JPH01141596A - アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ産業上の利用分野〕 本発明は、遺伝子組換技術を利用した、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属徽生物由来のアルカリプロテアーゼの
工業的に有利な製造方法を提供するものである。

Ｃ従来の技術〕 アルカリプロテアーゼはバチルス属細菌が分泌する菌体
外蛋白の典型的な例であり、その用途は皮革加工用、食
品工業用、洗剤添加用、医薬品など多岐にわたる。

従来、バチルス属微生物由来のアルカリプロテアーゼは
これらの菌からの醗酵法により製造されている。しかし
、従来の醗酵法では菌体量あたりの収量が低く、また他
の菌体外蛋白などの夾雑物が多く回収構造等の工程が複
雑になる。このため、より生産性が高く、製造工程の簡
略化されたプロテアーゼの製造法の開発が望まれる。

このため、従来からプロテアーゼ生産菌の改良が行われ
ており、このために一般に人工的突然変異法が利用され
てきたが、プロテアーゼ生産性の観点からはいまだ充分
満足するものは得られていない。さらに人工的突然変異
法では、酵素の特性に変化がおこる可能性もあり、改良
法としては最適とはいえない。

また、最近開発された遺伝子組換え技術を利用してアル
カリプロテアーゼの生産性を高める試みもなされている
が工業的に利用可能なものとじては未だ成功の域には達
していない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、遺伝子組換技術によってアルカリプロ
テアーゼ生産能が向、ヒした微生物を作製し、これを用
いて工業的に有利にアルカリプロテアーゼを製造するこ
とができる方法を提供することを目的とするものである
。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、上記の目的を達成するための鋭意研究を
重ねた結果、アルカリプロテアーゼを生産することが知
られているバチルス属微生物から、アルカリプロテアー
ゼの生産に関与する遺伝子をクローン化することに成功
し、さらにこの遺伝子の構成を解明した。さらにこのク
ローン化された遺伝子を適当な宿主に導入することによ
り、該遺伝子が由来する野性株よりはるかに高いアルカ
リプロテアーゼ生産能を有する形質転換体を得、アルカ
リプロテアーゼの工業的生産性を大幅に向上させること
に成功した。

従って、本発明は、バチルス（Ｂａｃ　ｉ　１１　ｕｓ
）属微生物由来のアルカリプロテアーゼをコードする構
造遺伝子を含有するＤＮＡ断片であって、（ａ）該ＤＮ
Ａ断片は制限酵素切断点ｆｌｐａｌと１１ａｅｌｕとに
より両端を規定される領域を含んで成り： （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ　Ｉと１ＩａｅｌＴＩ
との間に他の制限酵素切断点Ｈｉｒ＋ｄｌｌｌ　、　　
Ｓｐｈ　Ｉ及びＳａｃ　１を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片１１ｐａｌとＨａｅ　ｍとの
間に制限酵素切断点Ｃ１ａｌ　、ＢｇｌＩＩ　、Ｂａｍ
ＨＩ　、ＥｃｏＲＩ。

Ｐｓｔｌ　、５ａｌＩ　、５Ｌｌａｌ　、ＸｂａＩ、及
びＸｈｏ　Ｉを含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片；
このＤＮＡ断片及び選択マーカー遺伝子を含んで成るＤ
ＮＡ　ＨこのＤＮＡ断片の導入により形質転換された細
菌；並びに前記ＤＮＡ断片の導入により形質転換された
微生物を培養し、得られた培養物からアルカリプロテア
ーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼ
の製造方法を提供するものである。

〔具体的な説明〕

遺伝子組換え技術による微生物の改良は一般に先ず遺伝
子を、必要により該遺伝子の発現及び発現生成物の分泌
のための遺伝子と共に、その供与細胞から取り出し、試
験管内でベクターＤＮＡと結合させ、得られた組換え体
ＤＮＡを宿主細胞に取り込ませる。そして目的とする組
換え体ＤＮＡを有する宿主細胞を増殖せしめ、導入遺伝
子を発現せしめることによって目的の生成物を得る。

本発明においては、形質転換体におけるアルカリプロテ
アーゼの高い生産性を得るため、目的生成物であるアル
カリプロテアーゼの構造遺伝子と共に、該構造遺伝子に
天然に付随している発現・分泌に必要な領域、例えばプ
ロモーター領域、ブレ・プロ配列コード領域、ターミネ
ータ−領域を用いるのが好ましい。従って、本発明にお
いては、前記構造遺伝子とその関連遺伝子領域を一体と
して切り出す。本発明におけるアルカリプロテアーゼの
構造遺伝子およびその関連遺伝子、すなわち発現・分泌
のための領域を含むＤＮＡ断片は、通常アルカリプロテ
アーゼ生産能を有する微生物の染色体ＤＮＡより適当な
制限酵素によって切り出されたものが用いられるが、原
則としてその由来については特別な制限はなく、例えば
土壌や他の天然物から分離されるアルカリプロテアーゼ
生産能を有する野性株は勿論のこと、それらを紫色線照
射や化学物質による処理をして得られる人工的突然変異
株等いずれでもよい。この様な微生物としては、アルカ
リプロテアーゼ生産能を有するバチルス属微生物であれ
ば特に制限はなく、例えばｍ１ｓ）、バチルス・アミロ
リクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｕ幻且■セ
ｅｆａＣ１ｅリー）、バチルス・フルカ０フィラス（ハ
意上り馴　旦兵４．ヒ仲−Ｕリ−）及びバチルス・ステ
アロサーモフィラス（Ｒａｅｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）　、並ヒにその他のへ′チル
ス属に属する微生物があげられる。特にバチルス・リケ
ニホルミスへＴＣＣ−１４５８０、バ′チルス・ズフ゛
チルスＩＦＯ−３０１３、バチルス・アミロリクエファ
シェンス八ＴＣＣ−２３８４２、ノマチルス・ステア１
コサーモフイラスＡＴＣＣ−８００５、バチルスＮＫＳ
−２１（微工研条寄第９３号）等が適している。

上記の染色体供与微生物から、染色体ＤＮＡ断片を得る
には、公知の方法、例えばＳａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａの方
法（１３ｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｔ＋ｙｓ　Ａｅｔａ　
７２６１９（１９６３））やＭａｒｍａｒの方法（Ｊ、
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　３２０８（１９６１））等を
用いることができるが、これらの方法に限らず他の如何
なる方法でもよい。

これらの染色体ＤＮＡより該ＤＮＡを切出すのに用いら
れる制限酵素は、アルカリプロテアーゼの構造遺伝子お
よびその発現・分泌のための領域に切断部位を有しない
ほうが扱いやすいが、切断部位を有する制限酵素でも部
分切断の条件で用いればよく、如何なるものでも使用可
能である。

この様にして染色体から切り出されたＤＮＡ断片は、そ
れを発現宿主細胞に導入するためのベクターに直接組み
込むこともできるが、−旦クローニングベクターに組み
込むことによってクローニングし、しかる後に導入用ベ
クターに組み込むのが便利である。このようなりローニ
ングベクターとしては、用いる宿主菌中で複製可能なも
のであれば何でもよく、例えば枯草菌を宿主とする場合
はｐＵＢ１＋、０、ｐｃ１９４　、　　ｐＥ１９４　、
　ｐＴＰ４　、　ｐＴＰ５　、又はｐｓＤ３０５１　（
特開昭６１−８８８７３）、あるいはそれらの−部又は
全部を含む複合プラスミド等が、また大腸菌を宿主とす
る場合は、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８　、　ｐＨ５Ｇ３
９６゜ｐｓｃｌｏｌ　　、　　　ｐｓＦ２１２４　　、
ｐＪＢ８　　、ｐＡｃＹｃ１８４　　、ｐｃＲｌ　　、
ＲＫ６゜ｐＲＲ３２８、又はｐｓＤ３１６５（特開昭６
ｌ−１０４７９０）、あるいはその一部又は全部を含む
複合ブスラミド等があげられる。また、クローニングベ
クターとしてはファージも利用可能であり、枯草菌を宿
主とする場合はρ、ファージ、φ１０５ファージ等を、
大腸菌を宿主とする場合はλファージ、Ｍ１３ファージ
等をあげることができる。

クローニング用宿主としては、上記クローニングベクタ
ーを複製することができるものであれば何でもよいが、
形質転換能が高いほうが望ましく、例えば枯草菌、大腸
菌等があげられる。

形質転換の方法は通常用いられる方法で実施可能であり
、例えば枯草菌の場合にはコンビ−テントセル法（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　８１７４Ｈ１９６１））　、ブロ
トフ１ラスト法　（Ｍｏ１．Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ、二Ｉ
Ｑ　１１１（１９７Ｂ））　　、またはレスキュー法（
Ｍｏ１．Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ、　１７７４５９（１９８
０）　）等を用いることができ、大腸菌の場合にはカル
シウム法（Ｊ、　Ｍｏ１．５３１５９（１９７０））ま
たはルビジウム法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｈｎｚｙｓ＋
ｏｌｏｇｙ　６８　ｐ２５３Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ（１９７９））等を用いることができるが、これら
の方法に限らない。

形質転換株は、枯草菌を宿主とする場合には選択培地と
して、スキムミルクまたはカゼインを含む寒天培地を用
いることでコロニーの回りに生ずるクリヤーゾーンで容
易に選択できる。大腸菌を宿主とする場合にはりゾチー
ム、クロロホルム等で溶菌させた後生じるクリヤーゾー
ンによる方法等で選択可能であるがこれらの方法に限ら
ない。

上記により得られた形質転換株により、常法により組換
体ＤＮＡを調製し、目的のアルカリプロテアーゼの構造
遺伝子並びにその発現・分泌に必要な領域を有するＤＮ
Ａ断片を含む組換体ＤＮＡを得ることができる。

上記のＤＮＡ断片は必ずしもその天然の形態である必要
はなく、そのＤＮＡ断片の一部または全部を含む誘導体
としても用いることができる。誘導体ＤＮＡとしては、
例えば該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素や、Ｂａ１３１　
、エキソヌクレアーゼ■。

Ｓｔヌクレアーゼなどの酵素等を用いて短小化したＤＮ
Ａ断片や末端にリンカ−等の合成りＮＡを結合したＤＮ
Ａ断片、またアルカリプロテアーゼの構造遺伝子部分に
他の遺伝子のプロモーター領域、シグナル配列、ターミ
ネータ−等を結合したＤＮＡ、等があげられるが、これ
らに限らず他のものでもかまわない、また、アルカリプ
ロテアーゼのアミノ酸配列を変えることなく、１個又は
複数個の塩基を置換したＤＮＡや、酵素活性を破壊しな
い範囲でアミノ酸の欠失、付加又は置換が行われている
蛋白質をコードするＤＮＡを使用することもできる。

本発明はまた、前記のごとき、°？ルカリプロテアーゼ
の構造遺伝子とその関連遺伝子を含むＤＮＡｌｔＪｉ片
に加えて、これらが宿主細胞に導入された場合にその宿
主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含有す
るＤＮＡにも関する。このることができる。これには線
状ＤＮＡ、！化されたＤＮＡが含まれる。選択可能な遺
伝子マーカーとは宿主菌内で発現するものであれば特に
制限はなく、例えば薬剤耐性遺伝ｒ、アミノ酸生合成遺
伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミン生合成遺伝子。

その他生体内物質の生合成遺伝子などがあげられる。薬
剤耐性遺伝子としては、例えばテトラサイクリン耐性遺
伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイ
シン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ
る。

以上の様にしてり１コーニングされたＤＮＡ断片は、前
記り１コーニングベクターに組込まれたままで発現宿主
微生物に導入される（すなわち、クローニング・ベクタ
ーがそのまま、発現宿主へＤＮＡ断片の導入のためのベ
クターとして使用される）か、又は他の導入用ベクター
に移された後、あるいはヘクターを用いないＤＮＡ断片
のみで発現用宿主に導入される。

導入用ベクターの種類は発現用宿主の種類に依存して選
択される。本発明の方法において使用する発現用宿主と
しては、例えば大腸菌やバチルス属に属する細菌が挙げ
られる。導入用ベクターの選択はまた、導入された遺伝
子の発現宿主中での存在形態をいかにするか、すなわち
、導入された遺伝子を宿主の染色体に組み込むか、ベク
ター中に維持するかによっても異る。発現用宿主として
腸閉を使用する場合には、そのための導入及び発現用ベ
クターとしてＣｏ１Ｅ１　、　ｐｓｃｌｏｌ　、　ｐｓ
ｃ１０５　、　　ｐＳＦ２１２４　、　ｐＪＢ８　、　
ｐＡｃＹｃ１８４　、　ｐｃＲｌ　、　　Ｒ６Ｋ　、　
ｐＢＲ３２２゜ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２８，ｐＵｃ１
８．　　ｐＨ５Ｇ３９６．　　ｐｓ０３１６５等のプラ
スミドが使用される。他方、バチルス属細菌を発現用宿
主として用い、導入した遺伝子をプラスミド上に維持し
ようとする場合には、導入・発現用ベクターとして、例
えば、ｐＵｌｌｌｌｏ　、　ｐｃ１９４゜ｐＥ１９４　
、　ｐＴＰ５　、　　ｐｓＤ３０５１　（特開昭６１−
１６２１８７）等のプラスミドを使用するのが好ましい
。また、発現用宿主としてバチルス属細菌を使用し、導
入された遺伝子を宿主の染色体に組み込もうとする場合
には、導入用ベクターは宿主細胞中で複製しないことが
好ましく、この場合にはバチル属発現用宿主に遺伝子を
導入するためのベクターとして、大腸菌用ベクター、例
えばＣｏ！Ｅｌ　、　ｐｓｃｌｏｌ　。

ｐｓＦ２１２４　、　ｐＪ８８　、　ｐＡｃＹｃ１８４
　、　ｐｃＲｌ　、　Ｒ６Ｋ　　、　ｐＢＲ３２２゜ｐ
ＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８、ｐＬＩｃ１８　、　ｐＨ５
Ｇ３９６　　、　ｐｓＤ３１６５（特開昭６ｌ−１０４
７９０）等のプラスミドを用いるか、あるいはベクター
を用いないでＤＮＡ断片のみを用いるのが好ましい。

前記のごとく、本発明においては、大腸菌やバチルス属
に属する微生物のごとき細菌を用いることができるが、
大腸菌は培養管理が容易であるが、菌体内で生産された
目的生成物を菌体内に分泌せしめることが困難であると
いう問題点を有し、これに対して、バチルス属細菌は生
産された蛋白を菌体外に分泌するので工業的見地から有
利である。

そこでバチルス属細菌を発現用宿主として用いる場合に
ついて詳細に説明する。

バチルス属の発現用宿主としては、最初に遺伝子が切り
出された細菌株と同じ株を用いる（すなわち、遺伝子供
４株と発現宿主株を同一にする）こともでき、又は異る
こともできる。

遺伝子供４株と発現宿主株とが同一である場合、宿主株
が本来その染色体上に有するアルカリプロテアーゼ遺伝
子に加えてさらにアルカリプロテアーゼ遺伝子が人為的
に導入されるため遺伝子のコピー数が増加し、アルカリ
プロテアーゼの生産性の向上が保証されること、宿主株
が本来生産するプロテアーゼと導入された遺伝子により
生産される目的プロテアーゼとが同一であるから、種類
の異るプロテアーゼやその他の蛋白質が夾雑することが
なく、「１的ブロテ？−ゼの精製が容易であること、等
の利点を有する。他方、アルカリプロテアーゼ生産株は
通常アルカリ性条件下で培養しなければならないため、
培養・醗酵管理が幾分厄介である。

これに対して、バチルス・ズブチリス等、通常の条件下
で培養することができる株を発現用宿主として用いれば
、その培養・醗酵管理が極めて容易になり、工業的見地
から有利であるが、他方、宿主が本来生産するプロテア
ーゼと導入された遺伝子が生産するプロテアーゼとが異
るため、目的プロテアーゼの精製に困難が伴う等、別途
解決しなければならない問題点が存在する。

本発明に用いられる宿主菌として代表的なものを列挙す
れば、バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニホルミ
ス、バチルス・アミロリクエファシェンス、バチルス・
アルカロフィラス、バチルス・ステアロサーモフィラス
、バチルス・セレウス、バチルス・プレビス、バチルス
・チューリンゲンシス、バチルスＮＫＳ−２１等がある
。

宿主が本来生産するプＬλテア・−ゼがト１的プロテア
ーゼに夾雑するとい・う前記の問題点を解決するだめの
１つの方法として、発現宿主としてプロテアーゼ非生産
性株を用いる方法がある。この様な菌株は前記のバチル
ス属の株を人為的に変異処理して得ることができる。

尚、本発明においてＤＮＡを染色体に挿入する場合には
、導入されるＤＮＡ、！：宿宿主の染色体Ｉ）　Ｎ　Ａ
の一部とが相同であることが必要であるが、導入される
ＤＮＡの他の部５トこ宿主菌の染色体Ｉ）　Ｎ　Ａとの
相同性があれば、アルカリプロテアーゼの構造遺伝子お
よびその発現・分泌のための領域を含むＤＮＡ断片が宿
主菌の染色体１１　Ｎ　Ａと相同性を有することは必ず
しも必要ではない。

該ＤＮＡの一１ユ記宿主菌への形質転換は、公知の方法
、例えばコンピーテンｌ−セル法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ。

８１７４Ｎ１９６１））或いはプロトプラスト法（Ｍｏ
ｌｅｅ。

Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　１６町、　１１１　（１９７９）
３等で実施可能であるが、これらの方法に限らず、如何
なる方法でも可能である。尚、形質転換にあたり、導入
ＤＮＡが環状でない場合は、形質転換頻度の向」二のた
め、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ等の酵素を用いて環状
にしておくことが望ましい。

形質転換の選択は、スキムミルクあるいはカゼインを加
えた寒天培地上でのクリアーゾーン形成や導入ＤＮＡに
結合した遺伝子マーカーの発現により行なうことができ
るが、他の方法でも可能である。

上記のようにして得た形質転換株を培養する培地として
は特に制限はなく、該形質転換株がタト育すれば用いる
ことが可能である。

以下に本発明のプロテアーゼの製造法について代表的な
例を示し、更に具体的に説明する。但しこれらは単なる
例示であり、本発明はこれらのみに限られない。

実土桝上 プラスミドｐＨ５Ｇ３９６　（宝酒造株式会社）ＤＮＡ
を制限酵素ｔ！ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同
様にＥｃｏＲＩおよびＢａｍ１ｌ　Ｉで切断し、大腸菌
アルカリフォスファターゼにより末端リン酸エステル結
合を加水分解したプラスミドｐＵＢ１１０　（Ｐｒｏ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５．１４２８（１９７８））　ＤＮ
Ａとそれら生したＤＮＡ末端の数が同じになるように混
合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼを用いて結合反応を
行った。このＤＮＡを用い、バチルス・ズブチルスＢＤ
２２４（ｔｒｐＣ２ｔｈｒ５　ｒｅｃＥ４）をプロトプ
ラスト法により形質転換し、カナマイシン耐性の形質転
換株を選択した。これらの形質転換株より、常法により
プラスミドＤＮＡを抽出・精製し、分析した結果ｐＵＢ
１１０のＥｃｏＲＩ　、　Ｂａｍｆｌ　Ｉ切断点の間に
、ｐＨ５Ｇ３９６のポリリンカーのＥｃｏＲＩ　−Ｒａ
ｍ１ｌ　１間の部分が挿入された約３．８　ｋｂｐＯ組
換体プラスミドｐｓＤＴ８００（第１図）を得た。

他方、Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａの方法により得たバチル
スＮＫＳ−２１の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｃ１ａ　Ｉで
切断し、同じ＜Ｃ１ａｌで切断し、大腸菌アルカリフォ
スターゼにより末端リン酸エステル結合を加水分解した
ｐｓＤＴ８００と混合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ
を用いて結合反応を行なう。このＤＮＡを用いバチルス
・ズブチルスＢ　Ｉ）２２４をプロトプラスト法で形質
転換し、カナマイシン耐性の形質転換株を選択する。得
られたカナマイシン耐性の形質転換株をカナマイシン７
０ｐｐｍ　、スキムミルク２％を含む！、寒天培地（１
％１−リブトン、０．５％酵母工４−ス、０．５％塩化
すトリウム、１゜５％寒天）に植え継き３７℃で１８時
間保温し、クリアーゾーン形成ヲ、ｉｌａべた。約２０
０００株のカナマイシン耐性形質転換株に一ついて調べ
た結果３株が、コロニーのまわりに大きなりリアーゾー
ンを形成する、ことを見出した。、これら３株より、常
法に従いプラスミドｒ、）　Ｎ　Ａを抽出精製し、分析
したところいずれもｐｓＤＴ８００（７）　Ｃｌａ　Ｉ
切断部位に約３．２ｋｂｐのＤＮＡを挿入した組換体Ｉ
）　Ｎ　Ａが得られた。このＤＮＡをｐｓＤ７２８２と
命名した（第２図）。

ｐｓＩＩＴ２８２を用いてバチルス・ズブチルスＲＤ２
２４をコンピーテン１−セル法により形質転換し、カナ
マイシン耐性の形質転換株を選択した。得られたカナマ
・イシン耐性形質転換株はスキムミルク２％を加えたＬ
寒天培地で１００％大きなりリアーゾーンを形成した。

この形質転換株を１２液体培地で２１時間培養し、その
培養を清のグロテアーゼ活性を測定したところこの形質
転換株はアルカリプロテアーゼを大量に分泌生産してい
ることが示された。

プロテア−・ゼの活性は次の様にして測定した。

培養」二重を０．１　Ｍ炭酸ソー・ダＯ０ＩＭホウ酸−
塩化カリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）で適当に希釈した
液Ｑ、’５　ｍ　ｉｌ！にｐＨ１０，０の２％ミルクカ
ゼイン溶液０．５ｍｌを加えて、３０℃で１０〜３０分
酵素反応をさせた。酵素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−０
，２Ｍ酢酸ソーダ緩衝液を含む０．１　Ｍ　ｌ−リクロ
ル酢酸２鋼ｌを加えて反応を停止させた。３０℃、１０
分以上放置後濾紙を用いて濾過した６濾液１ｒｎｅに０
．４Ｍ炭酸ソーダ５ｍｆｆ、６倍希釈のフェノール試薬
１ｍｌを添加し、３０℃、２０分間放４して発色させた
のち６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。なお、酵素
単位は国際酵素委員会の「エンザイムノーメンクレイチ
ャー」に従がい、３０℃でｐＨ１０，０の１％カゼイン
を基質とし１秒間チロシン１モル相当量の６６０ｎａ＋
の発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を遊離するアル
カリプロテアーゼ量を１カタール（ｋａｔａｌ）とする
。

また、この培養上清を抗原とし、枯草菌およびバチルス
ＮＫＳ−２１のアルカリプロテアーゼに対する抗血清を
用いた免疫二重拡散法の結果該形質転換株の分泌するア
ルカリプロテアーゼはバチルスＮＫＳ−２１型のもので
あることも判明した。

ｐｓＤＴ２８２中の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素切断点（
下方）、と、塩基配列の決定に基いて推定される遺伝子
中の各機能領域（上方）の関連を第３図に示す。約３．
２　ｋｂｐから成るＣ１ａ　［断片は、制限酵素切断点
Ｂａｍ１ｌｌ　、　ＥｃｏＲＩ　、　Ｐｓｔｌ　、Ｓａ
ｌ　Ｉ　、　Ｓｍａ■。

Ｘｂａ　Ｉ及びＸｈｏＩを含有していなかった。アルカ
リプロテアーゼ関連遺伝子、すなわち、約２００〜３０
０ｂｐのプロモーター領域、約ｑｏｂｐのＰｒｅ体コー
ド領域、約２７０ｂｐのＰｒｏ体コード領域、約８２０
ｂｐのアルカリプロテアーゼ構造遺伝子及び約１００ｂ
ｐのターミネータ−領域がＨｐａ　Ｉ　−１１ａｅｌｌ
１間の約２３００ｂｐの範囲に含まれる。

実ＪＩｉＪＬ入 ｐＳＤＴ２８２を用いバチルスＮＫＳ−２１をプロトプ
ラスト法により形質転換し、カナマイシン耐性の形質転
換株を取得した。該形質転換株をカゼイン１％、ミート
エキス１％、ポリペプトン１％、及び炭酸水素ナトリウ
ム１％を含有し、水酸化ナトリウムでｐｌ＋を９．５に
調整した培地３００ｍ　ｌ中で６６時間振とう培養し、
培養上清の酵素活性を測定したところ２３．１マイクロ
カタール／ｌの酵素活性を示した。

これは平行して培養したバチルスＮＫＳ−２１の約５．
１倍であった。

裏施拠１ プラスミドｐＨ５Ｇ３９６のＤＮＡを制限酵素Ｃ１ａ　
Ｉで切断し、大腸菌アルカリフォスファターゼにより末
端リン酸エステル結合を加水分解し、同様にＣ１ａ　Ｉ
で切断したｐｓＤ７２８２と混合し、Ｔ４ファージＤＮ
Ａリガーゼで結合させる。このＤＮＡを用い大腸菌ＪＭ
１０５（ｔｈｉ　ｒｐｓＬ　ｅｎｄＡ　５ｂｃＢ１５　
ｈｓｐＲ４。

Δ　　（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）　　、　　　ＣＦ　　’
　　、　　ｔｒａＤ３６　　、ｐｒｏ／ＩＢ　　。

ｌａｃ”２６Ｍ１５　）　）をカルシウム法により形質
転換し、クロラムフエニコー・ル耐性でかつ、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−
ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）添加により白色コロニーを
形成する形質転換株を取得した。該形質転換株より組換
体ＤＮＡを抽出精製し、分析した結果、ｐｉ（ＳＧ３９
６のＣ１ａｌ切断部位に約３．２　ｋｂｐのｐＳＤＴ　
２８２のＣ１ａｌ切断断片が挿入された組換体Ｄ　Ｎ　
Ａ　ｐｓＤＴ８１２が得られた（第４図）。

夫施勇土 プラスミドｐｓＤ３１６５（特開昭６ｌ−１０４７９０
）のＤＮＡを制限酵素Ｃ１ａ＋で切断し、大腸菌アルカ
リフォスファターゼにより末端リン酸エステル結合を加
水分解し、同様にＣ１ａ　Ｉで切断したｐＳＤＴ２Ｂ２
と混合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼで結合さゼる。

このＤＮＡを用い大腸菌ＪＭ１０５をカルシウム法によ
り形質転換し、アンピシリン、テトラサイクリン、クロ
ラムフェニコールにいずれも耐性を有する形質転換株を
取得する。該形質転換株より組換体ＤＮＡを抽出精製し
、分析した結果ｐｓＤＹ３１６５のＣ１ａ　Ｉ切断部位
に、約３゜２ｋｂｐのｐＳＤＴ２８２のＣ１ａ　Ｉ切断
断片が挿入された組換体ＤＮＡｐＳＤＴ８３１が得られ
た（第５図）。

人差１ 実施例４において作製したプラスミドｐｓＤＴ８３１を
用い、バチルスＮＫＳ−２１をプロ］・プラスト法で形
質転換し、クロラムフェニコール耐性の形質転換体を得
た。この形質転換株をカゼイン１％、ミートエキス１％
、ポリペプトン１％、炭酸水素すＩ・リウム１％を含有
し、水酸化ナトリウムでｐ＋＋を９゜５に調整した培地
３００ｍ　ｅ中で６６時間振と・う培養し、培養上清の
酵素活性を測定したところ８．６マイクロカタール／ｌ
の酵素活性を示した。これは平行して培養したバチルス
ＮＫＳ−２１の約１．９倍であった。

ス斯ｌＷ斑 実施例１において作製したブラスミｌ’　ｐＳＤＴ２Ｂ
２ヲＨａｅ［ＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動法
により各断片を分離する。アルカリプロテアーゼの構造
遺伝子およびその発現分泌のための領域を含む約２．６
ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル部分を切りとり
、常法によりＤＮＡを分離、精製した。このＤＮＡ断片
にＴ４−ファージＤＮＡリガーゼを作用させ環状のＤＮ
Ａにした。このＤＮＡを用い、バチルスＮＫＳ−２１に
プロトプラスト法で形質転換する。得られた形質転換体
を２％スキムミルクを含んだし寒天培地に移し、大きな
りリーンゾーンを形成する株を選択した。該形質転換株
をカゼイン１％、ミートエキス１％、ポリペプトン１％
、及び炭酸水素ナトリウム１％を含有し、水酸化ナトリ
ウムでｐｌ＋を９．５に調整した培地３００ｍ１で６６
時間振とう培養し、培養−１−清の酵素活性を測定した
ところ、７．７マイクロカタール／ｌの酵素活性を示し
た。これは平行して培養したバチルスＮＫＳ−２１の約
１．７倍であった人止拠１ バチルス・ズブチルスυ０ＴＯ５３１（ＴｒｐＣ２、Ｌ
ｅｕ　Ａ８）（東京大学応用微生物研究所）をＬ寒天培
地で３０℃−晩生前させ、その−白金耳量を０．５％酵
母エキスを含むスビザイゼン培地（（Ｎｌ１４）　ｚｓ
Ｏ４０，２％、Ｋ２ＨＰＯ４１，４％、Ｋｌｌ□ｐｏ、
０．６％、クエン酸ナトリウム２１１□００．１％、Ｍ
ｇ５Ｏｎ７１１□００．０２％、グルコース０．５％〕
で対数増殖期中期まで培養した。

培養液を１００ＯＯＧＩＯ分間遠心分離して菌体を築め
、ＴＭＮＩＩ衝液（０，１５％Ｎａ（１、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣＡ’　ｚ　　、　１０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　
、　ｐＨ７，０）で２回洗浄した。次に菌体を５ｍ６Ｔ
Ｍ緩衝液（１０ｍＭ　ＭｇＣ（！　、　、　１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−１１Ｃｌ　、　ｐＨ７，０）に懸濁し、０．
５■のＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを添加し、３７℃で１５分間振とうした。１００Ｏ
ＯＧＩＯ分間遠心分離して菌体を集め”１’　Ｍ　Ｎ緩
衝液で２回洗浄後、２％スキムミルクを含む■、寒天培
地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣ６，，１，５％寒天）に広げた。約１００００個の
コロニーの中から１株クリアーゾーンを形成しない株を
取得した。

該菌株をＬ液体培地で３７℃２１時間培養し、培養上清
のプロテアーゼ活性をアンソン・ヘモグロビン法（Ｊ、
　Ｇｅｎ、　Ｉ’ｈｙｓｉｏ１．２２７９（１９３８）
）によりｐＨ７、０、ｐＨ１０，０で測定したところ、
０．１ナノカタール／　ｍ　（！以下であった。本菌株
をバチルスＳｌｌ−８００と命名した。

実瀦−例−失 ｐＳＤ７２８２を用いバチルス５０８００をプロトプラ
スｉ・法により形質転換し、カナマイシン耐性の形質転
換体を選択した。該形質転換株を、カゼイン１％、ミー
トエキス１％及びポリペプトン１％を含有し、炭酸すト
リウムでｐＨ７，５に誹Ｉ整した培地３００ｍ　ｌ！中
で６６時間振とう培養し、培養上清の酵素活性を測定し
たところ１８．６マイクロカタール／ｒの酵素活性を示
した。

Ｘ−ｈＬ例−９゜ ｐｓｒｌＴ２８２をＩｆ　ａ　ｅ　Ｉｌｌで切断し、ア
ガ０　　’；ｌ　’）’　ルミ気泳動法により各断片を
分離する。アルカリプロテアーゼの構造遺伝子およびそ
の発現分泌のための領域を含む約２．６ｋｂｐのＤＮＡ
断片を含むアガロースゲル部分を切りとり、常法により
ＤＮＡを分離、精製した。このＤＮＡ断片にＴ４ファー
ジ１）　Ｎ　Ａリガーゼを作用させ環状のＤＮＡにした
。

このＤＮＡを用い、バチルスＳＤ　８００をプロトプラ
スト法により形質転換した。得られた形質転換株を２％
スキムミルクを含んだｌ、寒天培地に移し大きなりリア
ーゾーンを形成する株を選択した。該形質転換株（バチ
ルス５ｏ−２００１）　（ｍ工研条寄第９７０６号）を
カゼイン１％、ミートエキス１％及びポリペプトン１％
を含有し、炭酸す１−リウムでｐＨ７，５に調整した培
地３００ｍ１中で６６時間振とう培養し、培養上清の酵
素活性を測定したところ７．９マイクロカタール／ｌの
酵素活性を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローニング用ベクターｐｓＤＴ８００の制
限酵素切断点地図を示す。 第２図は、第１図に示すｐｓｏＴ８００のＣ１ａ　１部
位に、染色体由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含む
約３．２１ｃｂｐのＣ１ａＩ　−ＤＮＡ断片が挿入され
たバチルス川プラスミドｐＳＤ７２８２の制限酵素切断
点地図を示す。 第３図は、染色体由来の前記約３．２ｋｂｐのＣ１ａ　
ｌ−ＤＮＡ断片の制限酵素切断片地図（Ｂ）、並びにア
ルカリプロテアーゼ構造遺伝子及びそれに関連する領域
の推定される位置（Ａ）を示す、（Ｂ）における数値は
各制限酵素切断点間のおよその塩基対の数を示す。（Ａ
）において、ｐは推定されるプロモーター領域、Ｐｒｏ
は推定されるプレ体コード領域、Ｐｒｏは推定される１
０体コード領域、Ｍは成熟アルカリプロテアーゼのコー
ド領域（構造遺伝子）、そしてＴは推定されるターミネ
ータ−領域を示し、数字は各領域のおよその塩基対数を
示す。 第４図は、プラスミドｐＳＤ７２８２山来のアルカリプ
ロテアーセ遺伝子を含有する約３．２ｋｂのＣ１ａ　ｌ
−ＤＮＡ断片を含有する大腸菌プラスミドｐｓｏ’ｒ８
１２の制限酵素切断点地図を示す。 第５図は、プラスミドｐＳＤＴ２８２由来のアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子を含有する約３．２ｋｂのＣ１ａ　ｌ
−ＤＮＡ断片を含有する大腸菌プラスミドｐＳＤＴ８３
１の制限酵素切断片地図を示す。 第１図 第２図 （Ｂ） 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のアル
   カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
   ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
   ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
   ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
   ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
   ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
   の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
   れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
   く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片。 ２、前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨｌａｅIIIとによ
   り両端を規定される領域に加えて、さらにＨａｅIIIと
   前記Ｈｐａ I とにより両端を規定される追加の領域を
   含んで成る、特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ断片
   。 ３、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のアル
   カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
   ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
   ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
   ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
   ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
   ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
   の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
   れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
   く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片、
   並びに選択マーカー遺伝子を含んでなるＤＮＡ。 ４、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のアル
   カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
   ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
   ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
   ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
   ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
   ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
   の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
   れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
   く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片の
   導入により形質転換された細菌。 ５、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のアル
   カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
   ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
   ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
   ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
   に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
   ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
   ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
   の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
   れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
   く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片の
   導入により形質転換された微生物を培養し、得られた培
   養物からアルカリプロテアーゼを採取することを特徴と
   するアルカリプロテアーゼの製造方法。 ６、前記形質転換された微生物がバチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌であり、そして生
   産されたアルカリプロテアーゼを菌体外培養液から採取
   することを特徴とする、特許請求の範囲第５項に記載の
   方法。