JPH0315761A - 糖転移酵素の活性測定方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な酵素活性測定法に関する。さらに詳しく
は、本発明はオリゴ糖や糖蛋白質、糖脂質などの、いわ
ゆる複合糖質における糖鎖生合成に関与する重要な糖転
移酵素の活性を定量的に測定する方法に関する。また、
本発明は該方法の血液型判定や癌診断などのような医学
や臨床テストにおける使用にも関する。

（従来の技術） 糖転移酵素は、高等動物から細菌に至るまで生物界に広
く存在しており、種々の糖鎖抗原の合成を直接担ってい
ることから、その生物学的役割が注目されている。例え
ば、近年、各種疾患、特に癌化にともなう攻合糖鎖の糖
鎖構造の変化、例えば、ネオラクト系（二型糖鎖）にお
いてαｌ−３のフコース転移が癌化に伴って増えること
、糖鎖の直鎖上の延長がみられることや［ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリ−（Ｊ．Ｂ．Ｃ．）
．２５９（１６），　１０５１１〜＋０５１７，　１９
８４．　　Ｊ．Ｂ．Ｃ．，　２５９（７）．４８７２　
〜４６８０．　１９８４．キャンサー・リサーチ（Ｃａ
ｎｃｅｒＲｅｓ．）．　４６．　２６１９〜２６２６，
　１９８６；　Ｊ．Ｂ．Ｃ．，　２５９（７）．４６８
１〜４６８５．　１９８４：キャンサー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒＲｅｓ，），　４８，　４７５〜４８２，　
１９８８；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
＋ｓ．），　４６．　５９８５〜５９９２．　１９８６
］、また、ネオラクト系に限らず癌化に伴いシアル化が
進むことが知られている［キャンサー・リサーチ（Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．），　４６．　２６１９〜２６２６
．　１９８６；同４８．２２ｌ４〜２２２０．　１９８
８．同４５．　２４０５〜２４１４．　１９８５］。

これらは全て糖耘移酵素が関与していると考えられ、そ
れぞれの糖鎖構造の合成に関与する糖転移酔素の癌性変
化や、量的変化も十分考えられる。

そこで、糖転移酵素活性の測定を癌診断に用いることが
提案されている。

一般に、糖転移酵素の活性は、基質として、糖ヌクレオ
チドのような活性化された糖供与体と、その供与体の糖
を受容する糖受容体を組み合わせて測定される。しかし
ながら、これらの糖転移酵素の活性測定には、多くの技
術的問題が残されており、医学や生物学の研究ならびに
臨床分野における実用的研究における糖転移酵素活性測
定の重要性から簡便で精度の高い測定系の開発が望まれ
ている。

これまで開発された糖転移酵素の測定法としては、通常
、３Ｈあるいは１４ｃで標識した糖ヌクレオチドと溶液
状態の糖受容体とを反応させ、得られた酵素反応生成物
を電気泳動や、種々のクａマトグラフイーなどの手段で
分離した後、生成物中の放射活性を測定する方法が採用
されている。しかし、この方法は生成物の分離が煩雑で
あり、度に多数の試料の測定は不可能である。また、ヒ
ト血液型物質合戊に関与する糖転移酵素の測定で使用さ
れている簡便法が報告されている。この方法は赤血球を
用いて酵素反応を行なった後、その赤血球の型変換を型
特異的抗体で検出し、酵素活性を測定するものである。

しかし、これは定量的測定法というよりは、むしろ定性
的測定法である。

最近、これらの改良測定方法として、１Ｃで標識された
糖ヌクレオチドと不溶性オリゴ糖［ケムバイオメド（Ｃ
ＨＥＭＢ　［　ＯＭＥＤ）社製ＳＹＮＳＯＲＢ］を反応
させ、とりこまれた放射性同位元素をシンチレーション
カウンターで測定する方法［エム・ジェイ・エリスおよ
びアイ・ノエイ・コールドステイン、アーカイブズ・才
ブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（
ＭＪ．ＥＩｉｃｅｓ　　Ｉ．Ｊ．　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ
　：＾ｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）
．　２５４．　３２９　〜３４１．　１９８７３、ある
いは標識されていない糖ヌクレオチドと、糖受容体とを
反応させ、生成した糖転移アクセブターに対してのみ特
異的に結合する物質を利用し、公知の方法で酵素活性を
測定する方法（特開昭６３＝１５２９９８号公報）が知
られている。

しかし、前者の方法においては、反応生成物の分離の煩
雑さは解決されるものの、従来法の欠点でもある非特異
的取り込みなどバックグランドの上昇は解決されない。

また、糖供与体による分析においては糖の結合様式（た
とえば、α２→３）が特定できない。さらに、実際上、
１４Ｃ１３Ｈなどのベーター線は感度が低いため、一般
に、酵素活性の非常に弱い検体の測定は困難である。一
方、後者の方法は受容体、または反応生成物を１！５１
で標識するため受容体または反応生成物は糖蛋白質に限
定される。一般に、糖蛋白質の糖鎖はその構造が全て解
明されていないので、糖蛋白質を用いる限り、特定の糖
転移酵素活性を特異的Ｉこ測定することは困難であると
考えられる。さらに、この測定法では反応生成物と、そ
れと同じ構造を有する検体中の内因性物質を区別して測
定できないため、検体中の該内因性物質の影響を受ける
と言う欠点がある。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者は、かかる従来法の問題を排除して簡便かつ測
定精度が高く、特異性の高い、血液型判定、癌診断など
のような医学や臨床検査に適した糖転移酵素活性の測定
方法について鋭意検討を重ねたその結果、前記の問題が
、 ａ）糖転移酵素の活性測定において、糖受容体として、
不溶性担体または蛋白質に結合した才リゴ糖を用いるこ
と、 ｂ）反応生成物の定量において、糖供与体および糖受容
体と糖転移酵素との反応生成物に特異的に結合する抗体
またはレクチンを用いるか、あるいはこの抗体と、ａ）
に示したオリゴ糖に結合した蛋白質に特異的に結合する
抗体を用いてサンドイッチ法で定量すること、 からなる糖転移酵素活性の新規な測定方法により解決で
きることを見出した。

特開平１−２６０３６４号には、測定すべき糖転移酵素
を含有する検体と、該酵素の基質となる糖を、不溶性担
体に結合した受容体複合糖質からなる固相化受容体複合
糖質と反応させ、検体中の酵素により、それに特異的な
糖鎖を不溶性担体上に生成させる糖転移酵素活性の測定
法が開示されている。この方法では、ついで、生成物を
該糖鎖の構造に対するモノクローナル抗体を標識剤で標
識した標識抗体と反応させ、不溶性担体に結合した標識
抗体の標識剤の活性を測定している。しかしながら、用
いる糖受容体および反応生成物の量の測定による酔素活
性の定量方法は本発明の該新規方法とは異なる。特に、
前記ｂ）におけるサンドイッチ法はこの方法によって全
く示唆されるものではない。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、従来法の欠点を克服した糖転移酵素の測定法
を提供するものであり、その要旨は、第一の方法として
、標識されていない糖ヌクレオチドよりなる糖供与体と
、不溶性担体にオリゴ糖を結合した糖受容体とを検体に
作用させて固定化反応生成物を得、該反応生成物と同じ
構造の検体中の内因性物質を洗浄除去し、この固定化反
応生成物量を測定して糖転移酵素を定量することを特徴
とする糖転移酵素の活性測定方法を提供するものである
。第二の方法は、標識されていない糖ヌクレオチドより
なる糖供与体とオリゴ糖を結合させた蛋白質を糖受容体
とする反応系に、検体を作用させて反応生成物を得、こ
の反応生成物の蛋白質郎分を認識する不溶化抗体で反応
生成物を固定化し、該反応生成物と同じ構造の検体中の
内因性物質を洗浄除去後、生成糖部分を認識する抗体ま
たはレクチンを加え、反応生成物量を測定して糖転移酵
素を定量するサンドイッチ法による糖転移酵素の活性測
定方法である。本発明はまた、これら第一または第二の
方法のいずれかで検体中の糖転移酔素活性を測定するこ
とからなる血液型判定方法を提供するものである。さら
に、本発明は、これら第一または第二の方法のいずれか
で検体中の糖転移酵素活性を測定することからなる癌診
断法を提供するものである。

前記のごとく、糖メクレオチドよりなる糖供与体を糖転
移酵素の存在下、糖受容体と反応させ、反応生成物を分
離して種々の方法により反応生成物を定量することによ
り糖転移酵素の活性を測定する方法は従来より種々提案
されている。

しかし、本発明の方法においては、反応生成物を固定化
した状態で反応系より取り出し得るため、反応生成物の
取り扱いが極めて容易であるのみならず、反応生成物と
同じ構造の検体中の内因性物質の影響を減ずることがで
き、その上、反応生成物の定量法も種々の方法を用いる
ことが可能である。

さらに詳しくは、本発明の第一の方法においては、標識
されていない糖ヌクレオチドを糖供与体とし、不溶性担
体にオリゴ糖を結合した糖受容体を検体に作用させて固
定化反応生成物を得、反応生成物と同じ構造の検体中の
内因性物質を沈浄除去した後、該固定化反応生成物に対
し、特異的に結合する物質としてｌｆｆＪ［識された抗
体またはレクチン、酵素標識された抗体あるいはレクチ
ンを加えて反応させ、公知の方法により固定化反応生成
物中の放射活性、あるいは標識酵素により生ずる色素の
発色度合を測定することにより糖転移酵素の活性を定量
する。

また、標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体とし
、これと、不溶性担体に前記糖受容体が結合した固定化
受容体とを検体に作用させて固定化反応生成物を得、標
識されていない抗体を加えて固定化反応生成物と特異的
に反応させ、結合した抗体量を公知の方法により、この
抗体に対する二次抗体を利用した酵素抗体法により測定
し、糖転移酵素活性を測定することもできる。

さらに、標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体と
し、これと、オリゴ糖を結合した不溶性担体からなる糖
受容体とを、検体と反応させ、得られた固定化反応生成
物に特異的に結合するビオチン化抗体を加え、公知の方
法により、アビジン化酵素により固定化反応生成物の活
性を測定して糖転移酵素活性を測定することもできる。

第二の方法においては、例えば、標識されていない糖ヌ
クレオチドを糖供与体とし、才リゴ糖を結合させた蛋白
質を糖受容体とし、これらを検体と反応させ、得られた
反応生成物をその蛋白質側に特異的に結合する不溶化抗
体で固定化し、反応生成物と同じ構造を有する検体中の
内因性物質を洗浄除去した後、生成した糖部分に特異的
に結合する抗体によってサンドイッチを形成させて公知
のサンドイッチ法により固定化反応生成物を測定するこ
とにより糖転移酵素の活性を測定することができる。勿
論、第二の方法においても第一の方法のように、′！５
Ｉ標識、あるいは酵素標識抗体を用いたり、二次抗体に
ビオチン・アビジンを応用することも可能である。

本発明で用いられる糖ヌクレオチドとしては、ＧＤＰ−
フコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル
ガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、Ｕ
ＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン
酸等が挙げられ糖受容体としては、オリゴ糖、糖脂質、
糖蛋白質等が挙げられる。これらの糖受容体を不溶化さ
せる不溶性担体には、シリカ、ジルコニア、金属等の無
機担体、合成高分子、天然多糖類等の有機担体あるいは
これらの組合せから成る担体が使用出来る。

担体の形状としては、粒子、球、容器の壁等が使用でき
る。不溶性糖受容体は、これらの担体と糖受容体とを公
知の方法により化学的あるいは物理的に結合することに
よって調製される。

糖受容体の具体例としては、Ｎ−アセチルラクトサミン
（Ｇ　ａｌβＩ　→４ＧＩｃＮＡｃ）、ラクトース（Ｇ
　ａｌβｌ→４ＧＩｃ）、ルイスｃ（Ｇ　ａｌβＩ−３
ＧＩｃＮＡｃ）、■１抗原タイプＩ鎖（ＦｕｃａＩ→２
Ｇａｌβ１→３　Ｇ　ｌｃＮ　Ａｃ）、■４抗原タイプ
■鎖（Ｆｕｃα１−＋２Ｇａｌβｌ　→４ＧｌｃＮＡｃ
）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｔ
型抗原（Ｇ　ａｔβＩ→３ＧａｌＮＡｃ）、ルイスａ（
ＧａｌβＩ−３［Ｆｕｃａ　Ｉ→４　］Ｇ　ＩｃＮＡｃ
）、ルイスＸ　（Ｇ　ａｌβＩ−＋４［Ｆｕｃα１　−
３　ＩＧ　ｌｃＮ　Ａｃ）、等の糖鎖を結合させた不溶
性担体（ケムバイオメド社製ＳＹＮＳＯＩＩＲＱ）等が
挙げられる。

一方、オリゴ糖を結合させる蛋白質としては、ヒト血中
（検体）に存在しない蛋白質が望ましく、例えば、牛血
清アルブミン（ＵＳＡ）等の他種動物由来の蛋白質を用
いることができる。

本発明の方法の対象となる糖転移酵素としては、例えば
、フコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセ
チルグルコサミン転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノ
ース転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素等
が挙げられる。

これらの糖供与体と糖受容体に前記酵素を作用させた反
応生成物の例としては、Ａ型抗原（ＧａｌＮＡｃａ　ｌ
−＋３［Ｆｕｃαｌ−＋２］Ｇａｌ）、Ｂ型抗原（Ｇａ
ｌａ　ｆ　４３　［ＦｕｃαＩ→２　］Ｇａｌ）、ルイ
スａ型抗原（Ｇａｌβ１−＋３［Ｆｕｃα１→４］ＧＩ
ｃＮＡｃ）、ルイスｂ型抗原（Ｆｕｃαｌ→２Ｇａｌβ
Ｉ−＋３［Ｆ’ｕｃαｌ−４］ＧＩｃＮＡｃ）、ルイス
Ｘ　（Ｇ　ａｔβＩ→４［Ｆｕｃαｌ−＊３コＧＩｃＮ
Ａｃ）、　ルイスＹ（ＦＬＩＣ（ＩＩＩ＝２ＧａｌβＩ
−＊４　［Ｆｕｃａ　Ｉ−＋３］Ｇ］ｃＮＡｃ）、シア
リル・ルイスＸ（ＮｅｕＡｃα２−＋３　ＣａｌβＩ→
４［Ｆｕｃα１−”３］ＧｌｃＮＡｃ）、シアリル・ル
イスａ（ＮｅｕＡｃａ２−＊３ＧａｌβＩ→３　［Ｆｕ
ｃａ　Ｉ→４　ＪＧＩｃＮＡｃ）、シアリルＴｎ抗原（
ＮｅｕＡｃα２　−ｅ　６ＧａｌＮＡｃα）、Ｔ型抗原
（Ｃ　ａｌβＩ　→３ＧａｌＮＡｃ）、シアリルＴ型抗
原（ＮｅｕＡｃα２−＋３Ｇａｌ７９　１−ｅ３ＧａＩ
ＮＡｃ）、Ｇａ１β　Ｉ→３［ＧＩｃＮＡｃβ！→６コ
Ｇ．ａｌＮＡｃ，ＧＩｃＮＡｃβＩ→６ＧａｌＮＡｃ等
の糖鎖が不溶性担体に結合したものが挙げられる。

本発明の反応生成物に対してのみ特異的に結合する物質
としては、例えば、抗体またはレクチンが挙げられる。

これらの特異的に結合する物質の必要条件としては、糖
供与体である糖ヌクレオチドおよび糖供与体からの糖が
まだ転移していない糖受容体に対しては結合せず、糖供
与体からの糖が転移した糖受容体に対してのみ特異的に
結合しなければならない。

かかる抗体は、それぞれ特定の糖転移酵素により生成さ
れる反応生成物と同じ構造の糖鎖を末端に有する糖蛋白
質、糖脂質、オリゴ糖等で免疫することにより得られる
。一般に、特異的に結合する抗体としてモノクローナル
抗体が用いられるが、これはポリクローナル抗体に比べ
て特異的結合性の点ではるかに有利であるからである。

例えば、Ａ型抗原に対する抗Ａ抗体、Ｂ型抗原に対する
抗Ｂ抗体など各種の抗体が挙げられる。これら各抗体は
前記のようにｌ！Ｊを用いて常法により標識化放射活性
を測定してもよく、あるいは公知の酵素標識抗体方法に
より、標識酵素により生ずる色素の発色度合を測定して
もよい。また、標識していない抗体と、標識した二次抗
体を用いてもよい。

さらに、糖蛋白質を糖受容体として用いるときは、生成
糖を認識する抗体と、蛋白質側を認識する抗体を用いる
公知のサンドイッチ法により測定することもできる。

本発明の測定方法は血液、血漿などの体液のごとき、種
々の検体中の種々の糖転移酵素の活性測定ができる。

特に、本発明の方法は血液型判定および癌診断に用いる
ことができる。さらに詳しくは、血液型特異的糖転移酵
素の測定が血液型判定に採用できる。すなわち、該判定
にはＨ物質合成α（Ｉ→２）フコシルトランスフェラー
ゼ、Ａ型物質合成α（ｌ→３）Ｎ−アセチルガラクトサ
ミニルトランスフェラーゼ、Ｂ型物質合成α（１−３）
ガラクトシルトランスフエラーゼ、Ｌｅ型物質合成α（
ｌ→４）フコシルトランスフェラーゼ、Ｔ型物質合成β
（Ｉ→３）ガラクトシルトランスフェラーゼなどの血液
型特異的糖転移酵素の活性が測定される。

また、癌診断においては、α（ｌ→３）フコシルトラン
スフェラーゼ、α（２→３）シアリルトランスフエラー
ゼ、α（２→６）シアリルトランスフェラーゼ、α（２
→８）シアリルトランスフェラーゼ、β（＋−３）Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフヱラーゼ、β（！→
４）ガラクトシルトランスフエラーゼ、βｌ→６Ｎ−ア
セチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β１→３ガ
ラクトシルトランスフェラーゼなどが測定される。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例ｌ １−１（タイプ■鎖）ハプテン（Ｆｕｃαｌ−＋２Ｇａ
ｌβＩ−＋４ＧＩｃＮＡｃβ→Ｒ）が結合したＳＹＮＳ
ＯＲＢトＩビーズ（ケムバイオメド社製Ｘｌ７．４ｒｕ
＋＋ｏｌノ翫プテン／　２　０　ｍｇビーズ）を糖受容
体として用い、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン３
０ｎｍｏｌ、Ａ４１衝液（住友精化株式会社製ガルサー
ブＡＢ）１００μｅおよび被検血清（血漿）１００μｅ
を加えて、試験管中で３７℃、４時間インキユベートし
た後、生理的食塩水２ｘ（ｌで３回ビーズを洗浄した。

これに１！Ｊｌ識精製抗Ａモノクローナル抗体（比活性
０．０　１　５μＣｉ／μ９）１００μＱおよび緩衝液
（０．１　５Ｍ　　ＰＢＳ，ｐＨ７．２、０．０２％Ｎ
　ａ　Ｎ　３、０．２５％　ＢＳＡ）１　０　０ｔｔＱ
を加えた。

室温で３０分間インキユベートした後、再び生理的食塩
水２ｘ１２で３回ビーズを洗浄し、結合した抗体の放射
活性をガンマーカウンターで測定した。

ＳＹＮＳＯＲＢ　Ａ（Ａ抗原量、０　．　３　８　ｎａ
ｏｌ　／　ｘ９）を標準物質として、前記と同様に１″
■標識精製抗Ａモノクローナル抗体を加え、結合した抗
体の放射活性から、第ｌ図に示す検量曲線を作成した。

各血清（血漿）中のＡ型特異的糖転移酵素活性（試料１
ｚＮ、１時間当りに合成されたＡ抗原量、ｐｍｏｌ）は
、以下のとおりに測定された。

Ａ，　　　　（ｎ＝２０）　　３０５９±　９２９Ａ，
Ｂ　　　（ｎ＝２０）　　２６５７±　４８７Ａｉｎｔ
　　　　（ｎ＝３）　　Ｉ　３　６　０±１１５４Ａｓ
（ＡｔＢ）（ｎ＝６）　　　６２３±　３７９Ａｓ（Ａ
ａＢ）（ｎ＝６）　　　　７０±　　５３Ｂ　　　　　
　（ｎ＝２０）　　　　００　　　　　　（ｎ＝２０）
　　　　０以上の結果は、Ａ型血清（血漿）にのみ存在
するＡ型特異的糖転移酵素活性を短時間のうちに定量す
ることが出来ることを示しており、また、Ａ型亜型や従
来測定が困難であった、Ａ型変異型についても、同様に
それぞれの酵素活性が定量できることを示している。

実施例２ Ｈ（タイブ■鎖）ハプテン（Ｆｕｃα１−ｅ２ＧａＬβ
ｌ＝４Ｇ１ｃＮＡｃβ→Ｒ）が結合したＳＹＮＳＯＲＢ
Ｈビーズ（ケムバイオメド社製）（１　７．４ｎｏ＋ｏ
ｌハブテン／　２　０　ｍｇビーズ）を糖受容体として
用い、ＵＤＰ−ガラクトース３　０ｎｍｏｌ，　Ｂ＠衝
液（住友精化株式会社製ガルサーブＡＢ）１００μｇお
よび被検血清（血漿）■００μａを加え、試験管中で３
７℃、４時間インキユベートした後、生理的食塩水２ｘ
（ｌで３回ビーズを洗浄した。これに１１５目標識精製
抗Ｂモノクローナル抗体（比活性０　０１５μＣｉ／μ
ｇ）ｔｏｏμＱおよび緩衝液（０．１　５Ｍ　　ＰＢＳ
，ｐＨ７．２、０．０２％Ｎａ　Ｎ　ｓ、０，２５％　
＋３ＳＡ）１００μｆ２を加えた。

室温で３０分間インキユベートした後、再び生理的食塩
水２ｘＱで３回ビーズを洗浄後、結合した抗体の放射活
性をガンマーカウンターで測定した。

ＳＹＮＳＯＲＢ　Ｂ（Ｂ抗原量、０　．　３　１　ｒｕ
ｗｏｌ／ｘ９）を標準物質として前記と同様にｌｔＪ標
準精製抗Ｂモノクローナル抗体を加え、結合した抗体の
放射活性から、第２図に示す検量曲線を作成した。

各血ｆｉＩ（血漿）中のＢ型特異的糖転移酵素活性（試
料１村、１時間当りに合成されたＢ抗原量、ｐｍｏｌ）
は、以下のとおりに測定された。

Ｂ　　　　　　（ｎ＝２０）　　７１３±２０９ＡＢ　
　　　　（ｎ＝２０）　　５９１±１７２Ｂｔ（ＡＢｔ
）（ｎ＝４）　　　３５２±２７５Ｂ３（ＡＢ３）（ｎ
＝７）　　　　４　９±　４０Ｉ３１１１（ＡＢＭ）（
ｎ＝７）　　　１５０±　７３Ａ　　　　　　（ｎ＝２
０）　　　Ｑ Ｏ　　　　　　（ｎ＝２０）　　　０ 以上の結果は、Ｂ型血清（血漿）にのみ存在するＢ型特
異的糖転移酵素活性を短時間のうちに定徂することが出
来ることを示しており、また、Ｂ型亜型や従来測定が困
難であった、Ｂ型変異型についても、同様にそれぞれの
酵素活性が定量できることを示している。

実施例３ Ｈ（タイプ■鎖）ハプテン（ＦｕｃαＩ−ｓ２Ｇａｌβ
１−４４０ＩＣＮＡＣβ一Ｒ）が結合したＳＹＮＳＯＲ
ＢＨビーズ（ケムバイオメド社製ＸＩ　７．４ｎｍｏｌ
ハブテン／２０ｘ９ビーズ）を受容体として、ＬＩＤＰ
−Ｎ−アセチルガラクトサミン３０ｒ＋＋ｗｏｌ、Ａ！
？ｊＦ液（住友精化株式会社製ガルサーブＡＢ）１００
μｅおよび被検血ｔｌｌＱＱｕ（ｌを加え、３７℃、１
２〜１８時間インキユベートした後、蒸留水２ｚ（ｌで
３回ビーズを洗浄した。これにアフィニティー精製抗Ａ
モノクローナル抗体（ケムバイオメド社製ＳＹＮＮＡＦ
　Ａ）を０．５％ゼラチンを含むＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ　
７　．　０　）で希釈した溶液２００μＱを加えて室温
で１時間インキユベートし、蒸留水２ＩＩＩＱで３回ビ
ーズを洗浄した。アフィニティーＭ’ｌＪパーオキシダ
ーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体（ＴＡＧＯ）を０．５％ゼ
ラチンを含むＰＢＳで希釈して２００μＱを加え、室温
で２時間インキユベートした後、ビーズを蒸留水２ｘＱ
で３回洗浄した。

Ａ　Ｂ　Ｔ　Ｓ　　Ｈ　＊　Ｏ　ｔ溶液２００μＱを加
えて発色を見た後、シュウ酸を加えて比色（ＯＤ　４　
２　０ｎＩ１）した。生成された抗原量の定量のために
Ａハブテン（ＧａｌＮＡｃαＩ　−＋３　［ＦＬＩＣ（
Ｚ　ｌ　−＋２］Ｇａｌβ−Ｒ）が結合したＳＹＮＳＯ
ＲＢ　　Ａ（０〜４．５ｎｍｏｌ／Ｏ〜２０ｍｇビーズ
）を標準物質として、前記と同様に一次、二次抗体を加
えてインキユベートした。

比色によって第３図に示すＡ抗原量の検量曲線を作成し
た。

亜型、変異型を含めた各型血漿中のＡ型特異的糖転移酵
素活性を調べたところ、Ａ型およびＡＢ型にＡ型特異的
糖転移酵素活性が特異的に検出され、Ｏ型、Ｂ型には検
出されなかった。それぞれのＡ型特異的糖転移酵素活性
（血漿１ｘＱ、１時間当たりに合戊されたＡ抗原量、ｐ
ｍｏｌ）は、以下のとおり測定された。

Δ，　　　　　　（ｎ＝２０）　　２２７８±６６９Ａ
，Ｂ　　　　　　（ｎ−２Ｇ）　　２３１５±６８２Ａ
ｔ（ＡｔＢ）　　　（ｎ＝８）　　　Ｉ　５　５　９±
６２４Ａ＝　　　　　　　（ｎ＝４）　　　　４４４±
３９４以上の結果は、実施例ｌにおける１５■標識した
抗Ａを用いたＲｆＡ法に基づく測定法と同様、Ａ型にの
み存在するＡ型特異的糖転移酵素について、その活性を
特異的に定量できることを示すとともに、Ａ型亜型や従
来測定が困難であった、Ａ型変異型についても簡便に測
定できることを示している。

実施例４ Ｈ（タイプ■鎖）ハプテン（Ｆｕｃα１−ｅ２Ｇａｌβ
！−”４ＧｌｃＮＡｃβ→Ｒ）が結合したＳＹＮＳＯＲ
Ｂ１−１ビーズ（ケムバイオメド社製）（１７．４ｎｍ
ｏｌハプテン７　２　０　Ｂビーズ）を受容体として、
ＵＤＰ−ガラクトース３　０ｒ＋ｍｏｌ．　Ｂａ衝液（
住友精化株式会社製ガルサーブＡＢ）＋００μＱおよび
披検血漿＋００μＱを加えて３７℃、１２〜！８時間イ
ンキユベートした後、蒸留水２ｘＱで３回ビーズを洗浄
した。これにアフィニティー精製抗Ｂモノクローナル抗
体（ケムバイオメド社製ＳＹＮＮＡＦ　Ｂ）を０．５％
ゼラチンを含むＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ　７　．　０　）で
希釈した溶液２００μＱを加えて室温で１時間インキユ
ベートし、蒸留水２ｘＱで３回ビーズを洗浄した。アフ
ィニティー精製パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗
体（ＴＡＧＯ）を０，５％ゼラチンを含むＰＢＳで希釈
して２００μＣを加え、室温で２時間インキユベートし
た後、ビーズを蒸留水２１ＩＱで３回洗浄した。ＡＩ３
ＴＳ−ＨｔＯｔ溶液２００μｇを加えて発色を見た後、
シュウ酸を加えて比色（ＯＤ　４　２　０ｎｍ）Ｌた。

生成された抗原量の定量のためにＢハブテン（Ｇ　ａｔ
αＩ→３［Ｆｕｃαｌ→２］Ｇａｌβ−Ｒ）が結合した
ＳＹＮＳＯＲＢ　　Ｂ（０〜３．１ｎｍｏｌ／０　〜２
　０ｎｇビーズ）をそれぞれ標準物質として、前記と同
様に一次、二次抗体を加えてインキユベートした。比色
によって第４図に示すＢ抗原量の検量曲線を作成した。

亜型、変異型を含めた各型血漿中のＢ型特異的糖転移酵
素活性を調べたところ、Ｂ型およびＡＩ３型にＢ型特異
的糖転移酵素活性が特異的に検出され、Ｏ型、Ａ型には
検出されなかった。それぞれのＢ型特異的糖転移酵素活
性は（血漿１ｘＱ、１時間当たりに合成されたＢ抗原量
、ｐｍｏｌ）は、以下のとおり測定された。

Ｂ　　　　　　（ｎ＝２０）　　１４６５±５７８ＡＢ
　　　　　（ｎ＝１５）　　１５１６±４２６Ｂｗｅａ
ｋ　　　　　（ｎ＝　５）　　　　　７　３　２±６０
７８ｓ　　　　　　　（ｎ−３）　　　　　２　４　２
±１９７Ｂｍ　　　　　　　（ｎ＝６）　　　　　６８
９±３７４以上の結果は、実施例２における１５■標識
した抗Ｂを用いたＲＩＡ法に基づく測定法と同様、Ｂ型
にのみ存在するＢ型特異的糖転移酵素について、その活
性を特異的に定量できることを示すとともに、Ｂ型亜型
や従来測定が困難であった、Ｂ型変異型についても簡便
に測定できることを示している。

実施例５ ンリカに不溶化したオリゴ糖であるＳＹＮＳＯＲＢ　Ｈ
タイプ■鎖ビーズ（８　．　７　ｒｕ＋＋ｏｌハプテン
／ＩＯｍｇビーズ、ケムバイオメド社製）を糖受容体と
し、ＧＤＰ−フコース１５ｎｍｏｌ（住友精化株式会社
製）、ＡＴＰ（シグマ社製）０．４μｍｏｌ、ＭｎＣｌ
ｇ（和光純薬株式会社製）２μｍｏｌ、ＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７　０、シグマ社製）１００μＱ、および被検
血清１０・０μＱを加え、試験管中で３７℃、４０時間
インキユベートした後、生理食塩水２ｘＱで５回ビーズ
を洗浄した。これにＩＪ標識抗ルイスＹ抗体（比活性０
．９μｃｉ／μｇ）２００μＱ（約５　０　０　０　０
ｃｐｍ）を加え、２時間インキユベートした。再び生理
食塩水２ｚＱで５回ビーズを洗浄後、結合した抗体の放
射活性をガンマーカウンターで測定した。

健常人血清および各種癌患者血清中のルイスＹ合成酵素
活性（α１→３フコシルトランスフエラーゼ活性）を第
５図に示す。この結果は、本発明の方法によりこの酵素
活性を定量することができることを示すと共に、この方
法が癌診断に有用であることを示している。

実施例６ 牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を結合したオリゴ糖で
あるＳＹＮＴＡＧＥＮ　Ｈタイプ■鎖（６．３ｎｍｏｌ
ハブテン／０、５μｇ１ケムバイオメド社製）を糖受容
体とし、ＧＤＰ−フコース１５ｎｍｏｌ（住友精化株式
会社製）、ＡＴＰ（シグマ社製）０，４μＩＩｌｏｌ，
　ＭｎＣＩｔ（和光純薬株式会社製）２μａ＋ｏｌ，Ｈ
ＥＰＦ，Ｓ緩衝液（ｐＨ　７　．　０、シグマ社製）２
００μＣ、および被検血清１００μＣを加え、試験管中
で３７℃、４０時間インキユベートした。抗ＢＳＡ抗体
固相化ポリニチレンビーズを１ヶ入れ、２時間さらにイ
ンキユベートした後、蒸留水２ｙｔＱで３回洗浄した。

これにＩｔＪ標識抗ルイスＹ抗体（比活性０．９μＣｉ
／μ９）２００μｇ（約＋０００００ｃｐｍ）を加え、
２時間インキユベートした後、再び蒸留水２ｘＱで３回
ビーズを洗浄後、結合した抗体の放射活性をガンマーカ
ウンターで測定した。

健常人血清および各種癌患者血清中のルイスＹ合成酵素
活性（α１→３フコシルトランスフェラーゼ活性）を第
６図に示す。この結果、前記の不溶化オリゴ糖を糖受容
体に用いた方法と同様に、この方法も癌の診断に有用で
あることを示している。

実施例７ 牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を結合したオリゴ糖で
あるＳＹＮＴＡＧＥＮ　　ルイスＣタイブ■糖鎖（５　
．　８　ｎｓｏｌ／ハプテンｏ．ｓμｇ，ケムバイオメ
ド社製）を糖受容体とし、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸（シグマ社製）３　０ｎｇ＋ｏｌ，　ＡＴＰ（シ
グマ社製）０．４　μＩＩｌｏｌ，　ＭｎＣＩｔ（和光
純薬株式会社［）２μｓｏｆ、ＨＥＰＥＳＩＩ衝液（ｐ
Ｈ　７　，　Ｏ、シグマ社製）２００μｇおよび被検血
清１００μｇを加え、試験管中で３７℃、４０時間イン
キユベートした。抗ＢＳＡ抗体固相化ポリスチレンビー
ズを１ヶ入れ、２時間さらにインキユベートした後、蒸
留水２ｘ（ｌで３回洗浄した。これに目５Ｉ標識抗シア
リルα２−３ルイスＣ抗体（比活性５．２ｕ　Ｃｉ／μ
ｇ）２　０　０　ｕ（Ｉｃ約１　０　０　０　０　０　
ｃｐｓ）を加え、２時間インキユベートした後、再び蒸
留水２ｘＱで３回ビーズを洗浄後、結合した抗体の放射
活性をガンマーカウンターで測定した。

この結果、癌患者血清のα２→３シアリルトランスフェ
ラーゼ（Ｄ活性は、健常人血清に比較して有意に高かっ
た。この事実はこの方法に従って、被検者のα２−３ト
ランスフェラーゼ活性を測定することが癌の診断に有用
であることを示している。

実施例８ 牛血清アルプミン（ＢＳＡ）を結合したオリゴ糖である
Ｔｎ抗原（Ｎ−アセチルガラクトサミニルトレオニン、
ＧａｌＮＡｃａ　１→０　−Ｔｈｒ，　　７．２ｎｍｏ
ｌハブテン／０，５μｇ）を糖受容体とし、ＣＭＰ−Ｎ
−アセチルノイラミン酸（シグマ社製）　３　Ｑ　ｒ＋
ｍｏｌ，ＡＴＰ（シグマ社製）　０　．　４　ｐ　ｍｏ
ｌ，　ＭｎＣ　Ｉ！（和光純薬株式会社製）２μＩＩｌ
ｏ１、ＨＥＰＥＳ［衝液（ｐｔｒ７．０、シグマ社製）
２００μＱおよび被検血清１００μｅを加え、試験管中
で３７℃、４０時間インキスベートした。ついで、抗Ｂ
ＳＡ抗体固相化ポリスチレンビーズＩケを入れ、２時間
さらにインキユベートした後、蒸留水２＊Ｑで３回洗浄
した。これに１！５Ｔ標識抗シアリル２−＊６Ｔｎ抗体
（比活性５．１μＣｉ／μｇ）２００μＱ（約＋０００
００ｃｐｍ）を加え、２時間インキユベートした後、再
び蒸留水２ｍ１２で３回ビーズを洗浄後、結合した抗体
の放射活性をガンマーカウンターで測定した。

この結果、癌患者血清のα２−６ンアリルトランスフエ
ラーゼ活性（［［［）は健常人に比較して有意に高く、
この方法によりα２→６シアリルトランスフェラーゼ活
性を測定することが癌の診断に有用であることを示して
いる。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、生成物の測定に１！５Ｉ漂識さ
れた抗体を使用する場合、液体シンチレーションカウン
ターに代わり、汎用的かつ簡便なガンマーカウンターを
用いることができる。また非ＲＩ標識抗体を使用すれば
、特別な施設を必要とせず、簡単に測定できる。

反応系の特異性については、反応生成物に対して特異的
に反応する抗体またはレクチンを使用するため、その特
異性に優れ、かつ、受容体を不溶化して用いるか、また
は酵素反応生成物のみを固定化して測定するため、反応
生成物と同じ構造を有する、検体中内因性物質の影響を
減ずることが可能となり、この点でも特異性に優れる。

かくして、本発明により血液型特異的糖転移酵素や癌関
連糖転移酵素の活性が簡便かつ精度よく、特異性に優れ
た定量法が確立され、例えば、これを利用して従来判定
が困難であった変異血液型の判定が容易に行なえるよう
になった。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は前記実施例ｌ〜４で用いた検量曲線で
ある。第５図および第６図は前記実施例５および６にお
ける測定結果の分布図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体とし
   、これと、オリゴ糖、糖脂質または糖蛋白質を不溶性担
   体に結合してなる糖受容体とを、検体と反応させて、反
   応生成物を固定化した状態で得、該反応生成物と同じ構
   造を有する検体中の内因性物質を洗浄して除去し、つい
   で、該固定化反応生成物量をその生成物に特異的に反応
   する抗体またはレクチンを用いて測定することにより糖
   転移酵素を定量することを特徴とする糖転移酵素の活性
   測定方法。 （２）固定化反応生成物に特異的に反応する抗体または
   レクチンとして＾１＾２＾５Ｉ標識された抗体またはレ
   クチンを用い、固定化反応生成物の放射活性を測定する
   請求項（１）記載の方法。 （３）固定化反応生成物に特異的に反応する抗体または
   レクチンとして酵素標識された抗体またはレクチンを用
   い、標識酵素により生ずる色素の発色度合を測定する請
   求項（１）記載の方法。 （４）固定化反応生成物に特異的に反応する抗体として
   、標識されていない抗体を用い、結合した抗体量をこの
   抗体に対する二次抗体を利用して酵素抗体法により定量
   する請求項（１）記載の方法。 （５）固定化反応生成物に特異的に反応する抗体または
   レクチンとしてビオチン化抗体またはレクチンを用い、
   アビジン化酵素により固定化反応生成物を定量すること
   を特徴とする請求項（１）記載の方法。 （６）標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体とし
   、これと、オリゴ糖を不溶性担体に結合してなる糖受容
   体とを、検体と反応させて反応生成物を固定化した状態
   で得、該固定化反応生成物の量を測定して糖転移酵素を
   定量することにより検体中の糖転移酵素活性を測定して
   血液型を判定することを特徴とする血液型判定方法。 （７）標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体とし
   、これと、オリゴ糖を不溶性担体に結合してなる糖受容
   体とを、検体と反応させて反応生成物を固定化した状態
   で得、該固定化反応生成物の量を測定して糖転移酵素を
   定量することにより検体中の糖転移酵素活性を測定して
   癌を診断することを特徴とする癌診断方法。 （８）標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体とし
   、これと、オリゴ糖をヒトの体液中に存在しない蛋白質
   に結合させた糖受容体とを、検体と反応させて反応生成
   物を得、該反応生成物を、その蛋白質部分を認識する不
   溶性抗体で固定化し、該反応生成物と同じ構造を有する
   検体中の内因性物質を洗浄して除去し、ついで、反応に
   よって生じた糖鎖を認識する抗体またはレクチンを加え
   、反応生成物量を測定して糖転移酵素を定量することを
   特徴とするサンドイッチ法による糖転移酵素の活性測定
   方法。 （９）生成した糖部分を認識する抗体またはレクチンが
   ＾１＾２＾５Ｉ標識抗体またはレクチンで、その放射活
   性を測定する請求項（８）記載の方法。 （１０）生成した糖部分を認識する抗体またはレクチン
   が酵素標識された抗体またはレクチンで、その標識酵素
   により生ずる色素の発色度合を測定する請求項（８）記
   載の方法。（１１）生成した糖部分を認識する抗体が標
   識されていない抗体で、抗体量をこの抗体に対する二次
   抗体を利用した酵素抗体法により定量する請求項（８）
   記載の方法。 （１２）生成した糖部分を認識する抗体またはレクチン
   がビオチン化した抗体またはレクチンで、アビジン化酵
   素により固定化反応生成物を定量することを特徴とする
   請求項（８）記載の方法。 （１３）標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体と
   し、これと、オリゴ糖をヒトの体液中に存在しない蛋白
   質に結合させた糖受容体とを、検体と反応させて反応生
   成物を得、該反応生成物を、その蛋白質部分を認識する
   不溶性抗体で固定化し、該反応生成物と同じ構造を有す
   る検体中の内因性物質を洗浄して除去し、ついで、反応
   によって生じた糖鎖を認識する抗体またはレクチンを加
   え、反応生成物量を測定して糖転移酵素を定量すること
   により、サンドイッチ法で糖転移酵素活性を測定して血
   液型を判定することを特徴とする血液型判定方法。 （１４）標識されていない糖ヌクレオチドを糖供与体と
   し、これと、オリゴ糖をヒトの体液中に存在しない蛋白
   質に結合させた糖受容体とを、検体と反応させて反応生
   成物を得、該反応生成物を、その蛋白質部分を認識する
   不溶性抗体で固定化し、該反応生成物と同じ構造を有す
   る検体中の内因性物質を洗浄して除去し、ついで、反応
   によって生じた糖鎖を認識する抗体またはレクチンを加
   え、反応生成物量を測定して糖転移酵素を定量すること
   により、サンドイッチ法で糖転移酵素活性を測定して癌
   を診断することを特徴とする癌診断方法。