JPH01144977A - 新規組換えプラスミドｐＴＰＧＩＦ２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、成長ホルモン分泌制御因子であるソマトスタ
チン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
−５ｅｒ−Ｃｙｓの１４個のアミノ酸配列よりなるペプ
チド、以下、ＧＩＦと略す。）を含む融合タンパク質を
生産可能とする新規組換えプラスミドに関するものであ
る。

ＧＩＦは、視床下部ペプチドの一種であり、成長ホルモ
ンなど下垂体前葉ホルモンおよびインシュリン、グルカ
ゴンなどの消化管で生産される多くのペプチドホルモン
の分泌を抑制する。このよう作用を有することから、Ｇ
ＩＦは、小人症、糖尿病等の治療薬としての利用が期待
されている。

本発明の新規組換えプラスミドｐＴＰＧＩＦ２は、第１
図に示されるＤＮＡ配列を有する。ｐＴＰＧ　ＩＦ２お
よびｐＴＰＧＩＦ２を含有する大腸菌は２発酵工業、医
薬品工業等の分野に好適である。

従来の技術 本発明Ｍ’、’＋ｉ術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。ＧＩＦ遺伝子を組み込んだプラスミド
およびその大腸菌での発現に関しては、板倉らの成果が
公知である　（に、Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、１９８．ｐ１０５６（１９
７７））。

一般に９分子量１万以下のポリペプチドは、大腸菌など
の宿主中で生産させても菌体中のプロテアーゼなどによ
って分解されるため安定に細胞内に蓄積されない。これ
は２分子として小さいため安定なコンホメーションをと
れないためであると考えられている。従って、遺伝子操
作を利用してＧＩＦなどの短いポリペプチドを生産しよ
うとした場合、融合遺伝子を作成し、融合タンパク質と
して発現させることが必要である。そのため、板倉らは
、ＧＩＦを暗号化する遺伝子を化学合成いこれをβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子に融合し、多コピープラスミドに
組み込み得られた組換えプラスミドを大腸菌に導入し、
融合タンパク質として発現させた。融合タンパク質は、
β−ガラクトシダーゼとＧＩＦとをメチオニン（Ｍｅｔ
）残基を介して結合させている。タンパク質をブロムシ
アンで処理することにより、タンパク質中のメチオニン
残基のカルボキシ末端側の結合を特異的に切断すること
ができる。この方法を利用することにより。

β−ガラクトシダーゼ−ＧＩＦの融合タンパク質からＧ
ＩＦを特異的に切り出すことができる。

しかしながら、上記の板倉らの方法は、　（１）大腸菌
で発現した融合タンパク質が不溶化していること、　（
２）β−ガラクトシダーゼがＧＩＦと融合することによ
りその酵素活性を失うこと。などから、ｉｉｉ！Ｉ！合
タンパク質の分離精製に関して問題があった。

本発明者らは、この問題を解消するために、枯草菌のジ
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用して。

融合タンパク質（以下、　Ｄ　ＨＦ　Ｒｂｓ　　Ｇ　Ｉ
　Ｆと略す。）として発現させることに成功した（特願
昭６２−０７９３７８，６２−０９２８８１）。

その結果に従うと２作られるＤＨＦＲｂ−−−ＧＩＦは
、可溶性の状態で大腸菌面体内に生産され、かつＧＩＦ
と融合してもＤＨＦＲの活性が保持され問題点 しかしながら、上記の本発明者らの方法は２作られるＤ
ＨＦＲｂ−−ＧＩＦの菌体内蓄積量が、菌体タンパク質
のせいぜい数パーセントであり、融合タンパク質を多量
に利用しようと考えた場合。

生産効率上で問題が考えられた。

発明の目的 本発明の目的は、上記の問題点を解決するために、ＧＩ
Ｆの大量生産を可能にする組換えプラスミドを開発する
ことにある。また２本発明は、遺伝子操作の手法を用い
てＧＩＦを大量に生産する方法の開発の一環として行わ
れたものである。

既に２本発明者らは（１）大腸菌のＤＨＦＲを大量に発
現する発現プラスミドを構築していること（特願　昭６
０−２１０８１３）、（２）大腸菌のＤＨＦＲのカルボ
キシ末端側の配列を変化させても、枯草菌のＤＨＦＲ同
様酵素活性が失われないこと、（３）大腸菌のＤＨＦＲ
のカルボキシ末端側に異種ペプチドを融合させることを
可能とするプラスミドベクターｐＴＰ７０−１を構築し
ていること（特願　昭６２−３１２８３８）、（４）ｐ
ＴＰ７０−１上の改変ＤＨＦＲは、大腸菌で効率良く発
現すること、を明らかにしている。

このことを利用し、鋭意研究の結果、ｐＴＰ７０−１を
用いて、ＧＩＦ遺伝子をＤＨＦＲと融合させて発現する
ことにより、上記問題点を解消できることを見いだし、
その知見に従って、ｐＴＰ７０−１にＧＩＦ遺伝子を組
み込んだ組換えプラスミドｐＴＰＧＩＦ２を作成し２本
発明を完成させた。

発明の構成 第１図は２本発明の組換えプラスミドｐＴＰＧＩＦ２の
全塩基配列を示している。本発明のｐＴＰＧＩＦ２は、
４６６０塩基対の大きさであり。

宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアシビシリン
耐性ｍ、’２ｉ与することができる。ｐＴＰＧＩとε− Ｆ２は、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００株に導入されて安定
状態に保たれ、ｐＴＰＧＩＦ２を含有するＥ、　ｃｏｌ
ｉ　Ｃ６００株は、微工研にＦＥＲＭ８Ｐ−１５７７と
して寄託されている。

ｐＴＰＧＩＦ２は、ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨＩ切断部
位に、ＧＩＦを暗号化する配列を含む５２塩基対のＤ　
Ｎ　Ａが挿入した構造である。第１図において、５３３
番目から５８４番目迄の配列が挿入された配列であり、
それ以外の配列がｐＴＰ７０−１の配列と全く同一であ
る。第１図の５７番目から５８１番目の配列は、ｐＴＰ
７０−１の改変ＤＨＦＨのカルボキシ末端側にＧｒＦが
メチオニンを介して結合したＤＨＦＲ−ＧＩＦを暗号化
する。

第２図は、　　ＤＨＦＲ−ＧＩＦを暗号化する部分のＤ
ＮＡ配列とそれから作られると予想されるタンパク質の
アミノ酸配列を示している。ＤＨＦＲ−ＧＩＦは、１７
５アミノ酸よりなるタンパク質であり、このうちアミノ
末端側から数えて、１から１５９番目までの配列が、大
腸菌の野生型ＤＨＦＲに１箇所アミノ酸置換置換が起こ
った（Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　＋　Ｇ
ｌｕ−１５２）配列であり、１６２番目から１７５番目
までがＧＩＦの配列である。ＧＩＦの配列の直前のアミ
ノ酸はメチオニン（Ｎｅｔ）である。このことにより、
ＤＨＰＲ−ＧＩＦをブロムシアン処理することにより、
ＧＩＦを特異的に切り出すことができる。１６０番目の
イソロイシン（ｌｌｅ）は、ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨ
Ｉ部位にＧＩＦを暗号化するＤＮＡを導入する際に、遺
伝暗号の読み取り枠を合わせるために生じた配列である
。ｐＴＰ７０−１が作る改変ＤＨＦＲは、１６２個のア
ミノ酸よりなり、第２図のＤＨＦＲ−ＧＩＦのアミノ酸
配列のうち、アミノ末端側から数えて、１から１６０番
目までの配列に、　Ｇｌｎ−１１ｅの２個のアミノ酸配
列が結合した配列をしている。

ＤＨＦＲ−ＧＩＦは、ｐＴＰ７０−１の改変ＤＨＦＲの
カルボキシ末端側に、ＧＩＦが融合した構造をしている
にもかかわらず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。このため
、大腸菌がＤＨＦＲ−（、ＩＦを多量につくると、ＤＨ
ＦＲの阻害剤であり。

抗細菌剤でゃＪるトリメトプリムに対して、耐性を示す
ようになる。

ＤＨＰＲ−ＧＩＦを暗号化する配列の上流には。

ｐＴＰ７０−１の改変ＤＨＦＲ遺伝子の発現を効率良く
行わせる配列が存在する（特願　昭６ｌ−３１２８３６
）。即ち、４３番目から５０番目までの配列がＳＤ配列
と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、４６１８
番目から４６４６番目までが、コンセンサス転写プロモ
ーターであり。

効率の良い転写に貢献する。また、ｐＴＰ７０−１は、
抗菌剤であるアンピシリンに対して耐性を付与する遺伝
子を有しており、その遺伝子の発現は、ｐＴＰ７０−１
のＢａｍＨＩ部位に異種ＤＮＡが挿入されても影響を受
けない。このことから。

ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨＩ部位に、ＧＩＦを暗号化す
るＤＮＡ配列が挿入した構造をしているｐＴＰＧＩＦ２
は、大腸菌に導入された場合、多量のＤＨＦＲ−ＧＩ　
Ｆを作る。作られたＤＨＦＲ−ＧＩＦは、菌体内に可溶
性の状態で、菌体タンパク質の１５〜２０％にいたるま
で蓄積する。このことによって、ｐＴＰＧＩＦ２を有す
る大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。また
、ｐＴＰＧＩＦ２は、ｐＴＰ７０−１由来のアンピシリ
ン耐性を付与する遺伝子を有することから、ｐＴＰＧＩ
Ｆ２が導入された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す
。

このような特長を有するｐＴＰＧＩＦ２は、実施例に従
って作成することができるが１組換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。

次に本発明の実施例および参考例を示す。

実施例 ｐＴＰＧＩＦ２の作成 ＧＩＦを暗号化するＤＮＡとしては。

１、５’−ＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＴＡＡＡＡ
ＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＣＴＴＣ
ＡＴＧＣＴＡＡ−３’ ２、５’−ＧＡＴＣＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧ
ＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＣＡＧＣ
ＣＡＧＣＣＡＴ−３’ ホアミダイト法に従って化学合成し、精製後、ポリヌク
レオチドキナーゼを用いて、各ＤＮＡの５′末端をリン
酸化した。　　リン酸化したＤＮＡを約０．１ｍ１（約
０．１ｄｇのＤＮＡを含んでいる。）ずつ取り、これを
６０’Ｃでインキュベートすることによって両ＤＮＡを
アニールさせた（これをＤＮＡＩと呼ぶ）。

ＧＩＦを暗号化したＤＮＡを組み込むベクターとしては
、ｐＴＰ７０−１を用いた（特願　昭６ｌ−３１２８３
６）。　　約１μｇのｐＴＰ７０−１を、ＢａｍＨＩで
切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした。アル
カリホスファターゼ処理したＤＮＡをフェノール処理す
ることにより、共存する酵素タンパク質を変性除去し、
その後エタノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮ
Ａを７０％エタノールで洗った後、エタノールを除き。

減圧下に沈澱を乾燥させた。ＢａｍＨＩによるＤＮＡの
切断、アルカリホスファターゼ処理、フェノール処理、
およびエタノール沈澱の各操作は。

いずれも、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
Ａ　ＬｏｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ　ｌ”（Ｔ、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、　　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｊ、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ。

ｅｄｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）、以下２文献１と
呼ぶ。）に記載している方法に従って行った。乾燥させ
たＤＮＡを５０μｍのリガーゼ用反応液（１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨｃＩ、ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１
０ｍＭジチオトレイトール、５　ｍＭ　ＡＴＰ）に溶解
後、５μｍのＤＮＡＩを加え、これに１ユニツトの７４
−ＤＮＡリガーゼを加えて、１５°Ｃで、４時間ＤＮＡ
の連結反応を行わせた。この反応物を、形質転換法（ｔ
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ、上記文献
１に記載）に従って、大腸菌に取り込ませた。この処理
をした菌体を、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンナトリウム
および１０ｍｇ／Ｉのトリメトプリムを含む栄養寒天培
地（培地ｌｉ中に、２ｇのグルコース＋　　Ｉｇのリン
酸２カリウム、５ｇのイーストエキスｔ　５　ｇのポリ
ペプトン、１５ｇの寒天を含む。）上に塗布し、３７°
Ｃで２４時間培養することにより、約５００のコロニー
を得ることができた。これらのコロニーから適当に８個
選び、１．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培８ｇのトリプト
ン、５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む。）で、
３７°Ｃ，１晩、菌体を培養した。培養液を、各々エッ
ペンドルフ遠心管にとり。

１２．０００回転／分で１０分間遠心分離し、菌体を沈
澱として集めた。これに、０．１ｍｌの電気泳動用サン
プル調製液（０，０６２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐ
ｔ（６，８，２χのラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
。

１０％のグリセリン、５χの２−メルカプトエタノール
。

０．００１％のブロムフェノールブルーを含む。）を加
え２面体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち２面体
を溶かした。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（Ｕ、Ｋ。

Ｌａｍｍ１ｉ；　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　
ｐ、６８０（１９７０））に従って分析した。標準サン
プルとしてｐＴＰ７０−１を含有する大腸菌に同様な処
理をしたもの、および分子量マーカーとしてラクトアル
ブミン（分子量１４．２００）、　　）リブシンインヒ
ビター（分子量２０、ｔｏｏ）　、　）リブシノーアン
（分子量２４，０００）　、カルボニックアンヒドラー
ゼ（分子ｆｆ１２９，０００）　、グリ七〇アルデヒド
３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子量３６，０００）　
、卵アルブミン（分子量４５，０００）　。

および牛血清アルブミン（分子ｆｆ１６６．０００）を
含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の１０から２０
％濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、８個のコロニー
のうち、３個ではｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲのバンドが
消失し、それより明らかに分子量が大きくなったタンパ
ク質（分子量的２３　、０００と推定される。）を新た
に生産していること、残りの５個のコロニーは、ｐＴＰ
７０−１のＤＨＦＲとほぼ同じ大きさのタンパク質を生
産すること、ｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲ（分子量１８，
３７９）は、この条件で分子量的２１　、０００のタン
パク質として泳動することが明らかになった。分子量の
大きい新たなタンパク質を生産するコロニーのうちから
適当に一つ選び、これをＹＴ＋Ａｐ培地で培養し、Ｔａ
ｎａｋａとＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎａｋａ
、　Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１２１．ｐ、３
５４（１９７５））に従って。

プラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＴＰＧ
　ＩＦ２と名づけだ。ｐＴＰＧＩＦ２は、ｐＴ　Ｐ　７
０−１籍Ｂ　ａｍＨＩ部位に合成りＮＡが挿□□ｉ− 人された構造をしているはずであるので、ｐ’ｒｐＧＩ
Ｆ２をＥｃｏＲＩと５ａｌＩによる切断によって得られ
る約４００ヌクレオチド長のＤＮＡについて９Ｍ１３フ
アージを用いたジデオキシ法（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ；　Ｍｅｈｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１０１．ｐ、２０（１９８３）
）に従って塩基配列を決定した。その結果。

第１図に示すｐＴＰＧＩＦ２の全塩基配列の４７１番目
から８８２番目の配列が明らかにされた。

ｐＴＰ７０−１の塩基配列は９本発明者らによりて明ら
かにされている（特願　昭６ｌ−３１２８３６）。ｐＴ
ＰＧＩＦ２のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩの配列は、ｐＴＰ７
０−１のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩの配列に間にあるＢａｍ
ＨＩ部位に、５２ヌクレオチドのＤＮＡ（ＧＩＦを暗号
化する配列として設計・合成した配列）が結合した配列
であった。

また、ｐＴＰＧＩＦ２のＥｃＯＲｌ−５ａ　ｌ　Ｉ切断
によって得られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡは、Ｐｓ
ｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｐａｌ、ＡａｔＩ　Ｉ、　Ｐ
ｖｕ　Ｉ　Ｉ、　Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ、およびＣ１ａＩを用
いた制限酵素による切断実験の結果、ｐ’ｒｐ７０−１
のＥｃｏＲＩ−５ａｌｌ切断によって得られる約４．２
キロ塩基対のＤＮＡと全く同一であることが示された。

以上の結果から、ｐＴＰＧＩＦ２の全塩基配列が第１図
に示した配列であることが明らかである。

参考例 ｐＴＰＧＩＦ２を有する大腸菌の作るＤＨＦＲ−ＧＩＦ
融合タンパク質の精製 ｐＴＰＧＩＦ２を有する大腸菌を１．５１のＹＴ＋Ａｐ
培地で３７°Ｃで一晩培養後、菌体を遠心分離により集
めた。湿重量約６ｇの菌体が得られた。

菌体を２０ｍ１の１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ
）および０．１ｍＭのエチレンジアミン４酢酸２ナトリ
ウム（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，
０（以下、緩衝液１）に懸濁し。

フレンチプレスを用いて面体を破砕した。菌体破砕液を
、２０，０００回転／分、１時間の遠心分はとんど全て
が上清中に回収された。このことからＤＨＦＲ−ＧＩＦ
は、可溶性の状態で菌体中に蓄積していると考えられる
。得られた上清中のＤＨＦＲ活性は、１５２０ユニツト
であった。上清なあらかじめ緩衝液１で平衡化したＤＥ
ＡＥ−）コパール６５０Ｍカラム（２，５００ｍｍ　ｘ
　１，５００．ｍｍ、、約７５０ＴＩ＋３）に吸着させ
、Ｏ，ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液１で洗った後、緩衝液
１中で、０．１Ｍから０゜３ＭのＫＣＩの濃度勾配をか
け、タンパク質を溶出させた。約６ｍｌずつのフラクシ
ョンを、フラクションコレクターで集め、各フラクショ
ンについて、ＤＨＦＲの酵素活性を調べ、活性を有する
フラクションを集めた。約４０ｍ１の酵素液が得られた
。回収されたＤＨＦＲ酵素活性は、１，０６５ユニツト
（約７０％）であった。回収酵素液を。

アミコン限外ろ過装置を用いて約１ｍｌにまで濃縮し、
これをトヨパールＨＷ５５カラムクロマトグラフィーに
より分画した。約２．５ｍｌずつのフラクションを、フ
ラクションコレクターで集め。

各フラクションについて、ＤＨＦＲの酵素活性と２８０
　ｎｍの吸光度を調べた。各フラクションについて、Ｄ
ＨＦＲの酵素活性を２８０ｎｍの吸光度で割った値を計
算し、一定の値（約３０）を示すフラクションを集めた
。４１０ユニツト（約２７％）、約２３　ｍ　ｇの酵素
が回収された。

得られた酵素タンパク質をＳＤＳ電気泳動法（上記実施
例に記載の方法）により分析したところ。

約２３　、０００の単一なタンパク質バンドが示され、
得られた酵素標品が均一であることが示された。

精製したＤＨＦＲ活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、ＧＩＦに対する抗
体と反応することが示された。即ち、精製して得られた
タンパク質は免疫学的にＧＩＦと同等の構造を有するこ
とが明らかとなった。

精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼＹを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量した（カルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボ−−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−（カルボキシ末端）であることが
予想された。ＤＨＦＲ−Ｇ　ＩＦのカルボキシ末端のア
ミノ酸はＣｙｓ　（システィン）であるが、このアミノ
酸は上記方法では検出できない。

Ｅｌｌｍａｎの方法を用いて、５，５ξジチオビス２−
ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を用いて、精製タンパク質
中のチオール（ＳＨ基）の含料を測定したところ、２．
６〜２．９残基／酵素分子という値が得られた。ｐＴＰ
７０−ＩＤＨＦＲについて同様に測定したところ、０．
８〜１．０残基／酵素分子という値であった。

以上の結果は、ｐＴＰＧＩＦ２を有する大腸菌から精製
して得られたＤＨＦＲ活性を有するタンパク質が、ＤＨ
ＦＲ−ＧＩＦであることを示している。

発明の効果 上記のように、新規組換えプラスミドｐＴＰＧＩＦ２は
、ＤＨＦＲ−ＧＩＦを暗号化しており。

つｐ’ｒｐｃｌＦ２を有する大腸菌は、ＤＨＦＲ−ＧＩ
Ｆを可溶性の状態で大量に蓄積生産する。さらに、生成
したＤＨＦＲ−Ｇ　ＩＦは、ＤＨＦＲ酵素活性を示し、
精製を容易に行うことができる。

このような性質を有することから２本発明の新規組換え
プラスミドｐＴＰＧＩＦ２およびそれを有する大腸菌は
、ＤＨＦＲ−ＧＩＦの生産、およびそれを利用したＧＩ
Ｆの生産に有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＴＰＧＩＦ２の全塩基配列を示した図であ
り、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列だけを、５
′末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は
、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、
Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は
、ｐ’ｒｐｃｒＦ２に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ
切断認識部位のうち制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に
近い方のＣ１ａｌ切断認識部位の、５’　−ＡＴＣＧＡ
Ｔ−３’　、の最初の”Ａ”を１番として数えたＲ−Ｇ
　Ｉ　Ｆを暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質
のアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基
およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシン
を、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ａｌａはアラニン
を、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、
Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓはシスティンを、Ｇ
ｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｇｌｙ
はグリシンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｉｌｅはイソロ
イシンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｍ
ｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｐ
ｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｔｈｒはトレオ
ニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒはチロシン
を、Ｖａｌはバリンを示している。図中番号は、１番目
のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧコドン
の”Ａ”を１番として数えた番号を示している。 ＡＴＣＧＡＴＧＴＴＡ　ＡＣＡＧＡＴＣＴＡＡＡＣＴＴ
ＣＣＡＴＧＡ　ＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴｌｌｏ　　　　　
　　１２０ ＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＡＡＣＧＣ
ＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＣ
ＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡＣＧ　ＧＡＣＧ
ＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧ　ＴＧＧＴＧＡＣＧ
ＴＡＧＴＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＴ
ＴＡＡＣＴＡＡ　ＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧ　ＡＡＡＡＧＧ
ＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡ　ＧＣＧＧＴＡＧＡＴＣ
ＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧ
ＡＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡ
　ＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡ　ＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧ
ＡＣＧＣＡＡＡ　ＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧ
ＴＣＡＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡ　ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡ
ＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣ
ＴＡＴＧ　ＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＣ
ＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＴＧＡＴＣＣＴＣＴ　ＡＣＧＣ
ＣＧＧＡＣＧ６６０　　　　　　６７Ｃ ＴＧＣＧＧＴＴＧＣＴ　　ＧＧＣＧＣＣＴＡＴハフ１０
　　　　　　７２Ｃ ＣＴＣＧＣＣＡＣＴＴ　ＣＧＧＧＣＴＣＡＴ（１第 １　　図　　の　　　１ ＣＴＴＧＣＧＧＣＧＧ　ＣＧＧＴＧＣＴＣＡＡ　ＣＧＧ
ＣＣＴＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧ　ＴＣＧＣＡＴＡ
ＡＧＧ　ＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＡＣＣＣＡＧＴ　
ＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＣＡＣＴ
ＴＡＴＧＡ　ＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴ　ＴＡＴＣＡＴＧＣ
ＡＡｌｏｌｏ　　　　　　１０２０　　　　　１０３０
ＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧ　ＧＴＣＡＴＴＴＴＣＧ　ＧＣＧ
ＡＧＧＡＣＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＴ　ＧＴＣＧＣＴＴ
ＧＣＧ　ＧＴＡＴＴＣＧＧＡＡｌｌｌｏ　　　　　　１
１２０　　　　　１１３０ＧＣＣＴＴＣＧＴＣＡ　ＣＴ
ＧＧＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＧＣＣ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
   にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
   ことができ、トリメトプリム耐性を付与する遺伝子が大
   腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の３′末端側の配列
   が改変されたことによりジヒドロ葉酸還元酵素−ソマト
   スタチン融合タンパク質を暗号化し、４６６０塩基対の
   大きさを有し、第１図において示されるＤＮＡ配列を有
   する新規組換えプラスミドｐＴＰＧＩＦ２。 ２、特許請求範囲第１項記載の新規組換えプラスミドｐ
   ＴＰＧＩＦ２を含有するＥ．ｃｏｌｉＣ６００株。