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JPH02190193A - アミド化ペプチドの製造方法 - Google Patents

アミド化ペプチドの製造方法

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JPH02190193A
JPH02190193A JP1005879A JP587989A JPH02190193A JP H02190193 A JPH02190193 A JP H02190193A JP 1005879 A JP1005879 A JP 1005879A JP 587989 A JP587989 A JP 587989A JP H02190193 A JPH02190193 A JP H02190193A
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gly
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正治 田中
Kazuhiro Oosue
和廣 大末
Koji Magota
浩二 孫田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、Ｃ−末端α−アミド化生理活性ペプチド前駆
体の製造方法、Ｃ−末端α−アミド化酵素によるＣ−末
端α−アミド化ペプチドの一製造方法、並びにこの方法
に用いる酵素の動物細胞を用いる製造方法に関する。
〔従来の技術〕
一般に、真核細胞において、ある種のペプチドまたは蛋
白質はメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から翻訳さ
れた後、細胞内酵素により、さらに修飾（ポスト・トラ
ンスレーショナル・モデイフィケーション）され、天然
型のペプチドまたは蛋白質が生ずることが知られている
。しかしながら、現在遺伝子操作によって、真核細胞由
来ペプチドまたは蛋白質を生産する宿主として広く用い
られている大腸菌のような原核細胞では、ｍＲＮＡ翻訳
後のペプチドまたは蛋白質の修飾をおこなうことができ
ない。
この真核細胞特有なペプチドまたは蛋白質の修飾の一つ
に、ペプチドまたは蛋白質のカルボキシル基末端（Ｃ−
末端）α位がアミド化（−ＣＯＯＩＩ基をＣ［］ＮＨ２
基へ変換すること）される修飾反応がある。
すでにこの修飾は、真核細胞由来の多くの生理活性ペプ
チドまたは蛋白質に起こっていることが知られており、
又、しばしばこの修飾はこれらペプチドまたは蛋白質の
生理活性作用発現に必須であることが知られている。−
例を示せば、ヒト・カルシトニンの場合、天然型のＣ−
末端プロリンアミド残基をプロリン残基に変換すると、
生理活性が１６００分の１にも減少することが知られて
いる。
近年、真核細胞由来のＣ−末端α−位がアミド化された
ペプチドまたは蛋白質（以後アミド化ペプチドと略す）
の生合成機構を明らかにすることの重要性に加え、遺伝
子操作を用いてアミド化ペプチドを大量生産する手段と
しても、真核細胞特有なアミド化ペプチドの詳細な生合
成機構に関する研究がなされてきた。まず、多くのアミ
ド化ペプチドのｃＤＮＡの解析から、これらアミド化ペ
プチドの前駆体構造が明らかにされた。この結果アミド
化ペプチドの共通の前駆体構造は、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌ
ｙ（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化されるドの残りの
部分を示す〉であることが推定された。
一方、このアミド化ペプチド前駆体をアミド化ペプチト
ニ変換する（Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−＋ＲＸ−ＮＨ２）酵素（
Ｃ−末端α−アミド化酵素）については、１９８２年Ｂ
ｒａｄｂｕｒｙらにより初めて報告された。すなわち彼
らは、合成基質Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＧｌｙをＤ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−ＮＨ２に変換する酵素活性が、ブタ、下垂
体中に存在することを示し、さらに基質のＣ−末端グリ
シン残基がアミドの窒素（Ｎ）の供与体として必須であ
ることを示した（Ｂｒａｄｂｕｒｙ、　Ａ、　Ｆ、等；
　Ｎａｔｕｒｅ、　２９８゜６８６−６８８．１９８２
）　。次に、Ｅｉｐｐｅｒらは、コノ酵素活性がラット
下垂体の前葉・中葉及び後葉に存在していることを報告
し、この酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状酸
素のほかに、銅イオン（Ｃｕ”）とアスコルビン酸が必
要であることを報告した（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　８０．５１４４−５
１４８゜１９８３）。
さらに、最近では種々の組織から、Ｃ−末端αアミド化
酵素の精製が試みられており、まずＭｉｚｕｎｏ等はア
フリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）の
体皮より、Ｃ−末端α−アミド化酵素を単一で純粋な状
態まで精製することに成功しくＭｉｚｕｎｏ、　Ｋ等、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ
ｕｎ、１３７．９８４−９９１゜１９８６、及び特願昭
６ｌ−１３１０８９）、又、本発明者らにより、この酵
素のｃＤＮＡクローニングが成された。この結果、この
酵素の全アミノ酸配列が明らかにされ、さらにカエルに
は少なくとも種類の異なる２種類の酵素が存在している
ことも明らかにされた（Ｍｉｚｕｎｏ、　Ｋ等、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ
。
１４８、５４６−５５２．１９８７．０ｈｓｕｅ、　Ｋ
等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１５０．１２７５−１２８１
．１９８８．及び特願昭６２−１７７１８４）。
一方、ε１ｐｐｅｒらは、牛脳下垂体由来のＣ−末端α
−アミド化酵素のｃＤＮＡクローニングを行い、牛脳下
垂体由来のＣ−末端α−アミド化酵素は前者（Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ由来）とはアミノ酸配列上明らかに異なる酵素で
あることを明らかにした（Ｅｉｐｐｅｒ、　Ｂ９等Ｍｏ
ｌ、　ｕｎｄｏ、１．７７７−７９０．１９８７）。
これらの研究により現在までに、真核細胞ではＣ−末端
α−アミド化酵素が複数存在していることが明らかにさ
れてきた。このことは、個々のＣ−末端α−アミド化酵
素がそれぞれ異なる基質特異性を示す、言い換えれば、
生体内において個々のアミド化ペプチドの生合成に関し
、それぞれ固有のＣ−末端α−アミド化酵素が存在して
いる可能性を示しているが、現在までのところ、この問
題に関する詳細については明らかにされていない。
以上述べた様に、現在までに解明されてきた真核細胞の
アミド化ペプチド生合成機構を考えれば、以下に示す方
法を用いてアミド化ペプチドを大量生産することが可能
と思われる。すなわち、まず、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで
示されるアミド化ペプチド前駆体を遺伝子操作を用いて
大腸菌などの原核細胞で大量発現させ、大量かつ安価に
製造する方法を見いだし、次に、真核細胞由来のＣ−末
端α−アミド化酵素を何らかの方法で十分量確保し、さ
らに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでアミド化ペプチド前駆体と、
Ｃ−末端α−アミド化酵素とを用いて、アミド化ペプチ
ドを生産する至適反応条件を確立することができれば、
アミド化ペプチドを大量かつ安価に製造することが可能
と思われる。事実、現在までに、この考え方に基づき、
アミド化ペプチドを製造しようとする試みが、数多くな
されてきた。
まず第一に、アミド化ペプチド前駆体の製造に関しては
、大腸菌を用いた遺伝子操作による製造が数多く報告さ
れている。例えば、ベネット、アラン、デビット等は、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）蛋白質の活性部分とヒト・カルシトニン前駆体（
ｈｃＴ−Ｇｔｙ）の融合タンパクを大腸菌で発現した後
、ヒト・カルシトニン前駆体を生産する方法について報
告している（特表昭６Ｏ−５０１３９１）。
しかし、この方法では融合蛋白質４４ｍｇからヒト・カ
ルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）が約１．１〜２、
　Ｏｍｇ　Ｌか得られず、ｈＣＴ−Ｇｔｙの生産系とし
ては効率よい方法とは言えない。
一方、本発明者らは、β−ガラクトシターゼ由来の蛋白
とヒト・カルシトニン前駆体構造を含むペプチド（ｈＣ
Ｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）との融合タンパ
クを大腸菌を用いて発現させ、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ＾ｒｇを極めて効率よく生産する方法について
報告している（特願昭６３−４９７２３　’）。
しかし、このペプチドは、そのままではＣ−末端α−ア
ミド化酵素の基質とはならず、何らかの方法でｈＣＴ−
Ｇｌｙへ変換する必要がある。
第二に、Ｃ−末端α−アミド化酵素の選択及び量の確保
に関しては、イートン、マイケル等による、ブタ下垂体
より部分的に精製したＣ−末端αアミド化酵素を用いて
ヒト・カルシトニンを製造した例（特表昭６３−５０１
５４１）がある。
しかし、この方法も含め、天然の組織及び細胞から目的
とするＣ−末端α−アミド化酵素を十分量得ることは困
難であり、コストも高く、実際、産業上アミド化ペプチ
ドを大量に生産するには実用的でないと考えられる。こ
の点に関し、本発明者らは、カエル体皮由来のＣ−末端
α−アミド化酵素及びこの誘導体を遺伝子操作を用い、
大腸菌内で大量に発現させ、この酵素を大量に確保する
方法を開発したく特願昭６２−３０６８６７）。
しかしながら、大腸菌内で発現させたカエル体皮由来の
Ｃ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は、カエル体
皮より精製した酵素に比べ比活性が低く、アミド化ペプ
チドを大量生産するのに用いるためには、現在、より比
活性の高い酵素の供給方法が望まれている。
第三に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでアミド化ペプチド前駆体と
Ｃ−末端α−アミド化酵素とでアミド化ペプチドを製造
する際の至適反応条件に関しては、前記したように、こ
の酵素反応には銅イオン（Ｃｕ２”）、分子状酸素、ア
スコルビン酸、及びカタラーゼが必要とされていること
が判っていたが、例えば、特表昭６３−５０１５４１で
報告されているように、ヒト・カルシトニン前駆体をブ
タ下垂体より部分的に精製したＣ−末端α−アミド化酵
素でヒト・カルシトニンを製造する場合、この酵素の至
適反応条件ではヒト・カルシトニン前駆体の溶解度が低
く、反応が効率よく起こらないことが知られている。
従ってこの反応をｉｎ　ｖｉｔｒｏで効率よく行わせる
ためには、目的ペプチドに最適な反応条件を見いだすこ
とが必須と考えられる。
以上述べたように、現在、アミド化ペプチドを大量かつ
安価に得るためには、少なくとも三つの技術的問題、す
なわち、■アミド化ペプチド前駆体をいかに効率よく生
産するか。■Ｃ−末端α−アミド化酵素をいかにして十
分量確保するか。■ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、アミド化ペプ
チド前駆体とＣ−゛末端α−アミド化酵素でアミド化ペ
プチドを製造する際の至適反応条件をいかに設定するか
。以上三つの技術的問題を解決しなければならず、現在
、これらの解決策が望まれている。
〔発明が解決しようとする課題〕
従って本発明は、まず、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで示され
るアミド化ペプチド前駆体を大量かつ安価に生産する方
法を提供し、次に、活性の高いＣ−末端α−アミド化酵
素を十分量確保する方法を提供し、さらには、アミド化
ペプチド前駆体とＣ−末端αアミド化酵素を用い、ｉｎ
　ｖｉｔｒｏでアミド化反応の至適反応条件を設定する
ことにより、産業上有用なアミド化ペプチド（例えばヒ
ト・カルシトニン）を、大量かつ安価に製造することが
できる方法を提供しようとするものである。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者等は、前記に述べた三つの課題の解決方法を種
々検討した結果、まず第一の課題、すなわち、アミド化
ペプチド前駆体の大量かつ安価な製造法としては、アミ
ド化されるべきアミノ酸のＣ−末端側にグリシン残基を
有しさらにこのグリシン残基のＣ−末端側に任意のアミ
ノ酸又はオリゴペプチドを有するペプチド、例えばシス
ティン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法（特
願昭６３−４９７２３）に従って製造されるヒト・カル
シトニン前駆体構造を含むペプチド（ｈＣＴ−Ｇｌｙ−
ＬｙｓＬｙｓ−Ａｒｇ又はＨＰＣＴ）をカルボキシペプ
チダーゼＢ（Ｃｐｓ）で処理することにより目的とする
ヒト・カルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）が大量か
つ安価に製造できることを見いだした。次に第二の課題
、すなわち、比活性の高いＣ−末端α−アミド化酵素を
いかにして十分量確保するかに関する解決策としては、
本発明者等が報告したアフリカッメガエル体皮由来のＣ
−末端α−アミド化酵素及びその誘導体を遺伝子操作し
、動物細胞で発現させることにより、比活性の高いＣ−
末端α−アミド化酵素を十分量生産できることを見いだ
した。さらに、第三の課題、すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏでのアミド化反応の至適条件設定に関しては、−例と
して、ヒト・カルシトニン前駆体と前記した方法で生産
したＣ−末端α−アミド化酵素とを用い、アミド化反応
の至適条件を種々検討した結果、きわめて効率の良い反
応条件を見いだすことができ、本発明を完成させるに至
った。
従って、本発明は、まず第一に一般式Ｒ−Ｘ−Ｇ１ｙ−
Ｂ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグ
リシン残基を示し、Ｂは１個又は複数個のアルギニン残
基、リジン残基又はアルギニン残基とリジン残基から構
成される任意のアミノ酸配列を示し、そしてＲはペプチ
ド又は蛋白質の残りの部分を示す）で示されるペプチド
（原料ペプチド又は蛋白質謄、カルボキシペプチダーゼ
（ＣｐＢ）で処理することにより、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇ１
ｙ（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化される任意のアミ
ノ酸残基を示し、そしてＲ及びＧｌｙは前記の意味を有
する）で示されるアミド化ペプチド前駆体を、大量にし
かも効率よく製造することを特徴とするアミド化ペプチ
ド前駆体の製造方法を提供しようとするものである。
第二に、第一の方法で得たアミド化ペプチド前駆体と、
Ｃ−末端α−アミド化酵素を用い、ｉｎν１ｔｒｏでア
ミド化ペプチドを得る際の至適反応条件（基質濃度、ア
スコルビン酸濃度、Ｃｕ２＋濃度、Ｂｕｆｆｅｒの種類
・濃度・ｐＨ，及びカタラーゼ濃度）を設定することを
特徴とするアミド化ペプチドの製造方法を提供しようと
するものである。なお、本発明においては任意のＣ−末
端α−アミド化酵素を使用することができ、例えばアフ
リカッメガエル体皮由来の酵素、ヒト甲状腺由来の酵素
（本特許出願と同日に出願された「ヒト甲状腺由来Ｃ末
端アミド化酵素」と題する特許出願の明細書中に詳細に
８己載されている。）等を挙げることができる。
第三に、前記第一の方法及び第二の方法を用いて原料ペ
プチド又は蛋白質からアミド化ペプチド又は蛋白質を製
造する方法を提供するものである。
本発明はさらに、Ｘｅｎｏｐｕｓ由来のＣ−末端α−ア
ミド化酵素又はその誘導体に対応する遺伝子を動物細胞
へ導入し、この細胞を培養することにより、培養上清中
より実用化しうるに十分量のＣ−末端α−アミド化酵素
を得ることを特徴とするＣ末端α−アミド化酵素の製造
方法を提供しようとするものである。
〔具体的な説明〕 （１）ヒト・カルシトニン前駆体及び他のアミド化ペプ
チド前駆体の製造方法 本発明者らは、以前ヒト・カルシトニン前駆体構造を含
むペプチド（ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
又はＨＰＣＴ）を極めて効率よく、しかも大量に得る方
法を報告した（特願昭６３−４９７２３）。しかしなが
ら、このペプチドは、直接、Ｃ−末端α−アミド化酵素
の基質とはなりえない。したがって、ヒト・カルシトニ
ン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）を得るためには、何らかの
方法を用いて、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇのＣ−末端部分に存在するＬｙｓ−ｔ、ｙｓ−Ａｒｇ
を除去しなければならない。本発明者等は、ｈＣＴ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｒｇをカルボキシペプチダーゼ
Ｂ　（ＣｐＢ）で処理すれば、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇから目的とするヒト・カルシトニン前
駆体（ｈｃＴ−Ｇｌｙ）が、極めて効率よく得られるこ
とを見いだした。なお、本発明の実施例には、ｈＣＴ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをｃｐｅを用いｈＣＴ
Ｇｌｙを製造する方法について具体的に述べるが、コノ
方法は、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（式中、Ｒ，Ｘ、及びＧ
ｌｙは前記の意味を有する）で示されるアミド化ペプチ
ド前駆体の製造方法として、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇ１ｙＢ（
式中、Ｒ，Ｘ、Ｇｌｙ、及びＢは前記の意味を有する）
で示されるアミド化ペプチド前駆体構造を含むペプチド
を、まず、化学合成・又は遺伝子操作で大腸菌などの原
核細胞で大量かつ安価に製造し、次にこれをＣｐＢで処
理すれば、目的とするアミド化ペプチド前駆体（Ｒ−Ｘ
−Ｇｌｙ）が容易に得ることができることを示している
。本発明におけるアミド化ペプチドの製造法の有用性は
、従来の技術（特表昭６Ｏ−５０１３９１）に報告され
ているような、アミド化ペプチド前駆体（Ｒ−Ｘ−Ｇｕ
ｙ）を融合蛋白法を用いて、直接大腸菌内で発現させ製
造する方法に比べ、以下に述べる点において優れている
。
ヒト・カルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｕｙ）を例に具
体的に示せば、このペプチドは、リジン残基とアスパラ
ギン酸残基をそれぞれ一残基含む、全体として３３アミ
ノ酸残基から成るペプチドで、ペプチド全体としてｐｌ
　（等電点）は中性付近を示す。従って、このペプチド
を融合蛋白質として大腸菌などで発現させ、この融合蛋
白質を、適当なプロテアーゼを用いてｈＣＴ−Ｇｌｙを
回収する場合に、ｈＣ’ＴＧ１ｙをｈｃ’ｒ−Ｇｔｙの
相手方蛋白質、ならびに相手方蛋白質より生ずるペプチ
ドフラグメントと分離することが必要となるが、ｈｃ’
ｒ−ｃｒｙのｐｆが中性付近を示す為に、簡単なイオン
交換クロマトグラフィーなどの分離操作でｈｃＴ−Ｇｔ
ｙを完全に精製することが困難である。一方、先に本発
明者らにより開発された様に（特願昭６３−４９７２３
）　ｈＣＴ−ＧｌｙのＣ−末端にＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇを付加したペプチド（ｈＣＴ−ＧｕｙＬｙｓ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ）はこのペプチド全体としてｐＩは塩基性を示
し、簡単なイオン交換クロマトグラフィーを行うことに
より、容易に精製することができる。
さらに、このようにして精製したｈＣＴ−Ｇ　ｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−ＡｒｇをＣｐＢで処理すれば、目的のア
ミド化ペプチド前駆体（ｈ（’Ｔ−Ｇｌｙ）は、この反
応で副生ずると考えられるｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　、
　ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　、及び原料のｈＣ
Ｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇからは簡単なイオ
ン交換クロマトグラフィー、または逆相クロマトグラフ
ィーなどを用い簡単に精製することができる。
次に、この方法の第二の利点としては、本発明者等によ
り開発された（特願昭６３−４９７２３）系において、
ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ生産に用いた
のと基本的には同一な発現プラスミツドを用い、ｈｃ’
ｒ−ｒ；ｔｙを発現したところ、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの場合に比べ、ｈＣＴ−Ｇｌｙとβ
−ガラクトシターゼの部分構造を含む融合タンパクの生
産性が、ｈＣＴ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの
それに比べ、著しく減少すると言うまったく予測し得な
い事実を見いだした。又、このキメラ蛋白質の生産性の
減少は、ｈｃＴ−ＧｌｙのＣ−末端に塩基性アミノ酸残
基、例えばＡｒｇ残基を付加したｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ、さらにはｈｃ’ｒ−Ｇｔｙ−＾ｒｇ−＾ｒｇ＾ｒｇ
などではｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇと同
じくらいの生産性を示すと言うまったく新しい事実を発
見した。従って、これらの実験事実を考え合わせると、
本発明で示すアミド化ペプチドの新規製造法が、従来法
に比べいかに優れているかが判る。
（２）Ｃ−末端α−アミド化酵素の製造法すでに本発明
者らは、カエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素、
及びこの誘導体を遺伝子操作を用い、大腸菌内で大量に
発現させ、この酵素を大量に発現させることに成功して
いる（特願昭６２−３０６８６７）。しかし、この方法
で発現したＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は
、大腸菌内でそのほとんどが変性（蛋白質のアミノ酸配
列は同一であるが、二次・三次構造が異なる）してあり
、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を示さない。
従って、この様な方法で製造した不活性な酵素は、何ら
かの方法を用いて活性型に変換する（ｒｅｎａｔｕ−ｒ
ａｔｉＯｎ）ことが必要となる。前記記載の発明におい
ては、この問題を解決するために、大腸菌で発現させた
酵素を尿素またはグアニジン塩酸塩などの変性剤で処理
した後、ｒｅｎａｔｕｒａｔ　ｉｏｎさせることにより
部分的にこの問題を解決した。しかし、この方法でもこ
れらの酵素活性は天然より精製したＣ−末端α−アミド
化酵素の比活性には及ばないことが判った。本発明者ら
は、この原因の一つが、カエル体皮由来のＣ−末端ａ−
アミド化酵素及びこの誘導体に複数個存在しているシス
ティン残基（カエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵
素の一つは分子内に１０個のシスティン残基を有してい
る）が、大腸菌内でこの酵素を発現した場合、天然型と
同様なシスチン結合（Ｓ−Ｓ結合）を形成することがで
きないと考えた。そこで、本発明者らは、大腸菌で発現
した酵素を前記した変性剤に加え、還元剤（例えば、Ｄ
ＴＴまたは２−メルカプトエタノール）などで処理した
後、様々な方法を用いて酸化させることにより、ｒｅｎ
ａｔｕｒａｔｉｏｎを試みたが、酵素活性を高めること
はできなかった。
そこで、本発明者らは、この問題を解決する新たな手段
として、先に得た、カエル体皮由来のＣ−末端α−アミ
ド化酵素ｃＤＮＡを用い、２種類（カエル体皮由来のＣ
−末端α−アミド化酵素及びその誘導体）のＣ−末端α
−アミド化酵素を動物細胞で発現させることにより、酵
素活性の高いＣ−末端α−アミド化酵素を、大量に得る
ことを計画した。すなわち、まず、カエル体皮由来のＣ
−末端α−アミド化酵素（ＸＡ４５７）としては、特願
昭６２−３０６８６７の第１＝１図〜第１−３図に記載
されているｐＸＡ４５７　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａにコードされ
ているアミノ酸配列１から４００番目までのアミノ酸−
次配列をコードするｃＤＮＡを、一方、その誘導体（Ｘ
Ａ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　＞としては、特願昭６２−３
［１６８６７の第１６−１図〜第１６−３図に記載され
ているｐＸＡ７９９ｃＤＮＡにコードされているアミノ
酸配列−３９から６９２番目までのアミノ酸−次配列を
Ｎ〜末端に、これにひき続くＣ−末端がロイシン残基が
付加したアミノ酸配列をコードする遺伝子を、それぞれ
ＳＶ４０プロモーター支配下、動物細胞内で発現される
ようにデザインしたプラスミツド（このプラスミツドを
それぞれｐＫＤＰＸＡ４５７及びｐＫＤＰＸ＾７９９　
Ｂｇｌ　ｍとする）を作製する。次にこれらのプラスミ
ツドを常法に従い、それぞれＣＨＯ細胞（チャイニーズ
ハムスター卵巣由来細胞）へ導入し、目的遺伝子が導入
された細胞（この細胞をそれぞれＣＨＯ／　ｐにＤＰＸ
八４へ７−　ａ及びＣＨＤ／ｐＫＤＰＸＡ７９９　Ｂｇ
ｌ　ＩＩαとする）を得た。次に、このようにして得た
細胞をメトトレキセー）　（ＭＴＸ）濃度を順次上昇さ
せた培地で培養することにより導入遺伝子が増幅された
細胞株を得た。最終的には、ｐＫＤＰＸ＾７９９８ｇｌ
■を導入した細胞集団から、クローニング操作を行うこ
とにより、大量のＣ−末端α−アミド化酵素活性（２０
００ｕｎｉｔ／Ｉｎ！＞を培養上清中へ分泌するＣ−末
端α−アミド化酵素（これをＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ
とする）生産株ＣＨ［ｌ／ＩＯｃを樹立することができ
た。さらに、本発明者らは、前記培養上清中に分泌され
たＣ−末端α−アミド化酵素は、この培養液を硫安（硫
酸アンモニウム）で処理すれば、特異的にこの酵素を沈
澱させることができることを見いだした。以上の結果、
本発明者らは、実用化しろるに十分量のＣ−末端α−ア
ミド化酵素を製造する方法を確立することができた。
（３）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるアミド化反応の至適
反応条件の設定 すでに述べた様に、真核細胞においては、種類の明らか
に異なるＣ−末端α−アミド化酵素が存在していること
が判っているが、これらの酵素の基質特異性に関する詳
細については、判っていない。一方、一般にこれらの酵
素は、最大酵素活性を示すためには、分子状酵素、銅イ
オン（Ｃｕ”）、アスコルビン酸及びカタラーゼが必要
であることが、主に合成基質（例えばＤ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ）を用いた実験より判っており、また、個々
に部分精製、または完全に精製された、Ｃ−末端α−ア
ミド化酵素についての至適ｐｌ（についても報告されて
おり、それぞれの酵素について異なった至適ｐＨが存在
していることも判っている。さらに、特表昭６３−５０
１５４１で報告されているように、ヒト・カルシトニン
前駆体を、ブタ・下垂体より部分的に精製したＣ−末端
α−アミド化酵素でヒト・カルシトニンを製造する場合
、この酵素の至適反応条件ではヒト・カルシトニン前駆
体の溶解度が低く、目的とするヒト・カルシトニンを得
られないという例もある。従って、これらの事実を考え
合わせると、ｉｎ　ｖ＋ｔｒｏでアミド化ペプチド前駆
体とＣ−末端α−アミド化酵素を用いて、目的とするア
ミド化ペプチドを効率よく得るためには、個々の、アミ
ド化ペプチド前駆体及びＣ−末端α−アミド化酵素を用
いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるアミド化反応の至適反
応条件を設定することが重要となる。
そこで、本発明者等は、まず本発明で製造した、ヒト・
カルシトニン前駆体（ｈｃＴ−Ｇｌｙ）ト、Ｃ−末端α
−アミド化酵素（ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　）を用い
て、ヒト・カルシトニンをｉｎ　ｖｉｔｒｏで製造する
場合の、至適反応条件、すなわち、ａ）アスコルビン酸
濃度、ｂ）カタラーゼ濃度、Ｃ）銅イオン（Ｃｕ’“）
濃度、ｄ）緩衝液の種類・濃度・ｐＨ，及びｅ）基質（
ｈｃＴ−Ｇｕｙ）濃度について個々の至適条件を検討し
た。この結果、ａ）アスコルビン酸濃度は１〜７ｍＭで
反応は効率よく進んだが、さらに濃度が高い（２０ｍＭ
）と反応効率が逆に低下した。ｂ）カタラーゼ濃度は、
１μｓ　／　ｍ１以上の濃度があればよいことが判った
。Ｃ）銅イオン濃度は、０，１゜１０μＭと濃度が高く
なるにつれて反応効率が高まるが１０μＭ以上の濃度で
は、反応効率が変わらなかった。ｄ）緩衝液の種類、濃
度、及びｐＨに関しては、酢酸アンモニウム、ｌ　９ｍ
ＭＳｐＨ６〜７が良いことが判った。さらに、ｅ）基質
濃度に関しては、５ｍｇ／−まで基質濃度を高めること
ができることが判った。なお、本発明で見いだした１ｎ
ｖｉｔｒｏでのアミド化反応条件を用いれば、特表昭６
３−５０１５４１に報告されているような、ヒト・カル
シトニン前駆体（ｈｃＴ−Ｇｕｙ）の溶解度が悪く、ア
ミド化反応が効率よくおこらないと言う問題は、起こら
ず、ヒト・カルシトニンを効率よく得ることができた。
次に、この様にして求めた反応条件を基に、実際、ヒト
・カルシトニン前駆体とＣ−末端α−アミド化酵素（Ｘ
Ａ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　）を用い、ヒト・カルシトニ
ン（ｈＣＴ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏで効率よく、安価に製
造する方法を見いだした。
〔発明の効果〕
本発明では、第一に、前記Ｒ−Ｘ−Ｇ１３１−８で表わ
される原料ペプチド又は蛋白質例えばヒト・カルシトニ
ン前駆体構造を含むペプチドｈＣＴ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇを、カルボキシペプチターゼＢ　（Ｃ
ｐｓ）により、効率よく、前記Ｒ−Ｘ−Ｇ１ｙで表わさ
れる前駆体、例えばヒト・カルシトニン前駆体ｈＣＴ−
Ｇｌｙに変換することができる。第二に、前記した方法
で製造した前駆体Ｒ−Ｘ−Ｇ１ｙと、Ｃ−末端α−アミ
ド化酵素とを用い、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、目的とするＣ
−末端アミド化ペプチドＲ−Ｘ−ＮＨ２を製造すること
ができる。第三に、カエル体皮由来のＣ−末端α−アミ
ド化酵素及びその誘導体に対応する遺伝子を遺伝子操作
を用い、動物細胞（ＣＨＯｃｅｌｌ）で発現させること
により、実用化しうるに十分量のＣ−末端α−アミド化
酵素を製造することができる。この結果、産業上有用な
Ｃ−末端がアミド化された生理活性ペプチドを大量しか
も安価に製造することができる。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．　ヒト・カルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ）の製造法 ｈＣＴ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　（この
ペプチドは特願昭６３４９７２８の１１頁に記載されて
いるＨＰＣＴと同一化合物であり、この物の製造に関し
ては上記特許出願明細書に記載の方法を用いて製造でき
る）２８０ｍｇを、まず、０．１Ｎ酢酸３０ｍ！！に完
全に溶かし、次に、この溶液にＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐ
Ｈ８，０＞　３０　ｍｌ！と水を加え、全体として２３
０ｒｄ！（ｐＨ７，８）の反応溶液を作製する。次に、
この反応溶液にカルボキシペプチターゼＢ（Ｓｉｇｍａ
社より購入）５６０μｇを加え、３７℃で３０分間反応
させた。この反応の進行は、反応液の一部をＹＭＣＰａ
ｃｋｅｄカラムＡ−３０２（０，４６ｃｍＸ１５ｃｍ　
・山村化学研究所）を用いた高速液体クロマトグラフィ
ー（）！ＰＬＣ）に供し、目的とするｈｃｒ−Ｇｔｙ、
反応中間体のｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　、　ｈ
ＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　、及び原料のｈＣＴ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを０．１％トリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）　と０．１％ＴＦＡ−５０％ＣＨ３ＣＮを用い
たの直線濃度勾配で溶出させ解析した。この結果、上記
反応は３７℃３０分間で完全に終了していることが判っ
た（第１図参照）。ｈＣＴ−Ｇｌｙの単離は、上記反応
液をＹＭ［：　ＰａｃｋｅｄカラムＤ−ロＤＳ−５（２
ｃｍＸ２５ｃｏ＋・山村化学研究所）を用いたＨＰＬＣ
に供し、つづいて、ｈｃ’ｒ−ｒ；ｔｙを０．１％ＴＦ
Ａ−５０％Ｃ１１３ＣＮで溶出させた。次に、溶出画分
を集め、凍結乾燥することにより、最終的にｈＣＴ−Ｇ
ｌｙを２３５ｍｇ得た。このようにして得たｈｃＴ−Ｇ
ｌｙの同定は、一部を６Ｎ塩酸で２４時間加水分解した
後のアミノ酸分析値（日立製作新製８３５−２０型アミ
ノ酸分析機を用いた）が理論値とよく一致すること、さ
らには、Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０＾Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　５ｅｑｅｎｃｅｒ）を用いてアミノ酸配列を決
定することによって行った。なお、以下にｈｃ’ｒ−ｒ
；ｔｙのアミノ酸分析の結果を示す。ただしく　）内は
理論値。
Ａｓｘ　２．８３（３）、Ｔｈｒ　４．５１（５）、Ｓ
ｅｔ　０．９１（１）、ＧＩＸ　１，９４（２）、Ｐｒ
ｏ　２．０４（２）、Ｇｌｙ　４．８３（５）、＾ｌａ
　１．７８（２）、　ＶａｌＯ，９８（１）、　Ｍｅｔ
　０．９７（１）、　ｌｉｅ　０．９５（１）、　Ｌｅ
ｕ　２．００（２）。
Ｔｙｒ　Ｏ，９５（１）、　Ｐｈｅ　２．８９（３）、
　Ｌｙｓ　０．９９（１）、　Ｈｉｓ　０．９７（１）
。
実施例２．Ｃ−末端α−アミド化酵素の製造法（１）動
物細胞発現プラスミツドｐＫＤＰＸ＾４５７及びｐＫＤ
ＰＸ＾７９９　Ｂｇｌ　ＩＩの作製（第２図参照）ｐＫ
ＤＰＸＡ４５７及びｐＫＤＰＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ
は、それぞれ、本発明者らによりクローニングされたア
フリカッメガエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素
ｃＤＮＡの内、特願昭６２−３０６８６７の第１−１図
〜第３−３図に記載されテイルｐＸＡ４５７中のｃＤＮ
Ａｌ：：コードされているアミノ酸配列１から４００番
目までのアミノ酸配列を持つ蛋白と、特願昭６２−３０
６８６７の第１６−１図〜第１６−３図に記載されてい
るｐＸＡ７９９中のｃＤＮＡにコードされているアミノ
酸配列−３９から６９２までのアミノ酸−次配列をＮ−
末端に、これに引き続くＣ−末端にロイシン残基が付加
した蛋白を動物細胞で発現させるようにデザインされた
プラスミツドである。すなわち、上記プラスミツドはい
ずれも、目的とする蛋白（Ｃ−末端α−アミド化酵素）
に対応するｃＤＮＡ遺伝子が、動物細胞内でＳＶ４０（
Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０）アーリープロモータ
ーの支配下転写され、しかも転写後、真核細胞でｍＲＮ
Ａが生成するために必要と考えられているスプライシン
グ及びｐｏｌｙ　Ａの付加を行わせるために、ＳＶ４０
プロモーターと、対応するｃＤＮＡ遺伝子の５′末端の
間にはウサギβグロビン遺伝子由来のイントロンが、ま
た、ｃＤＮＡの３′末端にはウサギβグロビン遺伝子由
来のｐｏｌｙ＾付加シグナルが付加しである。さらに、
これらのプラスミツドは上記遺伝子以外に動物細胞へ目
的遺伝子を導入した後、目的遺伝子が増幅した細胞をク
ローン化するのに利用されるｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子がＳＶ４０のアーリープロモーター支配下
に発現されるようにデザインされている。なお、本発明
で用いたプラスミツドｐＫＤＰＸＡ４５７、及びｐＫＤ
ＰＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｔ：形質転換した大腸菌
は、それぞれＥ、ｃｏｌｉ　ＳＳＭ　３００、及びＥ。
Ｃｏ１１　ＳＢＭ　３０１と命名され、工業技術院微生
物工業技術研究所に、微工研菌寄第２２３５号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−２２３５）、及び微工研菌寄第２２３６号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−２２３６）　として、寄託されている。
（２）　ｐＫＤＰＸＡ４５７又はｐＫＤＰＸＡ７９９　
Ｂｇｌ　Ｉ［０）ＣＨＯ細胞への導入 ｐＫＤＰＸＡ４５７とｐＫＤＰＸＡ７９９　Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉをツレツレｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃ
ｔａｓｅ遺伝子（ｄｈｆｒ）の欠損したチャイニーズハ
ムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ（以下ＣＨＯｄｈｆｒ−細
胞と略す。なお、この細胞はＣＨＯｄｈｆｒ（→Ｃｅ１
ｌ　ＳＢＭ　３０６と命名され、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２２４１号（ＦＯＲＭ　ＢＰ
−２２４１）として寄託されているｏ）　（Ｈａｎａｋ
ａ。
Ｓ１等Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　７２５７８−
２５８７．１９８７）にリン酸カルシウム共沈法を用い
て導入した。すなわち、まず、核酸を含むＭｉｎｉｍｕ
ｍ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）Ａｌ
ｐｈａ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ１α”ＭＢＭ培地）
に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）　（ＦｌｏｉｌｌＬ
ａｂ、）と抗生物質としてペニシリンＧ（５０１／ｒｎ
ｌ）とストレプトマイシン５０　μｇ／ｍｌを含む培地
で継代培養したＣＨＯｄｈｆｒ細胞を遺伝子導入１２時
間前に８０ＣＩＩｌのＴプラス：］　（Ｔ８０．　Ｎｕ
ｎｃ）あたり１．６Ｘ１０’細胞／３０ｍｊ！／Ｔ８０
になるようにまき直し、さらに遺伝子導入４時間前に、
新しいα＋ＭＢＭ培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質を含む
）３０ｍｆで培地交換した。一方、プラスミツ）’ｐＫ
ＤＰＸＡ４５７及びｐＫＤＰＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ
をツレぞれ１０μｇあたり２４０μｌの滅菌精製水に溶
解し、等量のＢｕｆｆｅｒ　Ａ（０，５Ｍ　ＣａＣｌ２
．０、ＬＭ　ＨＥＰＥＳ）を加え、混合し、１０分間室
温で放置した後、この混合液Ｍｉｘｅｒで数秒撹拌後、
室温で２０〜３０分放置することにより、プラスミツド
を含むリン酸カルシウムゲルを形成させた。次に、この
様にして得られた、プラスミツドを含むリン酸カルシウ
ムゲル９６０μｌを前記した方法で調製したＣＨＯｄｈ
ｆｒ−細胞（１，６Ｘ１０６細胞／３０ｄ／Ｔ８０）に
加え、４時間放置した。次にこの細胞をＦＢＳを含まな
い新しいα”ＭＢＭ培地１０ｍ１で一回洗浄した後、１
０％ＦＢＳを含むα＋ＭＥ！Ｍ培地：グリセロールー４
：１の混液をＴ８０フラスコあたり５ｍｌ！を加え、正
確に１分後、吸収除去し、再び１０％ＦＢＳを含むα＋
ＭＥＪＩ培地３０−を加え、５％Ｃ０２存在下で、３７
℃で培養した。次に、この細胞を４日間培養した後、０
．２５％トリプシン液（千葉血清）で細胞を剥離し、こ
の細胞をもう一度、核酸を含まないＭＥＭ　Ｍｅｄｉｕ
ｍ（α〜ＭＢＭ）　１０％透析ウつ胎児血清（ＦＢＳ’
、　ＨＡＺＢＬＴＯＮ）を加えた培地で１．６Ｘ１０’
細胞／３０ａｌｌ！／Ｔ８０になるようにまきなおした
。つづいて、この細胞を１０日間培養した後、この培地
で生存している細胞を目的のプラスミツドが導入された
細胞（ｐＫＤＰＸＡ４５７を導入しり細胞をＣＨＯ／ｐ
ＫＤＰＸＡ４５７−　ａ、ｐＫＤＰＸ＾７９９Ｂｇｌ　
Ｕ　全導入ｔ、り細胞をＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ７９９　
Ｂｇｌ　Ｕ−ａとする）として以下の実験に用いた。
（３）遺伝子増幅 上記方法で得た細胞ＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ４５７−　ａ
とＣＨＯ／ｐＫＤＰＸ八７９９　ＢｇＩへＵ−ａ　ニ含
まれる遺伝子（ｐＫＤＰＸＡ４５７ｔ　タＬ！　ｐＫＤ
ＰＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　）を増幅させるために、
上記細胞を、それぞれメトトレキセー）　（ＭＴＸ。
Ｓｉｇｍａ）　６度を３０ｎＭ、　１１００ｎ、　３０
０ｎＭ、　１１０００ｎと順次上昇させた培地で培養し
、各段階でＭＴＸ耐性を示す細胞を得た。次に、このよ
うにして得た１０００１０００ｎ耐性を獲得した細胞（
この細胞をそれぞれＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ４５７−１及
びＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ｌｌ−１とす
る）をそれぞれ１．６Ｘ１０６細胞／３０ｍｆ／Ｔ８０
になるようにまきなおし、５％ＣＤ□存在下、４日間、
３７℃で培養した。次に、これらの培養液の一部を取り
、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を合成基質［’　”　
Ｉ　］−］Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌを用いて測定し
た（Ｃ−末端α−アミド化酵素活性の測定方法及びｕｎ
ｉｔの定義については本発明者らによる特願昭６２＝３
０６８６７に詳細に記載しである）。この結果、ＣＨＯ
／ｐＫＤＰＸＡ４５７−１　、ＣＨＩ／ｐＫＤＰＸＡ７
９９　ＢｇＩ　ｌｌ−１（７）培養液　　中にそれぞれ
、１ｕｎｉｔ及び３１０ｕｎｉｔの酵素活性があること
が判った。
（４）Ｃ−末端α−アミド化酵素高生産株の樹立上記実
験より、ｐＫＤＰＸＡ７９９　ＢｇＩ　ｎを導入した細
胞の方が、ｐＫＤＰＸＡ４５７を導入した細胞より高い
酵素活性を示すことが判ったので、本発明者らは、さら
に高い、Ｃ−末端α−アミド化酵素生産株を樹立する為
に、前記実施例２−（３）で得た、ＭＴＸ１００ｎＭ耐
性株Ｃ）Ｉｎ／ｐＫＤＰＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　ニ
ツイテ、限界希釈法により、クローニングを行った。す
なわち、９６穴平底プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ）にＭＴ
Ｘ１００ｎＭ耐性Ｃｌｌ０／ｐＫ［１ＰＸＡ７９９　Ｂ
ｇｌ　ＩＩ細胞が、平均３個、１．５個、０．７５個、
又は０．３７５個／ｗｅｌｌになるようにまき、これら
の細胞を１０％ＦＢＳを含むα−ＭＢＭ培地１００μβ
／ｗｅｌｌで一週間培養した。−週間後、顕微鏡下に単
一のコロニーを形成して増殖してきたと認められる３　
０ｗｅｌｌに１００μβのα−Ｍ［ＥＭ培地を加え、さ
らに−週間培養した。これら３０の細胞について、細胞
をまいてから二週間後、培養上清の酵素活性を測定した
。この結果、ＣＨＤ／９Ｃと名付けた細胞が、これらの
細胞の内で最も高い酵素活性（９１０ｕｎｉｔ／　ｍｊ
２）を示すことが判った。次に、最も高い酵素活性を示
したＣｌｌ０／９Ｃを、さらにＭＴＸ濃度を０．１．０
゜３．１．３．１０．３０μＭと、順次上昇させながら
・培養し、それぞれ各段階のＭＴＸ耐性株を得た。この
様にして得たＭＴＸ耐性株をそれぞれ１０％ＦＢＳを含
むむａ　ＭＢＭ培地を用イテ、１．６Ｘ１０６細胞／３
Ｍ！／Ｔ８０の条件で４日間培養した後、培養上清中の
酵素活性を測定した結果、ＭＴＸ　３μＭ耐性株が、最
も高い酵素活性値（２８６０ｕｎ　ｉｔ　／　ｍｊ２）
を示すことが判った。本発明者らは、このようにして得
られたＭＴＸ　３μＭ耐性株９０株から、さらに高生産
株を樹立するために、この細胞株より、前記した方法を
用いてクローニングを行った。この結果、最終的には、
２０００ｕｎｉｔ／ｍ１以上のＣ−末端α−アミド化酵
素活性を示すＣ８０株（この生産株を（：）１０／ＩＯ
Ｃとする）を樹立することができた。
（５）カエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素誘導体
（ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　）生産株の培養実施例２
−（４）で得たカエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵
素誘導体生産株ＣＨＯ／ＩＯＣを用いて、以下に示す方
法でカエル体皮由来Ｃ−末端αアミド化酵素誘導体の生
産を行った。すなわち、ＣＨＯ／ＩＯＣ、１ｘ１０７細
胞と１０％ＦＢＳを含むαＭＢＭ培地５００−を１８５
０ｃｆｆＩのＲｏｌｌｅｒ　Ｂｏｔｔｌｅ（Ｆａｌｃｏ
ｎ）に入れ３７℃条件下−週間培養した。
次に、この細胞を順次新しいｌＯ％ＦＢＳを含むα−Ｍ
陣、３％ＦＢＳを含むα−ＭＩＥＭ及び１％ＦＢＳを含
むα−ＭＢＭ培地で３７℃、２４時間培養した。
最終的には１％ＦＢＳを含むα−ＭＢＭ培地で２４時間
培養した培養上清を回収し、以下の実験に用いた。なお
、ここで得られた培養上清は、約４ＱＱＱｕｎｉｔ／ｄ
の酵素活性を示し、この様にして得たＣ−末端α−アミ
ド化酵素を以後ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ｎとする。
（６）　　ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　（７）精製実施
例３−（５）で得られた培養上清１１に、最終硫酸アン
モニウム濃度が４５％になるように硫酸アンモニウムを
加え、生じた沈澱を遠心分離で集め、この沈澱を５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，−０）
２０ｒｙｔｉ！に溶かした。次に、このようにして得た
各両分の酵素活性を合成基質を用いて測定したところ、
はとんどすべての酵素活性が沈澱画分に回収されること
が判った。さらに、各両分を５Ｏ３−ＰＡＧＥを用いて
解析したところ第３図に示すように、この沈澱画分は培
地由来の多くの蛋白質（主にＯ３＾）が除かれているこ
とが判った。以後、この様にして得たＸＡ７９９　Ｂｇ
ｌ　ＩＩを用い、ｉｎ　ｖｉｔｒｏテのアミド化反応の
条件を検討した。
実施例３．ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるアミド化反応の条
件検討 実施例１で製造したｈＣＴ−Ｇｌｙと実施例２−（６）
で精製したＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ｎを用いて、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏにおけるアミド化反応の至適条件を検討した。
反応は、反応液１ｍｊ！を３７℃でインキュベートし、
０．５．１゜２及び４時間後に５０μｌをサンプリング
し、これに９５０μｌの５Ｎ酢酸に加え、このうち２０
ｐｉをＣｌ８−ＨＰＬＣ’　（カラム：　ＹＭＣＡ−３
０２４，６ｘ１５０ｍｍ緩衝液：１０％酢酸アンモニウ
ムをベースにアセトニトリル濃度を２４％から４５％ま
で１８分の直線勾配で上げる）に適用し、ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙの残量と新しく生じたｈＣＴＯ量を調べた。尚、反応
条件は、合成基質［１２ＳＩ　］］Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−＋［１２’　Ｉ　］］Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ−ＮＨの条件（特願昭６２−３０６８６７）をもとに
、（１）アスコルビン酸、（２）カタラーゼ、（３）硫
酸銅、（４）緩衝液（ｐＨ）　、（５）緩衝液（濃度）
、（６）　　ｈｃ’ｒ−ｃｒｙ濃度について検討した。
（１）アスコルビン酸濃度の検討（第４図参照）０、１
．０．３．５．７．２０ｍＭのアスコルビン酸濃度での
アミド化効率を調べた。他の組成は以下に示した。
２．５　ｍｇ／ｍＩ！ｈＣＴ−Ｇｌｙ ｌｏｏ　ｍＭ　　　　　）リス塩酸（ｐＨ７，０）２５
μＩ！１ｍｌ　　カタラーゼ ７０　μＭ　　　　硫酸銅 １８６０　Ｕ／−ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ反応１時間
後の変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣＴ−Ｇｌｙ
）を第４図に示した。アスコルビン酸非存在下では、全
く反応が進まず、１〜’１ｍＭでは、効率よく反応が進
んだ。しかし、さらに濃度を上げるとき（２０ｍＭ）　
、変換率は低下した。
（２）カタラーゼ濃度の検討（第５図参照）０．２．１
．２．２５．１２ＳＩｇ／ｒｎｊ！のカタラーゼ濃度で
のアミド化効率を調べた。他の組成は以下に示す。
２．５　ｍｇ／ｍｊ！　　　ｈＣＴ−Ｇｌｙｌｏｏ　ｍ
Ｍ　　　　　）リス塩酸（ｐＨ７，０）３．５ｍＭ　　
　　　アスコルビン酸 ７０μＭ　　　　硫酸銅 １５００　［１／ｍｌ！　　　ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ反応１時間後の変換率（１００にｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈ
ＣＴ−Ｇｌｙ）は、６０〜７５％とほぼ変らなかったが
（第５図）、１μｇ／ｍ１以上では、２時間で変換率が
１００％なのに比べ、０．２μｇ／−では４時間でも９
３％であった。
肌１．１０．７０．１５０μＭの硫酸銅濃度でのアミド
化効率を調べた。他の組成は以下に示す。
２．５　ｍｇ／−ｈＣＴ−Ｇｌｙ １００　ｍＭ　　　　　）リス塩酸（ｐＨ７，０）２５
　μｇ／ｍｌ　　カタラーゼ ３．５ｍＭ　　　　　アスコルビン酸 １５００　Ｕ／ｒ＋＋１ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ反応
１時間後の変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣＴ−
Ｇｌｙ）を第６図に示した。硫酸銅の濃度が、０．１．
１０μＭと増えるに従いアミド化効率は良くなるが、そ
れ以上では変らなかった。
（４）緩衝液（ｐＨ）の検討（第７図参照）１００ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ７，０，７，５，８，０，８，５）１
００　ｍＭ　ＭＯＰ　５（ｐＨ６，５，７，０，７，５
，８，０）１００　ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０
，６，５，７，０）の１１種類の緩衝液についてアミド
化効率を調べた。
他の組成は以下に示す。
２．５　ｍｇ／ｉｆ　　　ｈＣＴ−Ｇｌｙ２０μｇ／ｍ
Ｉ！　　　カタラーゼ ２．０ｍＭ　　　　　アスコルビン酸 １０μＭ　　　　硫酸銅 １０００　Ｕ／ｍｉ２　　　ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ
反応１時間後の変換率（１００ｘｈｃＴ／ｈ［’Ｔ＋ｈ
ｃ’Ｔ−，Ｇｌｙ）を第７図に示す。。至適ｐＨは６〜
７であることがわかった。また、酢酸アンモニウムを用
いた場合に反応速度が速かった。
（５）緩衝液（濃度）の検討（第８図参照）１０、５０
及びｌｏＯｍＭの酢酸アンモニウム１度でのアミド化効
率を調べた。他の組成は以下に示す。
２．５　ｍｇ／ｍｊ！　　　ｈＣＴ−Ｇｌｙ２０　μｇ
／ｍｊ！　　　カタラーゼ １０μＭ　　　　硫酸銅 ２．０ｍＭ　　　　　アスコルビン酸 １０００　Ｕ／ｍｆ　　　Ｘ＾７９９　Ｂｇｌ　Ｕ反応
１時間後の変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣＴ−
Ｇｌｙ）を第８図に示す。変換率は緩衝液の濃度によら
ず、はぼ８０％で同じだが、低いほうが若干高かった。
（６）基質（ｈＣＴ−Ｇｌ　）濃度の検討（第９図参照
）２．５及び５　ｍｇ　／ｌａｒ！のｈＣＴ−Ｇ１ｙ濃
度でのアミド化効率を調べた。他の組成は以下に示す。
１０　ｍＭ　　　　　酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）
２０μｇ／−カタラーゼ １０μＭ　　　　硫酸銅 ２．０ｍＭ　　　　　アスコルビン酸 １０００１Ｊ／−ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ経過時間の
それぞれのｈＣＴ−Ｇａｙ濃度での変換率（１００ｘｈ
ＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣＴ−Ｇｌｙ）を第９図に示す。２．
５ｎ＋ｇ／ｒｎｌでは２時間で、５ｍｇ／ｍｌでは４時
間で、すべてアミド化される。ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉの濃度が同じな（７）テｈｃＴ−Ｇｌｙ当り（７）　
ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ　（ＤＨＪはｈＣＴ−Ｇｌｙ
濃度５ｍｇ／ｍｊｌ’では２．５　ｍｇ／ｍＩ！の半分
になる。
実施例４．　　ｈＣＴの製造（第１０図参照）以上の条
件検討をもとにｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応を行い、
ｈＣＴの製造を行った。アミド化反応の条件は以下に示
す。
２．５　ｍｇ／ｒｒｄ！　　　ｈＣＴ−Ｇｌｙｌｏ　ｍ
Ｍ　　　　　酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）２０μｇ
／ｍｌ　　カタラーゼ １０μＭ　　　　硫酸銅 ２．０＋ｔ＋Ｍ　　　　　アスコルビン酸１０００１Ｊ
／ｍｌ　　　ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　　ＩＩ反応前、反応
後０．５時間、及び２時間のＣｌ８−ＨＰＬＣのチャー
トを第１０図に示す。時間経過に伴い、ｈｃ’ｒ−ｃｘ
ｙのピーク（１１，８分）が減少シ、ｈｃＴのピーク（
１２，９分）が増えるのがわかる。反応２時間後、この
サンプルをＣ１ｇ−ＨＰＬＣに供し、ｈｃＴを分離、精
製した。この結果、ｈＣＴが９３．５％の収率で得られ
ることが判った。なお、収率は、分取したｈＣＴをアミ
ノ酸分析することにより求めた。
実施例５．ｈＣＴの同定 実施例４で製造した、ヒト・カルシトニン（ｈＣＴ）の
同定は以下に示す方法で行った。すなわち、ｌ）本発明
で製造したｈＣＴは１（ＰＬＣ（実施例３に記載した条
件）での溶出位置が、化学合成で製造されたヒト・カル
シトニン（ペプチド研究所より人手）と完全に一致した
。２）アミノ酸分析の結果は、下記に示す値を示し、理
論値（）とよく一致した。
ＡＳＸ　２．９９（３）、　Ｔｈｒ　４．７２（５）、
　Ｓｅｒ　Ｏ，９１（１）。
ＧＩＸ　２．００（２）、　Ｐｒｏ　１．９７（２）、
　Ｇｌｙ　３．９６（４）。
＾１ａ　１．９７（２）、　Ｖａｌ　ｔ、００（１）、
　Ｍｅｔ　０．９８（１）。
ｌｉｅ　Ｏ，９７（１）、　Ｌｅｕ　２．００（２）、
　Ｔｙｒ　１０２（１）。
Ｐｈｃ　２．９５（３）、　Ｌｙｓ　１．００（１）、
　Ｈｉｓ　Ｏ，９７（１）。
３）アミノ酸配列はＣ−末端のＰｒｏ−ＮＨ２を除く全
アミノ酸配列を確認できた。４）ｈＣＴのＣ−末端、Ｐ
ｒｏ−ＮＨｚの最終構造は、ｈＣＴをＬｙｓｙｌＥｎｄ
ｏｐｅｐｔ　１ｄａｓｅ　（和光純薬工業株式会社）で
処理することにより得られるＣ−末端ペプチドフラグメ
ント　（ｈ［：Ｔ［１９−３２］　’）をＩＩＰＬｃを
用いて単離しくｈＣＴは１８位にリジン残基が１残基存
在している）このものの分子量をＦａｓｔ　Ａｔｏｍ　
Ｂｏｍｂａｒｔｍｅｎｔ（ＦＡＢ）質量分析で測定した
ところ、分子量が理論値と一致することから、ｈＣＴの
Ｃ−末端Ｐｒｏ　ＮＬであることが確認された。以上の
結果より、本発明で述べた方法により製造したｈＣＴの
構造は、ヒト・カルシトニンと同一であることを確認で
きた。
Ｃ−末端塩基性アミノ酸がβｇａ１９７ｓＨＰｃＴの生
産量に与える影響をみるためにβｇａ１９７ｓ　（Ｌ［
Ｅ）　［ＧＫＫＲ］のＣ−末端のアミノ酸を変えた以下
のキメラ蛋白質をデザインし、その生産量を調べた。
βｇａ１９７ｓ（ＬＢ）ＨＰＣＴ［ＧＲＲＲ］βｇａ１
９７ｓ（ＩＪ）ｔｌＰｃＴ［ＧＲ］βｇａ１９７ｓ（Ｌ
Ｅ）ＨＰＣＴ［Ｇ］（ＬＥ）はβｇａ１９７ｓとＨＰＣ
ＴがＬｅｕ−Ｇｌｕを介して結合しており、［ＧＲＲＲ
］、　［ＧＲ］及び［Ｇ］はｈＣＴのＣ−末端にそれぞ
れＧｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、　Ｇｌｙ−Ａｒｇ
又はｃｔｙが付加しである。
以上のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラ
スミツドを作製した後、それぞれのプラスミツドで大腸
菌を形質転換し、各々の菌を得、それぞれの菌のキメラ
蛋白質の生産性を調べた。
（１）種々のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を持つプ
ラスミドの作製（第１１図参照）プラスミツドｐＧ９７
ＳＨＰＣＴ　（特願昭６３−４９７２３、実施例８第１
９図）をＳａｌ　Ｉで部分消化し、アガロース電気泳動
により、３．９ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。次に、
このＤＮＡ断片をＳｍａ　ｌで完全に消化しアガロース
電気泳動により、３．８ｋｂのＤＮＡ断片■を切りだし
た。このＤＮＡ断片と両端にＳｍａ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉ
切断部位をもつ３組の合成リンカ− Ｓｍａ　Ｉ　　　　　　　　　Ｓａｌ　Ｔ■　５″　Ｇ
ＧＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＴＴＡＡＧ　　　　３″３″　
ＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＣＴ　　５゜
■　５°　ＧＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧ　　　　３’３°　
ＣＣＣＧＧＣＧＡＴＴＣＡＧＣＴ　　５゜■　５’ＧＧ
ＧＣＴＡＡＧ　　　　３’３°　ＣＣＣＧＡＴＴＣＡＧ
ＣＴ　　５゜をそれぞれライゲーションし、それぞれ、
ｐＧ９７ＳＨＰＣＴ　（ＬＥ）　［ＧＲＲＲ］、　ｐＧ
９７ＳＨＰＣＴ　（ＬＥ）　［ＧＲ］、　ｐＧ９７ＳＨ
ＰＣＴ（ＬＥ）　［Ｇ］を得たく第１１図）。これらの
ＤＮＡ溶液で大腸菌Ｗ３１１０株を各々形質転換し、そ
れぞれＷ３１１０／ｐＧ９７ＳＨＰＣＴ（ＬＢ”）　［
ＧＲＲＲ］、Ｗ３１１０／ｐＧ９７ＳＨＰＣＴ（ＬＥ）
　［ＧＲ］、及びＷ３１１０　／ｐＧ９７ＳＨＰＣＴ　
（ＬＢ）［Ｇ］を得た。
（２）生産量の検討（第１２図参照） （１）で作製した３種の大腸菌、すなわち、Ｗ３１１０
／ｐＧ９７ｓＩ−ＩＰＣＴ（ＬＥ）［ＧＲＲＲ］、　　
Ｗ３１１０／ｐＧ９７ＳＨＰＣＴ（ＬＨ）　［ＧＲ］、
Ｗ３１１０／ｐＧ９７ｓｌｌＰｃＴ（ＬＢ）　［Ｇ］、
及びＷ３１１０／Ｉ）Ｇ９７Ｓ）ＩＰＣＴをテトラサイ
クリンを含む培地（２，４％トリプトン、１．２％酵母
エキス、０．５％グリセロール）で１６時間培養し、各
々のサンプルの５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を
行った（第１２図）。この結果、キメラ蛋白質の生産性
は、Ｃ−末端に塩基性アミノ酸が付加したものの方が、
付加していないものに比べ、明らかに高いことがわかっ
た。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを
ＣｐＢで処理して得たｈＣＴ−ＧｌｙのＣｌ８ＨＰＬＣ
’による溶出パターンを示す。 第２図は、動物細胞でＣ−末端α−アミド化酵素（ＸＡ
４５７．　ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩ）　発現ｔルタ？
ｂノア’　ラスミツドの構造を示す。 第３図は、硫酸アンモニウム沈殿によるＸ＾７９９Ｂｇ
ｌＩＩの精製を示す。 第４図は、ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩによるｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏテのｈｃ’ｒ−ｃｔｙのアミド化反応に対するア
スコルビン酸濃度の影響を示す。 第５図は、ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ｎによるｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏでのｈｃＴ−Ｇｌｙのアミド化反応に対するカタラ
ーゼ濃度の影響を示す。 第６図は、ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩによるｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏでのｈｃ’ｒ−Ｇｉｙのアミド化反応に対する銅
イオン濃度の影響を示す。 第７図は、ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩによるｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏでのｈｃＴ−６ｔｙのアミド化反応に対する緩衝
液（ｐＨ）の影響を示す。 第８図は、ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩによるｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏでのｈｃｉ−ｒ；ｔｙのアミド化反応に対する緩
衝液濃度の影響を示す。 第９図は、ＸＡ７９９　Ｂｇｌ　ＩＩによるｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏでのｈｃ’ｒ−Ｇｒｙのアミド化反応に対する基
質（ｈｃＴ−Ｇｌｙ）濃度の影響を示す。 第１０図は、Ｘ＾７９９　Ｂｇｌ　［によるｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏでのｈＣＴ−Ｇ　１ｙ−、ｈＣＴ変換反応００分
、３０分、及び２時間後のサンプルのＣｌ８ＨＰＬＣの
チャートを示す。 第１１図は、Ｃ−末端に付加した塩基性アミノ酸を変換
した３種のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を持つプラ
スミツドの作製過程を示す。 第１２図は、Ｃ−末端塩基性アミノ酸の異なる４種のキ
メラ蛋白質の大腸菌での生産性を示す５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動である。 Ｖ４０ 前期プロモーター レーン１ 分子量マーカー レーン２ ＣＨＯ／ＣＩＯの培養上清 レーン３ レーン２の硫安沈澱の上清画分 レーン４ レーン２の硫安沈澱の沈澱画分 第３図 変換率（％） 第５図 アスコルビン酸 変換率（％） Ｃｕ２＋ 変換率（％） 第６図 （％） 緩衝液 （ｐＨ） 第７図 ｈＣＴ−Ｇｌｙ （％） 時間（時） 第９図 （％） 緩衝液濃度 Ｏ Ｎ　Ｈ４０Ａ　ｃ　（ｐ　Ｈ７，０） （ｍＭ） 第８図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、次の式で表わされるペプチド又は蛋白質：Ｒ−Ｘ−
    Ｇｌｙ−Ｂ （式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表わし、Ｇｌｙはグ
    リシン残基を表わし、Ｂはリジン残基もしくはアルギニ
    ン残基、あるいはリジン残基及び／又はアルギニン残基
    から構成されるオリゴペプチドを表わし、そしてＲは前
    記ペプチド又は蛋白質の残りの部分を表わす） にカルボキシペプチダーゼＢを作用せしめることを特徴
    とする、次の式（II）： Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （式中、Ｒ及びＸは前記の意味を有し、そしてＧｌｙは
    Ｃ−末端のグリシン残基を表わす）で表わされるペプチ
    ド又は蛋白質の製造方法。 ２、次の式（II）で表わされるペプチド又は蛋白質： Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （式中、Ｘはα−アミド化されるべき任意のアミノ酸を
    表わし、ＧｌｙはＣ−末端のグリシン残基を表わし、そ
    してＲは前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分を表わす
    ） にアフリカツメガエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化
    酵素もしくはその誘導体又はヒト甲状腺由来のＣ−末端
    α−アミド化酵素もしくはその誘導体を作用せしめるこ
    とを特徴とする、次の式（III）：Ｒ−Ｘ−ＮＨ＿２ （式中、Ｘ−ＮＨ＿２はα−アミド化されたＣ−末端ア
    ミノ酸を表わし、そしてＲはペプチド又は蛋白質の残り
    の部分を表わす） で表わされるＣ−末端アミド化ペプチド又は蛋白質の製
    造方法。 ３、次の式（ I ）で表わされるペプチド又は蛋白質： Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｂ （式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表わし、Ｇｌｙはグ
    リシン残基を表わし、Ｂはリジン残基もしくはアルギニ
    ン残基、あるいはリジン残基及び／又はアルギニン残基
    から構成されるオリゴペプチドを表わし、そしてＲは前
    記ペプチド又は蛋白質の残りの部分を表わす） にカルボキシペプチダーゼＢを作用せしめることにより
    次の式（II）： Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （式中Ｘはα−アミド化される任意のアミノ酸残基を表
    わし、ＧｌｙはＣ−末端グリシン残基を表わし、そして
    Ｒは前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分を表わす） で表わされるペプチド又は蛋白質を生じせしめ、次にこ
    れにＣ−末端α−アミド化酵素又はその誘導体を作用せ
    しめることにより、次の式（III）：Ｒ−Ｘ−ＮＨ＿２ （式中、Ｘ−ＮＨ＿２はα−アミド化されたＣ−末端ア
    ミノ酸残基を表わし、そしてＲは前記ペプチド又は蛋白
    質の残りの部分を表わす） で表わされるＣ−末端α−アミド化ペプチド又は蛋白質
    を生じさせることを特徴とする、Ｃ−末端α−アミド化
    生理活性ペプチドの製造方法。 ４、前記ペプチドがヒト・カルシトニンである、請求項
    １〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５、Ｃ−末端α−アミド化酵素がアフリカツメガエルの
    体皮由来又はヒト甲状腺由来である、請求項３項に記載
    の方法。 ６、アフリカツメガエル体皮由来のＣ−末端α−アミド
    化酵素及びその誘導体の製造法において、該酵素をコー
    ドしているＤＮＡを有し、これを発現することができる
    プラスミッドにより形質転換された動物細胞を培養する
    ことにより、該酵素を生成し、これを採取することを特
    徴とする製造法。
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