タンパク質の他に、成熟した生来のタンパク質及
び他の属又は種からの細菌性タンパク質もまた、しばし
ば、不完全にプロセシングされる。

この現象の例は、Ｅ、コリのアスパラギン酸トランスカ
ルバミラーゼ（Ｒ−鎖）、Ｅ、コリのトリプトファンシ
ンテターゼＡプロティン及びＥ、コニρバクテリオファ
ージＴ４リゾチームを含む（Ｆａｓｍａｎ、　　Ｇ、Ｏ
，、Ｅｄ、、ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅａｉｓｔｒ＆　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏ　　　ｍ　：　３０８〜３１３　　）　ａ他の人は、
Ｎ−末端のメチオニンを分解するために及びＮ−末端の
“Ｍｅｔ−欠失性”ペプチド又はタンパク質を生成する
ために種々の方法で試みて来た。Ｂａｘｔｅｒ　（アメ
リカ特許第４．３５０，７６４号）は、交互の切断部位
を保護した後、前駆体タンパク質を切断するためにプロ
テアーゼトリプシンによる処置をイン　ビトロで行なう
、融合タンパク質もまた合成され、ここで、目的とする
コード配列がＡＴＧによって先行され、従ってＣＮＢｒ
によって切断できる“内部”メチオニンをその融合体中
に提供する。これは、余分な製造段階を含むのみならず
、またタンパク質又はペプチドがその残存する配列中の
いずれのメチオニン残基で切断されるという一層重大な
欠点を有する。ジェネンテックにより１９８４年１２月
５日に出版されたＥＰＯ出願第１２７．３０５号は、得
られるｈＧＨの分泌をもたらすためにある細菌宿主中に
おいて明らかに作用する生来のｈＧＨリーダーペプチド
を含むコード配列を用いることによってＭｅｔ欠失性の
ｈＧＨの生成を開示する。Ｇ１１ｂｅｒｔ（アメリカ特
許第４，３３８，３９７号）は、多分、Ｎ−末端のＭｅ
ｔ欠失性のβ−グロビンの分泌をもたらすためにペプチ
ダ−ゼのリーダー配列を用いている。同じ論受入に感渡
され、そしてこの開示を引用によりこの明細書中に組み
込まれた、１９８６年３月２５日に出願された、日本特
許出願第６４９９５／８６は、いくらかの（但しすべて
ではない）組換え体ペプチドの分泌をもたらすために、
細菌のホスホリパーゼＡ　（ｐｈｏ　Ａ　）についての
リーダー配列の使用を開示する。

前記の解決法は、その問題に対する普遍的な解決を提供
しない。Ｎ−末端のＭｅｔ欠失性形で特定の組換え体タ
ンパク質を産生ずるための必要性に直面している当業者
は、産生されるべき特定のペプチドのために適切な方法
を、可能性あるレパートリ−から選択する必要がある。

下記の発明の方法は、もう１つのパターンの適応性を提
供するためにこのレパートリ−を広げる。

〔発明の開示〕

本発明は、細菌的に産生された組換え体タンパク質又は
他のタンパク質からＮ−末端のメチオニン残基のプロセ
シングを保証するための便利な酵素を提供する。また、
別の段階を要しないでインビボで目的とするプロセシン
グをもたらすために、組換え宿主生物の遺伝子操作を可
能にする、この酵素をコードするＤＮＡが提供される。

従って、本発明のペプチダーゼ酵素の有効性が、治療的
に使用される場合、免疫原性を減じている紐換え体タン
パク質の細菌宿主において産生を可能にする。

１つの観点においては、本発明は、あるタンパク質配列
からＮ−末端のメチオニン残基を切断するペプチダーゼ
、すなわち、メチオニンアミノペプチダーゼ又はＮ−末
端エキソペプチダーゼに関する。その酵素はこの明細書
でＮｅｔ−アミノペプチダーゼとして言及されるであろ
う、そのＭｅｔ−アミノペプチダーゼ酵素は、定義され
た特異性の活性（下を参照のこと）を有し、そして第２
図に示されているアミノ酸配列のタンパク質に対して生
成された抗体と免疫沈殿するタンパク質を含むそのＮｅ
ｔ−アミノペプチダーゼ酵素はさらに、この活性を有し
、そしてそれは、推定されるアミノ酸配列をコードする
、第２図に例示されるＤＮＡに対して、特定の条件下で
ハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされている
タンパク質を含む０本発明はまた、第２図に示されてい
るアミノ酸配列のタンパク質と免疫反応性の抗体に関し
、そしてを推動物中にこのタンパク質を注入することに
よって高められた抗体を含む。

他の観点においては、本発明は、Ｎｅｔ−アミノペプチ
ダーゼをコードする組換え体ＤＮＡ配列、この配列を担
持するプラスミド及びこれらのプラスミドにより形質転
換された微生物宿主、並びに本発明の物質を用いて、細
菌宿主又はイン　ビトロでＮ−末端のＭｅｔ欠失性の組
換え体タンパク質を産生ずるための方法に関する。さら
にもう１つの観点においては、本発明は、一般的にペプ
チダーゼ−欠失（但し、Ｎｅｔ−アミノペプチダーゼ欠
失ではない）の形質転換宿主（ここで該形質転換体はそ
れ自体のゲノムの一部を導入している）をスクリーニン
グすることを含んで成る、高いＭｅｔ−アミノペプチダ
ーゼ活性を有する細菌株を得るための方法に関する。

〔発明を実施するためのｎ様〕

Ａ、主１ 本明細書に使用される場合、“Ｍｅｔ−アミノペプチダ
ーゼ”はペプチド配列からＮ−末端のメチオニン残基を
特異的に切断し、そして内部のメチオニン残基又はメチ
オニンよりも他のＮ−末端残基で切断しない酵素に関す
る０本発明のＮｅｔ−アミノペプチダーゼは、位置２を
占める残基及び基質タンパク質又はペプチドの二次又は
三次構造に依存して、特定のペプチド配列に対して特異
的であるように思える。この事に関する酵素の正確な特
異性は、無数の基質をほとんど試験しないでは測定され
得ない；しかしながら、大ざっばなやり方が、Ｓｈｅｒ
ｍａｎ、　Ｆ、、など、旦ムハ且■（１９８５）３：２
７〜３Ｉによって示されている。５ｈｅｒｖａｎなとは
、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼの特異性についての彼ら
の考えを、酵母からのイソ−１−チトクローム−Ｃの突
然変異体の観察形及び８２の成熟の細胞内タンパク質の
公開された一次配列に１いた。彼らは、メチオニンは普
通、１．２９人又はそれよりも小さならせん状の半径を
有するａｇを含む残基から切断されるが、しかし一般的
に、１．４３人よりも大きならせん状の半径を存する残
基からは切断されないと推定する。原核及び真核系から
の他の公開されたタンパク質の配列を考慮して得られた
、突然変異的に変えられたイソ−１−チトクローム−〇
は、Ｎ−末端のメチオニンがアラニン、システィン、グ
リシン、プロリン、セリン、トレオニン又はバリンの残
基を先行するがしかし、それがアラギニン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソ
ロイシン、ロイシン、リシン又はメチオニンの残基を先
行しない場合、Ｎ−末端のメチオニンが切断されること
を示し、そしてこの事は観察と一致する。これらの結果
は、一般的に、下の例示に示されている結果と一致する
。しかしながら、第２アミノ酸についてのらせん状の半
径が１．２９人より大きく、そして第二及び第三構造体
又は他の条件が特に好ましい場合、いくつかの例外が存
在する。従って、この特異性の観点は、一般的なガイド
ラインとして意図され、そして本発明を例示するために
使用されるアミノペプチダーゼの特異性さえ正確に測定
されないことが心に留められるべきであり、すなわち、
すべての可能な第三構造体は必ずしも試験されていない
、従って、“Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼ”の定義内に
存在するためには、内部のメチオニン残基の切断及びい
ずれかのペプチドからメチオニン以外のＮ−末端残基の
切断を伴わないでＮ−末端のメチオニンの特異的な切断
の必要条件を満たすのみの酵素が必要である。

本発明の好ましいＮｅｔ−アミノペプチダーゼは、第１
図に示されているものに実質的に等しいＮ−末端のアミ
ノ酸配列及び第２図に例示されているＤＮＡによってコ
ードされているものに実質的に等しい全アミノ酸配列を
有する。“実質的に等しい”とは、たとえ小さな変化が
アミノ酸配列に存在したとしても、タンパク質が第二及
び第三構造体又はその次のアミノ酸残基に間して、同じ
根本的な特異性を基本的に有する特定のペプチド配列又
はタンパク質配列からＮ−末端のメチオニン残基を特異
的に切断することにおいて同じ活性を保持することを意
味する。少しも活性を変えない、配列中の１又は複数の
アミノ酸の変化、交換、付加又は欠失は、この定義から
特定のタンパク質を除外しない。

たとえば、保存性アミノ酸置換、たとえば位置４５　、
５９　、７８　、１２６又は２４５で１又は複数のシス
ティンの代りにセリン又はアラニンの置換は、Ｍｅｔ−
アミノペプチダーゼ活性を保持することができるペプチ
ドをもたらす、さらに、ロイシン、インロイシン及びバ
リン残基の互換性が存在することができる。また、Ｎ−
末端で始めの７個のアミノ酸までを欠失することができ
、そしてアミノ酸２２８で始まるペプチドの下流領域の
部分は、活性のために必須でない。

もちろん、さらにＭｅｔ−アミノペプチダーゼの中性形
及び塩形、並びに付加の非タンパク質成分、たとえばグ
リコジル化、脂質残基又はアセチル化を含む形が含まれ
る。

“ペプチダーゼ欠失”の菌株は、Ｎｅｔ−アミノペプチ
ダーゼよりも他の少なくとも４個のペプチダーゼ（該ペ
プチダーゼは通常、野生型に見出される）を欠いている
菌株とみなす。

この明細書に使用される“Ｎ−末端のＭｅｔ欠失性”タ
ンパク質は、Ｎ−末端のメチオンを欠いているが、しか
しその−次構造においてどこかよそにメチオニン残基を
含むかも知れないタンパク質と言及する。そのタンパク
質のためのコード配列は、読み枠において、すぐ先行す
るＡＴＧ開始コドンを有するであろう。“Ｎ−末端のＭ
ｅｔ欠失性”は、この状態をとりま（条件がくり返し与
えられる必要がないように、便利な速記語として使用さ
れる。特に、″Ｎ−末端のＭｅｔ欠失性”は、タンパク
質配列中に必ずしもメチオニン残基が必要でなく、最初
にＮ−末端のメチオニンの可能性を持たないタンパク質
、たとえば融合タンパク質として又は分泌されるタンパ
ク質として産生されるタンパク質を含むことも意図され
ないことを、本発明において意味する。従って、本明細
書に使用されるような“Ｎ−末端のＭｅｔ欠失性タンパ
ク質”は、ＤＮＡ配列によってコードされているタンパ
ク質として見なされ、ここで該成熟タンパク質は、読み
枠のＡＴＧ開始コドンによってすぐ先行され、そしてＣ
ＮＢｒ、トリプシン又は他の試薬によって実質的に切断
されるべき融合体の一部でない０組換え体タンパク質の
場合、その構成体は、明らかに記されていて；生来の又
は天然に組換られたＤＮＡ配列のための構成体は、容易
に定義され得ない。

“Ｍｅｔ−先行のタンパク質”は、特定の成熟タンパク
質に通常、見出される第１アミノ酸をすぐ先行するＮ−
末端のメチオニン残基を含むタンパク質である。

“細胞”、“細胞培養物”、“宿主細胞”及び同様のも
のは、組換え体ＤＮＡ操作のための主細胞として見なさ
れる０本文から明らかであるように、これらの細胞は、
組換え技法に従って、新規ＤＮＡ配列の形質転換のため
の候補者であることができる。細胞によるＤＮＡ取り込
みのために適切な技法は、イン　ビトロでの形質転換を
含む。

しかしながら、他の技法、たとえばトランスダクション
又は接合もまた使用され得る。その定義はさらに、直接
的に関連する細胞の子孫を含む。そのような子孫は、そ
れらの親とＤＮＡ含有において、正確に同一でないが、
しかしたとえば突然の又は意図的な突然変異による修飾
が、それらの親によって示される性質に幾分か類似する
方法で、導入されたＤＮＡによって与えられる性質を示
すように細胞の能力を破壊しない限り、そのような子孫
は定義に含まれることが理解される。

Ｂ、二股負星五里 本発明は、Ｎｅｔ−アミノペプチダーゼの使用によって
、細菌宿主中にＮ−末端のＭｅｔ欠失性の組換え体タン
パク質の産生を達成する。最も好ましい態様においては
、そのＭｅｔ−アミノペプチダーゼは、高レベルでその
場で生成され、そして細胞宿主中においてイン　ビボで
組換え体又は他のタンパク質を処理する。しかしながら
、宿主細胞から目的とする組換え体又は他のタンパク質
を単離又は抽出し、そして細菌源から独立して得られる
Ｎｅｔ−アミノペプチダーゼによりイン　ビトロで該抽
出物を処理することがまた可能である。

Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼそれ自体に関して、この酵
素は生成され、そしてそれをコードするＤＮＡは、Ｅ、
コリ株をスクリーニングすることで容易に回収され、そ
してこれは、−船釣に、それら自体のゲノム中にコード
されているＭｅｔ−アミノペプチダーゼの増強された産
生について不完全なペプチダーゼである。この方法にお
いて、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードする、プラ
スミドに担持され、且つ増幅されたＤＮＡ源を得、そし
て次に、その酵素がそれらの細胞から直接的に調製され
、そして精製され得る。さらに、このプラスミドＤＮＡ
及び目的とする組換え体タンパク質のための発現ベクタ
ーを含む組換え体宿主の同時−形質転換が、Ｎ−末端の
Ｍｅｔ欠失性形の組換え体タンパク質の産生を、その場
でもたらす。

通常、野生型の細菌中に見出される多数のペプチダーゼ
を欠いている多数のＥ、コリ株が知られている。たとえ
ば、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｃ，Ｇ、、など、ムＢａｃｔｅｒ
ｉｏ１．　（１９７８）　１３５　：　６０３〜６１１
は、ペプチダーゼ欠失である多数の細菌株を開示する。

これらの菌株の１つ、すなわちＣＭ８９　（これは、ペ
プチダーゼＮ、ペプチダーゼＡ、ペプチダーゼＢ、ペプ
チダーゼＤ及びペプチダーゼＱを欠いている）が下の例
示に使用された。しかしながら、細菌株の他のペプチダ
ーゼ欠失の突然変異体も同じように使用され得た。

多分、これらの菌株のゲノムは、Ｍｅｔ−アミノペプチ
ダーゼ活性をコードする配列をまだ含み、そして従って
、そのゲノムＤＮＡが、適切な制限酵素により消化され
そして担体ベクター中にそのフラグメントをクローニン
グすることによってライブラリィを構成するために使用
される。ｐＨｃシリーズ及びｐＢＩ？３２２を含む、種
々のそのような担体ベクターが使用できる。次に、所望
により、プラスミドＤＮＡは、プラスミドＤＮＡの単離
及びスクリーニングのためにペプチダーゼ欠失の菌株中
への形質転換の前に、いずれか便利な野生型宿主を用い
て増幅され得る。

次に、形質転換されたペプチダーゼ欠失の細菌は、適切
な基質を切断するためのそれらの能力のために、粗抽出
物を検定することによって、目的とするＭｅｔ−アミノ
ペプチダーゼの産生についてスクリーンされる０次に、
高レベルのＮｅｔ−アミノペプチダーゼを示す菌株は、
組換え体タンパク質のための発現ベクターによる同時−
形質転換のために、この酵素源として、又はプラスミド
ＤＮＡｆＩとして便利に使用される。

さらに、この菌株からのプラスミドＤＮＡを使用し、適
切なＮｅｔ−アミノペプチダーゼをコードする配列のた
めに野生型細菌のゲノムをプローブすることができる。

適切な方法は、特に下に記載されているハイブリッド形
成条件の特徴のものである。これらの特定条件は、使用
される必要はないが、しかしそれらは相同する必要条件
を有する。

もちろん、これらの回収された配列はまた、それら自身
のプロモーターの制御下で又は当業界に知られている他
のプロモーター、たとえばｔｒｐプロモーター又はペニ
シリナーゼプロモーターを用いて、発現され得る。

本発明で産生されるＭｅｔ−アミノペプチダーゼタンパ
ク質を精製し、そしてその精製されたタンパク質及び適
切な免疫方法を用いて抗体を得ることができる。その精
製は、細胞を破壊し、そして溶菌を含む上清液から酵素
を単離することによって行なわれる。この単離は、タン
パク質が吸着され、次に適切な緩衝液による溶出を含む
条件下で、陰イオン交換樹脂による処置を含む、！切な
陰イオン交換樹脂は、種々の炭化水素支持体に接合され
ているＤＥＡＥを含む、当業界で良く知られている、他
の陰イオン交換樹脂もまた使用され得る。

ウサギ、ラット又は他の哺乳類中で精製されたタンパク
質に応じて生まれる抗体は、種々の微生物からのＭｅｔ
−アミノペプチダーゼタンパク質を同定することに有用
である。

多数の組換え体タンパク質は、本発明の方法を用いて、
Ｎ−末端のメチオニンを含まない成熟タンパク質として
生成するための候補者である。たとえば、リンフ才力イ
ン、たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１；α−及びＴ−インタ
ーフェロン（β−インターフェロンは通常、その成熟形
中Ｎ−末端のメチオニンを含む）；腫瘍壊死因子；及び
リンパ系に関連する他のタンパク質が産生される。また
種々のホルモン、たとえば成長ホルモン、インシュリン
、ＡＣＴＨ、エンドルフィン及び他のペプチドホルモン
が組換え体により産生され得る０組換え体産生のための
他の候補者は、酵素、たとえば組織プラスミノーゲン活
性化因子、ウロキナーゼ及び工業的用途に有用な酵素、
たとえばアルコールデヒドロゲナーゼを含む。他のタン
パク質は、毒素、たとえばジフテリア及びリシン毒素及
び種々の因子、たとえば上皮成長因子及び形質転換成長
因子を含む、前記のものは、単に典型的なものであり、
そしていったんその遺伝子が得られた後、大体、目的と
するタンパク質が、すぐ上流のＡＴＧ開始コドンに読み
枠を整合してそれに結合し、そして必要な制御配列を提
供することによって成熟タンパク質として発現され得る
６本発明の方法は、これらのタンパク質のすべてが、Ｎ
−末端のメチオニンを含まないで便利に産生されること
を可能にする。

上に述べたように、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼは、２
つの一般的な方法で使用され得る。たとえば、酵素は、
プラスミド担持のＤＮＡから比較的多量に酵素を産生ず
る特定の細胞から単離され、そしてイン　ビトロの反応
混合物に添加し、Ｎ−末端のメチオニン　プロセシング
をもたらし、又はイン　ビボ　プロセシングを可能にす
るために、Ｎｅｔ−アミノペプチダーゼをコードするプ
ラスミドを、組換え体細菌宿主中に目的とするタンパク
質のための発現ベクターと一緒に同時形質転換すること
ができる。

イン　ビトロ　アプローチにおいては、精製されたＭｅ
ｔ−アミノペプチダーゼを、プロセシングされていない
タンパク質、適切な塩及び緩衝液を含む反応混合物に添
加する。その反応混合物を、約３０℃の温度で一部イン
キユベートし、そのプロセシングを可能にする。その酵
素はコバルト　イオンを必要とする。典型的な反応混合
物は、約１■／ｄの基質タンパク質、ｐＨ＝７〜８のリ
ン酸緩衝液中、約８（ｂ＋＋ｒ／ｄの酵素及び約０．２
ｍＭのコバルトイオンを含むことができる。もちろん、
前記の典型的な混合物は単に例示的であり、そしてその
成分の濃度は、基質の性質及び使用される時間及び温度
の条件に依存して連続的に変化することができる。完全
なプロセシングは、切り離されるメチオリン残基の量を
測定し、プロセシングされた及びプロセシングされてい
ないタンパク質を５ＤＳＰＡＧＥ上でその移動度を比較
し、又は混合物中に含まれる基質材料を配列決定するこ
とによって確かめられ得る。

イン　ビボ　アプローチにおいては、プラスミドＤＮＡ
を、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼ源の菌株から単離し、
そしてそれを用いて、すでに含む又はタンパク質のため
の発現系を含むために付随的に又は続いて形質転換され
る細胞を形質転換する。

細菌性酵素のだめの細菌源に用いられる場合、プロセシ
ングされていない基質を、微生物によって通常、生成さ
れるタンパク質の補体の一部として産生ずることができ
る。より一般的には、その場で生成されるペプチダーゼ
を用いて、組換え体により生成されたタンパク質をプロ
セシングし、そしてその細胞は、形質転換されるある点
で、目的とするタンパク質のための発現系を含むべきで
ある。

Ｃ，（１」Ｕｌｌ支 線菌の形質転換のための標準的な方法、マーカーを用い
ての好結果をもたらす形質転換体の選択、プラスミドベ
クターの製造及び遺伝子又はｃＤＮＡバンクのスクリー
ニングが技術的に良く理解されている。便宜上、下に示
されている例において特に有用な方法の選択がここに示
される。はとんどのそのような方法、又は他の可能な方
法が、Ｍａｎｉａｔｉｓ、など、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕ
ａ）（１９８２Ｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｒｒｅｓｓに見出される。

Ｃ１１，杢ユＪＢＩ唱」１死 Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼを担持するベクターによる
同時形質転換のために適切な細胞及びタンパク質のため
の発現系はｍｇである。最も頻繁に使用される宿主は、
種々のＥ、コリ株である。しかしながら、他の細菌株、
たとえばバチルス（たとえば枯草１１）、種々の一ズ今
畳追上」Ｌカッ、又は他の細菌株もまた使用され得る。

そのような原核系においては、宿主と適合できる種に由
来する複製部位及び制御配列を含むプラスミドベクター
が使用される。たとえば、Ｅ　コリは、Ｂｏｌｉｖａｒ
、　　など、Ｇｅｎｅ　（１９７７）　２　：　９５に
よるＥ　コリ種に由来するプラスミド、すなわちｐＢ２
３２２の誘導体を用いて典型的には形質転換される。　
ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐
性のための遺伝子を含み、そして従って、目的とするベ
クターを構成することにおいて、保持され又は破壊され
得る付加マーカーを提供する。転写開始のためのプロモ
ーター、場合によってはオペレーター及びリボゾーム結
合部位配列を含むようにこの明細書で定義されている、
通常使用される原核生物の制御配列は、β−ラクタマー
ゼ（ベニシリナーゼ）及びラクトース（Ｉａｃ）プロモ
ーター系ｒｃｈａｎｇ、など、Ｎａ　ｔｕｒｅ（１９７
７）　１９８　：　１０５６）及びトリプトファン（ｔ
ｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ、などＮｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８０）−旦−：　４０５７）並びにλ由来のＰＬ
プロモーターのような通常用いられるプロモーター及び
Ｎ−遺伝子のりボゾーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ
、　　など、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２　：
　１２８）を含み、そしてこのカセットは、１９８４年
２月８日出願された同時係属出願第５７８，１３３号に
示されている。しかしながら、原核生物と適合する、い
ずれか有効なプロモーター系が使用され得る。

Ｃ０２，ゑ１転遺 Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、（ＬＩＳＡ）（１９７２）６９　：　２１
１０によって記載されているような塩化カルシウムを用
いるカルシウム処理力又はＭａｒｉａｔｉｓなど、（前
記）に記載しているＲｂＣ１！法を用いて、細胞を形質
転換する。

Ｃ・３・　ご！褒≧」１衣 目的とするコード配列及び制御配列を含む適切なベクタ
ーの構成は、当業界において良く理解されている標準の
連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、Ｄ
ＮＡ配列又は合成されたオリゴヌクレオチドを、目的と
する形に切断し、合わせ、そして再連結する。

部位特異的なりＮＡ切断を、当業界において一般的に理
解されている条件及び商業的に入手可能な制限酵素の製
造業者によって記されている詳報下で適切な制限酵素（
又は複数の制限酵素）により処理することによって行な
う、たとえばＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、
　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。

一般的に、約ＩＫのプラスミド又はＤＮＡ配列を、約２
０４の緩衝溶液中１ユニツトの酵素によって切断し；本
明細書での例においては、典型的には過剰の制限酵素を
用いて、ＤＮＡ基質の完全な消化を確実にする。変動は
置火に見られ得るが、約３７°Ｃで約１〜２時間のイン
キュベーション時間が用いられる。おのおののインキュ
ベーションの後、フェノール／クロロホルムによる抽出
によってタンパク質を取り除き、そしてその後エーテル
抽出を行ない、そしてエタノールによる沈殿、次に５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピン　カラムを通すことによ
る水性画分から核酸を回収する。所望により、切断され
たフラグメントのサイズ分離を、標準技法を用いてポリ
アクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動によっ
て行なうことができる。一般的なサイズ分離の説明は、
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｓｏｌ。

（１９８０）房１４９９〜５６０に見出される。

制限することにより切断されたフラグメントを、５０ｖ
ｇＭのＴｒｔｓ　（ｐＨ＝　７．６　）　、５０ｗＭの
ＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇＣ１□、６ｍＭのＤＴＴ及び５
〜１０声のｄＮＴＰ中において２０〜２５℃で約１５〜
２５分間のインキュベーション時間を用いて、４種のデ
オキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存
在下でＥ、コリのＤＮＡポリマラーゼＩの大フラグメン
ト（にＩｅｎｏｗ）により処理することによって平滑末
端にすることができる。たとえ４種のｄＮＴＰが存在し
ても、ｌ［ｅｎｏｗフラグメントは５′付着端でフィル
インし、そして突出する３′の単一鎖をチュバツクスす
る。所望により、選択的な修復を、付着端の性質によっ
て受ける範囲内でたった１つの又は選択されたｄＮＴＰ
を供給することによって行なうことができる。

Ｋｌｅｎｏｗによる処理の後、その混合物を、フエノル
／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールによる
沈殿せしめた後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカ
ラムを通す、Ｓｌヌクレアーゼによる適切な条件下での
処理は、単一鎖部分の加水分解をもたらす。

Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　　など、Ｊ、Ａｓ、Ｃｈｅｓ、
Ｓｏｃ、　（１９８１）１０３　：　３１８５のトリエ
ステル法又は商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチ
ド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドを調製する
。アニーリングの前又はラベリングのための単一、鎖の
キナーゼ処理を、５０ｓ＋ＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ＝　７
．６　）　、１０ｍ−のＭｇＣｈ、５■阿のジチオトレ
イトール、１〜２謹ＨのＡＴＰ。

１．７Ｐモルのγ２ｔｐ−＾ＴＰ（２，９＊Ｃｔ／　ｍ
モル）、０．１ｍＭのスペルミジン及び０．１■ＨのＩ
Ｉ！ＤＴＡの存在下において０．１ｎモルの基質に対し
ておよそ１０ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを用
いて達成する。

次の標準条件及び温度：　２０ｓＨのＴｒｉｓ−ＣＩ　
（ｐＨ〜１−５　）　、１０ｗＭのＭｇＣ１ｇ　、１０
腸ＨのＤＴＴ、３３Ｉ！Ｉｌ／〆のＢＳＡ、１０ｍＭ〜
５０ｍＭのＮａＣ１及び１４℃で４０−のＡＴＰ、０．
０１〜０．０２０１’ｅｉｓｓ　）ユニットのＴ４のＤ
ＮＡリガーゼ（“付着端”の連結のための）又は１４℃
で１ｍＭのＡＴＰ、Ｏ１３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ）の
ユニットのＴ４のＤＮＡリガーゼ（“平滑端”の連結の
ための）のいずれか下で、連結を１５〜３０ｄの体積で
行なう０分子間の“付着端”連結は、普通、合計のＤＮ
Ａ濃度のｄ当り３３〜１００■（５〜１００ｎＨの合計
最終濃度）で行なわれる０分子間の平滑端連結（普通１
０〜３０倍のモル過剰のリンカ−を用いる）を、１−の
合計最終濃度で行なう。

“ベクターフラグメント”を用いるベクター構成におい
ては、５′のリン酸を取り除き、そしてベクターの再連
結を妨げるために、細菌性アルカリホスファターゼ（Ｂ
ＡＰ　）によりベクターフラグメントを通常、処理する
。ＢＡＰによる消化は、ベクターの層当り約１ユニツト
のＢＡＰを用いて６０℃で約１時間、Ｎａ”″及びＭｇ
１の存在下でおよそ１５０＋ｓＭのＴｒｉｐ　（ｐＨ＝
　８　）中において行なわれる。

核酸フラグメントを回収するために、調製物をフェノー
ル／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールによ
り沈殿せしめ、そして５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピ
ン　カラムに適用することによって脱塩化する。他方、
所望としないフラグメントの追加の制限酵素による消化
によって二重消化されているベクターにおいて、再連結
を妨げることができる。

配列の修飾を必要とする、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに
由来するベクターの部分のために、部位特異的ブライマ
ーにより指図された突然変異誘発を、Ｚｏｌｌｅｒ、　
Ｍ、Ｊ、、　など、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、（１９Ｂ２）１０　：　６４８７〜６５００の方法
に従って用いる。これは、突然変異誘発されるべき（但
し、′ミスマツチングを限定する）単一鎖のファージの
ＤＮＡに相補的なブライマー合成オリゴヌクレオチドを
用いて行われる０手短に言えば、合成オリゴヌクレオチ
ドは、そのファージに相補的な鎖の合成を指示するブラ
イマーとして用いられ、そしてその得られる二重１１１
ＤＮＡは、ファージ支持の宿主細菌に形質転換される。

形質転換された細菌の培養物をカンテン上にプレートし
、ファージを含む単一の細胞からプラーク形成を可能に
する。

理論上、新プラークの５０％が、単一鎖として突然変異
形を有するファージを含み；他の５０％が元の配列を有
するであろう。得られるプラークは、正確なマツチのハ
イブリッド形成を可能にする温度で、キナーゼ処理され
た合成ブライマーによりハイブリッド形成されるが、し
かしここで、元の鎖とのミスマツチは、十分にハイブリ
ッド形成を妨げる０次に、そのプローブと共にハイブリ
ッド形成するプラークを得、培養し、そしてそのＤＮＡ
を回収する０部位特異的な突然変異方法は下の特定の例
に詳しく説明される。

Ｃ１４，璽底■錆認 プラスミド構成のための正しい連結を、Ｅ、コーリーＧ
ｅｎｅｔｆｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ＋　ＣＧＳＣ
＃６１３５がら得られりＥ、コリ株ＭＭ　２９４又はそ
の連結混合物を有する他の適切な宿主をまず形質転換す
ることによって確かめる。好結果をもたらす形質転換体
を、当業界に知られているようなアンピシリン、テトラ
サイクリン又は他の抗生物質耐性により又はプラスミド
構成の態様に依存して他のマーカーを用いることによっ
て選択する。次に、その形質転換体から−のプラスミド
を、Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、、など、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）　（１９６
９）　６２：Ｈ５９の方法、場合によっては続いて、ク
ロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、
、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９７２）　１１０　
：６６７〕に従って調製する。その単離されたＤＮＡを
制限処理によって分析し、そして／又はＳａｎｇｅｒ。

Ｆ、、など、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、
　（ＵＳＡ）　（１９７７）７４　：　５４６３、さら
にＭ６ｓｓｉｎｇ　、など、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓＲｅｓ、　（１９８１）　９　：　　３０９又はＭａ
ｘａ＊、など、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｒ＋ｚ刃１国旺
（１９８０）房し　４９９のジデオキシ法によって配列
決定する。

Ｃ・５・　阻丞土並太盗土 本発明でクローニング及び発現に使用される宿主株は次
の通りである： クローニング及び配列決定のためには、及びほとんどの
細菌プロモーターの制御下で構成体の発現のためには、
Ｅ、コリ株間２９４　（前記）を宿王として使用したＴ
ａｌｍａｄｇｅ、　Ｋ、、など、Ｇｅｎｅ　（１９８０
）１２　：　　２３５　；　Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、　Ｍ、
　、など、Ｎａｔｕｒｅ　（１９６８）刀ユニ　１１１
０．　ＰＬＮｗ＋＋ｓプロモーターの制御下での発現の
ためには、Ｅ、コリ株に１２　ＭＣ１００Ｏλ溶原菌、
ＮＪｓｓＣＩ８５１ＳｕＳＰｓｏ　、　ＡＴＣＣ３９５
３１（この後、時々ＭＣ１０００−３９５３１として言
及する）を用いる。挿入体の存在を確かめるために、そ
の挿入体の領域における主鎖ベクターの＊ｒＢｌを相足
する菌株を使用する。たとえば、ｐＵＣシリーズのため
には、挿入体の不在下でメーゲル指示培地上で青色のコ
ロニイー及び挿入体の存在下で白色のコロニイーを生成
するＥ、コリ株ＤＧ９９を用いる。

Ｄ、■ 次の例は本発明を例示するものであって、限定するもの
ではない。

Ω、■、　　プラスミドＭｅｔ−アミノペプチダーゼを
コ５ｉｌｈａｖｙ、　Ｔ、Ｊ、、など、Ｅｘ　ｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＧｅｒｅＦｕｓｉｏｎｓ　　（１
’１４）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆ１ａ１ｂａｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１３７〜
１３９の方法によって、Ｅ、コリ株ＣＭ８９　（前記）
から染色体ＤＮＡを抽出し、そして１０＋ｇＭのＴｒｉ
ｓ及び１ｗＭのＥＤＴ＾（ＴＥ）緩衝液（ｐＨ＝８．０
）中に保存した。そのＤＮＡを、０．ＩＵ／眉及び０．
２Ｕ／ｇで１時間３７°ＣでＳａｕ　３ＡＩにより消化
した。反応を停止し、そしてエタノールによる沈殿せし
めた後、一部消化されたＤＮＡをプールし、そしてＢｅ
ｃｋｍａｎｎ　５Ｗ２８　ローターを用いて２６．００
０ｒｐ−で２４時間、１５°Ｃで１０〜４０％のスクロ
ース　　グラジェント上で両分した。４〜８ｋｂのフラ
グメントを含む両分をプールし、ＤＥ５２カラム上で精
製し、溶Ｈ荊からエタノールにより沈殿し、そしてＴＥ
緩衝液中に保存した。

次に、染色体ＤＮＡの４Ｒ部分を、Ｂａ５ＨＩにより消
化された、ＢＡＰ処理されたｐｔｌｃ１８ベクターフラ
グメント０．５　ｇと共に連結した。その連結混合物を
用いて、Ｅ、コリＤＧ９９を形質転換し、そしてラクト
ース指示器プレート上に置き、プラスミド中に挿入体の
存在を確めた。更に、形質転換体のおよそ９４％がおよ
そ４ｋｂのＤＮＡ挿入体を含んだ。

従って、１８４の連結混合物を用いて、篩ｐＲＬこ対し
てＥ、コリＨＭ２９４を形質転換し、その遺伝子ライブ
ラリィを得た。好結果をもたらす形質転換体を得、そし
てそれを用いて、プラスミドＤＮＡ調製のためにアンピ
シリン含有の培養、ｌ　７０（ｌｄに接種した。

上のＣ，４，（Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　（１９６９）　）に記載しているようにし
て、プラスミドＤＮＡを細胞から得、そしてそれを用い
てＥ、コリＣＭ８９を形質転換した。Ａｍ　ｐ　Ｒに対
して選択された、好結果の形質転換体を、スクリーニン
グのためにマイクロタイタートレイ中に置き、そしてお
よそ１　、０００コロニイをスクリーンした。

２ＸのＬ−Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ）　＋　１％のＮａ
Ｃ１，１０％のカサミノ酸及び１０Ｘの酵母窒素塩基の
それぞれを５％ｖ　／　ｖで補足された最小培地（たと
えばアメリカ特許筒４，５１８，５８４号を参照のこと
、そしてこの開示を引用によりこの明細書中に組み入れ
る）２００Ｉ中に、単一のコロニイーを取った。３７℃
で１晩、増殖した後、細胞をＯ，ｌ　ＭのＴｒｉｓ４Ｃ
Ｉ　（ｐＨ＝　７．４　）で２度洗浄した。その細胞を
、同じ緩衝液中１■／ｄのリゾチーム溶液２０１ｔｌを
添加することによって細胞溶解し、次に凍結融解を３度
くり返した。

次に、７２にのＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ　、　
３６ｐｔｒのＬ−アミノ酸オキシダーゼ、４〜５層のホ
ースラディシュベルオキシダーゼ、及び１８ＲのＯ−ジ
アニシジンジヒドロクロリドを含む、０．１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ＫＰＯ４）　　（＋）Ｈ＝　７．４　）
　＋０．２１１１Ｍ　ＣｏＣ１ｇの溶液１８０ｕ！を、
おのおののウェルに添加し；　　Ｍｅｔ　−アミノペプ
チダーゼ含有の細胞溶解物において、色の形成は明らか
であった。スクリーンされたおヨソ１，０００のコロニ
イーのうち１０のコロニイーが、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅ
ｔ−ＭｅｔからＭｅｔを放す速度を上昇することを示し
、そしてさらに、同じ条件下でＬｅｕ−ＧＩＶ−ＧＩｙ
からＬｅｕを放すことができないものについてスクリー
ンした。１つの好結果をもたらすコロニイーを、ｐｓＹ
ｃ１１７４と名づけた。Ｅ、コリのｐｓＹｃ１１７４を
、１９８５年８月２７日、Ａｍｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託し、そし
て寄託番号５３２４５を得た。

ｐｓＹｃ１１７４を有する旦−ユユ株（また１８Ｅ７と
名づけられた）は、上に記載しているようにして一般的
に行なわれた。　Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ基質
介在のエン　ビトロ検定において、およそ１００倍の高
い活性を与えた。

プラスミドＤＮＡを、菌株１８Ｅ７から単離し、そして
Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードするプラスミドｐ
ｓＹｃ１１７４を単離した。　ｐｓＹｃ１１７４は、Ｂ
ａｍＨＴ部位で、ｐｏｃｉｓベクター中に３．２ｋｂの
挿入体を担持した。１．２ｋｂのフラグメントを、Ｅｃ
ｏＲＩ／Ｃ１ａ　　ｒによる消化によって該挿入体の５
′末端から切り出し、そしてｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９
中に挿入し：ｐｓＹｃ１１７４を、Ｃ１ａ　　Ｉにより
消化し、Ｋｌｅｎｏ＠により平滑にし、そして次にＥｃ
ｏＲＴにより消化し、１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ　／平滑
フラグメントを切り出した。このフラグメントを、Ｅｃ
ｏＲＩ　／　Ｓｅａ　　Ｉにより消化された１口Ｃ１８
又はｐＵｃ１９中に挿入し、そしてこれは宿主プラスミ
ド上でｌａｃプロモーターに対して反対の方向をもたら
す、　ＣＭ８９中にトランスフェクトされる場合、得ら
れるベクターｐｓＹｃ１１８７及びｐｓＹｃ１１８８の
両者は、ρ５ＹＣ１１７４によって示されるレベルに匹
敵するアミノペプチダーゼ生成のレベルを示した。これ
らの結果は、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼの遺伝子及び
そのプロモーターの両者が１．２ｋｂのフラグメント内
に位置していることを示す。

第２図は、ジデオキシ配列決定によって決定された１、
２ｋｂのフラグメントの完全なヌクレオチド配列を示す
、ＡＴＧから開始する読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄ
ｉｎｇ　ｆｒａ＋＊ｅ）は、位置２１９〜１０１Ｏであ
り、そして２９，３３３の計算分子量を有する２６４個
のアミノ酸の推定タンパク質をコート′する。推定され
る最初の６４個のアミノ酸は、下の０．３に記載されて
いるような精製タンパク質のアミノ酸配列決定を用いて
得られるアミノ酸に対応する。この読み取り枠に関連す
る２つの並んだプロモーターの位置がまた示され、そし
てＰｌ及びＰ２としてラベルされている。（左のカラム
の数字はヌクレオチドを示し、右のカラムの数字はアミ
ノ酸を示す。

上の１．２ｋｂのフラグメントを、サザン法によって旦
−ユニのゲノムＤＮＡをプローブするために使用し、そ
してそれぞれＰｓｔ　　Ｉ　、　ＥｃｏＲｌ及びＢｓ５
Ｈｎによる消化によって生成された３、　６　、５．２
及び１．３５ｋｂのバンドに対してハイブリッド形成し
く但し、染色体の他の領域に対してはハイブリッド形成
しない）、従って、その遺伝子は、Ｅ、コニ中において
単純複写として存在することを示す。

その遺伝子の３′末端での配列の測定はまた、Ｍｅｔ−
アミノペプチダーゼから下流に同時転写された遺伝子が
たぶん存在しないという結論を導びく。５′末端での配
列の測定は、並列のプロモーターの存在を示す。

推定されるアミノ酸配列１〜２６４（又はその補体）を
コードする、第２図に示されるヌクレオチド配列は、−
船釣に、追加のＮｅｔ−アミノペプチダーゼをコードす
る配列のために細菌性ゲノムＤＮＡをプローブするのに
有用である。従って、この挿入体は、たとえばバシラス
　サブチリス、プソイドモナス又は酵母からこの目的と
するＤＮＡを得るための便利な道具である。ハイブリッ
ド形成に関連する適切な方法は、６ＸＳＳＣ１０，ＯＩ
ＭのＨＤＴ＾、５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ　、　０．５
％のＳＤＳを含む緩衝液中において、６５℃で反応を完
結するのに十分な時間反応せしめ、次に６５℃で３ｘｓ
ｓｃにより洗浄することである。すなわち、これらの条
件下で上の二ックトランスレーシッンされたプローブに
対してハイブリッド形成し、そして本明細書に定義され
ているようなＭｅｔ−アミノペプチダーゼ活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡが、本発明内に含まれ、
そして本発明内のＭｅｔ−アミノペプチダーゼ　タンパ
ク質をコードする。

Ｄ、３．　　Ｅ、コリの５ＹＣ１１７４からのＭｅｔ−
アミノベＮｅｔ−アミノペプチダーゼを、Ｅ　コリのｐ
ｓＹｃ１１７４の粗抽出物から精製し、そしてその精製
されたタンパク質を、種々のペプチド基質を用いてアミ
ノ酸を放す能力について分析した。

精製のためには、Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｔ　ｒｎｆｕｓｔ
ｏｎブイヨン中での旦、ユニのｐｓＹｃ１１７４の一晩
の培養物を、０．２ｍＭのＣｏＣ１ｇを含むＫＰＯ４緩
衝液（２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で２度洗浄し、そして
音波処理した。ＰＭＳＦ（０，１■Ｍ）を、その音波処
理物に添加した。その音波処理物を、遠心分離し、そし
てその上清液を、ＤＥＡＥ−セファロース　ファースト
　フローに通した。酵素を、同し緩衝液中、ＮａＣｌグ
ラジュント（Ｏ〜０．２５Ｍ）により溶離した。Ｎｅｔ
−アミノペプチダーゼ活性を有する画分をプールし、分
子量３０．０００のＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを用
いてｆｉ縮し、そして同じ緩衝液＋１ｍＭのメチオニン
を含むＳ−２００セフアクリルカラムを通した。活性画
分をプールし、そして前のようにして濃縮した。

サブユニットの分子量が、ＳＯＳ　ＰＡＧＥ　（ＳＯＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によっておよそ３２
．０００であることが測定され（Ｌａｅ＊ｓｌｉ、　Ｊ
、Ｍｏｌ影且１．（１９７３）別：５７５〜５９９〕そ
して酵素純度は９５％であることが推定された。従って
、そのタンパク質は、２６４のアミノ酸のタンパク質に
ついてこのおよその予定サイズである。染色されたゲル
のデンシナメーターに基づく量の推定値は、Ｍｅｔ−ア
ミノペプチダーゼが約１５〜２０％の細胞タンパク質で
あることを示した。

Ｎ−末端の配列決定を、精製されたペプチダーゼに対し
て行なった。初めの６５個のアミノ酸についての結果は
第１表に与えられている。

変形されたＬ−アミノ酸オキシダーゼ−ＨＲＰＯＤＡＤ
検定を用いて、−ａ的には、上に記載しているように及
びＴＬＣ法によって、精製されたＭｅｔ−アミノペプチ
ダーゼが種々のペプチド基質からアミノ酸を放す能力に
ついて分析された。初めにふれた検定のためには、タン
パク賞溶液（この場合、細胞溶解物）　１０１１１を、
４ｍＭのＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔｏ、　１　Ｍ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐｉｆ＝７．５及び０．２ｍ
ＭのＣｏＣｌ　ｔを含む基質溶液９Ｏｄ中に添加した。

その反応混合物を含むチューブを、３０°Ｃで１０分間
インキュベートし、そして熱湯槽中に２分間、そのチュ
ーブを置くことによって、その反応を停止せしめた。０
．９１ｄの発色混合物〔Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ０．
２■、ホースラデイツシュ　ペルオキシダーゼ０９０３
■及び○−ジアニシヂン　ジヒドロクロリド０．２■を
含む０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ＝７．４））
を添加した後、そのチューブを、３０℃で３０〜６０分
間インキュベートし、そしてその光学密度を４４０ｎ＊
で読取った。

ＴＬＣ法は、ｎ−ブタノール−酢酸−水（１２０：５０
：３０ｖ／ｖ）溶媒混合物を含むシリカゲルプレートを
使用した。ニンヒドリン試薬によりそのプレートをスプ
レーした後、放出されたアミノ酸を検出し、そして同定
した。

メチオニンは、次のペプチドから放された：Ｍｅｔ−Ａ
ｌａ−Ｍｅｔ　　； Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ　　；Ｍｅｔ−Ｇｌｙ
−Ｍｅｔ　　； Ｎｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ　　； Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； Ｎｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−３ｅｒ−５
ｅｒ−丁ｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ　　；及びＮｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ
−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｃｙｓ　　。

アミノ酸は、次のペプチドからは放されな力１つた： Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　； Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ　； Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　； Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ　； Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　； Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　； Ｍｅｔ−Ａｌａ　； Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　； Ｌｅｕ−八Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−５
ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ　； Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ　　；Ｎｅｔ−
Ｐｈｅ　　； Ｎｅｔ−５ｅｒ　　； Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−１１ｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｙ−
Ｇｌｙ　　；Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｐｒ。

Ｐｈｅ−Ａｒｇ　； Ｇｌｙ−（Ｇｌｙ）ｓ−Ｇｌｙ　； Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； ５ｅｒ−Ｓｅｒ−５ｅｒ　　； Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｙｓＬｅｕ−Ｃｙｓ　　； Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＧｌｎ−Ｌｅｕ　　； Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　　； Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； Ａｌａ−（Ａｌａ）　ｇ−Ａｌａ　； Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ　； Ｌｙｓ−Ｇｌｎ− Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　　； Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　　； Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； １１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　； Ｍｅｔ−へｒｇ−Ｐｈｅアセテート。

そのペプチダーゼ活性は、１ｍＭのＥＤＴＡによって完
全に抑制され、そして最大の活性のためには、約１〜２
００ｍＭのリン酸イオン及び０．０２〜２．ＱｍＭのＣ
ｏ”を要する。

ＣＯ゛２を、Ｍｎ”　、　Ｃｕ”　、　Ｚｎ”又は−区
゛２イオンと取り替えることはできなかった。リン酸カ
リウム緩衝液の代りに丁ｒｉｓが用いられる場合、その
活性はまた、激しく減少するが、しかしこの活性は、ナ
トリウム又はカリウム塩の添加によってもとに戻され得
る。

前記結果から、ペプチダーゼは、Ｎ−末端のメチオニン
のみを切断し、そして他の特異的必要条件もまた有する
ことが明らかである。配列中の第２及び第３アミノ酸の
性質は、重要であるように思え、そしてペプチド中に最
少の３個のアミノ酸が必要とされるように思える。しか
しながら、短鎖ペプチドに基づく結果は、大きなタンパ
ク賞の折りたたみが、残基２及び３に関しての特異性を
変える二次及び三次構造を提供することができる場合、
続くアミノ酸のための必要条件の点から完全に決定的で
あることができない、さらに、その特異性は、条件に依
存し、そして使用される特定の条件下で加水分解を受け
ていないペプチドは、もしその条件が変えられるなら、
まだ加水分解され得る。

第二残基が１．２９人よりも小さならせん半径を有する
側鎖を持つ場合、−ａ的にＮｅｔ−アミノペプチダーゼ
がＮ−末端のメチオニンを切断し、そしてその側鎖のサ
イズが１．４３人よりも大きな場合、−船釣に切断が起
こらないであろうと思われるが、下に記載されているリ
シンＡにおいて著しい例外が存在し、ここでＩｌｅ、す
なわち第ニアミノ酸についてのらせん半径が１．５６人
である。従って、隣接するアミノ酸の影響及び基質の二
次及び三次構造がまた、その特異性に対して影響を及ぼ
すように思える。

さらに、上のようにしてｐｓＹｃ１１７４から精製され
たＮｅｔ−アミノペプチダーゼを、標準の方法及びアジ
ュバントを用いてウサギに注入し、Ｍｅｔ−アミノペプ
チダーゼと特異的に反応する抗血清を得た。

Ｄ、４．　　Ｎ−のＭｅｔ　　　　ＩＬ−２のｐｓＹｃ
１１４３を担持するＥ、コリＭＭ２９４、すなわち、ｔ
ｒｐプロモーターの制御下で、成熟タンパク質中におい
てＮ−末端配列：＾Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｒを育
する組換え体ＩＬ−２ムティンのための発現ベクターを
、旦−ユユｐＳＹＣ１１７４から調製されたプラスミド
Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐｓＹｃ１１７４と名づけられた）と共
に形質転換した。目的とする両プラスミドの存在を示す
、好結果をもたらす形質転換体を、八−ｐｍ及びＴｅｔ
”によって選択した。

両プラスミドを含む細胞を、トリプトファン５０■／］
、カサミノ酸５　ｇ　／　１、アンピシリン５０■／１
及びテトラサイタリン５■／ｌを含む最少培地中で１晩
３７℃で増殖した０次に、その培養物を洗浄し、ＩＬ−
２合成を抑制解除するためにトリプトファンを含まない
同し培地中に再懸濁し、そして３７°Ｃで４時間インキ
ユヘートした。

このようにして産生されたＩＬ−２は、細胞内のＲ体中
に含まれる。そのＲ体を、くり返し音波処理することに
よって精製し、８１１ＭのＥＤＴＡにより洗浄し、そし
て最後に５％ＳＤＳ中に再懸濁した。そのＩｔ−２を、
Ｖｙｄａｃ　Ｃ４逆相カラム及びＯ，１％トリフルオロ
酢酢酸中上セトニトリル対する水のグラジェントを用い
るＨＰＬＣによってさらに精製した。その精製されたＩ
Ｌ−２のためのＮ−末端配列を決定し、そしてその配列
は次の混合物を示した：Ｎｅｔ−＾１ａ−Ｐｒｏ−０〜
５％ Ａｌａ−Ｐｒｏ−２５〜３０％ Ｐｒｏ−７０〜７５％。

上のようにして増殖され、そして誘導された対照培養物
（但し、ｐｓＹｃ１１４３のみを含む）は、生成された
ＩＬ−２を与え、ここでその精製されたタンパク質は、
７０％のＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ及び３０％のＡｌａ−
Ｐｒ。

の組成物を有する。

（ｐｓＹｃ１１４３は、　ｔｒｐプロモーター及び１位
置の正のレトロレギュレーター配列の制御下でＩＣ−２
配列を含む。それはｐＦｃ５１．Ｔ（０，９５ｋｂのＥ
ｃｏＲＩフラグメントとしてこの発現系を含み）及びｐ
ＡＣＹＣ１８４（Ｃ−〇マーカーを担持するｐＵｃ１８
と適合する宿主ベクターである）から製造される。その
発現系は、ｐＦｃ５１．ＴのＥｃｏＲＩ消化物として製
造され、そしてＥｃｏＲＩにより消化されたｐＡｃＹｃ
１８４に連結され、ｐｓＹｃ１１４３を得る。　ｐＦｃ
５１．Ｔは、１９８５年８月３１日に出願された日本特
許第１９０９７６／８５号に広く記載され、そしてこの
開示を引用によりこの明細書中に組み入れる。〕 Ｄ、５．　　Ｍｅｔ−ＩＬ−２のイン　ビトロ　ピロセ
シング精製されたＭｅｔ−アミノペプチダーゼをまた用
いて、精製されたｒＬ−２をイン　ビトロでプロセシン
グした。その反応混合物は、０．０５％ＳＤＳ中、上で
調製された１、７＊／ｄのＩＬ−２を含む原液５０ｐ１
；０．２ｍＨのＣｏＣＩｚを含む０．１　Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ＝　７．５　）　４０メ；及び８Ｉ１
ｇ／Ｍ１の旦−ユユｐｓＹｃ１１７４から精製されたＭ
ｅｔ−アミノペプチダーゼの１：１０希釈溶液ＩＯ！！
ｌを含んだ。その反応混合物を、３０″Ｃで１晩インキ
ユヘートし、そしてプロセシングの度合は、ＳＯ５ＰＡ
ＧＥ及びＮ−末端の配列決定を用いて査定した。第３図
は、未反応のＩＬ−２及び酵素の存在におけるＩＬ−２
に対して行なわれたＳＯ３ＰＡＧＥの結果を示す。イン
キュベーシヨンの後、わずかに低い分子量のタンパク質
の存在が、元のＭｅｔ−先行のタンパク質によって示さ
れるハンドを補充する。酵素処理の前、その精製された
ＩＬ−２のためのＮ−末端配列は、７４％のＭｅ　ｔ　
−Ａ　ｌ　ａ　−Ｐｒｏ及び２６％のＡｌａ−Ｐｒｏで
あり；酵素処理の後、それは９４％Ａｌａ−Ｐｒｏ及び
６％のＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏであった。

Ｄ、６．　　リシンＡの　　ベクターのｐｈｏ　Ａプロ
モーター、リーダー配列及び該リーダー配列のＣ−末端
でＮａｒ　　１部位を提供するように変性されたコード
配列、次にＢ、スリンジエン之ス（Ｂ、ｔｈ肛ｎ「弘５
ｉｓ）の正のレトロレギュレーターを含む、リジンＡ配
列のための宿主ベクターすなわちｐｓＹｃ１０８９を次
のようにして構成した。

５ＹＣ９９７：　Ｎａｒ　　Ｉ　　　を４むように　　
されたプラスミドｐＥＧ２４７、すなわち旧ｎｄｌ［［
／χｈｏ　Ｉフラグメントとして２．６ｋｂのｐｈｏ　
Ａ構造遺伝子を含む２５ｋｂのプラスミドを、ｐｈｏＡ
遺伝子の源として使用した。このプラスミドを門、Ｃａ
５ａｄａｂａｎから得、そしてＧｒｏｉｓｍａｎ、　Ｅ
、八、、など、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　Ｉ　、　Ａｃａ
ｄ。

拡（ＵＳＡ）　（１９８４）影、：１８４０〜１８４３
に示されている方法に類似する方法により構成した。更
に、前記の文献に示されている方法を適用することによ
って、ｐｈｏ　Ａ遺伝子を、いづれかの目的とする主力
ベクター中に便利にクローンすることができる。

ｐＥＧ２４７からの旧ｎｄＩ［Ｉ／Ｘｈｏ　　Ｉによる
２、６ｋｂフラグメントを、精製し、そしてｐＵｃ１８
中にクローンした。この２．７ｋｂプラスミドは、アン
ピシリン耐性マーカー及び目的とする配列の便利な挿入
を可能にするポリリンカーを含む、　　ｐＵｃ１８を旧
ｎｄｌｌ［／Ｓａｌ　　Ｉにより消化し、そしてその線
状ベクターを、単離されたｐｈｏ　Ａフラグメントと連
結した。その連結混合物を用いて、Ｅ、コリＪＭ１０３
又はＪＭ１０５、に匹敵する株のＥ、コリＤＧ９９をＡ
―ρ０に対して形質転換し、そしてｐＵｃ１Ｂ中への挿
入体についてスクリーンされた、好結果をもたらす形質
転換体における中間のプラスミドｐｓＹｃ９９９の構成
を確めた。

目的とするＮａｒ　　Ｉ変性を含むｐＳＹＣ９９７を、
特定部位の突然変異誘発によってｐｓＹｃ９９１から製
造した。　Ｐｖｕ　ＩＩ／Ｐｖｕ　ＩＩによる　７７０
個の塩基対フラグメントを、ｐｓＹｃ９９１から得た。

それはｐｈｏ　Ａプロモーター及び成熟のアルカリ性ホ
スファターゼの上流のＮ−末端配列の部分、及び従って
、完全なリーダー配列もまた含む、このフラグメントを
、Ｍ１３ｗｐＨのＳ−ａ　　１部位に連結し、そして単
鎖ファージを、突然変異誘発のための鋳型として調製し
た。この突然変異誘発においては、次の合成の６−ｍｅ
ｒ ５　　’　　−ＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＧＧＣＧＣＣＴＴ
ＴＧＴＣＡＣＡＧ−３’（上に書いた線はＮａｒ　　Ｉ
部位を示す）は、ブライマー及びプローブとして使用さ
れた。次に、突然変異誘発されたファージ粒子を用いて
、Ｎａｒ　　Ｉ部位を含む、目的とするリーダー配列の
ための源としてＲＦ−ＤＮＡを調製した。

５ＹＣ１０１５：　に、ｘマーカーのパンクボーン　ベ
ク叉二 クロラムフェニコール耐性を提供するｐｓＹｃ１０１５
、レプリコン及びｐｈｏ　Ａ遺伝子における適切な制限
部位をまたｐｓＹｃ９９１から構成する。まずｐｓＹｃ
９９１を、旧ｎｄｍ／Ｂａ＊ＨＩにより消化し、そして
ｐｈｏ　Ａ遺伝子を含むおよそ２．６ｋｂのフラグメン
トを精製し、そして旧ｎｄｍ／ＢａｍＨｒにより消化さ
れたｐＡｃＹｃ１８４からの、精製された３、６５ｋｂ
のベクターフラグメントと連結した。　ｐＡｃＹｃ１８
４はＡＴＣＣから入手可能であり、そしてクロラムフェ
ニコール遺伝子（Ｃ１ｍｌ′）、細菌性レプリコン及び
テトラサイクリン耐性遺伝子における旧ｎｄＩ［［及び
Ｂａ５Ｈ１部位を含む。その連結混合物を用いてＣｌｌ
１１に対するＥ。

２ｉ聞２９４を形質転換し、そしてｐｓＹｃ１０１５の
構成を、制限分析及び配列決定によって確めた。

・　ｈＯＡ−４のヨ ２つの付加中間体プラスミド、ｐｓＹｃ１０５２及びｐ
ｓＹｃ１０７８が、Ｂ、スリンジエンシスの正のレトロ
レギュレーターのための適切な宿主ベクターを提供する
ために構成された。

変性されたリーダーｐＳＹＣ９９７からのｐｈｏ　Ａプ
ロモーター及びＮａｒ　　Ｉ部位を含む、精製された小
さなＨｉｎｄ　ｍ　／　Ｂｓ５ＨＩＩフラグメントを、
旧ｎｄ　ｍ　／Ｂｓ５ＨＩＩにより消化されたｐｓＹｃ
１０１５　（従って、これは変性されていない欠失した
ｐｈｏＡ配列を有する）に結することによってｐｓＹｃ
１０５２を構成した。この得られるベクターｐｓＹｃ１
０５２を、Ｃｍ”に対するＥ、コリ形質転換体において
確認した。

ｐＳＹＣ１０７８は、欠失されたｐｈｏ　Ａプロモータ
ーの前にＢａ５８１部位を有するｐｓｙｃ１０５２の変
性された形である。このＢａ■１１部位を削除するため
に、ｐｓＹｃ１０５２を、部分的なりａｍＦＩ　Ｉ消化
にゆだね、４個のｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリマラー
ゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ）を用いてフィルインし、そして
平滑末端条件下で再連結した。ｐｈｏ　Ａ遺伝子のちょ
うど３′で唯一のＢａ−〇１部位を含む、この目的とす
る得られたプラスミドを、好結果をもたらすＣＩＩ″形
質転換体をスクリーニングした後、確認した。

１（ＣＷ７０１　　：し　ロレギュレー　−の上流のコ
ード配列の発現を促進するために、Ｂ　ス１ンジエンシ
スからの結晶タンパク賞をコードする遺伝子（ｑｌ遺伝
子）の３′配列の能力は、１９８４年８月３１日に出願
されたアメリカ同時係属出願第６４６，５８４号に記載
され、そして特許請求されていて、そしてこの開示を引
用によりこの明細書中に組み入れた。要約すれば、これ
らの配列は、約４３％のシトシン−グアニン残基含有物
を有するステム及びループ構造を形成することができる
、対応するＲＮＡ転写物に転写するＤＮＡ配列によって
特徴づけられている。遺伝子の３′末端からの約３０〜
３００のヌクレオチドを連結する場合、正のレトロレギ
ュレーター効果がその遺伝子発現上に示される。その正
のレトロレギュレーターは、４００ｂｐのＥｃｏＲＩ　
／　Ｂａｗｌ　Ｉ制限フラグメントとして製造され、そ
してそれは平滑末端化され、そしてｐ［Ｊｌ、すなわち
インターロイキン−２のための発現ベクター中に連結さ
れた。

〔ρＬ１１１は、旦−ユニ中で効果的なレプリコン、Ｔ
ｅｔ置装伝子、Ｅ、コリのｔｒｐプロモーター、リボゾ
ーム結合フラグメント及び７０６ｂｐの旧ｎｄＤＩ／Ｐ
ｓｔ　　Ｉ　　ＤＮＡフラグメント（ヒトＩＬ−２のた
めの遺伝子を含む）を含むｐｌ？Ｂｌ？３２２誘導体で
ある。　ｐｌＪｌは、ブダペスト条約下でＡＴＣＣに寄
託され、そして寄託番号第３９４０５号を得る。〕 Ｋｌｅｎｏ−及び２個のｄＮＴＰにより１遺伝子の正の
レトロレギュレーターを含む４００ｂｐのＥｃｏＲＩ　
／Ｂａ層ＨＩフラグメントを平滑末端化し、そしてＴ４
リガーゼを用いてＳｔｕ　　Ｔにより消化されたプラス
ミドｐｌＪｌ中にその平滑末端化されたフラグメントを
連結することによってｐＨＣＷ７０１を完結した。制限
処理分析によって容易に区別できる、挿入体の２つの可
能な方向を得ることができる。ｐＨＣＷ７０１と名付け
られた目的とするプラスミドは、ＩＬ−２遺伝子の３′
末端の近くに、再構成されたＢａｍＨｒ部位を有する。

このプラスミドは、ブダペスト条約下でＡＴＣＣに寄託
され、そして寄託番号３９７５７号を得る。

パＬ田狙餞四１１止 ｐｓＹ０１０８９を完結化するために、ｐＨｃ１４７０
１をＥｃｏＲ１により消化し、にＩｅｎｏ−及び４個の
ｄＮＴＰを用いてフィルインし、次にＢａｍＨＩにより
消化し、そして正のレトロレギュレーターを含む４００
ｂｐのフラグメントを回収した。ｐｓＹｃ１０７ＢをＡ
ｖａ　　Ｉにより消化し、Ｋｌｅｎｏｗ４及び４個のｄ
ＮＴＰによりフィルインし、そして次にＢａｍＨＩによ
り消化した。その連結混合物を、Ｅ　コリＭＭ２９４中
に形質転換し、そして目的とするプラスミドｐｓＹｃ１
０８９、すなわちＣｍ”を与える５、５ｋｂのプラスミ
ドを確認した。　ｐｓＹｃ１０８９は、ｐｈｏＡプロモ
ーターのための配列及びリーダー（Ｎａｒ　　ｒ部位を
有する）配列並びにＢａｓ＋Ｈ１部位のすぐ上流に構造
遺伝子、次に辺遺伝子の正のレトロレギュレーター配列
を含む。

リシンＡ リシンへのコード配列を、ｐＲＡ１２３から、より詳し
くは、ｐＲＡＴｌの構成を通して、下記のｐＲＡ１２３
のＭ１３サブクローンから得た。　ｐｌ？Ａ１２３は１
９８４年８月１７日にＡＴＣＣに寄託され、そして寄託
番号第３９７９９号を得た。ｐＲＡ！２３からのｐＲＡ
Ｔｌの構成は、１９８４年９月２０日に出願されたアメ
リカ特許第６５３，５１５号に広く記載され、そしてそ
の開示を引用によりこの明細書に組み入れた。要約すれ
ば、完全なりシンＡのコード配列（第４図を参照のこと
）を含むｐＲＡ１２３を変性し、アミノ酸２６５の後の
正しい位置に終止コドン及び成熟配列のすぐ先の位置に
開始コドンを有する旧ｎｄｍ／ＢａｍＨＩカセントとし
てこの配列を捷供する。ｐＲＡ１２３をＢａｍＨＩによ
り消化し、およそ８９６ｂｐのＢａｙｓＨＩ　／Ｂａｔ
ａＨｒフラグメントを単離し、そしてＭ１３ベクターに
おける　Ｉａｃプロモーターに関してアンチ−センス方
向においてＭ１３＋ａｐｌＳ中にサブクローンした。そ
のファージの単鎖ＤＮＡを、ブライマーとして、次の配
列： ５　’　−ＣＡＣＡＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡ
ＡＧＧ−３’（ここで、リシンＡ鎖のＣ−末端の３ｅｒ
−ｇｌｎ−ｐｈｅ配列の末端で正しく読み枠を合せてＴ
ＡＡ終止コドンを配置し）、次に、次の配列； ５　　’　　−ＣＴＴ丁ＣＡＣＡＴＴＡＧＡＧＡＡＧＣ
ＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣ−３’（ここで
、リシンＡのＮ−末端の１ｌｅ−ｐｈｅ−ｐｒ。

Ｉｙｓ配列のすぐ上流に目的とする旧ｎｄＩ［［／ＡＴ
Ｇ開始コドンの２回対称軸を配置している）を用いて２
段階のブライマー指示の突然変異誘発にゆだねた。プロ
ーブとして適切な上のプライマーを用いておのおのの突
然変異誘発の後、変性されたファージを同定した０次に
、目的とする構成体を、Ｈｉｎｄｌ［［及びＢａｗＦＩ
　Ｉにより二重消化し、そして適切なりジンＡをコード
するフラグメントを単離した。

旧ｎｄ　Ｉ［［／　ＢａｍＨＩにより消化されたｐＴＲ
Ｐ３と旧ｎｄＩ［［／Ｂａ５ｅｒフラグメントとの連結
によりｐＲＡＴＩを完結した。ｐＴＲＰ３は、下流のＨ
ｉｎｄ　ｍ部位と共にｔｒｐプロモーターを含む、ｐＢ
Ｒ３２２基礎のベクターであり；　ｐＴＲＰは１９８４
年１２月１８日にＡＴＣＣに寄託され、そして寄託番号
第３９９４６号を得た。

ｐＲＡＴｌから完全に由来したコード配列を用いて、ｐ
ＲＡＰ２２９を構成した。それは、（１）順に、旦−ス
リンジエンシス−正のレトロレギュレーター配列、クロ
ラムフェニコール耐性マーカー、適合可能なレプリコン
及びｐｈｏＡプロモーター及びリーダー配列を提供する
、Ｎａｒ　Ｉ　／Ｂａ＋＊ＨＴレプリコン含有のｐｓＹ
ｃ１０８９のフラグメント；　（２）適切に終結された
りシンＡのＣ−末端部分をコードする５ｏｏｂｐフラグ
メントを提供する、Ｃ１ａ　　Ｉ　／Ｂａｗｌ　１によ
り消化されたｐＲＡＴｌ　；及び（３）　　ｐＲＡＴｌ
がらのおよそ３５０ｂｐのＣ１ａ　　Ｉ　／Ｃ１ａ　Ｉ
フラグメントによって提供されるようなＮ−末端配列の
３通りの連結によって得られた。リシンＡ配列はまた、
ｐＲＡＴｌからのＣ１ａ　　Ｉ　（一部）　／ＢａｍＨ
ｒにより切断されたフラグメントとして製造され得る（
そして好ましくは製造され得る）ことが明らかである。

その得られる融合体は、（１）イソロイシン残基を先行
するりシンＡｆＸの開始コドンを保持し；（２）７ｂρ
づつ及び従って、リーダー配列に対する読み枠から分離
され；　　（３））リペブチドの１ｉｅ−５ｅｒ−Ｌｅ
ｕによってｐｈｏ　Ａリーダを延長し；そして（４）リ
シンＡの開始コドンを有するフレームの外にあるが但し
、すぐ近くのＴＧＡコドンでリーダー配列の終結を可能
にする。ｐＲＡＰ２２９は１９８５年３月８日にＡＴＣ
Ｃに寄託され、そして寄託番号第５３４０８号を得る。

Ｄ、７．Ｅ、コリにおけるリシンＡの　　　びプロセシ
ング 旦、ユニＭＭ２９４を、ρＩ？ＡＰ２２９のみにより形
質転換し、又は、ｐＲＡＰ２２９及びｐｓＹｃ１１７４
により同時形質転換した。その形質転換培養物を、Ｍｉ
ｃｈａｅｌｉｓ、など、Ｊ、Ｂａｃｔ、（１９８３）１
５４：　３５６〜３６５に記載されている条件に類似す
る条件下で増殖せしめた。外因性リン酸塩濃度を低め、
そしてその培養物を１６〜１７時間維持することによっ
て、その細胞を誘発する。

その細胞を収穫し、そして界面活性剤の不在中で音波処
理によって調製された全細胞抽出物を、天然のりシンＡ
に対するウサギ抗血清を用いるウェスターン法を用いて
、発現について検定した。

Ｎ−末端のメチル化を査定するために、そのリシンＡを
精製し、そして定量分析のためにエドマン分解にゆだね
た。その細胞を、ρＲＡＰ２２９により形質転換する場
合、リシンＡの４０％がＮ−末端のメチオニンを含んだ
、同時形質転換された細胞は、メチル化された鎖の９％
のみを有するリシンＡを産生した。

Ｄ、８．　　Ｍｅｔ−リシンＡのイン　ビトロ　ブロモ
ジｆ ｐＲＡＰ２２９により形質転換された細胞熔解物からの
精製されたりシンＡ　（６００■）を、０．２ｍＭの塩
化コバルト及び０．１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｆｌ＝７．５）（０，３ａｆの合計体積を有する）中に
おいて、Ｅ、コリｐｓＹｃ１１７４から精製されたＭｅ
仁−アミノペプチダーゼ２４ｔａｒと共に混合した。そ
の反応混合物を３０°Ｃで１晩インキユベートし、そし
て熱湯槽中で加熱することによって停止した。その反応
混合物を脱塩化した後、Ｎ−末端配列をエドマン分解に
よって決定した。　　Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼを含
まない対照混合物は、Ｎ−末端のメチオニンを有するリ
ジンＡの４０％を示し、その同し両分は、上に記載され
ているように、細胞溶解物中に通常見出された。Ｍｅｔ
−アミノペプチダーゼ酵素を含む反応混合物は、タンパ
ク質の８％のみがＮ−末端のメチオニンを含んでいるリ
シンＡを含み、そしてｐＲＡＰ２２９／ρ５ＹＣ１１７
４により形質転換された細胞から得られる百分と実質的
に同じであった。

１９８５年８月２７日、Ｅ、コリ株ｐｓＹｃＩＩ７４を
、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）に基
づいてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃａ１ｔｕｒｅ　
Ｃｅ１ｌｅｃｔｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ番号５３２４５
を得た。これは寄託の日から３０年間保証される。微生
物はブダペスト条約の元で、そして適切なアメリカ特許
の発行後には無制限の入手可能性を保証する出願人とＡ
ＴＣＣの間の契約に基づいて、寄託された菌株はＡＴＣ
Ｃにより入手可能にされるであろう、特許法に従って、
いずれかの政府の権威下で与えられた権利に反してこの
発明を実施する許諾であると解釈してはならない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＮｅｔ−アミノペプチダーゼのタン
パク質から決定されたＮ−末端のアミノ酸配列を示す。 第１図中の１〜４は次の意味を有する。 １：同量のＰＴＩＪ−Ｍｅｔが、その製造における遊離
メチオニンのために、サイクル１に観察された。 ２：サイクル３６及び３７の生成物は、サンプル調製の
間、偶然に混合された。サイクル３８へのキャリーオー
バー（Ｃａｒｒｙｏｖｅｒ　）の定量分析は、アミノ酸
の順序がＴｈｒ−５ｅｔよりかむしろ５ｅｔ−Ｔｈｒで
あることを提案する。 ３：サイクル４３においては確認され得なかった。 しかしながら、ＰＴＭ−デヒドロアラニンの実質量が観
察された。この誘導体は、セリン及びシスティンの両者
から形成される。 ４：配列決定機（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　）におけるフラ
クションコレクター問題を、誘導されるべき複数のサン
プルに引き起こした。 第２図は、第１図に例示されているＮｅｔ−アミノペプ
チダーゼをコードするｐｓＹｃ１１７４の１．２ｋｂ挿
入体を示す。 第３図は、本発明の酵素によりプロセシングされる前及
びプロセシングされた後の精製された組換え体ＩＬ−２
のＳＤＳゲルを示し、そしてこれは図面に代わる写真で
ある。 第４図は、リシンＡについての遺伝子を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌ
   ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを有するＭｅｔ−アミノペプチダ
   ーゼをコードするＤＮＡを得るための方法であって： 下記のＤＮＡ又はその相補体： 【遺伝子配列があります。】 を含んで成るラベルされたＤＮＡにより微生物性ゲノム
   ライブラリィをスクリーニングすることを含んで成る方
   法。 ２、目的の外来性組換え体タンパク質のために、Ｍｅｔ
   −アミノペプチダーゼをコードするプラスミドＤＮＡ及
   び発現ベクターを含む組換え体細菌。 ３、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードする単一のク
   ローン化された組換え体細胞から鋼製された組換え体Ｄ
   ＮＡ。 ４、前記Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードする部分
   がＥ．コリに由来することを特徴とする特許請求の範囲
   第３項記載のＤＮＡ。 ５、プラスミド上に配列されていることを特徴とする特
   許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ。 ６、前記プラスミドがＥ．コリｐＳＹＣ１１７４に由来
   することを特徴とする特許請求の範囲第４項記載のＤＮ
   Ａ。 ７、下記配列： 【遺伝子配列があります。】 を含んで成るＤＮＡ。 ８、６×ＳＳＣ，０．０１ＭのＥＤＴＡ，５×Ｄｅｎｈ
   ａｒｄｔ及び０．５％のＳＤＳを含む緩衝液中において
   、６５℃でハイブリダイゼーション反応を完結するのに
   十分な時間ハイブリダイズし、次に６５℃で３×ＳＳＣ
   により洗浄することに相当するハイブリダイゼーション
   条件下で、下記ＤＮＡ（又はその相補体）：【遺伝子配
   列があります。】 にハイブリダイズすることを特徴とするＭｅｔ−アミノ
   ペプチダーゼをコードするＤＮＡ。