JPH0280687A - リグノセルロース材料の酵素脱リグニン方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の技術的分野］ 本発明はリグノセルロース材料の酵素脱リグニンの１段
階法、または多段階法に関する。さらに詳しくは、本発
明はパルプおよび製紙産業に用いるためのリグノセルロ
ース材料の酵素脱リグニンの改良方法に関する。 化学的パルプ化では、リグニンを分解する強い化学的酸
素化剤でリグノセルロース材料を処理する。化学的パル
プ化はリグニン・マトリックスの大部分を除去し、セル
ロース繊維を遊離させて、パルプの形成を生ずる、クラ
フト（硫酸塩）亜硫酸塩法、ソーダ法および改良亜硫酸
塩法によって最も一般的に実施される０例えば、クラフ
ト（硫酸塩）法は残留リグニンを５〜８重量％含むにす
ぎないパルプを製造し、最初のリグニン含量を約１／３
〜１１５に減する。上記パルプ化方法は、殆んど排他的
に残留リグニンのために、暗色のパルプを生ずる。 好ましい鮮明な紙製品を製造するには、パルプを増白す
るかまたは漂白しなければならないや最も一般的に用い
られる漂白方法は、塩素または、例えば塩酸カルシウム
、塩酸ナトリウムおよび二酸化塩素のような、塩素含有
化合物を用いる。これらの方法はリグニンを除去するこ
とによりてまず第一にパルプを漂白する。通常は塩素化
とアルカリ抽出である、最初の工程は効果的な漂白をも
たらすが、重大な欠点をも有する。第１に、これらの処
理の苛酷な性質がセルロース繊維の有意な分解と繊維長
さの短縮とを生ずる。従ってセルロース繊維の分解を最
小にするような漂白方法が望ましい。 他の重要な欠点は、高度に腐食、性の流出液が多数の塩
素化リグニン分解生成物を含み、その中の幾つかが有害
であり、突然変異誘発性または発癌性の恐れがあること
である。この流出液は重大な廃棄物処理問題を有してい
る。さらに他の欠点は高度に腐食性の塩化物がプラント
の装置に作用し、流出液の再循環を妨げることである。 最後に、この流出液の腐食性はプラントの従業員を危険
にさらすことになる。これらの理由から、漂白に必要な
塩素を減する代替漂白方法が産業界から非常に求められ
ている。 前記漂白方法の種々な欠点を克服するために、無公害性
の酵素漂白方法の開発が求められている。幾つかの種類
の微生物はセルロースまたはへミセルロースに作用する
ことなく、リグニンを変性または分解する酵素を分泌す
る。最も高範囲に研究されている種類のリグニン分解微
生物は白腐れ菌（ｗｈｉｔｅ　ｒｏｔ　ｆｕｎｇｉ　）
である。、：ノ種ノ最も知られている菌はファネロケー
テ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　
ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ　）である。 しかし、これらの菌をパルプの漂白に直接用いることは
不利である。菌による脱リグニンは非常に緩慢であり、
感知できる程度に増白するには少なくとも数日間を要す
る。他の欠点は、菌がセルロースおよびヘミセルロース
を分解する酵素をも分泌することであり、これは最も好
ましくない副作用である。結局、この方法は菌が生育で
きる限定された条件下でのみ実施することができる。こ
れらの障害の幾つかを克服するために、菌培養物に基づ
く酵素製剤（ｐｒｅｐａｒａＨｏｎｓ）の使用が研究さ
れている。 白腐れ菌は多くの酵素の協同作用によってリグニンを二
酸化炭素と水に完全に分解すると考えられる。この複雑
なプロセスの基礎をなす機構をここで説明する。 最近、白腐れ菌（ファネロケーテ・クリソスポリウム）
のリグニン分解系の幾つかの酵素が単離され、部分的に
特徴づけられている。リグニン・ペルオキシダーゼ（Ｌ
ｉＰ酵素）と名づけらねた酵素族のｌ族は脱リグニンに
最も直接的に感応する酵素であると一般に考えられる。 ＬｉＰ酵素は活性のために過酸化水素を必要とする。こ
れらの酵素の脱リグニン活性はベラトリル・アルコール
（２，３−ジメトキシベンジル・アルコール）をベラト
リルアルデヒド（２，３−ジメトキシベンジルアルデヒ
ド）に酸化するそれらの能力に換算して一般に測定され
る。従って、ベラトリル・アルコールは、リグニン・モ
デル化合物として従来技術において用いられており、そ
の酸化はリグニンを分解する酵素の存在を診断する（「
リグニナーゼ（ｌｉｇｎｌｎａｓｅ）　Ｊとしても好ま
れている）。 脱リグニン・プロセスに関係することが最近示唆された
他のファネロケーテ・クリソスポリウム酵素は、以下で
ｒＭｎＰ、１と呼ばれる、Ｍｎ（ＩＩ　）依存性ペルオ
キシダーゼ（ｒＮＡＤＨ−酸化ベルオキシダーゼ」とし
ても知られる）である。ＭｎＰ酵素は、ＬｉＰ酵素と同
様に、過酸化水素を必要とするが、Ｍｎ（ＩＩ）をも必
要とする。ＭｎＰはベラトリル・アルコールを酸化しな
い。しかし、ＭｎＰは２．２′　−アジノービス（３−
エチル−６−ベンゾチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴ
Ｓ）（ジェイ、ケイ、グレン（Ｊ、に。 Ｇｌｅｎｎ）とエム、エッチ２　ゴールド（Ｍ、Ｈ，Ｇ
ｏｌｄ）「リグニン分解性担子菌、ファネロケーテ・ク
リソスポリウムからの細胞外Ｍｎ（Ｉｔ）依存性ペルオ
キシダーゼの精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｆ　
ＡｎＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍｎ（ＩＩ　）−Ｄ
ｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＦｒｏｍ　Ｔ
ｈｅ　Ｌｉｇｎｉｎ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　Ｂａｓｌｄ
ｏｍｙｃｅｔｅ。 Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉ
ｕ＋ｓ　）　Ｊ　、アルチ、バイオケム、バイオフィズ
、（＾ｒｃｈ、　ＢＩｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　２４２（２）３２９−４１頁（１
９８５年）〕およびフェノールレッドを含めた幾つかの
染料を酸化する。フェノールレッドの酸化はＭｎＰ活性
の一般に用いられている測定法である〔エム、クワハラ
（Ｍ、にｕｗａｈａｒａ）等、「ファネロケーテ・クリ
ソスポリウムのリグニン分解性培養物からの２　ｆｌ類
の細胞外Ｈ２Ｏ２依存性オキシダーゼの分離と特性化（
５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃｔｅ
ｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｔｗ。 Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｈ２Ｏ２−Ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ　０ｘｉｄａｓｅｓ　Ｆｒｏａ＋Ｌｉ５ｎｉｎｏ
ｌｙｔｉｃ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｐｈａｎｅｒｏ
ｃｈａｅｔｅｃｈｒｏｓｏｓｐｏｒｉｕａ＋　）　Ｊ　
、フェツス・レット（ＦＥＢＳＬｅｔｔ、ｓ）　、１６
２（２）、２４７−５０頁、（１９８４年））。リグニ
ン分解系におけるＭｎＰの「実際の」役割は不明である
。ＭｎＰはＬｉＰ酵素が必要とする過酸化水素を発生さ
せることによってリグニン分解プロセスに関係すると仮
定されている。この仮説は、ＭｎＰによるＮＡＤＨ酸化
の副生成物として過酸化水素が発生するという発見によ
って、一部は考えつかれた〔ワイ、アサダ（Ｙ、＾５ａ
ｄａ　）等、「リグニン分解性端子菌、ファネロケーテ
・クリソスポリウムによって産生される細胞外ＮＡＤＨ
酸化性ペルオキシダーゼ（Ａｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕ
ｌａｒ　ＭＡＤＨ−Ｏｘｌｄｌｚｉｎｇ　Ｐｅｒｏｘｉ
ｄａｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　Ｂｙ　Ａ　Ｌｉｇｎｉｎ
−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　　Ｂａ５ｉｄｆｏｏ＋ｙｃｅｔ
ｅ　　、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ　）　Ｊ　、ジエイ、フエルメント、チクノ
ール、　　（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔａｃｈｎｏｌ、）
　、６５（４）、４８３−８７頁（１９８７年））。 ファール（Ｆａｒｒｅｌｌ）等の米国特許第４．６８７
７４１号は（１）　ファネロケーテ・クリソスポリウム
変異菌株ＳＣ２８から精製したリグニン分解酵素、（２
）　ファネロケーテ・クリソスポリウム変異菌株ＳＣ２
８、および（３）これらの精製酵素を用いた木材パルプ
中のリグニンの分解および変性方法に関する。ファール
の米国特許第４，８８７，７４５号はファネロケーテ・
クリソスポリウム菌株ＳＣ２６から生じた酵素を用いて
機械パルプの強度特性および白色度安定性の強化方法に
関する。ファールの米国特許第４，６９０，８９５号は
ファネロケーテ・クリソスポリウム菌株ＳＣ２８から生
ずる酵素を用いたクラフト・パルプの漂白方法に関する
。これに対し、本発明はファールの特許に述べられた方
法とは実質的に異なる、リグノセルロース材料の酵素脱
リグニンの新規な方法に関する。 ［発明の概要］ 本発明は、菌類に由来する酵素製剤にょろりグツセルロ
ース材料の効果的な脱リグニンの実用的な方法に関する
。 本発明の目的は、高粘度を有し、改良された白色度とす
ぐれた強度特性とを示す紙を製造できる漂白リグノセル
ロース・パルプを形成し、各工程と洗浄工程からの流出
液が他の工程からのパルプの洗浄に用いるために再循環
できる方法を提供することである。 本発明の他の目的は、１つ以上の酵素脱リグニン工程な
らびに１つ以上の従来の漂白工程を含む多段階漂白方法
を提供することである。 １態様では、リグノセルロース材料を過酸化水素の低定
常状体濃度の存在下での適当な反応条件において、リグ
ニン分解酵素製剤で処理する。好ましい態様では、次の
試薬の少なくとも１種類も存在する：Ｍｎ（１１）；α
−ヒドロキシ酸；非イオン洗剤または両性イオン洗剤：
および／またはリグニン分解酵素の基質として用いられ
る置換芳香族アルコール。 好ましい態様では、酵素による処理後に、リグノセルロ
ース・パルプに対してアルカリ抽出工程、水による洗浄
および希酸抽出工程を実施する。洗浄工程と抽出工程と
を伴う酵素脱リグニンの１工程が本発明による１段階酵
素脱リグニン・プロセスを構成する。他の好ましい態様
では、リグノセルロース材料に対して各段階が上記工程
から成る多段階脱リグニン・プロセスを実施する。 ［発明の詳細な説明］ 本発明の方法に用いる好ましいリグノセルロース材料は
周知の亜硫酸塩法、硫酸塩もしくはクラフト法、ソーダ
法および変性亜硫酸塩法によフて製造されたような木材
パルプである。本発明の方法は軟木パルプと硬水パルプ
の両方の有意性のある脱リグニンをもたらす。本発明は
特に、酵素脱リグニンが増白を容易にもたらすほど未処
理パルプのカッパ数（ｋａｐｐａ　ｎｕｍｂｅｒ）がす
でに低いような硬水クラフト・パルプの漂白に有用であ
る。広範囲なりラフト処理によって生ずる軟木パルプ（
漂白前カッパ数８を有する）の有意な増白も観察されて
いる。しかし、標準的クラフト方法によって生ずる軟木
パルプは非常に高いリグニン含量と、少なくとも２０の
漂白前カッパ数とを有する。このようにカッパ数の高い
パルプによって１段階または２段階酵素脱リグニン方法
で達成される脱すグニン度は、有意な増白を生ずるほど
まだ充分ではない。しかし、３段階以上の酵素脱リグニ
ン段階から成る本発明による方法は、測定可能な増白を
生ずるほど充分な、南洋産（ｓｏｕｔｈｅｒｎ）軟木ク
ラフト・パルプの脱リグニンを達成した。 本発明の方法によって達成されるリグノセルロース材料
の不完全脱リグニンは、このパルプを完全に脱リグニン
し、漂白するために必要な漂白剤量を減する有益な効果
を有する。従って、漂白プラントの廃棄流出液流に含ま
れる塩素化有機物レベルは減少すると考えられる。 機械パルプ、熱機誠パルプおよび化学熱機域パルプの酵
素脱リグニンも考えられる。 さらに、本発明の脱リグニン方法はパルプ形成に有益な
効果を有するので、不完全パルプ化リグノセルロース材
料の脱リグニンと増白が製紙への直接使用に通したパル
プを生ずると考えられる。 本発明の方法によって脱リグニンされるリグノセルロー
ス材料は、酵素脱リグニンの前に、水で洗浄するかまた
は他の処理を施すことができる。 化学パルプも、酵素脱リグニンの前に希エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）（５〜１００　ｍＭ）または他の
希キレート剤によって洗浄してから、水によって充分に
洗浄することができる。リグノセルロース材料を、酵素
脱リグニンの前に、例えば１０〜２００ａ＋Ｍ酢酸のよ
うな希酸によって洗浄することも有利である。これらの
洗浄工程中のパルプ粘稠度は通常０．Ｉ　Ｎ１０．０零
の範囲である。 白腐れ菌、褐色腐れ菌（ｂｒｏｗｎ　ｒｏｔ　ｆｕｎｇ
ｉ）または乾腐病菌（ｄｒｙ　ｒｏｔ　ｆｕｎｇｉ）に
由来するリグニン分解酵素製剤が本発明のために有用で
ある。これらの天然生成菌の変異菌株に由来する酵素も
、特に変異菌株が目的のリグニン分解酵素の産出量を増
加させるために選択された菌株である場合に、有用であ
る。白腐れ菌に由来する酵素の使用が好ましい。ファネ
ロケーテ・クリソスポリウムに由来する酵素の使用が特
に好ましい。この菌の頬内なる菌株も用いることができ
るが、好ましい菌株の例にはＳＣ２６（ノザン　リージ
ョナル　リサーチラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）　　（Ｎ　ＲＲＬ）　＃１５９７８　）　、　ＭＥ
−４４６（アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクシ
ョ：／　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　（：ｕｌｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（Ａ　ＴＴ　Ｃ）　＃
３４５４１　）およびＶＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＴ　
Ｃ＃　２４７２５　’）がある。 好ましいリグニン分解酵素は通常、菌類から細胞外培養
培地に分泌される。この培地を回収し、好ましい程度の
濃度と酵素精製とに達するように処理する。培養条件と
回収時間は、回収される総リグニン分解活性量ならびに
種々のリグニン分解酵素の各々の相対割合に影響を与え
る。 回収した培養培地は、例えばセルラーゼまたはプロテア
ーゼのような好ましくない酵素を比較的含んでいないか
ぎり、脱リグニン・プロセスに直接用いることができる
。しかし、脱リグニン反応に用いる前に培養培地を濃縮
することが好ましい。 例えば凍結乾燥、高級塩、ポリエチレングリコール、ア
セトンおよびアルコールによる沈降のような酵素活性を
保護する濃縮方法を用いることができる。これらの濃縮
方法のいずれかを用いる場合に、酵素を適当な１！衝液
（例えば酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ジメチル
・コハク酸ナトリウムまたはコハク酸ナトリウム、ｐ）
１３−５において）中に再構成して、脱リグニン反応に
用いるための非分画（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）
酵素濃縮物を得ることができる。この代りに、凍結乾燥
物または沈殿物を脱リグニン反応に直接加えることもで
きる。 好ましい濃縮方法は細胞外培養培地の加圧透析による方
法である。典型的な細胞外酵素濃縮液は０．５〜２０．
００７ｍ　Ｉｔのベラトリル・アルコール酸化（ＶＡＯ
）活性を含む。本出願のためＶＡＯ活性１単位は下記の
ような標準検定条件下で２５℃において１分間にベラト
リル・アルコール１μｍｏｌを酸化しつる酵素量と定義
される。 ＶＡＯ活性は３１０ｎａ＋における検定溶液の吸光度の
変化から定量される。調製した３種類の試薬を用いた：
（＾）　Ｈ２ＳＯ４でｐ）１３．０に調節した、０．２
５Ｍ酒石酸ナトリウム；　（Ｂ）　ｌｏ、ｏｉＭベラト
リル・アルコール〔アルドリッヒ　ケミカル社　（Ａｌ
ｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、）　ウィスコンシ
ン州　ミルウォーキ、　、ｓ　Ｄ１３，３０１１−ｏ　
）および（ｃ）　９８ｍＭＡ酸化水素〔フィシャー・サ
イエンティフィック（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ）　、　ニューシャーシー州、７　エフ　ロー：／　
＃Ｈ３２５−５）　　（毎日新しく調製）、ＶＡＯ活性
検定を実施するには、（ａ）試薬Ａ　　４００μ２を石
英キュベツトに加え；（ｂ）試薬８　２００μ℃を加え
：（ｃ）酵素サンプル／二度蒸留した水（二重蒸留水）
３９０μｍを加え；（ｄ）キュベツトの中味を混合し；
（ｅ）試薬Ｃ１Ｇμ文を加え；（ｆ）キュベツトの中味
を直ちに混合し；そして（ｇ）３１０ｎｆｆｌにおける
吸光度を２５℃において３ｏ秒間測定する。試験サンプ
ル１ミリリツトルあたりのＶＡＯ活性車位（９７ｍ　１
１　）はベラトリル・アルコールの吸光係数として９３
００Ｍ　−’　ｃｍ−’の値を用いて次のように算出す
る＝（ΔＡ／分）　　（９３００）　−’（１０００）
　（試験サンプル量（ｍｕり）−’、本出願のために、
ＬｉＰ酵素１単位はＶＡＯ活性１単位に等しい。 ΔＡｓＩａ／分は０．１〜０，５ΔＡ３＋ｏ／分の範囲
内で、ＬＩＰ濃度に比例して線型である。この範囲外の
割合を生ずる酵素サンプルは活性の算出に用いない、こ
の代りに、キュベツトあたりの試験サンプル量を、測定
割合が前記線型範囲に入るように減少または増加させる
。 ある状況下では、回収した培養培地の不完全精製した亜
分画（ｓｕｂｆｒａｃｔｌｏｎｓ）を用いることが望ま
しい０例えば、キュベツトラーゼを含まないリグニナー
ゼ含有並分画の使用が望ましい。この代りに、ＬｉＰ酵
素をＭｎＰ酵素から分離して、これらの酵素活性を別々
に用いることも望ましい、殆んど均質になるまで精製し
たリグニン分解酵素およびこれら精製酵素の混合物を用
いることができる。 本発明の予想されえない新規で重要な特徴は、ファネロ
ケーテ・クリソスポリウムの精製ＭｎＰが本発明の方法
を用いた木材パルプの脱リグニンに効果的であることで
ある。先行技術に基づくと、ｒＭｎＰノなる用語は、前
記酵素が現実に従来より公知であるか否かに拘らず、リ
グニンを変性または分解しうるマンガン依存性ペルオキ
シダーゼに適用される。 しＬＰ活性またはＭｎＰ活性のいずれかを有する組換え
（ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ）　　リグニン分解酵素も本
発明の方法に有用である。 酵素脱リグニン反応は、内容物の混合、酵素化および温
度調節の設備を備えるに通したサイズの容器内で実施さ
れる。さらに非気体反応成分の導入と反応生成物の取出
しとの好都合な機構も備えなければならない０反応酸分
の添加順序は重要ではないが、酵素を最後に加えること
が好ましい。 基本的反応混合物は、全てが適当なｐＨに維持された溶
液に含まれた、被脱リグニン・リグノセルロース材料、
活性なリグニン分解酵素製剤および低定常状態濃度の過
酸化水素から成る０反応混合物が次の成分の１つ以上を
含むことも好ましい：（ａ）非イオン洗剤または両性イ
オン洗剤、（ｂ）Ｍｎ　（ＩＩ）　、（ｃ）　　α−ヒ
ドロキシ酸および／または（ｄ）　　リグニン分解酵素
の基質として用いられつる置換芳香族アルコール。これ
らの成分の全てが存在することが最も、好ましい。 被漂白リグノセルロース材料が木材パルプである場合に
は、それは反応混合物中に０．１〜１０！。 好ましくは０．５〜４．０零の粘稠度（パルプ乾量ｇ／
パルプ湿量ｇ）で存在すべきである。 少なくとも１種類のＬｉＰを含み、ＭｎＰ活性を有さな
い酵素製剤を用いる場合には、反応混合物中にＶＡＯ活
性が０．０５〜１０．Ｏｕ／ｍ　ｆＬ　、好ましくは０
．４〜２．０１１７ｍ　１の濃度で存在すべきである。 少なくとも１種類のＭｎＰを含み、ＬｉＰ活性を有さな
い酵素製剤を用いる場合には、フェノール・レッド酸化
（ＰＲＯ）活性が反応混合物中に０．０４〜２０．ＯＵ
／ｍ　ｆＬ、好ましくは０．２５〜１０．ＯＵ／ｍ　Ｊ
２の濃度で存在すべきである。 ＰＲＯ活性１単位は、標準検定条件下、２５℃において
１吸光度単位／分の検定溶液の吸光度（５３０ｒｖにお
ける）を変化させるような酵素量として定義される。Ｐ
ＲＯ活性検定には３種類の試薬を用いる。試薬Ａはフェ
ノール・レッドのナトリウム塩

【シグマ　ケミカル社（
ＳｉｇＩＱａ　（：ｈｅｍｉｃａｌＧｏ、）ミズーリ州
、セントルイス、＃　Ｐ　−５５３０）０．１１ｇ／ｉ
、オボアルブミン１．１　ｇ／Ｊ２および８５％乳酸２
．５ｍｊ２／βを２０＋ａＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ
４，５）中に含む、試薬Ｂは２０ａ＋Ｍコハク酸ナトリ
ウム（ｐ）！４．５　）中のｌＯａＭ硫酸マンガンであ
る。 試薬Ｃは９．８　ｍＭ過酸化水素（フィッシャー・ケミ
カル社）（゛毎日新たに調製）である、ＰＲＯ活性検定
を実施するために、試薬Ａ　　９００μｍをキュベツト
に加え；酵素サンプル／二重蒸留水１００μ旦を加え；
試薬８１０μｍを加え；キュベツトの中味を直ちに混合
する；このキュベツトにおいて分光測光計は５３０ｎｍ
でブランクである：次に試薬Ｃ１，０μｍを加え；キュ
ベツトの内容物を直ちに混合し；そして５３０ｎａ＋の
吸光度を２５℃において３０秒間記録する。試験サンプ
ル１ミリリツトルあたりのＰＲＯ活性単位（０７ｍｌ１
）は次式を用いて算出する：　（ΔＡ／分）（検定に用
いた試験サンプル量（ｍｊＺ））−蓋。本出願のために
、ＭｎＰ１単位はＰＲＯ活性の１単位に等しい。 ΔＡＩＩ！。７分は０．０５〜０．２０ΔＡａｓｏ／分
の範囲内でＭｎＰ濃度に比例して線型である。この範囲
外の割合を生ずる酵素サンプルは活性の算出に用いない
、この代りに、測定割合が前記線型範囲内に入るように
、キュベツトあたりの試験サンプル量を減少または増加
させる。 １種類以上のＬｉＰ酵素と１種類以上のＭｎＰ酵素を含
む酵素製剤を用いる場合には、酵素製剤は反応混合物中
に上記濃度で存在すべきである。 本発明の重要な特徴は、脱リグニン反応を通して反応混
合物中に０．００１〜０．５　ｍＭ、好ましくは０．０
０５〜０．１　ＩＩＩＭの低定常状態濃度の水素を維持
することである。過酸化水素濃度は例えばグルコースに
対するグルコース・オキシダーゼの作用によるその場で
の酵素発生によって、好ましいレベルに便利に維持する
ことができる。従って、反応混合物へのグルコース・オ
キシダーゼ０．１〜１Ｏ９ＯＩＪ／ｒｎｆｌとグルコー
ス０．１〜２０．０ｍＭとの添加、典型的にはグルコー
ス・オキシダーゼ１．ＯＵ／ｍＪ２と０．１〜１０．０
１１１Ｍグルコースの添加を利用することができる。ま
たは、連続計量添加によって過酸化水素を供給すること
ができる。計量添加は、大規模な脱リグニン反応におい
て過酸化水素濃度を維持する好ましい方法である。過酸
化水素濃度は定期的な添加によっても大体維持すること
ができる。 ｐＨ値は脱リグニン反応を通して２〜８に、好ましくは
約３〜５の範囲内に維持するべきである。 ｐ）Ｉは、ケモスタッティング（ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉ
ｎｇ）によって・・・・・・適当量の酸または塩基の計
量添加または定期的添加によって維持することができる
。ケモスタッティングは大規模反応におけるｐ）ｌ維持
の好ましい方法である。または、反応混合物に緩衝液を
用いることによってｐ）Ｉを維持することができる。 好ましいｐＨで有効である好都合な緩衝液を用いること
ができる。好ましいｐＨ範囲における適当な緩衝液の例
は、酢酸塩、ジメチル・コハク酸塩、酒石酸塩およびト
ランス−アコニット酸である。緩衝液は通常、反応混合
物に約５〜５０ｍＭの濃度で、好ましくは１５〜２５ｍ
Ｍの濃度において加えられる。 反応混合物への非イオン洗剤または両性イオン洗剤の添
加が好ましい。最も一般的には、非イオン洗剤が用いら
れる。適当な非イオン洗剤の例には、オクチル・グルコ
シド、ポリオキシエチレン・グリコールおよびトライト
ン（Ｔｒｌｔｏｎ）　ｉｋ列とトウイーン（Ｔｗｅｅｎ
　）系列の洗剤からの化合物がある。トウィーン８０が
特に好ましい、洗剤は０．００１〜０．１ｋＶハ、好ま
しくは０．０１〜Ｏ，Ｑ５＊Ｖ／Ｖ（７３濃度で加えら
れる。 用いられるリグニン分解酵素製剤がＭｎＰを含んでいる
場合には、反応混合物中にＭｎ（ＩＩ）が必要である。 用いられるリグニン分解酵素製剤が少なくとも１種類の
ＬｉＰを含み、ＭｎＰを含まない場合には、Ｍｎ（ＴＩ
）の添加は必須ではない。Ｍｎ（ＴＩ）は例えば硫酸マ
ンガンまたは酢酸マンガンのような塩、通常は硫酸マン
ガンとして、０．０５〜ｌ　、　ＯｍＭ、好ましくは０
．１０〜０．５０ａＭの濃度で好都合に加えることがで
ざる。 Ｍｎ（ＩＩ）を反応混合物に加える場合には、少なくと
も１種類のα−ヒドロキシ酸を同様に加えることが好ま
しい。適当なα−ヒドロキシ酸にはリンゴ酸塩、酒石酸
塩、クエン酸塩、乳酸塩、フェニル−乳酸塩、グリコー
ル酸塩、２−ヒドロキシブチレートおよびそれらの塩が
ある。乳酸塩の使用が好ましい、α−ヒドロキシ酸は反
応混合物中に０．５〜２０．０ｍＭ、好ましくは１．０
〜１０．０ｍＭの濃度で存在しなければならない。 用いられるリグニン分解酵素製剤が少なくとも１種類の
ＬｉＰ酵素を含む場合には、リグニン分解酵素の基質と
して用いられつる置換芳香族アルコール０．０５〜０．
６０ｍＭを反応混合物に加えることが好ましい、ベラト
リル・アルコールを加えることが最も好ましい。 酵素脱リグニンには酸素が必要である。酵素を加える前
に、反応混合物を酸素で飽和することが好ましい、典型
的には、全ての反応成分を加えた後に、反応容器を短時
間酸素でフラッシュし、次に密封して酸素を多く含む雰
囲気を形成する。 反応混合物を１５〜５０℃において０．２５〜１８時間
インキュベートし、好ましくは３０〜５０℃において２
〜８時間インキュベートすべきである。最も好ましくは
脱リグニンを４５℃において実施する。 脱リグニン反応中に反応混合物成分の混合を行うことが
好ましい。 「１段階ノ酵素脱リグニン方法は、リグノセルロース材
料を上述のようなリグニン分解酵素製剤で処理する工程
のみから成る。しかし、１段階方法が酵素脱リグニン工
程の後にリグノセルロース材料を抽出し、洗浄する他の
工程をも含むことが好ましい。 本発明の好ましい態様では、リグノセルロース材料に対
して酵素脱リグニン工程後にアルカリ抽出工程を実施す
る。このアルカリ抽出工程は反応混合物へのアルカリ性
溶液の添加、次のリグノセルロース材料の０．１〜１０
９ｉ粘稠度における２５〜１００℃での２時間までの任
意のインキュベーションをも含む、インキュベートは０
．３〜１．０％の粘稠度において２５℃で約０．１時間
実施することが好ましい。インキュベーション後に、通
常、混合物を濾過してアルカリ性溶液からリグノセルロ
ース材料を分離する。この抽出工程における塩基の最終
濃度は０．１−１．ＯＮであることが好ましい。 反応混合物中の酵素の再使用が好ましい場合には、アル
カリ抽出の前にリグノセルロース材料から例えば真空濾
過、沈殿および沈降によって酵素を分離しなければなら
ない。この分離は通常、濾過によって実施する。酵素を
除去した後に、アルカリ性溶液をリグノセルロース材料
に加える。 本発明の好ましい態様では、アルカリ抽出工程後にリグ
ノセルロース材料を０．１〜１０９６の粘稠度において
水中に分散させ、次に濾過することによって、水で洗浄
する。この洗浄を１〜３回くり返すことが好ましい。 本発明の最も好ましい態様では、リグノセルロース材料
に対してアリカリ抽出工程後に酸抽出を実施する、また
はリグノセルロース材料に対してアルカリ抽出工程後に
水洗工程を実施する場合には、この水洗工程後に酸抽出
工程を実施する。酸抽出工程は、Ｍｎ（ＩＩ）の存在下
で酵素脱リグニンを実施したクラフト・パルプの白色を
度を特に明白に改良することが発見されている。リグノ
セルロース材料を回収し、希酸中に懸濁させ、１０〜１
００℃において０．１−１０分間、好ましくは２５℃に
おいて約０．１分間インキュベートする。 希酸溶液は０．０５〜０．５０ａ＋Ｍの酸を含むのが好
ましい。適当な酸には、酢酸、コハク酸、乳酸、亜流酸
、および他の弱無機酸がある。酢酸が好ましい、酸抽出
工程はリグノセルロース材料の乾量１８につき希酸溶液
約０．１５〜２．５２で実施する。 本発明の好ましい態様では、リグノセルロース材料に対
して各段階が上述のようなアルカリ抽出工程を含み、さ
らに上述のような水洗工程を含む多段階酵素脱リグニン
方法を実施する。最終段階はさらに酸抽出工程を含むの
が好ましい。 多段階方法は１段階方法に比べて、同量のリグノセルロ
ース材料に対して同じ総単位のリグニン分解製剤を加え
た場合に、リグノセルロース材料をより大規模に脱リグ
ニンする。２段階または３段階方法の各段階は、同じ脱
すグニン度に達するために、先行段階に比べて少ない単
位のリグノセルロース活性を要することは明らかである
。しかし、完全に漂白された製品を製造するために、酵
素脱リグニン方法に従来の漂白段階を組合せる場合には
、１段階、２段階または３段階酵素脱リグニン方法が５
段階方法よりも好ましい。 本発明は、１つ以上の酵素脱リグニン段階が１つの要素
にすぎないような多段階漂白方法をも意図する。１つ以
上の酵素脱リグニン段階に１つ以上の従来の漂白段階を
連続的に組合せることが考えられる。効果的な補助漂白
工程の例は二酸化塩素、塩素、次亜塩素酸塩、酸素、オ
ゾン、過酸化水素、他の弱酸化剤および電気還元性漂白
を用いた段階である。この態様では付加的な塩素に基づ
く漂白段階を用いるとしても、漂白プラント流出液中の
塩素化有機物の総量は１つ以上の酵素脱リグニン段階を
含めることによって有意に減少する。 本発明がさらに完全に理解されるために、本発明の方法
の次の例を述べる。これらの例は説明のためのみであり
、本発明がここでの詳述によって限定されるとはみなす
べきではない。 夫五■ユ 非分画（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）リグニン分解
酵素濃縮物の調製 リグニン分解酵素濃縮物を２　ｆｆｌ類の菌株、ファネ
ロケーテ・クリソスポリウム　ＳＣ２６（ＮＲＲＬ１５
９７８　）とＶ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７（Ａ　Ｔ　
Ｔ　Ｃ２４７２５）から調製した。 培養菌株Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７は次のように調
製した胞子接種物から発生した：（１）微量元素（Ｔｒ
ａｃｅＥｌｅ＋＋＋ｅｎｔ）溶液の１１５００希釈液、
バイオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）溶液の１／１００希釈液を
用い、クロロホルムを用いず、さらに２零Ｗ／Ｖモルト
エキスを３零Ｗ／Ｖおよび酵母エキスを補充して調製し
た胞子誘導培地［エッチ、ジエイ、ボーゲル（ＬＪ。 Ｂｏｇｅｌ　）　、　　ｒ菌類へのりシン経路の分布：
進化との関係（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｙ
ｓｉｎｅ　ＰａｔｈｗａｙｓＡｍｏｎｇ　　Ｆｕｎｇｉ
　　：　　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　　Ｉｍｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ　　）Ｊアム、ナト（Ａｍ、Ｎａｔ、　）
　ＸＣＶ　ＩＩ＋　（９０３）　、４５３〜４６頁（１
９６４）に述べられている［培地ＮＪ］を含むプレート
の寒天上に２４℃において１４〜２８日間、培養物を増
殖させる；（２）（プレートの大きく膨らんだ外観から
明らかであるように）胞子が充分に発達した後に、各１
００　Ｘ　１５ｍｍ＋プレートの寒天表面を無菌本釣３
〜１０ｒｎｕで洗浄して、胞子を遊離させる：および（
３）胞子を含む洗浄水を無菌グラスウール充填無菌ロー
トに通して、汚染菌糸を除去する。次に、生成した胞子
懸！！Ａ液の６５０　ｎｍにおける吸光度を測定した、
６５０ｎＩ１１における吸光度１は５　Ｘ　１０’胞子
／　ｍ　Ｉｔに大体等しい。これらの胞子製剤は使用す
るまで４℃において貯蔵した。 Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７培養物を発生させるため
に、増殖培地Ａに適当な胞子懸濁液を少なくとも０．５
×１０５胞子／　ｍ　Ｉｌ、通常は２．５ＸＩＯ’胞子
／ｍ１、の最終濃度に達するまで接種した。増殖培地Ａ
はティ、ケイ、キーク（Ｔ、に、に１ｒｋ）等の「ファ
ネロケーテ・クリソスポリウムによるリグニン代謝に対
する培養パラメーターの影響 （Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐａｒ
ａｍｅｔｅｒｓ　Ｏｎ　ＬｉｇｎｉｎＭｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ　Ｂｙ　Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓ
ｏｓｐｏｒｉｕＩｌｌ）」アーク、ミクロパイオル、　
（Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋、）　１１７巻、２７
７〜８５頁（１９７８）に述べられている培地に、７倍
の高濃度の「無機物」を加え、下記の試薬を指示した濃
度で補充したものである：１ｍＭ酒石酸アンモニウム；
０．１％ｖ／ｖトウイーン８０；１．８μＭ硫酸マンガ
ン；　２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ）１４．５　）　　
；　６ｍＭベンジル・アルコール：および２％Ｗ／Ｖグ
ルコース（炭素源として）。 菌株ＳＣ２６は、増殖培地Ａ　Ｉｏｎ　ｆｌへの寒天プ
レートからの菌糸の直接転移によって調製した出発培養
物から発生した。この代りに、無菌のワーリング・ブレ
ンダ−（ｌｆａｒｌｎｇ　ｂｌｅｎｄｅｒ）内で既存の
菌培養物を混和することによっても出発培養物を調製し
た。これらの出発培養物を使用前に少なくとも３日間、
３７℃においてインキュベートした。 ＳＣ２６培養物を発生させるために、増殖培地Ａに出発
培養物１容量％、通常はｌＯ容量％を接種した。 全ての菌株は２に無菌容器（エルシンマイヤー・フラス
コまたはローラー・ボトルのいずれか）内において０．
１〜１．０１量で決まりきった方法で培養した。接種後
に、培養物を酸素でパージし、５０ｒｐｍの回転振どう
器（エルシンマイヤー・フラスコの場合）または４０ｒ
ｐｍのローラーボトル・インキュベーターにおいて、３
７℃でインキュベートした。接種直後に混合を開始した
。 接種後４日目から、培養物の細胞外培地をＶＡＯ活性に
関して監視した。少なくとも約０．０５１１／ｒｎＱの
ＶＡＯ活性が検出された時に、培養培地を回収し、増殖
培地已に取り替えた。増殖培地Ｂは増殖培地Ａの低炭素
変形であり、３．６ｍＭ酒石酸アンモニウムとｏ　、　
２ｘＷ／Ｖグルコースとを含む点で、増殖培地Ａとは異
なる。個々の培養物り月５日間以内に好ましいレベルの
酵素活性に達しなかった場合には、酵素活性を高めるた
めに前記培地を増殖培地Ａに替えた。 細胞外培養培地が望ましいレベルのＶＡＯ活性に達した
場合には、培養物をグラス・ウール含有ロートに注入す
ることによって、菌糸を除去した０次にこの活性培地か
ら、ＰＭＩＯ透析膜を備えたアミコンモデル（３ｍ１ｃ
ｏｎ　Ｍｏｄｅｌ）　８４００限外濾過キユベツトを用
いる加圧透析によって、リグニン分解酵素濃縮物を調製
した。限外濾過は窒素２０ｐｓＩ下で実施した。培地量
がその最初の量の約５〜ｌＯ％に減少した時に、濃縮物
を取出した。この濃縮物は使用するまで一７０℃に貯蔵
した。この濃縮リグニン分解酵素製剤は典型的に０．１
−１．ＯＩＪ／ｍｌＬのＶＡＯ活性を有した。 及五■ユ ＰＲＯ活性を有するがＶＡＯ活性は実質的に有さないＳ
Ｃ２６酵素濃縮物分画による北洋産（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
硬木クラフト・八木クラフトグニンと増白 ファネロケーテ・クリソスポリウム菌株ＳＣ２６の非分
画酵素濃縮物を、陰イオン交換クロマトグラフィーによ
って分画化した。この分画をＶＡＯ活性とＡＢＴＳ酸化
（ＡＢＴＳＯ）活性（ＡＢＴＳはＬｉＰ酵素に対して非
常に耐性であるペルオキシダーゼ基質である）に関して
検定した０分画の２８０ｎｍと　４０７ｎｍにおける吸
光度も測定した。酵素活性に基づいて分画を選択し、３
種類のプールを形成するように組合せた。プールＩを形
成するように組合せた分画はＡＢＴＳＯ活性を含むが検
出可能なＶＡＯ活性は含まなかった。プール■を形成す
るように組合せた分画はＶＡＯ活性を含むが、ＡＢＴＳ
Ｏ活性は実質的に含まなかった。プールＩＩを形成する
ように組合せた分画は両タイプの活性を示した。次に３
種類のプールをそれらのＶＡＯｌＰＲＯおよびＡＢＴＳ
Ｏ活性に関して、および２８０ｎｍと４０７ｒ＋ａ＋に
おける吸光度に関して検定した。最後に、これらのプー
ルの硬水クラフトパルプを脱リグニンし、増白する能力
を検定した。測定可能なＶＡＯ活性を全く含まず、従っ
て活性なＬｉＰ酵素を含まないと考えられるプールＩが
パルプ増白に関して非常に効果であるという意外な結果
が得られた。全ての工程は他に指示しないかぎり、室温
において実施した。 ＳＣ２６酵素濃縮物の　　化 非分画酵素濃縮物をファネロケーテ・クリソスポリウム
菌株ＳＣ２６から、実施例１で述べたように調製した、
旦しこの場合にはグルコースの代りに０．２零Ｗ／Ｖグ
リセロールを用いるように増殖培地Ｂを変更した。全体
で１．３ｊ２の培養物上清（３培養物からプールしたも
の）を実施例１に述べたような加圧透析によって濃縮し
た。 二重蒸留水で予め平衡させた、アンバーライト（＾ｍｂ
ｅｒｌｌｔｅ）　ＸＡＤ−２樹脂〔マリンクロッツ社（
Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｉｎｃ、　）ケンタラキー
州ハリス、＃３４０９）充填１．５Ｘ　６　ｃｔａカラ
ムに通して、ＳＣ２６酵素濃縮物を処理した０次に、こ
のＸ＾ト２カラムを二重蒸留水で洗浄し、この溶出液を
流過液（ｆ　ｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）　　と共にプール
した０組合せたＸＡＤ−２プールは６５ｍ１量を有した
。これをさらに次のように特性化した：Ａ２６゜＝２．
５；Ａ４゜、−０，５、ＶＡＯ活性＝　０．８１ｔｌ／
ｍ　ｉ；およびＡＢＴＳＯ活性＝　９．ＯＵ／ｍ　ｊ２
゜ 全ＸへＤ−２プールを二重蒸留水で予め平衡させた６　
Ｘ　ｌＯｃｍＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セファセル（５ｅｐｈａ
ｃｅｌ）　（ファーマシア　ファイン　ケミカルス（Ｐ
ｈａｒａ＋ａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　
　スウェーデン、アブセラ〕カラムに装入した。装入し
た後に、カラムを二重蒸留水１００ｍＩｌで洗浄した。 次にカラムを約１００〜２００ｍ１／時の流量において
５ｍＭ酒石酸ナトリウム中ｏ、ｔ〜０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム（ｐ）１４．８　）直線勾配７７０ｍ　Ｉｔで溶出
した０分画（３００滴／分画）を勾配の開始時から回収
した。 Ｌ１五九皇二】Ｉ 他の全ての分画をＶＡＯとＡＢＴＳＯ活性、ならびに２
８００日における吸光度に関して検定した。 ＡＢＴＳＯ活性１単位は、標準検定条件下２５℃におい
て、４１５０層での検定溶液の吸光度（１吸光度単位／
分）を変化させるような酵素量として定義した。ＡＢＴ
ＳＯ検定には３ｆ！類の試薬を用いた。　試薬ＡはＡＢ
ＴＳ　（ベーリンゲル　マンハイム、西ドイツ、＃１０
２９４６）　０．０４５　ｇ／ｕ、６０％乳酸ナトリウ
ム１０ｍｆＬ／Ａ、ウシ血清アルブミンまたはゼラチン
３．４ｇ／、？、を５０＋ｗＭコハク酸ナトリウム（Ｉ
ＩＨ４，５）から成る。試薬Ｂは５０ｍＭコハク酸ナト
リウム（ｐＨ４，５）中の１０ｍＭ硫酸マグネシウムで
あった。試薬Ｃは５０ｍＭコハク酸ナトリウム（９１４
４，５）中に０．０１７１％過酸化水素を含んだ（毎日
新たに調製）。ＡＢＴＳＯ検定を実施するには；試薬Ａ
　　９００μｍを石英キュベツトに加え：試験サンプル
１００μλを加え；試薬ＢＩＱμａを加え；キュベツト
の中味をケーブル・タイを用いて直ちに混合した二分光
測定計はこのキュベツトでは４１５ｎｍにおいてブラン
クであった；試薬ＣＩＯμｍを加えた；キュベツトの中
味をケーブル・タイによって直ちに混合し；　　４１５
ｎｍにおける吸光度を２５℃において３０秒間測定した
。試験サンプル１ミリリツトルあたりのＡＢＴＳＯ活性
単位（１１７ｍｌりを次式を用いて算出した：　（ΔＡ
／分）（検定した試験サンプル量（ｍＡ））−’ ＡＢＴＳＯ活性の広巾の複合ピークは大体分画１８〜６
０に及ぶものであった。大体分画３５〜５０．７０〜８
０および８０〜９２に及ぶ、３つの分離したＶＡＯ活性
ピークが存在した。カラム分画を選択し、組合せて３種
類の溶出液プールを形成し、使用するまで一７０℃にお
いて保存した。これらのプールをＶＡＯ，ＡＢＴＳＯお
よびＰＲＯ活性に関シテナらびに　２８０ｎｍと　４０
７ｎｍにおける吸光度に関して検定した。プールを形成
するように組合せたカラム分画ならびにこれらのプール
の特性を第１表に記載する。 第」−人 プール　　　　■ 分　　画　　　　　１８−３４ へＢＴＳＯ活性　３．７ （１１７ｍ　Ｉｔ　） １’ＲＯ活性　　２．９ （Ｕ／ｍρ） ＶＡＯ活性’　ｏ、ｏｏ±ｏ、ｏ。 （０７ｍｌ１） Ａ　２１５０　　　　０．４３ Ａ　４０７　　　　０．０４ ＩＩ　　　　　　　　　　　　ｌ１１ ３６−４８　　７２−７７＆８２−８９２．４　　　　
　　　　　０．０５ ０．２ ０．０３ ０．１６ ±０．０２　０．４２　　±０．１０ ｏ、ｉｓ ０．０５ ０．２０ ０．１１ ＶＡＯ活性値は独立した２回の測定の平均値である；標
準偏差を示す。プールｌはいずれの測定においてもＶＡ
Ｏ活性を示さなかった。 パルプの調製 北洋産硬水クラフト・パルプ湿量３０ｇを二重蒸留水Ｚ
ｆＬ中に懸濁させ、ワーリング・ブレンダー（高速）で
１５秒間旋回した。パルプを真空濾過によって回収し、
５ｍＭＥＤＴＡ１ｊＺ中に再懸濁させ、再び真空濾過に
よって回収した０次に、パルプを０．１７Ｎ酢酸１１中
に再懸濁させ、真空濾過によって回収した。最後に、パ
ルプを二重蒸留水２１中に再懸濁させ、真空濾過によっ
て回収し、使用するまで４℃に保存した。この湿った「
洗浄パルプ」は２４％の粘稠度（パルプ乾量０．２４ｇ
／洗浄パルプ湿量ｇ）を有した。 酵素　応：　験Ａ 次の反応成分を含むマスター・ミックスを調製した二二
重蒸留水１７５ｍ　Ｉｔ　；　　０．２Ｍ酢酸ナトリウ
ＩＡ　（ＰＨ５，０）　２０ｍ　ＩＬ；　ｌ０ＸＶ／Ｖ
トウイーン８００．５ｍｕ；２．０Ｍ乳酸塩１．Ｏｍ　
ｆｌ　；　　０．３Ｍグルコース１．０ｍｕ；０１１Ｍ
硫酸マンガン０．２　ｍｆｌ　；　０．Ｉ　Ｍベラトリ
ル・アルコール０．８ｍ℃およびＮＡＤＨ（２ｍｇ／ｍ
ＪＺ）０．５ｍｕ。酸素をこのマスター・ミックスに通
して３分間バブルさせた。次に反応ミックスを１０個の
５０ｍ　ｆｌ−コニカル・ボトム・ポリプロピレン遠心
管に一様に分配しく管あたり〜２０ｍｌ１）、洗浄パル
プ湿量０．５ｇ　（乾！ｊｋＯ，１２ｇ）を各管に加え
た。次に酵素濃縮物分画を次のように加えた： 島　　　酵素プール　　ｌ工旦至工 ６　　　　　　　　　Ｉ　　　　　　　　　　　　２０
７　　　　　　　　　ＩＩ　　　　　　　　　　　　　
２９　　　　　　　　　ＩＩＩ　　　　　　　　　　　
　　２１０　　　　　　　　　Ｉｌｌ　　　　　　　　
　　　　　５最後に、グルコース・オキシダーゼ〔シグ
マ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＣＯ
，）　、＃Ｇ　６５００１．ＯＵ／μＩＬ）を容管に加
えた０次に容管を短詩間、酸素でフラッシュし、栓をし
て、６０ｒｐｍの回転シェーカー上に水平において、３
７℃において１８時間インキュベートした。 インキュベートした後に、　０．５Ｎ水酸化ナトリウム
を容管に、約５０ｍλの最終量に達するように加えた。 容管の中味をホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）３Ｍフ
ィルター付きの各焼結ガラス・フィルター・ロートに加
えた０次に空になった反応管をそれぞれ０．５Ｎ水酸化
ナトリウム約３０ｍＪＺで洗浄し、これらの洗液を適当
なフィルター・ロートに加えた。各フィルター・ロート
内のパルプを真空濾過によって回収した。二重蒸留本釣
２５０ｍ　Ｊ２を各フィルター・ロートに攪拌しながら
加え、パルプを回収した。次に、０．１７Ｎ酢酸約２５
０ｍ　ｊ２を各フィルター・ロートに攪拌しながら加え
、パルプを再び回収した。パルプを３時間風乾させ、テ
クニダイン・コーポレーシュン　モデルＳ４ブライテイ
メーター（Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ　（：ｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　Ｓ４Ｂｒｉｇｈｔｉｍｅｔｅｒ）
を用いて白色度（Ｇ、Ｅ、９ｇ）を測定した。これらの
反応の結果は第２表に要約する。 第２表 ＰＲＯ活性　　白色度 （隻乙二↓）（Ｕ／ｇバルカ“　（零Ｇ、Ｅ、）０．０
　　　　０．０　　３９．２ ０．１４　　　２４．２　　４４．０ ０．２６　　　　　　４８．３　　　　４７．８０．４
８　　　　　　９６．６　　　　５０．５０．９７　　
２４１．７　　５３．２ １．４５　　４８３．３　　５３．４ ０．０２　　　３．３　　４８．０ ０．０４　　　　　　　８．３　　　　４６．３０．０
０３　　　０．５　　５２．２ ０．００６　　　　　　１．３　　　　５２．７反応　
ＶＡＯ活性 （奴ｍｌ）　（１１／■Ｕ）” １０．０　　　　　０．０ ２０．０　　　　　０．０ ３０．０　　　　　０．０ ４０．０　　　　　０．０ ５０．０　　０．０ Ｂｏ、０　　　　　０．０ ７　　０．０１５　　　２．７ ８　　０．０３２　　　６．７ ９　　０．０３８　　　０．７ １０　　０．０８４　　１７．５ °反応混合物中のパルプ乾Ｒ１ｇあたりの単位酵素　応
；　−験Ｂ ネジ込みキャップを備えた２５０ｍ　ｆｌ−ポリカーボ
ネート・エルレンマイヤー・フラスコ３個の各に次の試
薬を加えた：二重蒸留水１２５ｍＪ２　；　　０．２Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐｌ（５，０）２０ｍ　ｊ２　；　１
０ｔＶ／Ｖトウイーン８００．５ｍｕ　；　　２．０Ｍ
乳酸塩１．０ｍｌ１；　　０．３Ｍグルコース　１．０
ｍ　１１　；　　０．１Ｍ硫酸マンガン０．２ｍＪＺ；
０．１Ｍベラトリル・アルコール０．８ｍｕ；およびＮ
ＡＤＨ（２ｍｇ／　ｍｊｌ）０．５ｍＩＬ、各フラスコ
の反応混合物を通して酸素を３分間バブルさせた。次に
、洗浄パルプ湿量５ｇ（乾量１．２ｇ）を各フラスコに
加えた。二重蒸留水５０ｍ１を反応Ａに加えた。ブール
１　５０ｍＪＺを反応Ｂに加えた。プール！１１　５０
ｒｎＪＺを反応Ｃに加えた。最後に、グルコース・オキ
シダーゼ（１，Ｏｔｌ／μｌ１）０．２ｍｌを各フラス
コに加えた。 次に各フラスコを酸素でフラッシュし、栓をし、８０ｒ
ｐｍの回転振とう器上で３７℃において１８時間インキ
ュベートした。 インキュベーション後に、各反応からのパルプをホワッ
トマン３Ｍフィルター付き焼結ガラス・フィルター・ロ
ートでの真空濾過によって回収した。各パルプ・パッド
を０．５Ｎ水酸化ナトリウム約２００ｍ　Ｊ２中に攪拌
しながら再懸濁させ、次に濾過によって回収した。この
水酸化ナトリウム洗浄をくり返した。最後にパルプを０
．１７Ｎ酢酸約２５０ｍｊ２中に攪拌しながら再懸濁さ
せ、濾過によって回収した。パルプ・パッドをリグニン
含量（カッパ数）と白色度（ｋ　Ｇ、Ｅ、）を測定する
少なくとも４時間前に風乾させた。本質的にヴイ、バー
ジンス（Ｖ、Ｂｅｒｚｉｎｓ）　　　ｒカッパ数の迅速
測定方法（八Ｒａｐｉｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ｆｏｒ
　Ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆにａｐｐ
ａ　ＮｕＩｌｂｅｒ）　Ｊ　、タッピ（Ｔａｐｐｌ　）
　４８　（１）、　１５〜１８頁（１９６５）に述べら
れている通りにマイクロカッパ数を測定した。これらの
分析結果を第３表に示す。 第３表 反　　応　　　　　　　　　　八　　　　　　　　Ｂ　
　　　　　　ＣＶＡＯ活性 （０７ｍ　ｊ２　）　　　　　０．０　　　　０．０　
　　０．１１（Ｕ／ｇパルプ）’　　　　　　　０，０
　　　　　　　　０．０　　　　　１７．５ＰＲＯ活性 （ＩＪ／ｍ　ｊ２　）　　　　　０．０　　　　０．７
３　　０．０１（１１／ｇパルプ）”　　　　　　　　
０．０　　　　　１２０．８　　　　　　１．３白色度
（零Ｇ、Ｅ、　）　４１．１　　　５４．５　　５１．
０リグニン含量７．９±０．５　６．２±１．２　７．
０±０．５（μカッパ数）“ “各反応におけるパルプ乾量１ｇあたりの単位′“μカ
ッパ数の値は２回の独立した測定の平均値を表す；標準
偏差を示す。 えλ血ユ Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７非分画酵素濃縮物での多
段階処理による北洋産硬水クラフト・パルプの脱リグニ
ンと増白 北洋産硬水クラフト・パルプに対してファネロケーテ・
クリソスポリウムＶ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７非分画
酵素濃縮物による１段階、２段階または３段階処理を実
施した。２段階または３段階処理の最終段階の前の各段
階は次の３連続工程から構成される＝（１）パルプを酵
素濃縮物と共にインキュベートする；（２）パルプをア
ルカリで抽出する；および（３）パルプを水で洗浄する
。多段階処理の最終段階または１段階処理の単一段階は
さらに、希酸によるパルプの抽出という付加的な第４段
階を含んだ。３種類の濃度の酵素？Ｉ４縮物絹物段階で
テストした。１反応条件以外の全ての反応条件を二重に
ランした。酵素濃縮物を含まない対！１？（ｃｏｎｔｒ
ｏｌ）反応は各段階の分析に対して三重にランした。 パルプ調製 北洋産硬水クラフト・パルプを蒸留水による「洗浄」に
よって、酵素処理用に調製した。パルプ（湿量１００〜
２００ｇ）をプリティシュ・シート・ディスインチグレ
ーター（Ｂｒｉシｉｓｈ　Ｓｔ＋ｅｅｔＤｉｓｉｎｔｅ
ｇｒａｔｏｒ　）によって蒸留水約１ｆｔ中に４〜５分
間分散させた。パルプをブフナー・ロート（Ｂｕｃｈｎ
ｅｒ　ｆｕｎｎｅｌ）内のホワット？）’３Ｍ濾紙上で
の真空濾過によって回収し、アリコート（ａｌｉｑｕｏ
ｔｌ中のパルプ湿量１００ｇにつき蒸留本釣３０１で洗
浄し、水を真空濾過によって排除し、他のアリコートの
水紮加えた。このプロセスをくり返して、パルプを望ま
しい量の水で洗浄した。 湿った「洗浄」パルプは２３．４％（パルプ乾量０．２
３４　ｇ／パルプ湿量ｇ）の粘稠度、３８零Ｇ、Ｅ。 の白色度、１３．３のμカッパ数および２８．０ＣＰの
粘度を有した。 酵素濃縮　の調製 Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７非分画酵素濃縮物をロー
ラーボトルと増殖培地Ａとを用いて、実施例１に述べた
ように調製し、使用するまで一７０℃に貯蔵した。同じ
濃縮物製剤を全ての第１段階反応に用いた。第２段階と
第３段階反応に第２濃縮物製剤を用い、これらの段階の
間この濃縮物を４℃に貯蔵した。酵素濃縮物のＶＡＯ活
性とＰＲＯ活性を各段階の直前に、既述したプロトコー
ルに従って測定した。これらの活性は次の通りであった
：段　階　　　ＶＡＯ活性　　　　ＰＲＯ活性（１１／
ｍ　ｆＬ　）　　　　　　（Ｌｌ／ｍ　ｌｌ）１　　　
　　　　　　　　８．７　　　　　　　　　　　　　　
１３．４２　　　　　　　　　　　３．０　　　　　　
　　　　　　　　１２．１３　　　　　　　　　　　１
．９　　　　　　　　　　　　　　１２．０第１段階 パルプ、酵素濃縮物及びグルコース・オキシダーゼを除
いた全ての反応成分を含む反応ミックスを調製した。酢
酸ナトリウムｐＨ４，５ストツク溶液を用いて、反応ミ
ックスを調製後に１．ＯＮ水酸化ナトリウムによてｐ）
１４．５に調節した０反応ミックスを１７個の反応管（
５０ｍｊ２コニカル・ボトム・ポリプロピレン遠心管）
と９個の対照反応管の各々に加えて、次の成分から成る
最終反応条件（酵素濃縮物によって与えられる反応成分
を除く）を得る：　２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，
５）　　：　　０．０２５％トウィーン８０　；　１０
ｍＭグルコース；　０．４５ｍＭベラトリル・アルコー
ル；　１０ｍＭ乳酸；　　０．１ｍＭ硫酸マンガン。 酸素を多管の反応ミックスに通して３分間バブルさせた
０次に、洗浄パルプ１．７ｇ　（パルプ乾量０．４ｇ）
を多管に加え、パルプを分散させるために管をおだやか
に旋回させた。グルコース・オキシダーゼ（１，０［１
／μｍ、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ＣＯ，）　＃　Ｇ６５００）を多管に加えた。 酵素濃縮物および／または二重蒸留水を多管に最終反応
量２０．０ｍｌに達するように加えた；５管はＬｉＰ　
５．０単位とＭ　ｎ　Ｐ　７．７単位を受容しくサンプ
ル４〜５．１３および２１〜２２）、Ｂ管はｔ、ｉＰ　
１０単位とＭ　ｎ　Ｐ　１５．４ＪｉＬ位を受容しくサ
ンプル６〜７．１４〜１５および２３〜２４）；６管は
ＬＩＰ　２０単位とＭ　ｎ　Ｐ　３０．８単位を受容し
くサンプル８〜９．１６〜１７および２５〜２６）；９
管は対照として用いられ（サンプル１〜３．１０〜１２
および１８〜２０）、二重蒸留水のみを含み、酵素濃縮
物を含まなかった（第４表参照）、最後に、反応管を短
時間、酸素でパージし、栓をし、おだやかに数回逆さに
して混合した。 反応管を約１２５ｒｐｍの６２４工ンヴイ口メンタル・
インキュベーター・シェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ
ｔａｌＩｎｃｕｂａｔｏｒ　５ｈａｋｅｒ）　　（＝　
ニーーブルンスウ４’ｌり噂すイエンティフィック社（
Ｎｅｗ　ＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃ
Ｏ，Ｉｎｃ、）　＝　：ｓ−−シャーシー州、エジソン
〕内でインキュベーション中水平状態で３７℃において
１晩インキエベートした。 次に各反応からのパルプをホワットマン３Ｍフィルター
を含む別々の焼結ガラス・ロートに加えた。次に　０，
５Ｎ水酸化ナトリウム８０ｍ１を各フィルター・ロート
に加え、ロート中味を攪拌し、パルプを真空濾過によっ
て回収した。各フィルター・ロート内にパルプを約２５
０ｍ　Ｉｔの蒸留水中に再懸濁させ、真空濾過によって
再び回収した。この水洗を２回くり返した。 最後の水洗後に、サンプル１〜９からのパルプを０．１
７Ｎ酢酸約２５０ｍλ中にそれぞれ再懸濁させ、次に濾
過によって回収した。これらのパルプ・パッドをパルプ
の白色度（ｋＧ、Ｅ、　）　、リグニン含量（μカッパ
数）、および粘度（ｃｐ）を測定する少なくとも１２時
間前に風乾させた０％Ｇ、Ｅ。 およびμカッパ数を実施例２に述べたように測定した。 本質的に「パルプの粘度二毛管粘度測定法（Ｖｉｓｃｏ
ｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｕ１ｐ　：　Ｃａｐｉｌｌａｒｌｙ
　ＶＩｓｃｏｍｅｔｅｒＭｅｔｈｏｄ）　Ｊ　、タッピ
（ＴＡＰＰＩ）、試験方法Ｎｏ、　Ｔ２３０−Ｏ５−７
６、ジョーシア州アトランタ（１９７Ｂ）に述べられて
いるように、粘度を測定した。第５表にはこれらの分析
結果を示す。 呈］」え南 ｐ）Ｉを調節し、酸素化した、上述のような反応混合物
を含む、別々の反応管にサンプルｌ０〜２６からのパル
プを再び装入した。管をおだやかに旋回して、パルプを
分散させ、グルコース・オキシダーゼ２０μβを各反応
管に加えた。酵素濃縮物及び／または二重蒸留水を次の
ように加えて、各管内の最終反応量２０．０ｍ　ｆｔを
得た＝３管はＬＩＰ２．［ｌ単位とＭｎＦ２．１単位を
受容しくサンプル１３及び２１〜２２）、４管はＬＩＰ
４．Ｏ単位とＭ　ｎ　Ｐ　１６．１単位を受容しくサン
プル１４〜２５及び２３〜２４）；４管はＬＩＰ８．０
単位とＭ　ｎ　Ｐ　３２．３！＃位を受容しくサンプル
１６〜１７及び２５〜２６）；及び６管は対照として用
いられ（サンプル１０〜１２及び１８〜２０）、酵素濃
縮物を受容しなかった（第４表参照）、最後に、反応管
を短時間、酸素でパージし、栓をし、おだやかに数回逆
さにして混合した。 管を第１段階に対して上述したようにインキュベートし
た。次に、パルプを管から取り出し、別々に水酸化ナト
リウムで１回、水で３回、上述のように洗浄した。最後
の水洗後に、サンプルｌ０〜１７からのパルプを０．１
７Ｎ酢酸で上述のように洗浄した。生成したパルプ・パ
ッドをパルプの白色度（％Ｇ、Ｅ、）　、リグニン含量
（μカッパ数）及び粘度（ｃｐ）を測定する少なくとも
１２時間前に、上述のように風乾させた。 １１旦１ サンプル！８〜２６からのパルプを再び、上述したよう
なｐＨ調節し、酸素化した反応混合物を含む、別々の反
応管に装入した。管をおだやかに旋回してパルプを分散
させ、グルコース・オキシダーゼ２０μｍを各反応管に
加えた。酵素濃縮物及び／または二重蒸留水を次のよう
に加えて、多管の最終反応量２０．０ｍ　Ｉｔを得た：
２管はＬｉＰｌ、Ｏ単位とＭ　ｎ　Ｐ　６．３単位を受
容しくサンプル２１〜２２）　。 ２管はＬＩＰ２．０単位とＭ　ｎ　Ｐ　１２．６単位を
受容しくサンプル２３〜２４）；２管はＬＩＰ４．０単
位とＭ　ｎ　Ｐ　２５．３単位を受容しくサンプル２５
〜２６）３管は対照として用いられ（サンプル１８〜２
０）、酵素濃縮物を受容しなかった（第４表参照）。最
後に、反応管を酸素で短時間パージし、栓をし、おだや
かに数回逆さにして混合した。 管を第１段階に対して上述したようにインキュベートし
た０次にパルプを水酸化ナトリウムで１回、水で３回、
上述したように別々に洗浄した。 最後の水洗後に、サンプル１８〜２６からのパルプを０
．１７Ｎ酢酸で洗浄した。これらのパルプ・パッドを、
パルプの白色度（％Ｇ、Ｅ、）リグニン含量（μカッパ
数）及び粘度（ｃｐ）を測定する少なくとも１２時間前
に、上述のように風乾させた。 結　　果 第４表は、各段階のパルプ・サンプルに加えたＬｉＰと
ＭｎＰの単位を示す。ＬｉＰ単位はＶＡＯ活性の単位を
表す。ＭｎＰ単位はＰＲＯ活性の単位を表す。各反応は
２０ｍ　Ｉｔ量中にパルプ乾量０．４　ｇを含むので、
パルプ乾量１ｇあたりの単位および反応容量あたりの単
位は第４表の数値から算出することができる。 第５表はこの実験の結果−処理パルプの白色度、リグニ
ン含量及び粘度を示す。反復実験も含める。サンプル１
〜９は第１段階後に検定した。 サンプル１０〜１７は第２段階後に検定した。サンプル
１８〜２６は第３段階後に検定した。第５表は各パルプ
・サンプルに加えたＬｉＰとＭｎＰの累積単位値をも示
す。例えば、サンプル２６のＬｉＰの累積単位値として
示した値（３２，０）は第１段階、第２段階及び第３段
階で供給したＬｉＰ単位の合計（２０，０＋　　８．０
＋４．０　）を表す。 Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７酵素濃縮物による八木ク
ラフト・パルプの１段階処理は、酵素を加えなかった対
照サンプルからのパルプに比べて、パルプの有意な脱リ
グニンと増白を示した。２段階処理は１段階処理に比べ
て低いリグニン含量と大きい白色度とを有するパルプを
製造した。３段階処理は２段階処理よりもさらに良好に
作用した。リグニン含量の低下と白色度の増大が粘度の
許容できる減少を伴って得られた。 第１段階 第２段階 ＬｉＰ　　　　ＭｎＰ ０゜０ ０．０ ０．０ ５．０ １Ｏ６Ｏ １Ｏ００ ２０，０ ２０，０ ０，０ ０，０ ０，０ ７，７ １５，４ １５，４ ３０，８ ３０，８ ｏ、ｏ　　　　ｏ、。 ０．０ ０．０ ２．０ ４．０ ４．０ ８．０ ８．０ ０．０ ０．０ ８．１ １６．１ １６．１ ３２．３ ３２．３ 第３段階 ＬＩＰ　　　　ＭｎＰ ＬｉＰ　　　　ＭｎＰ ｏ、ｏ　　　　ｏ、。 ０．０ ０．０ ５．０ ５．０ １Ｏ１Ｏ １Ｏ００ ２０，０ ２０、Ｏ ０，０ Ｏｏｏ ７．７ ７．７ １５．４ １５．４ ３０．８ ３０．８ ０゜０ ０．０ ０．０ ５．０ ５．０ １Ｏ００ １０，０ ２０，０ ２０，０ ０，０ ０，０ ０，０ ７，７ フ、７ １５．４ １５．４ ３０．８ ３０．８ ０、Ｏ ０，０ Ｏ９０ ２，０ ２，０ ４，０ ４，０ ８，０ ８，０ ０，０ ０，０ ０，０ ８，１ ８，１ １６，１ １６，１ ３２，３ ３２，３ ｏ、ｏ　　　　ｏ、。 ０．０ ０．０ １．０ １．０ ２．０ ２．０ ４．０ ４．０ ０．０ ０．０ ６．３ ６．３ １２．６ １２．６ ２５．３ ２５．３ ０．０ ０．０ １１．１ ２７．６ １　　　　５．０　　　７．７　　　４６１　　　　５
．０　　　　？、７　　　５２１１．２　　　　２６．
７ ８．９　　　　２４．９ １　　　１０．０　　１５．４　　　５３１　　　　＋
０．０　　１５．４　　　５３７．９　　　　２４．９ ８．５　　　　２４．７ １　　　２０．０　　　：１０．８　　　５４１　　　
２０．０　　３０．８　　　５５８．０　　　　２４．
５ ５．２　　　　２４．８ ２　　　　０．０　　　０．０　　　４９２　　　　０
．０　　　０．０　　　４９１１．７　　　　２６．９ １１．２　　　　２５．２ ７．０ １５．８ ８．８ ２０．４ ２　　　１４．０　　３１．５　　　　Ｂ７２　　　１
４．０　　３１．５　　　６６６．１　　　　２０．４ ６．１　　　　２０．２ ２　　　２８．０　　８３．１　　　６８２　　　２８
．０　　６３．１　　　６７４．５　　　　１９．８ ５．２　　　　２０．３ ３　　　　０．０　　　０．０　　　５１３　　　　０
．０　　　０．０　　　５０３　　　　０．０　　　０
．０　　　５１１Ｏ１４ ２５，５ １Ｏ１０ ２７，４ ２５，５ ３８０２２，１７５ ３８，０２２，１７６ ４，３２０，１ ４，３２０，０ ２３３１６，０４４，１７６４，３１８，７２４３１６
，０４４，１７６４，３１８，８実施例４ Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７非分画酵素濃縮物による
１段階、２段階または３段階処理による南洋産軟木クラ
フト・パルプの脱リグニン 南洋産軟木クラフト・パルプに対して、ファネロケーテ
・クリソスポリウム−Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７非
分画酵素濃縮物による１段階、２段階または３段階処理
を実施した。実験は、以下に述べるように変更した、実
施例３の方法に従って実施した。 パルプの調製 湿った「洗浄」南洋産軟木クラフト・パルプは２５．４
％の粘稠度、２５％Ｇ、Ｅ、の白色度及び２５．００μ
カツパ数を有した。 酵素濃縮物の調製 Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７非分画酵素濃縮物を実施
例１に述べたように、ローラー・ボトルと増殖培地Ａと
を用いて調製し、使用するまで一７０℃に保存した。全
ての反応に対して同じ濃縮物製剤を用いた。酵素濃縮物
を解凍し、第１段階反応に加える直前にそのＶＡＯ活性
を測定した；この値は下記にリストする。第１段階反応
に用いた酵素濃縮物のＰＲＯ活性のリストした値は、凍
結前の濃縮物のＰＲＯ活性と第２段階の前に測定した濃
縮物のＰＲＯ活性との平均値を表す。第１段階反応に用
いるためのアリコートを取り出した後、酵素濃縮物を４
℃において１晩貯蔵した。翌日、酵素濃縮物を第２段階
反応に加える前に、ＶＡＯとＰＲＯの両活性に関して酵
素濃縮物を再び検定した。酵素濃縮物を第３段階に用い
るまで４℃において再び保存した。この実験では、第３
段階を第２段階と同じ日に開始した。第２段階と第３段
階との間の経過時間が比較的短かったため、第３段階の
直前に、濃縮物の３回目の検定は実施しなかった。 従って、第３段階反応に対して第７表でリストしたＬｉ
ＰとＭｎＰの単位は第２段階の直前に実施した検定から
のＶＡＯ活性とＰＲＯ活性とを用いて算出したものであ
る。各段階で加えた酵素単位の算出に用いた酵素濃縮物
のＶＡＯ活性とＰＲＯ活性との値を次に示す： ＶＡＯ活性　　　　ＰＲＯ活性 艮遵　　（Ｕ／ｌ！ｌｌ）　　　　　　（Ｕ／ｌｌ１ｌ
）１　　　１２．０　　　　　２３．８ ２　　　１１．２　　　　　２２．５ ３　　　１１．２　　　　　２２．５ 第１段階 次の組成の１０　Ｘ反応ミックスを調製した＝２００ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ）１４．５）　；　０．５％トウ
イーン８０　；　４．０ｍＭベラトリル・アルコール；
　　１００ｍＭ乳酸塩；１．０ｍＭ硫酸マンガン、この
反応ミックスを水酸化ナトリウムによってｐＨ４，５に
調製した。反応ミックスを１１反応管と６対照管の各々
に加えた（２．０ｍにＬ／管）。次に洗浄パルプ１．６
ｇ（パルプ乾量０．４ｇ）を容管に加えた。次に、全て
の反応成分を加えた時に管あたりの最終反応量が２０ｍ
１になるために必要な量で、二重蒸留水を容管に加えた
。酵素濃縮物によって与えられるグルコースを除いて、
最終反応濃度がｌｏ、ＱｍＭになるように容管にグルコ
ースを加えた。次に、管を旋回して混合した。管の中味
を通して３分間、酸素をバブルさせた。次に酵素濃縮物
を加えた。 第６表は各反応管に加えたＬｉＰとＭｎＰの単位を示す
、最後に、グルコース・オキシダーゼ（１，ＯＶ／μｍ
）２０μ℃を多管に加えた。多管の最終反応量は２０ｍ
　ＪＺであった。グルコース・オキシダーゼを加えた後
に、管に栓をし、おだやかに旋回させて中味を混合し、
パルプを分散させた。 サンプルを１晩インキユベートした。インキュベーショ
ン後に、各反応からのパルプを水酸化ナトリウムで洗浄
し、次に水で２回洗浄した。次にサンプル１〜６からの
パルプを酢酸で洗浄して、ｌＦ＆風乾させ、白色度、リ
グニン含量及び粘度に関して検定した。第７表はこれら
の分析結果を示す。 第２段階 サンプル７〜１７からのパルプに対して、蒸留本釣２５
０ｍｊ２による新たな水洗を実施した。この最後の水洗
後に、これらのサンプルからのパルプを再び反応管に入
れ、第１段階で上述したと同様に、酵素濃縮物と共にイ
ンキュベートした。第６表は第２段階反応に加えたＬｉ
ＰとＭｎＰの単位を示す。 第２段階反応を実施例３に述べたように５時間インキュ
ベートした。次に、各反応からのパルプを水酸化ナトリ
ウムで１回及び水で２回、第１段階で述べたように、洗
浄した。次にサンプル７〜１１からのパルプを酢酸で洗
浄し、１晩風乾させ、白色度、リグニン含量及び粘度に
関して検定した。第７表はこれらの分析の結果を示す。 １１旦１ サンプル１２〜１７からのパルプに対して蒸留本釣’２
５０ｍＪ！による新たな水洗を実施した。次にサンプル
１２〜１７からのパルプを再び反応管に入れ、第１段階
で上述したように、酵素濃縮物と共にさらにインキュベ
ートした。第６表は第３段階反応に加えたＬｉＰとＭｎ
Ｐの単位を示す。 第３段階反応を１晩インキユベートした。次に、各反応
からのパルプを、第１段階で上述したように、水酸化ナ
トリウムと水で洗浄した。次にサンプル１２〜１７から
のパルプを酢酸で洗浄し、１晩風乾させ、白色度、リグ
ニン含量及び粘度に関して検定した。第７表はこれらの
分析結果を示す。 結　　果 第６表は各段階のパルプ・サンプルに加えたＬｉＰとＭ
ｎＰの単位を示す、実施例３と同様に、パルプ乾量１ｇ
あたりのＬｉＰまたはＭｎＰ単位及び反応混合物量あた
りの単位は、各反応が２０ｍｕ量中にパルプ乾量０．４
ｇを含むので、第６表の値から算出することができる。 第７表はこの実験の結果−一処理パルブの白色度、リグ
ニン含量及び粘度を示す０反復実験も含める。サンプル
１〜６は第１段階後に検定した。 サンプル７〜１１は　２段階後に検定した。サンプル１
２〜１７は第３段階後に検定した。第６表は各パルプ・
サンプルに加えたＬｉＰとＭｎＰの累積単位をも示す。 南洋産軟木クラフト・パルプのＶＫＭ−Ｆ−１７６７酵
素濃縮物による１段階処理はパルプの有意な脱リグニン
を生じた。２段階処理はリグニン含量がさらに低いパル
プを生じた。３段階処理は２段階処理よりもさらに良好
に作用した。１段階処理及び２段階処理によっても有意
な脱リグニンが達成されたが、パルプは増白されなかっ
た。この理由はリグニン含量が増白を生ずるほど充分に
低下しなかったためと考えられる。しかし、３段階処理
後には、リグニン含量が充分に低下し、増白が観察され
た。パルプ粘度は酵素処理によって減少しなかった。 呈」し宍 第１ ＬＩＰ ０．０ ０．０ ９．６ ９．６ １９．２ １９．２ ０．０ ０．０ ９．６ ９．６ １９．２ ０．０ Ｏｏｏ ９．６ ９．６ １９．２ １９．２ 段階 ＭｎＰ Ｏ９０ ０、Ｏ １９，０ １９，０ ３８，１ ３８，１ ０，０ ０，０ １９、Ｏ １９，０ ３８，１ ０，０ ０、Ｏ １９、Ｏ １９，０ ３８，１ ３８、ｌ 第２段階 ＬＩＰ　　ＭｎＰ ｏ、ｏ　　ｏ、。 ｏ、ｏ　　　　ｏ、。 ４．８　９．６ ４．８　　　９．６ ９．６　１９．３ ０．０ ０．０ ４．８ ４．８ ９．６ ９．６ ０．０ Ｏ９０ ９，６ ９゜６ １９．３ １９．３ 第３段階 ＬｉＰ　　　　ＭｎＰ ｏ、ｏ　　　　ｏ、。 ｏ、ｏ　　ｏ、。 Ｏ，６１，２ Ｑ、８　１．２ １．３　　　２．８ １．３　　　２．６ 単位 ０．０ ０．０ ３　　　１　　　９．６　　１９．０　　　２８４　　
　１　　　９．８　　１９．０　　　２７５　　　１　
　１９．２　３８．１　　　２８Ｂ　　　　１　　１９
．２　３８．１　　　２８０．０ ０．０ ９　　　１　　１４．４　　２８．８　　　３１１０　
　　２　　１４．４　　２８．６　　　３０２８．８ ５７．４ ０．０ ０．０ １４　　　２　　１５．０　２９．８　　　３５１５　
　　２　　１５．０　２９．８　　　４０１［ｉ　　　
　２　　３０．１　　６０．０　　　４０１７　　　２
　　３０．１　６０．０　　　４３非処理洗浄パルプ ２２．４ １４．３ １９．９　　　　２１．４ ２０．１　　　　１９．４ １７．９　　　　１８．３ １９．４　　　　１９．５ ２２．３ １２．８ １６．０ ！５．０ １４．３ １６．４ １５．９ ２０．４ １１．９ １２．４ １Ｏ１２ １４，２ １０，１１３，９ ８，７１４，３ ２５，０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１つ以上の酵素脱リグニン段階を含むリグノセルロ
   ース材料の脱リグニン方法において、各段階が脱リグニ
   ン反応を通して約０．００１〜０．５ｍＭの定常状態濃
   度での過酸化水素；ならびに （ａ）Ｍｎ（II）０〜１．０ｍＭ、 （ｂ）α−ヒドロキシ酸０〜２０ｍＭ、 （ｃ）リグニン分解酵素の基質として用いられ得る置換
   芳香族アルコール０〜０．６ｍＭ及び （ｄ）非イオン洗剤及び両性イオン洗剤から成る群から
   選択した洗剤０〜０．１％を含む反応混合物に含まれる
   有効量のリグニン分解酵素製剤と共にリグノセルロース
   材料をインキュベートする工程を含むことを特徴とする
   方法。 ２、置換芳香族アルコールが０．００５〜０．５ｍＭの
   量で存在することを特徴とする請求項１記載の方法。 ３、リグノセルロース材料が木材パルプであることを特
   徴とする請求項１または２に記載の方法。 ４、過酸化水素濃度をその場での酵素による過酸化水素
   の発生によつてまたは過酸化水素の計量添加もしくは定
   期的添加によって定常状態レベルに維持することを特徴
   とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５、α−ヒドロキシ酸が乳酸塩であり、置換芳香族アル
   コールがベラトリル・アルコールであることを特徴とす
   る請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６、リグニン分解酵素製剤が白腐れ菌に由来するもので
   あることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の
   方法。 ７、白腐れ菌がファネロケーテ・クリソスポリウムの菌
   株であることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８、ファネロケーテ・クリソスポリウムの菌株がＮＲＲ
   Ｌ１５９８７の同定特徴を有するＳＣ２６；ＡＴＣＣ２
   ４７２５の同定特徴を有するＶＫＭ−Ｆ−１７６７；及
   びＡＴＣ３４５３１の同定特徴を有するＭＥ−４４６か
   ら成る群から選択した要素であることを特徴とする請求
   項７記載の方法。 ９、リグニン分解酵素製剤が白腐れ菌の濃縮細胞外培養
   培地からな成る非分画酵素濃縮物であることを特徴とす
   る請求項６に記載の方法。 １０、リグニン分解酵素製剤が少なくとも１種類のリグ
   ニン・ペルオキシダーゼを含むことを特徴とする請求項
   １記載の方法。 １１、リグニン分散酵素製剤が少なくとも１種類のＭｎ
   （II）依存性ペルオキシダーゼを含むことを特徴とする
   請求項１０記載の方法。 １２、リグニン分解酵素製剤が本質的に１種類以上のリ
   グニン・ペルオキシダーゼから成ることを特徴とする請
   求項１記載の方法。 １３、リグニン分解酵素製剤が本質的に１種類以上のＭ
   ｎ（II）依存性ペルオキシダーゼから成ることを特徴と
   する請求項１記載の方法。 １４、各酵素脱リグニン段階がさらに次の工程： （ａ）リグニン分解酵素製剤と共にインキュベートする
   工程の後でアルカリによってリグノセルロース材料を抽
   出する工程；と （ｂ）リグノセルロース材料を水で徹底的に洗浄する工
   程； を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法
   。 １５、アルカリによる抽出工程の後にリグノセルロース
   材料を希酸溶液で抽出することを特徴とする請求項１４
   記載の方法。 １６、前記の１つ以上の酵素脱リグニン段階に加えて少
   なくとも１つの従来の漂白段階を含む請求項１記載の方
   法。