JPH03251811A - 走査型顕微鏡の撮像方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、光学式の走査型顕微鏡において試料像を撮像
する方法、特に詳細には、試料を透過した光の位置ずれ
による画像劣化を防止できるようにした撮像方法に関す
るものである。

（従来の技術） 従来より、照明ビームを微小な光点に収束させ、この光
点を試料上において２次元的に走査させ、その際該試料
を透過した光あるいはそこで反射した光を光検出器で検
出して、試料の拡大像を担持する画像信号を得るように
した光学式走査型顕微鏡が公知となっている。なお特開
昭６２−２１７２１８号公報には、この走査型顕微鏡の
一例が示されている。

従来の光学式走査型顕微鏡においては、上記走査機構と
して、照明光ビームを光偏向器によって２次元的に偏向
させる機構が多く用いられていた。

また、本出願人による特願平１−２４１１ｉ９４６号明
細書に示されるように、送光光学系と受光光学系とを共
通の移動台に搭載し、この移動台を試料台に対して移動
させることにより、照明光光点の走査を行なうことも考
えられている。

（発明が解決しようとする課題） ところで上述のような走査型顕微鏡のうち透過型のもの
、つまり試料を透過した照明光を検出するタイプのもの
においては、この透過光の位置ずれのために、撮像され
た顕微鏡像のコントラストや解像度が劣化しやすいとい
う不具合が認められている。すなわちこの種の走査型顕
微鏡においては一般に、試料を透過した光を、そのハロ
ーや試料で散乱した光をカットするために、ピンホール
を介して光検出器で検出するようにしているが、照明光
が試料において屈折すると、透過光の中心がピンホール
中心から外れて、ピンホール板によってケラしてしまう
のである。

このような不具合を解消するために、ピンホール板を照
明光の走査と同期を取って、上記位置ずれを補償するよ
うに移動させることも考えられる。

しかし、試料における照明光の屈折の程度は、試料毎に
異なる上、さらに同一の試料においても各部分の光学的
性質に応じて変化するので、実際ピンホール板をどのよ
うに移動させれば良いのかを予め知ることはほとんど不
可能である。

そこで、透過光の位置ずれを検出しながら、その検出結
果に基づいてピンホール板の移動を制御することも考え
られる。しかしそのようにする場合は、制御系の応答性
を考慮すると照明光の走査速度を落とさざるを得ず、そ
れにより撮像所要時間が長くなり、通常行なわれている
テレビレートでの顕微鏡像出力はとても不可能となる。

本発明は上記のような事情に鑑みてなされたものであり
、試料を透過した透過光の位置ずれによる画像劣化を防
止可能で、またこの位置すれ補正のために撮像所要時間
が長くなることもない走査型顕微鏡の撮像方法を提供す
ることを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明による走査型顕微鏡の撮像方法は、先に述べたよ
うに照明光を試料上において２次元的に走査させ、 この試料を透過した透過光をピンホール板のピンホール
を介して光電的に検出して、試料の顕微鏡像を担う画像
信号を得る走査型顕微鏡において、上記画像信号を得る
前に、照明光の２次元的走査を行ない、 その際、上記透過光のピンホールからの位置ずれ方向お
よび量を、照明光の各走査位置毎に検出し、 この位置ずれ方向および量を、上記走査位置と対応付け
て記憶手段に記憶させ、 次に上記試料（つまり透過光位置ずれ方向および量検出
のための照明光走査が行なわれたもの）に関する画像信
号を得る際に、照明光の各走査位置毎に、それと対応付
けて上記記憶手段に記憶されている位置ずれ方向および
量通りに、ピンホール板を移動させるようにしたことを
特徴とするものである。

なお上述の位置ずれ方向および量を検出するため照明光
走査は、勿論、撮像操作とは全く別に行なっでもよい。

あるいは同一の試料について複数の顕微鏡像を撮像する
場合には、第ｎ番目の撮像を行なう際に同時に上記位置
ずれ方向および量を検出するようにして、次の第（ｎ　
＋　１）回目の撮像時に、この検出情報に基づいてピン
ホール板の移動を制御するようにしてもよい。

（作　　用） 上記の撮像方法においては、各試料について透過光位置
ずれの特性を実際に検出し、その特性に基づいてピンホ
ール板の移動を制御しているから、位置ずれ補正か正確
になされ得る。

そしてこの位置すれ特性は、顕微鏡像を担う画像信号を
得るための操作に先立って予め調べられており、該操作
に際しては、この特性に基づいてオーブン制御により位
置ずれ補正を行なうようにしているから、この補正は十
分高速で行なわれ得る。

（実　施　例） 以下、図面に示す実施例に基づいて本発明の詳細な説明
する。

第１図は、本発明の方法を実施する装置の一例を示すも
のであり、また第２図は、この装置が搭載された透過型
の共焦点走査型顕微鏡を示している。まず、走査型顕微
鏡の基本構成について、第２図および走査機構を詳しく
示す第３図を参照して説明する。

第２図に示されるように、照明光１１を発するレーザダ
イオード５が、移動台１５に一体的に保持されている。

また移動台１５には、コリメーターレンズ１６および対
物レンズ１７からなる送光光学系１８と、対物レンズ１
９および集光レンズ２０からなる受光光学系２１とが、
互いに光軸を一致させて固定されている。

これらの光学系１８．２１の間には、移動台１５と別体
とされた試料台２２が配されている。そして受光光学系
２１の下方において移動台１５には、光検出器９が固定
されている。この光検出器９としては、例えばフォトダ
イオード等が用いられる。また光検出器９の前側（図中
上方）には、ピンホール８ａを有するピンホール板８が
配されている。

レーザダイオード５から発せられたレーザ光（照明光＞
　１１は、コリメーターレンズ１６によって平行光とさ
れ、次に対物レンズ１７によって集光されて、試料台２
２に載置された試料２３上で（表面部分あるいはその内
部で）微小な光点Ｐに収束する。

試料２３を透過した各透過光１１’　の光束は、受光光
学系２１の対物レンズ１９によって平行光とされ、次に
集光レンズ２０によって集光されて点像Ｑに結像する。

この点像Ｑは、光検出器９によって検出される。この光
検出器９からは、光点Ｐで照射された試料２３の各部分
の明るさを示す信号Ｓが出力される。

なお、上記点像Ｑをピンホール８ａを介して検出するこ
とにより、そのハローや試料２３で散乱した光をカット
することができる。

次に、照明光１１の光点Ｐの２次元走査について、第３
図も参照して説明する。移動台１５は架台３２に対して
、矢印Ｘ方向に移動自在に支持されている。

すなわち架台３２には２本のガイドロッド４０．４０の
一端部が固定され、移動台１５に設けられた２つのガイ
ド孔４１．４１中にこれらのガイドロッド４０．４０が
遊嵌されている。上記移動台１５と架台３２との間には
、積層ピエゾ素子３３が介装されている。この積層ピエ
ゾ素子３３はピエゾ素子駆動回路３４から駆動電力を受
けて、移動台１５を矢印Ｘ方向に高速で往復移動させる
。この往復移動の振動数は、例えば１ｏｋＨｚとされる
。その場合、主走査幅を１００μｍとすると、主走査速
度は、 １０ＸＩＯ３Ｘ１００　×１Ｑ−ｓ　Ｘ２−２ｍ／ｓと
なる。

一方試料台２２は架台３２に対して、上記矢印Ｘ方向と
直角な矢印Ｙ方向に移動自在に支持されている。すなわ
ち架台３２には、２本のガイドロッド４５．４５の一端
部が固定され、試料台２２に設けられた２つのガイド孔
４６．４６中にこれらのガイドロッド４５．４５が遊嵌
されている。上記試料台２２と架台３２との間には、積
層ピエゾ素子４７が介装されている。この積層ピエゾ素
子４７はピエゾ素子駆動回路４８から駆動電力を受けて
、試料台２２を矢印Ｙ方向に高速で往復移動させる。そ
れにより試料台２２は移動台１５に対して相対移動され
、前記光点Ｐが試料２３上を、主走査方向Ｘと直交する
Ｙ方向に副走査する。

なおこの副走査の所要時間は例えば１／２０秒とされ、
その場合、副走査幅を１００μｍとすると、副走査速度
は、 ２０Ｘ１００　ＸＩＯ°６−０．００２　ｍ　／　ｓ冨
２ｍｍ／ｓ と、前記主走査速度よりも十分に低くなる。この程度の
副走査速度であれば、試料台２２を移動させても、試料
２３が飛んでしまうことを防止できる。

なお本実施例では、主、副走査方向ＸＳＹと直交する矢
印Ｚ方向（第２図参照）、すなわち光学系１８．２１の
光軸方向に試料台２２を移動可能としである。この移動
手段は特に図示していないが、上記主、副走査方向への
移動機構と同じものを用いればよい。こうして試料台２
２をＺ方向に所定距離移動させる毎に前記光点Ｐの２次
元走査を行なえば、合焦点面の情報のみが光検出器９に
よって検出され得る。

以上のようにして光点Ｐが試料２３上を２次元的に走査
することにより、該試料２３の２次元像を担持するアナ
ログの信号Ｓが得られる。第１図に示されるようにこの
信号Ｓはアンプ７０によって増幅された後、Ａ／Ｄ変換
器７１によりデジタルの画像信号Ｓｄに変換される。こ
のＡ／Ｄ変換器７１における標本化のタイミングは、同
期信号発生回路７２から入力される同期信号ｓｙによっ
て規定され、また標本化周期は、同じく該回路７２から
入力されるサンプリングクロックＣｓに基づいて定めら
れる。

なお、移動台１５と試料台２２のＸＳＹおよびＺ方向に
ついての相対位置はそれぞれ、例えばリニアエンコーダ
等の位置検出器７３．７４．７５によって検出される。

これらの位置検出器７３．７４．７５が各々出力する位
置検出信号Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３は信号処理回路７６に入力
される。この信号処理回路７Ｂは、入力された各信号Ｓ
１、Ｓ２、Ｓ３に基づいて、上記同期信号Ｓｙおよびサ
ンプリングクロックＣ８の出力タイミングを規定するた
めのリセット信号Ｓ４を出力する。

上述のようにしてデジタル化された画像信号Ｓｄは、画
像メモリ７７に記憶される。その際、画像信号Ｓｄの書
込みタイミングは、上記同期信号Ｓｙに基づいて規定さ
れる。試料台２２を第２図の矢印Ｚ方向に移動させつつ
所定回数の撮像がなされた後、画像メモリ７７から画像
信号Ｓｄが読み出され、この画像信号ＳｄはＤ／Ａ変換
器７８によってアナログ化される。なおこのアナログ化
のタイミング、および画像信号Ｓｄの画像メモリ７７か
らの読出しのタイミングは、同期信号発生回路７９が出
力する同期信号Ｓｙ’　およびクロックＣｓ’　に基づ
いて定められる。アナログ化された画像信号Ｓａは、例
えばＣＲＴ表示装置等の画像再生装置８０に送られ、試
料２３の顕微鏡像再生のために供せられる。

次に透過光１１’の位置ずれ、つまりそのビーム中心が
ピンホール８ａの中心から偏位してしまうことを補正す
る点について説明する。このような透過光１１°の位置
ずれは、レーザ光ｌｌが試料２３において屈折すること
に起因する。そしてこの屈折の程度は、各試料２３毎に
、また同一の試料２３においてもその部分毎に異なるの
が一般的である。

第１図に示されるように、ピンホール板８はＸＹアクチ
ュエータ８１に連結され、該アクチュエータ８１の駆動
によりＸ方向およびＹ方向に移動可能となっている。ま
た本実施例では特に、透過光１１゜が点像Ｑに結像する
位置がＺ方向に変動することも補正するため、集光レン
ズ２０はＺアクチュエータ８２によって光軸方向（矢印
Ｚ方向）に移動されるようになっている。そして集光レ
ンズ２０とピンホール板８との間にはハーフミラ−８３
が配されており、そこで透過光１１’　の一部が反射し
て、２次元光検出器８４に入射する。

この反射した透過光１１°は、２次元光検出器８４の受
光面上で点像Ｑ゛に結像する。この点像Ｑ。

と、顕微鏡像撮像用の光検出器９によって検出される点
像Ｑとは、互いに対応を有する位置関係を保つ。したが
って、点像Ｑがピンホール８ａと同軸に揃うＸＹ面内位
置にあるとき、点像Ｑ゛は光検出器受光面と平行なｘｙ
面内で所定の基準位置にあり、点像ＱがＸ７面内でピン
ホール８ａの中心からある方向にある量だけ位置ずれを
起こせば、点像Ｑ゛　もそれに対応した方向および量で
上記基準位置から偏位する。なお点像ＱがＸ方向にずれ
れば、点像Ｑ°はｘｙ面内でＸ方向にずれ、点像ＱがＹ
方向にずれれば、点像Ｑ゛は同じくＸ方向にずれる。

２次元光検出器８４は受光面上におけるこの偏位のＸ方
向成分、およびＸ方向成分を示す偏位信号Ｂ　Ｘ　％　
Ｂ　Ｙを出力する。上記の通りであるから、偏位信号Ｂ
ｘ、Ｂｙはそれぞれ、点像Ｑのピンホール８ａに対する
るＸ方向、Ｙ方向の位置ずれ量に対応する。これらの偏
位信号ＢｘＳＢｙは、位置ずれ補正用メモリ８５に記憶
される。

一方、ハーフミラ−８３で反射した透過光１１’　の一
部はさらにハーフミラ−８６で反射し、例えば４分割光
検出器等からなるフォーカス検出器８７に入射する。こ
のハーフミラ−８６で反射した透過光１１゜は、点像Ｑ
”に結像する。前記点像Ｑの光軸方向（Ｚ方向）結像位
置は、この点像Ｑ”の結像位置と対応する。フォーカス
検出器８７は、点像Ｑ″の（すなわち点像Ｑの）光軸方
向所定結像位置からのずれを示す偏位信号Ｂｚを出力す
る。この偏位信号Ｂｚも、前記位置ずれ補正用メモリ８
５に記憶される。なお上記光軸方向の結像位置のずれも
、主にレーザ光１１の試料２３における屈折に起因する
。

位置ずれ補正用メモリ８５は例えばＣＣＤ素子からなり
、ＣＣＤ動作信号発生回路８８が出力するＣＣＤ動作信
号Ｓ５を受けて動作し、入力された偏位信号Ｂｘ、Ｂｙ
、Ｂｚを正確に１フレ一ム周期分遅延させて出力する。

したがって、試料台２２をＺ方向に移動させつつ同一試
料２３について複数の顕微鏡像を撮像する際、第ｎ番目
の撮像時にある走査位置ｐ　（Ｘ、　Ｙ）を光点Ｐが通
過したとき得られた偏位信号ＢｘＳＢｙＳＢｚが、次の
第（ｎ＋１）番目の撮像時にその走査位置ｐ　（Ｘ、Ｙ
）を光点Ｐが通過するときに、位置ずれ補正用メモリ８
５から出力されることになる。こうして出力された偏位
信号ＢＸＳＢＹ％　ＢＺはそれぞれ、Ｘ補正ドライバ８
９ａ、Ｙ補正ドライバ８９ｂＳＺ補正ドライバ８９ｃに
入力される。なお、ＣＣＤ動作信号発生回路８８による
ＣＣＤ動作信号Ｓ５の出力タイミングは、前記同期信号
ｓｙおよびサンプリングクロックＣｓに基づいて、レー
ザ光１１の２次元走査と同期が取られている。

Ｘ補正ドライバ８９ａとＹ補正ドライバ８９ｂはそれぞ
れ、ＸＹアクチュエータ８１のＸ方向駆動源、Ｙ方向駆
動源を駆動させるものであり、各々入力された偏位信号
Ｂ　ｘ　ｓ　Ｂ　Ｙに応じた駆動電流Ｄｘ。

ｐｙをこれらのＸ方向駆動源、Ｙ方向駆動源に供給する
。このようにＸＹアクチュエータ８１の駆動が制御され
ることにより、上記第（ｎ　＋１）番目の撮像時に走査
位置ｐ　（Ｘ、　Ｙ）を光点Ｐが通過するとき、ピンホ
ール板８は、第ｎ番目の撮像時に走査位置ｐ　（Ｘ、　
Ｙ）を光点Ｐが通過したときの透過光１１゛　のＸＹ平
面内位置ずれ方向および量に従って移動するようになる
。

またＺ補正ドライバ８９ｃは、偏位信号Ｂｚに応じた駆
動電流ＤｚをＺアクチュエータ８２に供給して、集光レ
ンズ２０を光軸方向に移動させる。こうすることにより
、上記第（ｎ＋１）番目の撮像時に走査位置ｐ　（Ｘ、
　Ｙ）を光点Ｐが通過するとき、透過光圧の点像Ｑは、
第ｎ番目の撮像時に走査位置ｐ　（Ｘ、　Ｙ）を光点Ｐ
が通過したときの、点像Ｑのピンホール板８に対するＺ
方向位置ずれを解消するように該方向に移動する。

上記の実施例においては、ｃｃＤによる遅延線を用いる
ことにより、位置ずれ補正用メモリ８５が偏位信号Ｂｘ
ＳＢｙＳＢｚをあたがも一時的に記憶するように構成さ
れている。しがしこれらの偏位信号ＢｘＳＢｙＳＢｚを
記憶する記憶手段は、このようなもの以外に、例えば第
４図に示すような一般的なフレームメモリ９ｏを利用す
ることもできる。その場合は当然、アナログの偏位信号
Ｂｘ、Ｂｙ、Ｂｚをデジタル化するためのＡ／Ｄ変換器
９１と、フレームメモリ９ｏから読み出された信号ＢＸ
ｓ　ＢＹＳＢｚをアナログ化するためのＤ／Ａ変換器９
２とが必要となる。なお、Ａ／Ｄ変換器９１における各
信号Ｂｘ、Ｂｙ、Ｂｚの標本化周期や、デジタル化され
た信号のフレームメモリ９ｏに対する書込み、読出しの
タイミング等は、前述した同期信号Ｓｙおよびサンプリ
ングクロックＣｓに基づいて規定すればよい。

また上記実施例では、偏位信号ＢｘＳＢｙ、Ｂ２を１フ
レ一ム周期分遅延させて各ドライバ８９ａ１８９ｂ、８
９ｃに入力させるようにしているが、光点Ｐの飛越し走
査（インターレース）がなされる場合は、上記遅延時間
を１フイ一ルド周期分に設定してもよい。そうした場合
、第ｎ番目の撮像時にある走査位置ｐ　（Ｘ、　Ｙ）を
光点Ｐが通過したとき得られた偏位信号Ｂｘ、ＢｙＳＢ
ｚは、次の第（ｎ＋１）番目の撮像時に厳密には、光点
Ｐが上記走査位置ｐ　（Ｘ、Ｙ）から僅かに離れた走査
位置を通過するときにドライバ８９　ａ　ｓ　８９　ｂ
　ｓ　８９　ｃに入力されることになる。しかしこの走
査位置のずれは、原理的には１フレーム内の走査線ピッ
チ分であって極めて小さいので、通常の試料２３におけ
る屈折率分布状態を考慮すれば、実用上は無視できるも
のである。

さらに本発明の方法は、以上説明したように光学系１８
．２１と試料台２２とを相対的に移動させて照明光走査
を行なう走査型顕微鏡に限らず、照明光を２次元的に偏
向させて走査するようにした走査型顕微鏡においても勿
論適用可能である。

（発明の効果） 以上詳細に説明した通り本発明による走査型顕微鏡の撮
像方法においては、各試料について透過光位置ずれの特
性を実際に検出し、その特性に基づいてピンホール板を
移動させて、透過光の結像位置にピンホールを追随させ
ているから、透過光がピンホール板にケラレることか無
くなる。したがって本方法によれば、このケラレによる
顕微鏡像のコントラスト低下、解像力低下が防止され、
高画質の顕微鏡像を得ることができる。

また本発明による走査型顕微鏡の撮像方法においては、
上述の透過光位置ずれ補正をオーブン制御によって行な
っているから、この補正制御が十分高速で実行され得る
。よって該制御のために照明光走査速度を低下させる必
要が無く、撮像速度は高く保たれ得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法を実施する走査型顕微鏡の一例
を示す概略構成図、 第２図は、第１図の走査型顕微鏡の要部を示す正面図、 第３図は、第１図の走査型顕微鏡の照明光走査機構を示
す斜視図、 第４図は、本発明方法実施のために用いられる記憶手段
の別の例を示すブロック図である。 ５・・・レーザダイオード　８・・・ピンホール板８ａ
・・・ピンホール　　　９・・・光検出器１１・・・照
明光　　　　　　１１゛　・・・透過光１５・・・移動
台　　　　　　Ｉ６・・・コリメーターレンズ１７．１
９・・・対物レンズ　　エ８・・・送光光学系２０・・
・集光レンズ　　　　２Ｉ・・・受光光学系２２・・・
試料台　　　　　　２３・・・試料３２・・・架台　　
　　　　　８３．４７・・・積層ピエゾ素子３４．４８
・・・ピエゾ素子駆動回路 ７０・・・アンプ　　　　　　７１．９１・・・Ａ／Ｄ
変換器７２．７９・・・同期信号発生回路 ７３．７４．７５・・・位置検出器　７６・・・信号処
理回路７７・・・画像メモリ　　　　　７８．９２・・
・Ｄ／Ａ変換器８１・・・ＸＹアクチュエータ　８２・
・・Ｚアクチュエータ８３．８６・・・ハーフミラ−８
４・・・２次元光検出器８５・・・位置ずれ補正用メモ
リ ８７・・・フォーカス検出器 ８８・・・ＣＣＤ動作信号発生回路 ８９ａ・・・Ｘ補正ドライバ　　８９ｂ・・・Ｙ補正ド
ライバ８９ｃ・・・Ｚ補正ドライバ　　９０・・・フレ
ームメモリ第２図 事件の表示 平成０２年　特許願 発明の名称 第０４９，８４７ 走査型顕微鏡の撮像方法 補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 照明光を試料上において２次元的に走査させ、この試料
   を透過した透過光をピンホール板のピンホールを介して
   光電的に検出して、試料の顕微鏡像を担う画像信号を得
   る走査型顕微鏡において、前記画像信号を得る前に、前
   記照明光の２次元的走査を行ない、 その際、前記透過光の前記ピンホールからの位置ずれ方
   向および量を、照明光の各走査位置毎に検出し、 この位置ずれ方向および量を、前記走査位置と対応付け
   て記憶手段に記憶させ、 次に前記試料に関する前記画像信号を得る際に、照明光
   の各走査位置毎に、それと対応付けて前記記憶手段に記
   憶されている位置ずれ方向および量通りに、前記ピンホ
   ール板を移動させることを特徴とする走査型顕微鏡の撮
   像方法。