JPH03130069A - 巨大分子の転移用装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明の分野は、巨大分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋
白等を源媒体から転移媒体に転移するための装置及び方
法、例えば後続ゲル電気泳動に関する。

ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白後続ゲル電気泳動の転移は通常
三つの方法により実施される。古典的な技術は、毛細管
プロッティングで、これは典型的にはゲルに接して一片
の転移膜を置き、次いで転移膜の一方の側に吸収紙を置
くことを含んでいる。

分子は、ゲルから移動して転移膜に転移する。この手段
では、典型的には、ゲルは、ゲルの反対側をさらすこと
により断えず再び水和されて完全にぬれた芯となり、こ
れは転移緩衝剤の大きな保有体と接触している。

巨大分子を転移膜に転移する他の方法は、巨大分子をゲ
ルから転移膜に電気泳動するためのゲルを横切る電気分
野の適用を含んでいる。この方法は、最初に毛細管プロ
ッティングした。それは主に蛋白を転移膜に転移するた
めに一般的である。

しかしながら、その−膜性は、ＤＮＡ及びＲＮＡには維
持しえない。というのも第三の型のプロッティング、真
空プロッティングの導入のためである。

真空プロッティングは、転移膜の一方に真空を適用する
もので、それゆえ液はゲルから転移膜を通って落下する
。このンステムでは、ゲルは、大きな緩衝室に直接に、
又は大きな転移緩衝室に接する完全にぬれた紙に接して
設置される。真空の適用によって、演はゲルから、そし
て転移膜を通って引き出される。これはゲルを部分的に
脱水し、ゲルは緩衝室からの液流によって断えず再水和
されなければならない。この流れは、簡単な重力の及び
毛細管の力によって典型的に管理される。米国特許第４
，７２６，８８９号はかかる真空プロッティングシステ
ムを開示する。

三つの方法のうち、真空ブロッティ、ングは最も速かで
ある傾向がある。しかしながら、真空プロッティングも
電気プロッティングも共に、以下に記載されるように、
特に関心となる巨大分子がＤＮＡ又はＲＮＡである場合
、これらの方法の有効性が限定される傾向にあるという
欠点を伴う。この理由から、古典的な毛細管プロッティ
ングが、今でもＤＮＡ及びＲＮＡの転移に用いられる最
も人気のある方法である。しかしながら、蛋白プロッテ
ィングに対しては、電気プロッティングがほとんど独占
的に用いられる。

ＤＮＡ及びＲＮＡに対する電気プロッティングの欠点は
、転移膜上のＤＮＡ断片の分解が毛細管プロッティング
によるほど有効でなく、転移の効率も良くないというこ
とである。真空プロッティングの欠点は二重である。第
一は、技術が多少やっかいで、はとんどの真空プロッテ
ィング装置が、転移の局所部分で、しばしば転移が一様
に非効率であるか又は非効率であるようにする液又は空
気のもれを進展する傾向がある。真空プロッティングの
第二の欠点は、わずかに最小量の真空が転移膜とゲルの
一方の側に対して適用できのであり、さもなければゲル
は崩壊するであろう。これは典型的に大気圧より約３０
−３５＋＋＋ｍＨ９下の真空（以下、圧力に対してなさ
れる全ての引用は、大気圧に関するものである）。もし
約３０−３５ｍｉＨｇを越える真空が用いられると、液
は非常に速くゲルから引き出されてゲルの再水和が速く
ないので、ゲルマトリックスが崩壊するのを防止できな
い。

ゲルの崩壊は、ゲルの厚さが減少することにより認識で
き、その結果、ゲルから膜への大きな分子の転移が停止
する。それゆえ、−度ゲルが崩壊すると、全体の転移効
率が時に本質的に低下する。

この適用できる真空量が限定されているということは、
転移方法の速度及び／又は全体の効率とも限られること
になる。真空プロッティングに固有の制限によって、Ｄ
ＮＡ及びＲＮＡに従事する人々は、たとえ毛細管プロッ
ティングが６時間から１２時間を必要とし、これに比べ
て真空プロッティングがｌから２時間しか必要としない
にもかかわらず、依然として毛細管プロッティングを行
うことを選んで米た。

毛細管プロッティングに存在する非常に長い時間、真空
プロッティングの信頼できない性質と比較的非効率であ
ること、及び電気転移方法を用いる巨大分子の転移が不
確かで比較的焦心の合せにくいことを考慮し、巨大分子
の転移媒体への転移を遂行する別の手段が必要であった
。本発明は、効率的で、信頼性があり且つ正確な方法で
分子成分を転移するための改良された方法及び装置を提
供することにより、この必要に合致するものである。

発明の構成、作用、効果 本発明は、従来技術のプロッティング方法の欠点がなく
分子転移を促進するために陽圧が使用される装置並びに
方法に向けられる。この目的のため、源媒体、例えばゲ
ルの一方側は陽圧にさらされ得る。媒体の低圧側は、転
移媒体、例えば転移膜にさらされる。源媒体の圧力側に
対し陽圧を適用することで、分子は源媒体から転移媒体
に移り換わる。本発明の通り、このことは、例えば空気
圧、肢圧、空気及び液の圧を応用する手段、又は源媒体
を圧搾する手段を含む種々の手段によってなされ得る。

しかしながら、好ましくは、陽圧の導入は、空気と液の
圧を組合せて応用する手段によってなされる。

第１図を引用すると、本発明は、本体２ｏ及びふた４０
よりなるＩＯとして一般的に表示される外周として具体
化される。外周１０は、耐久性のアクリル又は耐圧性材
料として適した他の材料より構成され得る。しかしなが
ら、アクリルは耐久性で、人の心を引きっけ、又、洗い
やすい。本体２０は、一般に長方形で体質的に平らな底
要素２２と連続的で本質的に平らな下枠２６に伸びてい
る側面２４を含む。下枠２６から底要素２２の平面に垂
直に伸びて、４つのガイド２８かあり、これは図面では
一般的に円筒形のものとして示される。

底要素２２と側面２４に、一対の格子支持要素３０が取
り付けられる。格子支持要素は多くの他の支持形状、例
えば側面２４上に形成されるふたら可能ではあるが、本
質的に長方形である。

測面２４の一つを通って伸びて、圧取付け３２が通口又
は圧排出口を提供している、本体２０の開口している側
面２４に強固な圧シールを保証するのに適した、ステン
レススチール等の材料で形成された４つの引き掛け金３
４が取り付けられる。

下枠２５の上にンールガスケット３６を乗せる。

ンール３６は、ガイド２８と一列に並んで適合され、こ
れを受けるすきま３８を備える。

ふた４０は、一般に長方形で、頂部４２及び、そこから
連続的で本質的に平らな下枠４６に伸びる４つの側面４
４を含む。下枠４６は４つの凹所４８が設けられ、これ
らは、本体２０のガイド２８と一列に並んで適合され、
これを受ける。ふた４０の側面４４の一つに、緩衝剤を
移動させるための液出口を提供する豆コックフィッティ
ング５０が設けられる。ふた４０の頂部４２に、圧入口
と液導入部を提供する圧力フィッティング５２が設けら
れる。４つのステンレススチールの引っかけ５４が対抗
する側面４４に設けられ、本体２０上に引き掛け金３４
をとらえるように位置する。

下枠４６に、本体２０上のガイド２８と一列に並んで適
合され、これを受ける４つのすきま５８を備えたシール
ガスケット５６が設けられる。最後に、抽気弁５９がふ
た４０の頂部４２に設けられ、安全圧力救済弁として働
く。

一般的に長方形で本質的に平らな圧力要素又はマスク６
０が、本体２０とふた４０の間の配置に、ソール用務に
適用される。圧力要素６０は、周辺６２と内部６４を含
む。圧力要素６０は、液体及び気体を一般に通さないヴ
エリロン（商標）又は他の適当な材料から作られ得る。

内部６４の中央口に６６が配置され、これは、好ましく
は装置で用いられるゲル試料よりも面積が小さいように
切られる。

口は、単一のすきまから構成され得るし、又は２あるい
はそれ以上のすきまを含み得る。口は、又、多重すきま
より構成できる。口は、又、例えば透過性の格子やグリ
ッドにより提供されるような多重すきまより構成できる
。マスク６０の周辺６２は、下枠２６と４６及びシール
３６と５６と本質的に形及び大きさが同じであり、そし
て本体２０上のガイド２８と一列に並んで適合され、こ
れを受ける４つのすきま６８を含む。

圧力要素６０の下、格子支持要素３０上に、膜支持グリ
ッドが位置する。支持グリッド７０は、支持膜３０上に
ある枠７２と転移膜の支持を提供する肢体透過性内部マ
トリックス７４からなる。

操作中は、本体２０とふた４０は、シール３６と５６の
間に配置される圧力要素６０と共に掛け金がかけられる
。このように適合させて、圧力要素６０は頂部４２及び
ふた４０の側面４４の組合わせで、第１室を定め、これ
は圧力室と考え得る。

圧力室は、源媒体に圧力をかけるための緩衝容器（加圧
された空気及び／又は緩衝剤用）として働く。

圧力要素６０は、又、底部２２及び本体２０の側面２４
との組合わせで第二室を定め、これは収集室と考え得る
。

第１図の装置を操作するために、本体２０を水準面上に
置き、支持グリッド７０をグリッド支持膜上に置く。シ
ール３６は通常すてに下枠２６に接着されており、従っ
て装置を使用するたびごとに上にのせる必要がない。−
枚のフィルターペーパー８０及びナイロン又は他の適当
な転移膜９０は、支持グリッド７０のマトリックス７４
上に、下位の関係で、その中央部に、膜が圧力要素６０
内の中央口６６と一列に並んで適合されるようにして配
置する。次いで圧力要素６０を、口６８を通って中に伸
びるガイド２８でシール３６上に置く。目的の分子試料
を伴ったゲル＋００を圧力要素６０の内部６４により提
供された支持表面上に置き、口６６を覆うようにする。

次いでふた４０を、通常すでに下枠４６と結合している
シール５６と共に本体２０上に置く。システムは、引き
掛け金３４をかけることにより空気がもれないようにす
る。

第２図を引用して、外周１０は圧力源２００及び液源３
００と結合して作用する。圧力源２００は、経済的に空
気圧源であり得、典型的に電力により少なくとも３０ｘ
ｘで適用可能であり得るが、好ましくは２００＋ｕＨｇ
までの陽圧である。圧力源２００は、動力スイッチ２１
０、圧力出口２２０、圧力調節２３０および圧力ゲージ
２４０を含む。圧力源は、第一の圧力供給線を経て液源
３００と結合する。液源３００は、液容器、即ちビン３
１０及び調節弁４００を含む。

調節弁４００は、圧力源２００からの供給線に結合する
入口４２０よりなる。調節弁４００はさらに液源３００
に含まれる液に伸びる成敗入口４４０及びプランジャー
４８０を含み、該プランジャーは減圧の場合、加圧空気
を源供給線からビン３ＯＯ内に送り、それにより、含有
肢を成敗入口４４０を経て上方に移動させる。プランジ
ャーの位置により、加圧された空気又は液のいずれか調
節弁４００から出口４８０を経て第二の供給線に退き、
これは外周１０のふた４０上の圧力フィッティング５２
と結合して作用する。

しっかり留められた掛け金と適切な液、例えば転移緩衝
剤で充された肢容器とで封入物はまず空気圧のみで加圧
される。これはゲルが圧力要素６０上に堅く着付するこ
とを確実にする。次いでオペレーターはプランジャー４
６０を下に押し、これにより緩衝剤は、緩衝剤レベルが
ゲル上数ミリメートルまで圧力室に送られる。この時点
で、プランジャーは元の位置まで上げられて加圧空気が
付加的に導入される。少なくとも実質的に７５ｚｘＨｇ
、好ましくはＩ　００ｘｘＨｇの最終陽圧が有利に適用
され得ることが決定付けられた。圧力は、調査員次第で
１２０分まで又はそれ以上の間保持され得るが、標準的
な厚さのゲルに対しては通常約１５分である。というの
は、圧力室内の緩衝剤と収集室内の大気圧の間には圧力
差があり、液は緩衝剤からゲル内に流れはじめ、次いで
ゲルを経て転移膜を横切り収集室に入り、ここで転移膜
は試料を受けようとするからである。試料の転移膜５０
への転移後、緩衝剤は加圧されてシステムから豆コック
５０を経て（例えばドレーンホースへ）出され、ユニッ
トは分解されて膜９０が取り除かれる。

上記の加圧手段および方法と異なるものら、又、可能で
ある。例えば圧力室は加圧緩衝液で完全に充たすことも
出来る。別法として、室に肢体又は転移緩衝剤を含有さ
せることなく、圧力室をガス例えば空気で加圧すること
も出来る。加圧空気又はガスは、ゲル上に直接圧力を加
えうる。別法として、圧力室は、ゲルの実寸法とほぼ同
じ大きさにし、又、ゲルを圧搾する手段を備えて分子を
ゲルから転移膜に移し得る。

上記した装置及び方法の利点は、真空プロッティングよ
りもより圧力をゲルに適用できることである。ゲルは、
真空プロッティングにあるような部分的に脱水され、従
ってゲルへの傾向が同一でなく崩壊するということが全
くないと確信される。

少なくとも１００　ｘｉＨｇの陽圧が適用できること及
び−３０ｘｘＨｇでの同一時間の真空プロッティングと
比較して、ゲルから膜への転移が実質的により速やかで
あることが実験的に確かめられた。

１００ａ＋ｘｌ（ｇ陽圧で、ゲル崩壊の形跡は全く見ら
れなかった。転移速度におけるこの改良は正確に定量化
し得ないが、圧力と直線的に変化すると信じられる。即
ち、ＩｏｏｉｘＨｇでの圧力プロッティングは、−３０
又は３５＊ｘＨｇでの真空プロッティングよりも巨大分
子のゲルから膜への転移からｌ／３の時間である。別法
として、真空プロッティングと加圧プロッティングを同
一時間実施した場合は、システムが分子のゲルを使い果
すとか転移膜の結合容量が飽和されない限り、−３５ｆ
ｆｌＨｇでの真空プロッティングに比べｌ　００ｘｘＨ
ｇでの加圧プロッティングは３倍多くの分子を転移させ
ることが出来る。

真空プロッティング以上の本発明の利点を明白にするた
め、本質的に同一量の放射活性標識ＤＮＡを含む二つの
本質的に同一のアガロースゲルを、真空プロッティング
装置又は圧力プロッティング装置のいずれかに置いた。

各ゲルは、同−ＤＮＡの分離できる試料を幾つかの濃度
で含有した。

つのゲルにおける放射活性標識ＤＮＡは、標準の真空プ
ロッティング装置を用い一３ｓｘｘＨｇで転移した。他
のゲル中の放射活性標識ＤＮＡは、本発明の圧力プロッ
ティング装置を用いて＋＋００ｘｙ、Ｈｇで転移した。

両方の転移は１５分間実施した。転移膜を取り出し同一
時間Ｘ線フィルムにさらした。第３図に示されるように
、本発明の圧力プロッティング方法は、ＤＮＡ試料の全
農度において有意により強いシグナルを得た。

陽圧を用いる巨大分子試料の源媒体から転移媒体への転
移装置及び方法をここに開示する。本発明の具体例及び
応用か示され記載されるが、本分野の当業者にとって、
より多くの修飾が本発明概念から通続することなく可能
であることは明らかである。例えば源及び転移媒体とも
支持グリッドなしに圧力要素上に置くことも出来る。さ
らに、転移膜の収集側が大気圧である必要がないことも
確実である。そのうえ、圧力適用方法は適当に、例えば
空気のみ、液のみ、空気−液、又はゲル崩壊によって行
なうことができる。従って本発明は付加された請求範囲
の精神に限定されるできではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に従って構成された装置の分解透視図
である。 第２図は、本発明に従って構成された、圧力及び液供給
部を含む装置の線描写図である。 第３図は、真空プロッティングと本発明に従ったプロッ
ティングによって転移された放射活性ＤＮＡのオートラ
ジオグラフを比較したものである。 図面における主な符号の説明は以下の通りである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）転移媒体と隣接して関連する源媒体を支持する手
   段及び該源媒体に対し陽圧を適用する手段であって、そ
   れにより分子試料が源媒体から転移媒体に移し換えられ
   得るものからなる、源媒体から転移媒体への分子試料の
   転移装置。 （２）圧適用手段が大気圧を導入するものである請求項
   １記載の装置。 （３）圧適用手段が液圧導入手段である請求項１記載の
   装置。 （４）圧適用手段が液圧により起こる大気圧導入手段で
   ある請求項１記載の装置。 （５）圧適用手段が源媒体を圧搾する手段である請求項
   １記載の装置。 （６）その中に形成される転移口を有する加圧室を含ん
   でいる、源媒体に対し陽圧を適用する手段、及び転移入
   口と相対して関連する源及び転移媒体を支持する手段で
   あってこれにより源媒体中の分子成分が陽圧の作用の下
   に転移媒体に移し換えられ得るものからなる、源媒体か
   ら転移媒体への分子成分の転移装置。 （７）転移口がそれに向って開けられている収集室をさ
   らに含んでおり、該収集室は出口を有する、請求項６記
   載の装置。 （８）収集室がその中に緩衝剤を導入するための入口を
   含む、請求項６記載の装置。 （９）源及び転移媒体を支持する手段が、転移口に関連
   して配置された支持格子を含む、請求項６記載の装置。 （１０）源及び転移媒体を支持する手段が、部分的に加
   圧室を定義し、且つその内に形成された転移口を有する
   加圧要素を含む、請求項６記載の装置。 （１１）源及び転移媒体を支持する手段が、部分的に加
   圧室を定義し、且つその内に形成された転移口を有する
   加圧要素及び加圧要素に関連して配置された支持格子を
   含み、該加圧要素は源媒体を支持するために適合されて
   おり、また該支持格子は転移媒体を支持するために適用
   されている、請求項６記載の装置。 （１２）転移口が、陽圧適用の間、媒体を支持するため
   に源媒体よりも小さく作られた単一口である、請求項６
   記載の装置。 （１３）転移口が、陽圧適用の間、媒体を支持するため
   に二つの源媒体よりも小さく作られた二つの口である、
   請求項６記載の装置。 （１４）装置が、掛け金手段により可動しうるように取
   り付けられた本体とふたからなる、請求項６記載の装置
   。 （１５）装置が、接合部で可動しうるように取り付けら
   れた本体とふた、及びふた、加圧室と組合せて定義され
   且つその内に形成された転移口を有する接合部に相対し
   て配置される加圧要素からなる、請求項６記載の装置。 （１６）装置が、接合部で接合された本体とふた、及び
   ふた、加圧室と組合せて定義された加圧要素からなり、
   該加圧要素は接合部を形成する周辺部と周辺部の内側に
   配置された中央部よりなり、転移口は加圧要素の中央部
   に配置された口よりなる、請求項６記載の装置。 （１７）装置が、接合部で掛け金手段により、可動しう
   るように接合された本体とふたよりなり、ふたは加圧室
   から溶液を移動するための圧入口と液出口を含み、本体
   は大気への通口を備える部分及び加圧要素を含み、加圧
   要素は、接合部と、中央に配置された転移口を有する周
   辺部の内側に配置された中央部を形成する周辺部よりな
   り、加圧室はふたと加圧要素により定義され、収集室は
   本体と加圧要素により定義される、請求項６記載の装置
   。 （１８）溶液源に向けて設けられた弁に結合する出口を
   有する加圧空気源を含み、該弁は圧入口に順に結合し、
   且つ位置から調節可能で加圧空気が圧入口に提供される
   、請求項１７記載の装置。 （１９）さらに、加圧要素に隣接して配置され、本体内
   に配置された支持手段により可動しうるように支持され
   た支持格子を含む、請求項１８記載の装置。 （２０）ふたは、それから拡がる側部を備えた頂部から
   なり、本体は、それから拡がる側部を備えた底部からな
   り、これら側部はそれぞれ接合部まで拡がり、各側表面
   は、ふたと本体が接合されたとき、加圧要素の周辺部を
   占める、請求項１９記載の装置。 （２１）さらに、ふたと本体が接合されたとき、加圧要
   素の周辺部と対立してシールするためのふたと本体との
   接合表面に配置されたシール要素を含む、請求項２０記
   載の装置。（２２）さらに、本体の接合表面から拡がる
   格子、及びガイドを受けるよう適用されるふたの接合表
   面に配置された凹部を含み、凹部要素の周辺部と接合表
   面に配置されたシール要素は、ガイドを受けるために適
   当に開口している、請求項２１記載の装置。 （２３）転移媒体に対し基部の関係にある源媒体を設置
   すること、及び源媒体に陽圧を適用することの段階より
   なり、それにより分子成分が源媒体から転移媒体に移し
   換えられる、源媒体から転移媒体への分子成分の転移方
   法。 （２４）陽圧が加圧された空気と液体により供給される
   、請求項２３記載の方法。 （２５）陽圧が加圧ガス、次いで液体の適用により行な
   われる請求項２３記載の方法。 （２６）陽圧が加圧空気のみにより供給される請求項２
   ３記載の方法。 （２７）陽圧が加圧液体のみにより供給される請求項２
   ３記載の方法。 （２８）陽圧が源媒体に作用する機械的手段により供給
   される請求項２３記載の方法。 （２９）分子成分がＤＮＡ，ＲＮＡ又は蛋白から選択さ
   れる、請求項２３、２４、２５、２６、２７、２８又は
   ２９記載の方法。 （３０）源媒体がアガロースゲルで、転移媒体が膜であ
   る、請求項２３、２４、２５、２６、２７又は２８記載
   の方法。 （３１）分子成分がＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白からなり、
   源媒体がアガロースゲルで転移媒体が膜である、請求項
   ２３、２４、２５、２６、２７又は２８記載の方法。 （３２）フィルターが膜に隣接して、ゲルから離れて配
   置される、請求項３１記載の方法。 （３３）転移媒体の一方の側に適用される圧力が、転移
   媒体の逆側に及ぼす圧力よりも少くとも約７５ｍｍＨｇ
   上である、請求項２３、２４又は２５記載の方法。 （３４）転移媒体に対し基部の関係にある源媒体を設置
   すること、及び空気圧源及び／又は液体源から源媒体に
   陽圧を適用することの段階よりなり、空気圧と液の源は
   、互いに且つ源媒体と適当に関連し、且つ源媒体に空気
   、液又はそれらの組合せのいずれかを供給するために選
   択的に使用できる、源媒体から転移媒体への分子成分の
   転移方法。 （３５）本体、該本体は一般に平らな底部と該底部から
   連続基床に拡がる側部を含む、該側部に設けられた本体
   掛け金手段、該本体の内部から外側に伸びる出口、本体
   及び基床から伸びるガイド内に内側に配置された格子支
   持要素、ふた、該ふたは頂部と該頂部から連続ふた床に
   伸びる側部、該本体掛け金手段に対応するために設けら
   れた該側部に付された頂部掛け金手段、外部陽圧源に関
   連するため該ふたに配置された圧入口、緩衝液を導入す
   る液入口と該ガイドを受けるために設けられた該ふた床
   に配置された凹所、該床上に配置された一対の圧力シー
   ル部、該グリッド支持膜上に配置された膜支持格子、及
   び該シール部の間に配置された周辺部と、その中に口を
   有し、加圧空気用の通路を設えている内側部よりなる加
   圧要素からなる、源媒体、例えばアガロースゲルから転
   移媒体、例えば膜に巨大分子、例えばＤＮＡを転移する
   装置。