JPH01308959A - クロマト充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分腎〕 本発明はイオン交ｅＭを結合した合成ポリアミノ酸より
なるクロマト充填剤に関する。

〔従来の技術〕

従来より種々のイオン交換基を結合したクロマト充填剤
が製造されているが、それらは大別すると二種類に分け
られる。

１つは、シリカゲル粒子を担体としてアミノメチル化処
理を行い、そのアミノ基を利用してイオン交換基を結合
させたものであり、もう１つは、ポリスチレン等のビー
ズを直接スルホン化したりクロロメチル化処理をして三
級あるいは四級のアミノ基を反応させたものである。

シリカゲルＩ旦体にイオン交換基を導入したクロマト充
填剤はアルカリ領域での使用ができないため、タンパク
、ペプチド等の分離、分１のアルカリ洗浄が行えない、
従って生体関連物質の分離用途には向かない。

また、ポリスチレン、ポリアクリル酸誘導体にイオン交
換基を導入したクロマト充填剤はそれ自身が疎水基を有
するため、イオン交換基によるもの以外の非特異的吸着
を起こす。このため吸着物質の変性等の問題があり、こ
の用途に使用できなし１− （発明が解決しようとする課題〕 本発明は、上記従来技術の欠点を克服した、アルカリ領
域での使用が可能で、かつ非特異的吸着を起こさずに生
体物質の分離、分析が行えるクロマト充填剤の製造を目
的とするものである。

（ｙＡ題を解決するための手段〕 本発明者らはこれらの問題を解決するために、合成ポリ
アミノ酸が側鎖にエステル結合を有している場合、−級
または二級アミノ化合物と容易にアミド結合を形成し、
このアミド結合またはイミド結合が広範囲のｐ）Ｉ領域
において安定であるという事実を見出し、本発明を完成
するに到っｔ：。

すなわち、本発明は側鎖にエステル基を有する合成ポリ
アミノ酸の球状粒子の該エステル基に、イオン交換基を
有する一級アミノ化合物または二級アミノ化合物がアミ
ド結合またはイミド結合により結合してなるクロマト充
填剤である。

本発明の側鎖にエステル結合を有する合成ポリアミノ酸
とは、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等の酸性
ポリアミノ酸凪たはこれらの誘導体をエステル化したも
の、例えばアルキルエステル、ベンジルエステル、シク
ロヘキサンメチルエステル等を挙げることができる。

また、これら酸性ポリアミノ酸のエステル以外にも、ポ
リリジン、ポリヒスチジン等の塩基性ポリアミノ酸にカ
ルボキシル基を導入し、エステル化したもの或いは、直
接エステル基を有する官能基を導入したもの、中性のポ
リアミノ酸であるポリグリシン、ポリアラニン、ポリバ
リン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリセリン、
ポリスレオニン、ポリプロリン、ポリメチオニン、ポリ
シスチン、ポリフェニルアラニン、ポリチロシン、ポリ
トリプトファン等に同様にエステル基を導入したものが
挙げられる。エステル基の導入は重合の前であっても後
であつてもよい、またポリアミノ酸はこれらのエステル
基を有するアミノ酸と他のアミノ酸の共重合体であって
もよい。

エステル基の導入または重合に際して、他の官能基、例
えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等を必要に応し
て適当な保護基によって保護し、反応終了後、保護基を
脱離させることもできる。

これらアミノ酸、またはアミノ酸誘導体の重合方法は種
々提案されており、成＠（ポリアミノ酸一応用と展望−
；胚本康夫編、講談社）に詳細に出ている。

また、重合によって得られたポリアミノ酸は既知の技術
（特公昭５６−１６７６６、特開昭６２−１７２８等）
の方法により空孔、粒径等を制御しつつ容易に製造し得
る。すなわち、該ポリアミノ酸を含む溶液をこれと混合
しない分散媒中に分散し、該ポリアミノ酸の溶媒を蒸発
除去し、球状粒子を得るというものである。

また、この際にポリアミノ酸溶液に分散溶媒より高沸点
の第三溶媒等を適当に添加して、粒子化した後、これを
抽出除去して多孔質構造のポリアミノ酸球状粒子が得ら
れる。

球状粒子化の為に必要な重合度は構成アミノ酸残基の種
類によって異なるが、２０以上好ましくは１００以上、
更に好ましくは２００以上が良い。

本発明におけるイオン交換基を有する一級または二級ア
ミン化合物とは、−級アミノ基、二級アミノ基、三級ア
ミノ基、四級アミノ基等のアニオン交ＩＡ基若しくはカ
ルボキシル基、スルホン酸基等のカチオン交換基と、上
記の合成ポリアミノ酸のエステル部と結合するための一
級または二級アミノ基が同じ分子内に存在する化合物で
ある。

アニオン交換基を存する一級アミノ化合物の例としては
、ヒドラジン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミ
ン、トリエチレンテトラミン、ヘキサメチレンジアミン
等の一級アミン類、Ｎ−エチル−ジアミノエタン、Ｎ−
エチル−ジアミノプロパン、Ｎ−エチル−ジアミノヘキ
サン等の二級アミン類、Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノエチル
アミン、Ｎ。

Ｎ−ジエチルアミノプロピルアミン等の三級アミン類、
Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリエチルアミノエチルアミン、Ｎ、Ｎ。

Ｎ−トリエチルアミノプロピルアミン等の四級アミンが
挙げられる。

また、アニオン交換基を有する二級アミノ化合物の例と
しては、Ｎ、Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、ピペラ
ジンなどが挙げられる。

カチオン交ＩＡ基を有する一級アミン化合物の例として
は、２−アミノ酢酸、３−アミノプロピオン酸等の一級
アミノ基とカルボキシル基とを存する化合物、２−アミ
ノエチルスルホン酸、３−アミノプロピルスルホン酸等
の一級アミノ基とスルホン酸基とを有する化合物等が挙
げられる。

カチオン交換基を有する二級アミノ化合物の例としては
、２−Ｎ−メチルアミノ酢酸、３−Ｎ−メチルアミノプ
ロピオン酸等の二級アミノ基とカルボキシル基とを有す
る化合物、２−Ｎ−メチルアミノエチルスルホン酸、３
−Ｎ−メチルアミノプロピルスルホン酸等の二級アミノ
基とスルホン酸とを有する化合物が挙げられる。

これらのアニオン交ＪＡＭおよびカチオン交換基は、ポ
リアミノ酸と結合するための一級アミノ基と同一分子内
に存在すれば良く、その間の結合に特に制限はない０例
えばメチレン基の数を変えて交換基と合成ポリアミノ酸
主鎖との距離を任意に調整することも可能であり、その
他、バラアミノ安息香酸、パラアミノベンゼンスルホン
酸等の芳香族系の化合物でも良い。

これらのイオン交換基を有する一級または二級アミノ化
合物の一級または二級アミノ基は、ポリアミノ酸のエス
テル結合部分と選択的にアミド結合またはイミド結合を
形成する。反応は、−級、二級、三級、四級アミン等の
カチオン交換基を有する一級アミノ化合物の場合は、ア
ルコール等の比較的極性の高い溶媒中が好ましく、メタ
ノール、エタノール、プロパツール等のアノ？コール及
びこれらとテトラヒドロフラン、ヘキサン、デカリン等
の混合溶媒が好ましい。

反応温度は２０’Ｃ以上７容媒のリフラックス温度迄加
熱することもできる。

カチオン交換基を有する一級または二級アミノ化合物の
場合は、反応は、テトラヒドロフラン、ジメチルホルム
アミド等の溶媒中で行うのが好ましい。反応温度は２０
”Ｃ以上好ましくは５０゛Ｃ以上である。

〔作用〕

本発明によれば、従来技術では不可能であったアルカリ
領域で使用できる、生体関連物質に対して非特異的吸着
を起こさず変性も起こさない分離分析用クロマト充填剤
が得られる。その理由は必ずしも明らかでないが、合成
ポリアミノ酸はその構成が生体関連物質に類似している
ためではないかと推測される。

〔実施例〕

以下実施例に従って本発明の詳細な説明するが、本発明
は、これら実施例に限られるものではない。

以下において、部はＭＭｋ基準、％はモル基準とする。

実施例１ 平均重合度約５００のポリ−Ｌ−グルタミン酸−Ｔ−メ
チルエステル２部を含む１，２−ジクロロエタン溶液１
００ｇに４　ｍｌのデカリンを加え、この溶液を部分ケ
ン化ポリビニルアルコール２．５部を含む水溶液５００
　ｇ中に撹拌分散し、温度４５°Ｃで１．２−ジクロロ
エタンを蒸発せしめ、ポリ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メ
チルエステルの球状微粒子を得た。

この粒子を充分水洗した後、約５０′Ｃの熱メタノール
にて粒子中に残存しているデカリンを完全に抽出した。

この粒子１．５ｇをｌｏｏｍｊ！エタノール中に分散し
、Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノエチルアミン２．４ｇを加え
てエタノールのりフラックス温度で２４時間反応させた
０反応終了後エタノールで完全に未反応アミンを除去し
た後乾燥し、元素分析を行い、反応の前後で比較した。

表−１ 表−１の結果より、ポリ−し一グルタミン酸−γ−メチ
ルエステルのアミノ酸残基のうち約６２％が反応してい
ることが認められる。また、この反応粒子の赤外吸収ス
ペクトルでは、１７５０ｃｍ−’付近のエステル吸収が
小さくなり１６５０ｃｍ−’付近のアミド吸収が大きく
なっていることによりＮ、Ｎ−ジエチルアミノエチルア
ミンがアミド結合でエステル部分に反応していることが
わかる。この粒子をＰｌ＋＝１１のＮａＯＨ水溶液に室
温にて２４時間浸漬した後、よく水洗して乾燥し、元素
分析してみると、表−１の分析結果と一致しており安定
であった。

実施例２ 実施例１において、ポリ−Ｌ−グルタミン酸−Ｔ−メチ
ルエステルの代わりに、Ｎ−カルボキシ−し−ロイシン
無水物、Ｎ−カルボキシ−γ−ベンジルーし一グルタミ
ン酸無水物８０％の割合でアミノ酸七ツマ−をテトラヒ
ドロフラン中でトリエチルアミンを開始剤として共重合
したポリマーを用いた他は、実施例−１と同じく粒子化
を行った後、同様の反応を行ったところ表−２のような
元素分析結果が得られた。

表−２ この元素分析結果より、反応前のし一ロイシンとＬ　−
クルタミン酸−Ｔ−ヘンシルエステルの共重合比率は、
はぼモノマーの仕込１１１合（Ｌ　−ｏイシ７２０％）
に−敗している。

また該アミンとの反応によってポリマー中のγ−ベンジ
ルエステル部分のうち４５％すなわち全アミノ酸残基の
３６％がアミノ基によりアミド結合が成形されイオン交
換基が導入されたことが認められる。この粒子を実施例
１と同様の方法でＰＨ＝１１のＮａ０１１溶液に浸漬し
た後の、粒子の顕微鏡観察および元素分析結果が表−２
と変わらないことにより、この粒子がアルカリ側で安定
であることがわかる。

実施例３ 実施例１の方法で得られたポリ−Ｌ−グルタミン酸−Ｔ
−メチルエステルの球状粒子１．０ｇをメタノール／デ
カリン−５０１５０の混合溶媒１００ｄ中に分散し、ヘ
キサメチレンジアミン０．９ｇを添加し、メタノールの
りフランクス温度で１２時間反応させた。

この粒子の元素分析結果は、表−３の通りであっ表−３ として、反応後の割合を元素分析より計算するとｘ　＝
０．２６、ｙ＝ｏ、ｔｔとなり、架橋している残基の割
合は約２６％、未反応のメチルエステル部分は、約６３
％となる。

この粒子０．８ｇをテトラヒドロフラン１００Ｉｄ、中
に分散し、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸ナトリウム４
．１ｇを添加してテトラヒドロフランのりフランクス温
度で１５時間反応を行った。反応終了後十分テトラヒド
ロフランで粒子を洗浄した後、蒸留水中に分散し過剰量
の塩酸でスルホン酸基をＮａ型からＨ型に置換する。こ
の後蒸留水で水洗し、乾燥させた。この粒子の元素分析
結果は表−４の通りであった。

表−４ この結果より、メチルエステル部分６３％のうち約半分
の３０％が反応してイオン交換基が導入されたことが認
められる。

またこの値は、滴定によるイオン交換基の定量（直と一
致していた。

応用例１ 実施例１で得られた粒子を分級して２０〜３０μｍの範
囲に揃え、これを内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのス
テンレスカラムに充填し、１０ＩＩＩＭリン酸緩衝液（
ｐＨ・７．０）を溶離液としてアミノ酸の混合物（プロ
リン、ロイシン、グルタミン酸）を；゛α体クロマトグ
ラフィーにより分離した。

クロマトグラフィー条件は下記のとおり。

カラム：　４．６Ｘ１５０ｍｍ ン容離ン夜　：　　１０ｍＭ燐酸ｉ燐酸液　ｐＨ・７．
０流速　：　０．５　ｍｌｉ／ｌｌ１ｉｎ検出器：示差
屈折計（Ｒ１） サンプル：プロリン　１．Ｏｍｇ／ｒＩｄｌロイシン　
０．５ｍｇ／ｍｆｉ グルタミン酸　０．５ｍｇ／ｍｆｆ１ 結果を第１図に示す。

応用例２ 実施例３で得られた粒子を２０〜３０μｍの範囲に分級
し応用例１と同じカラムに充填し、蛋白質混合物（生血
清アルブミン、チトクロムＣ５リゾチーム）をイオン強
度グラジェント溶出により分離した。

クロマトグラフィー条件は下記のとおり。

カラム：　４．６Ｘ　１５０ｍｍ ？容離ン夜　；　Ａ液　　　　ｌＯａＩＭ燐酸４１１　
ｄｉ　’ａＢ　ンａ　　　３５０ＩＩＩＭ＃［＄ｌｊ　
ｖ夜Ａ液→Ｂ液りＯｎ＋ｉｎリニアグラジェント流速　
：　１．０　ｍｆｆ１／＋ｉｎ 検出器：ＵＶ２５４ｎｍ サンプル：牛血清アルブミンン　０．１ｍｇ／ｍ１リゾ
チーム　０．１ｍｇ／ｍｌ！ チトクロムＣＯ，ｌａ＋ｇ／ｍｅ 結果を第２図に示す。

を発明の効果〕 本発明によれば、合成ポリアミノ酸に容易にイオン交Ｉ
Ａ基を導入でき、従来技術で達成できなかったアルカリ
領域での使用に耐え、かつ生体関連物質の変性を起こさ
ないクロマト充填剤の製造法として確立でき、本発明の
意義は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１及び２図は本発明で得られたクロマト分離剤を用い
て各種アミノ酸及び蛋白質を分離した結果を表した図で
ある。 特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）側鎖にエステル基を有する合成ポリアミノ酸の球
   状粒子の該エステル基に、イオン交換基を有する一級ア
   ミノ化合物がアミド結合により結合してなるクロマト充
   填剤。
2. （２）側鎖にエステル基を有する合成ポリアミノ酸の球
   状粒子の該エステル基に、イオン交換基を有する二級ア
   ミノ化合物がイミド結合により結合してなるクロマト充
   填剤。
3. （３）合成ポリアミノ酸の球状粒子が架橋された粒子で
   ある請求項１または２に記載のクロマト充填剤。