JPH0970288A - 新規なアルカリホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】高純度であって、安定性がよい新規なアルカリ
ホスファターゼを提供する。 【構成】ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３０分間
安定であり、基質に対するＫｍ値が低いアルカルホスフ
ァターゼおよびバチルス属細菌から該酵素を製造する方
法ならびに標識として該酵素を使用する試料中のリガン
ドを検出する方法およびその試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は高純度であって、安定性
がよい新規なアルカリホスファターゼおよびその製造法
ならびに該酵素を標識として使用する試料中のリガンド
の検出法およびその試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体物質の検出法としては多くの方法が
知られており、様々な成分が混在する中で、ある特定の
微量の成分を特異的に測定する場合には、生化学的親和
性を利用した分析法が用いられている。例えばグルコー
スや尿酸等、体液中に１０^-2ｍｏｌｅ／Ｌオーダー以上
の濃度で存在する成分に対しては、該成分を基質とする
酵素反応を利用する検出法が多く使用され、酵素の基質
とならないより高分子量の成分や、より低濃度の成分を
測定しようとする場合には、各成分の親和性、例えば抗
原−抗体、ホルモン−ホルモンレセプター、核酸−核酸
等、より親和性の高いものを利用することが一般的であ
る。これらの親和性を利用する検出法では、一方の親和
性成分を標識して検出することが多くの場合、必要であ
る。その一つとし、標識として放射性物質（ＲＩ）を用
いる方法が、検出感度の面で優れており、従来から使用
されてきた。しかし、特殊な放射性物質を取り扱う施設
や測定装置を必要とすることから、近年は、酵素でもっ
て一方の親和性成分を標識し、親和性により結合した標
識もしくは結合しなかった標識の酵素活性を測定するこ
とにより、他方の親和性成分を定量する方法が用いられ
ている。

【０００３】標識酵素の検出に用いる基質を、比色用基
質から蛍光法用基質、更には発光用基質に変えることに
より飛躍的に検出感度の向上が図られている。標識用酵
素が備える条件として、一般的に高純度、安定性が高
い、ターンオーバーが高い、標識しやすい官能基を持
つ、基質に対するＫｍ値が低い、バックグランドが低
い、検出に適した基質がある等が挙げられる。用いられ
ている酵素の種類としてはアルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、β−ラクタマーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム
等が挙げられるが、この中でアルカリホスファターゼが
もつ大きな利点は、バックグランドが他の酵素より低い
ことおよび検出に適した基質であることなどである。

【０００４】抗原、抗体または核酸の検出に適したアル
カルホスファターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニ
ルリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ
ン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ジオキセタ
ン発光基質（ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤなど）が従来から使用
されている。これらの基質とアルカリホスファターゼと
の反応により生じた可視光線、蛍光、発光を測定するこ
とにより、生体物質の量が測定できる。

【０００５】上記した性質を最も兼ね備えたアルカリホ
スファターゼとしては、仔牛小腸由来のものが挙げら
れ、最も汎用されている。仔牛小腸由来のアルカリホス
ファターゼは、比活性３，０００Ｕ／ｍｇ以上を有すこ
と、糖鎖を有しているため、過ヨウ素酸法で標識できる
ことより、他起源の酵素より優れているとされている。
しかし、その一方で、安定性に乏しいこと、および有し
ている糖鎖のためにバックグラウンドが生じることも知
られている（Besman,M.,Coleman,J.E.,J.Biol.Chem.,26
0,1190(1985)，特開昭60-180584 号公報）。また、大腸
菌由来アルカリホスファターゼは安定性が良く、純度の
高い標品を容易に入手できるが、比活性が６０Ｕ／ｍｇ
と低く、標識用酵素に適さず、分子生物学における脱リ
ン酸化用酵素として使用されているに過ぎない（Reid,
R.W.,Wilson,I.B. in "The Enzymes", 3rd Ed.373(197
1)）。これらの酵素を改善するため、部位特異的変異に
より大腸菌アルカリホスファターゼのアミノ酸を置換
し、比活性を向上させる試みがある（特開平4-349881号
公報）。しかし、ここで得られた変異アルカリホスファ
ターゼは、比活性において３．９倍の上昇が得られたの
みであり、仔牛小腸由来のものに匹敵しない。

【０００６】自然界から高い比活性を有するアルカリホ
スファターゼを獲得しようとする試みもあり、好アルカ
リ性バチルス・エスピー(Bacillus.sp.)由来の酵素（M,
Nomoto et al.,Agric.Biol.Chem.,52(7),1643(1988))や
バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)
由来の酵素に関する報告（Hulett,F.M.,J.Gen.Microbio
l.,132,2387(1986))がある。しかしながら、前者は比活
性が１６５０Ｕ／ｍｇであって、仔牛小腸由来酵素の比
活性に匹敵するとはいい難い。また後者は比活性が２１
１５．９Ｕ／ｍｇながら、その酵素活性測定は５５℃に
おいてであり、実用的な３７℃では、その７割以下であ
ると予想されるデータが示されている（Hulett,F.M. et
al.,Biochemistry,10(8),1364(1971)）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記酵素より高純度、
安定性が高く、しかも仔牛小腸由来酵素程度の比活性を
有するアルカリホスファターゼを微生物から得ることが
求められていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、バチルス（Baci
llus）属に属する細菌から、熱安定性に優れ、かつ比活
性の高いアルカリホスファターゼを見いだし、本発明を
完成するに至った。

【０００９】すなわち本発明は、下記理化学的性質を有
するアルカリホスファターゼである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
０分間安定 熱安定性において、「安定」とは、残存活性が８０％以
上であることを意味する。 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００１０】

【発明の実施態様】本発明の一実施態様は、下記理化学
的性質を有するアルカリホスファターゼである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ４．至適温度：６０℃以上 ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ７．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ８．糖鎖を有さない。 ９．Ｋｍ値：０．３４ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） １０．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １１．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メ
チルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グ
リセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、
フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸
に作用する。

【００１１】本発明の別な具体例は、下記理化学的性質
を有するアルカリホスファターゼである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ４．至適温度：６０℃以上 ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ７．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ８．糖鎖を有さない。 ９．Ｋｍ値：０．２６ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） １０．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １１．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メ
チルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グ
リセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、
フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸
に作用する。

【００１２】本発明の別な具体例は、下記理化学的性質
を有するアルカリホスファターゼである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：７０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ４．至適温度：６０℃以上 ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０ ７．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ８．糖鎖を有さない。 ９．Ｋｍ値：０．２８ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） １０．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １１．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メ
チルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グ
リセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、
フォスフォエタノールアミン、グルコース−１−リン
酸、グルコース−６−リン酸に作用する

【００１３】また本発明はバチルス属に属し、上記理化
学的性質を有するアルカリホスファターゼ生産能を有す
る菌株を培地に培養し、培養物よりアルカリホスファタ
ーゼを採取することを特徴とするアルカリホスファター
ゼの製造法である。

【００１４】本発明は標識として、下記理化学的性質を
有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴と
する試料中のリガンドを検出する方法である。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００１５】また、本発明は（ｉ）下記理化学的性質を
有するアルカリホスファターゼで直接的または間接的に
標識されたリガンドに対する特異的結合物質または (i
i) リガンドに対する特異的結合物質および下記理化学
的性質を有するアルカリホスファターゼで標識されたリ
ガンド、および(iii) アルカリホスファターゼ測定試薬
を含有する生体試料中のリガンド検出試薬である。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００１６】さらに、本発明は（ｉ）アビジン化合物ま
たはビオチン化合物を結合するリガンドに対して特異的
な親和性を有する物質および（ii）ビオチン化合物また
はアビジン化合物を結合する下記理化学的性質を有する
アルカリホスファターゼおよび(iii) アルカリホスファ
ターゼを測定する物質を含有する生体試料中のリガンド
検出試薬である。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００１７】本発明は標識として、下記理化学的性質を
有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴と
する試料中のリガンドを定量する方法である。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００１８】本発明は標識として、下記理化学的性質を
有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴と
する試料中の核酸配列決定法である。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００１９】本発明の酵素の起源は、上記理化学的性質
を有するアルカリホスファターゼを産生するものであれ
ば、動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用い
ても良い。好ましくは、上記性質を有するアルカリホス
ファターゼを産生しうるバチルス（Bacillus）属細菌で
あって、好適な例としてはバチルス・バディウス（Baci
llus badius)ＴＥ３５９２（ＦＲＥＭ ＢＰ−５３２
９）およびバチルス・バディウス（Bacillus badius)Ｔ
Ｅ３５９３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３０）、バチルス・
バディウス（Bacillus badius)ＴＥ３５９７（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１２０）が挙げられる。なお、バチルス・バ
ディウスＴＥ３５９２およびバチルス・バディウスＴＥ
３５９３は、滋賀県伊香郡余呉町の土壌より分離した菌
株であり、バチルス・バディウスＴＥ３５９７は福井県
武生市の土壌より分離した菌株であり、その菌学的性質
は以下の通りである。

【００２０】 （Ａ）バチルス・バディウスＴＥ３５９２ （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：０．６×１．８〜３．０μｍ （３）細胞の多形性：無し （４）運動性：無し （５）胞子の有無：芽胞は楕円形であり、細胞の中央または末端に観察された 。芽胞のふくらみは観察されなかった。

【００２１】 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で灰黄色のコロニーを形成す る。コロニーの周縁は不斉歯牙状（Erose)であり、凸状（Convex）である。表面 は円滑（Smooth）で光沢を有し、半透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は普通で、一様に混濁する。沈さや菌環は形成しな い。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸状（Filiform）に生育 する。ゼラチン液化力は弱い。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化しない。 （５）マッコンキー寒天培地：生育しない。 （６）フェニルエチルアルコール寒天培地：生育するが悪い。

【００２２】 （ｃ）生理学的性質 （１）グラム染色性： 陰性（−）または不定 （２）硝酸塩の還元： − （３）脱窒反応： − （４）ＭＲテスト： − （５）ＶＰテスト： − （６）インドールの生成： − （７）硫化水素の生成： − （８）デンプンの分解： − （９）カゼインの分解： ＋ （１０）ゼラチンの分解： ＋ （１１）チロシンの分解 ＋ （１２）Ｔｗｅｅｎ８０の分解： − （１３）クエン酸の利用： koser の培地 − Christensen の培地 − （１４）無機窒素源の利用（炭素源はｄｌ−リンゴ酸） 硝酸ナトリウム − 硫酸アンモニウム ＋ グルタミン酸ナトリウム ＋ （１５）色素の生成： − （１６）ウレアーゼ − （１７）オキシダーゼ ＋ （１８）カタラーゼ ＋ （１９）β−ガラクトシダーゼ − （２０）アルギニンジヒドロラーゼ − （２１）リジンカルボキシラーゼ − （２２）オルニチンカルボキシラーゼ − （２３）トリプトファンデアミナーゼ − （２４）β−グルコシダーゼ − （２５）菌体外ＤＮａｓｅ： − （２６）生育の範囲： 生育温度 １０℃ − ２０℃ ＋ ２５℃ ＋ ３０℃ ＋ ３７℃ ＋ ４０℃ ＋ ５０℃ − 生育ｐＨ ｐＨ４ − ｐＨ７ ＋ ｐＨ９ ＋ ＮａＣｌ濃度 ２％ ＋ ５％ ＋ （２７）酸素に対する態度：好気性 （２８）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：−（糖を分解せず） （２９）糖から酸およびガスの生成 酸 ガス Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース − − Ｄ−ガラクトース − − マルトース − − シュークロース − − ラクトース − − トレハロース − − Ｄ−ソルビトール − − Ｄ−マンニトール − − イノシトール − − グリセリン − − デンプン − − Ｌ−ラムノース − − Ｄ−メリビオース − − Ｄ−アミダクリン − −

【００２３】 （３０）有機化合物の利用 Ｄ−グルコース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン − マルトース − グルコン酸カリウム ＋ ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 ＋ 酢酸フェニル −

【００２４】 （Ｂ）バチルス・バディウスＴＥ３５９３ （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：０．４×１．３〜２．８μｍ （３）細胞の多形性：無し （４）運動性：無し （５）胞子の有無：芽胞は楕円形であり、細胞の中央または末端に観察された 。芽胞のふくらみは観察されなかった。

【００２５】 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で灰黄色のコロニーを形成す る。コロニーの周縁は不斉歯牙状（Erose)であり、凸状（Convex）である。表面 は円滑（Smooth）で光沢を有し、半透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は普通で、一様に混濁する。沈さや菌環は形成しな い。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸状（Filiform）に生育 する。ゼラチン液化力は弱い。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化しない。 （５）マッコンキー寒天培地：生育しない。 （６）フェニルエチルアルコール寒天培地：生育するが悪い。

【００２６】 （ｃ）生理学的性質 （１）グラム染色性： 陰性（−）または不定 （２）硝酸塩の還元： − （３）脱窒反応： − （４）ＭＲテスト： − （５）ＶＰテスト： − （６）インドールの生成： − （７）硫化水素の生成： − （８）デンプンの分解： − （９）カゼインの分解： ＋ （１０）ゼラチンの分解： ＋ （１１）チロシンの分解 ＋ （１２）Ｔｗｅｅｎ８０の分解： − （１３）クエン酸の利用： koser の培地 − Christensen の培地 − （１４）無機窒素源の利用（炭素源はｄｌ−リンゴ酸） 硝酸ナトリウム − 硫酸アンモニウム ＋ グルタミン酸ナトリウム ＋ （１５）色素の生成： − （１６）ウレアーゼ − （１７）オキシダーゼ ＋ （１８）カタラーゼ ＋ （１９）β−ガラクトシダーゼ − （２０）アルギニンジヒドロラーゼ − （２１）リジンカルボキシラーゼ − （２２）オルニチンカルボキシラーゼ − （２３）トリプトファンデアミナーゼ − （２４）β−グルコシダーゼ − （２５）菌体外ＤＮａｓｅ： ＋ （２６）生育の範囲： 生育温度 １０℃ − ２０℃ ＋ ２５℃ ＋ ３０℃ ＋ ３７℃ ＋ ４０℃ ＋ ５０℃ − 生育ｐＨ ｐＨ４ − ｐＨ７ ＋ ｐＨ９ ＋ ＮａＣｌ濃度 ２％ ＋ ５％ ＋

【００２７】 （２７）酸素に対する態度：好気性 （２８）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：−（糖を分解せず） （２９）糖から酸およびガスの生成 酸 ガス Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース − − Ｄ−ガラクトース − − マルトース − − シュークロース − − ラクトース − − トレハロース − − Ｄ−ソルビトール − − Ｄ−マンニトール − − イノシトール − − グリセリン − − デンプン − − Ｌ−ラムノース − − Ｄ−メリビオース − − Ｄ−アミダクリン − −

【００２８】 （３０）有機化合物の利用 Ｄ−グルコース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン − マルトース − グルコン酸カリウム ＋ ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 ＋ クエン酸 − 酢酸フェニル −

【００２９】 （Ｃ）バチルス・バディウスＴＥ３５９７ （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：１．０×３．３〜４．０μｍ （３）細胞の多形性：無し （４）運動性：無し （５）胞子の有無：芽胞は楕円形であり、細胞の中央または末端に観察された 。芽胞のふくらみは観察されなかった。

【００３０】 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で灰黄色のコロニーを形成す る。コロニーの周縁は不斉歯牙状（Erose)であり、凸状（Convex）である。表面 は円滑（Smooth）で光沢を有し、半透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は普通で、一様に混濁する。沈さや菌環は形成しな い。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸状（Filiform）に生育 する。ゼラチン液化力は弱い。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化しない。 （５）マッコンキー寒天培地：生育しない。 （６）フェニルエチルアルコール寒天培地：生育するが悪い。

【００３１】 （ｃ）生理学的性質 （１）グラム染色性： 陽性（＋） （２）硝酸塩の還元： 陰性（−） （３）脱窒反応： − （４）ＭＲテスト： − （５）ＶＰテスト： − （６）インドールの生成： − （７）硫化水素の生成： − （８）デンプンの分解： − （９）カゼインの分解： ＋ （１０）ゼラチンの分解： ＋ （１１）チロシンの分解 ＋ （１２）Ｔｗｅｅｎ８０の分解： − （１３）クエン酸の利用： koser の培地 − Christensen の培地 − （１４）無機窒素源の利用（炭素源はｄｌ−リンゴ酸） 硝酸ナトリウム − 硫酸アンモニウム ＋ グルタミン酸ナトリウム ＋ （１５）色素の生成： − （１６）ウレアーゼ − （１７）オキシダーゼ ＋ （１８）カタラーゼ ＋ （１９）β−ガラクトシダーゼ − （２０）アルギニンジヒドロラーゼ − （２１）リジンカルボキシラーゼ − （２２）オルニチンカルボキシラーゼ − （２３）トリプトファンデアミナーゼ − （２４）β−グルコシダーゼ − （２５）菌体外ＤＮａｓｅ： − （２６）生育の範囲： 生育温度 １０℃ − ２０℃ ＋ ２５℃ ＋ ３０℃ ＋ ３７℃ ＋ ４０℃ ＋ ５０℃ − 生育ｐＨ ｐＨ４ − ｐＨ７ ＋ ｐＨ９ ＋ ＮａＣｌ濃度 ２％ ＋ ５％ ＋

【００３２】 （２７）酸素に対する態度：好気性 （２８）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：−（糖を分解せず） （２９）糖から酸およびガスの生成 酸 ガス Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース − − Ｄ−ガラクトース − − マルトース − − シュークロース − − ラクトース − − トレハロース − − Ｄ−ソルビトール − − Ｄ−マンニトール − − イノシトール − − グリセリン − − デンプン − − Ｌ−ラムノース − − Ｄ−メリビオース − − Ｄ−アミダクリン − −

【００３３】 （３０）有機化合物の利用 Ｄ−グルコース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース − グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 ＋ クエン酸 − 酢酸フェニル ＋

【００３４】上記菌学的性質同定のための実験法は、主
として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」
学会出版センター（１９８５年）によって行った。また
分類同定の基準として「バージェーズ・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジー」（１９８４
年）を参考にした。

【００３５】以上の文献および菌学的性質を参考にする
と、菌体外ＤＮａｓｅの産生で異なるが、いずれもグラ
ム染色性不定で胞子形成能のある好気性桿菌であること
よりバチルス（Bacillus）属に属するとみなされる。ま
たバチルス属中では芽胞が楕円形でふくらまないこと、
Ｄ−グルコースより酸を生成しないこと、ゼラチンを分
解するが、澱粉を分解しないことを考えると、いずれも
バチルス・バディウス（Bacillus badius)に属すると考
えられ、それぞれバチルス・バディウス（Bacillus bad
ius)ＴＥ３５９２、バチルス・バディウス（Bacillus b
adius)ＴＥ３５９３およびバチルス・バディウス（Baci
llus badius)ＴＥ３５９７と命名した。これらの菌はそ
れぞれ微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５３２９および
ＦＥＲＭＢＰ−５３３０、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２０と
して寄託されている。

【００３６】本発明の酵素を製造するにあたっては、上
記アルカリホスファターゼ生産菌を栄養培地に培養し、
該培養物からアルカリホスファターゼを採取する。アル
カリホスファターゼ生産菌の培養にあたって使用する培
地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無
機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれ
ば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源と
しては、例えばグルコース、グリセロール等が使用され
る。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵
母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、ク
エン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用され
る。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム等が使用される。またアルカリホ
スファターゼの生産誘導として、リン酸濃度を低くして
おくことが望ましい。

【００３７】培地は通常、振盪培養、あるいは通気撹拌
培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５
〜３７℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜
１０に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用
する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜
７日で生育し、菌体内および菌体外にアルカリホスファ
ターゼが生産蓄積される。

【００３８】本発明の酵素の精製法は一般に使用される
精製法を用いれば良い。例えば、菌体除去後の培地を、
硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カ
ルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレン
イミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミ
ノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−
セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精
製することができる。またこれらの方法で得られた粗酵
素液や精製酵素液は、例えば、スプレードライや凍結乾
燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定化し
て固定化酵素として使用できる。

【００３９】次に本発明のアルカリホスファターゼの活
性測定法を示す。 まず下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予備加温する。 ３．００ｍｌ ０．１ｍＭ ＣｏＣｌ₂ および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ を含む １Ｍ ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８ ０．０５ｍｌ ０．６７Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液 次に、酵素溶液０．０５ｍｌを加え、緩やかに混和後、
水を対照に３７℃で制御された分光光度計で４０５ｎｍ
の吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分か
ら１分間当たりの吸光度変化を求める。盲検は反応混液
に酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．０５ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ₂ および０．０５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）を加え、上記同様に
操作を行って１分間当りの吸光度を求めた。上記条件下
で１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生
成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。

【００４０】本発明の試料中のリガンドを検出する方法
とは、試料中のリガンドとリガンドに対して特異的な親
和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
り、該反応により結合した物質に結合するアルカリホス
ファターゼ活性を測定するか、あるいは結合しなかった
アルカリホスファターゼ活性を測定する方法である。

【００４１】本発明において、試料中のリガンドとして
は、抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプターまたは
核酸などが例示される。リガンドとリガンドに対して特
異的な親和性を有する物質との親和性反応としては、抗
原抗体反応、ホルモン−ホルモンレセプター反応、核酸
ハイブリダイゼーション反応などがある。

【００４２】本発明に使用するアルカリホスファターゼ
は、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼ
であれば、いずれの起源のものを用いても良い。好適な
ものとしては、バチルス(Bacillus)属のアルカリホスフ
ァターゼなどがある。例えばバチルス・バディウス(Bac
illus badius) ＴＥ３４９２、バチルス・バディウス(B
acillus badius) ＴＥ３４９３、バチルス・バディウス
(Bacillus badius) ＴＥ３４９７のアルカリホスファタ
ーゼが例示される。

【００４３】バチルス・バディウス(Bacillus badius)
ＴＥ３４９２のアルカリホスファターゼの理化学的性質
は、以下の通りである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グル
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に
作用する。 ３．Ｋｍ値：０．３４ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ²⁺およびＣｏ²⁺ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
濾過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００４４】バチルス・バディウス(Bacillus badius)
ＴＥ３４９３のアルカリホスファターゼの理化学的性質
は、以下の通りである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グル
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に
作用する。 ３．Ｋｍ値：０．２６ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ²⁺およびＣｏ²⁺ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
濾過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００４５】バチルス・バディウス(Bacillus badius)
ＴＥ３４９７のアルカリホスファターゼの理化学的性質
は、以下の通りである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グル
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に
作用する。 ３．Ｋｍ値：０．２８ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ²⁺およびＣｏ²⁺ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
濾過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００４６】本発明において、アルカリホスファターゼ
で標識される物質としては、例えば、抗原としてはタン
パク質、核酸などの高分子物質などが挙げられる。最
近、良く用いられている抗原のエピトープ部位をデザイ
ンしたペプチドも使用することができる。また抗体とし
ては通常、使用されるもの、例えばヤギ、ウサギ、モル
モットなどに免疫して得られるポリクローナル抗体、マ
ウス腹水等のハイブリドーマから得られるモノクローナ
ル抗体、更にこれらの抗体をプロテアーゼ処理して得ら
れる抗原結合活性フラグメント（Ｆａｂ’）などを使用
することができる。遺伝子組換え技術で得られるＦｖ抗
体、一本鎖Ｆｖ抗体等、抗原結合活性を有するタンパク
質を使用することも可能である。

【００４７】本発明において、アルカリホスファターゼ
は、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
有する物質のいずれか一方に結合されていることが好ま
しい。

【００４８】アルカリホスファターゼを上記抗原や抗体
などに標識する際に使用する方法としては、グルタルア
ルデヒド法、マレイミド法、カルビジイミド法、ピリジ
ン−ジスルフィド法などを用いることができるが、好ま
しいのはマレイミド法のように抗原、抗体や酵素の活性
を低下させない方法である。

【００４９】抗体や抗原１分子に導入される標識用酵素
としては、通常、１分子以上、好ましくは２分子以上結
合した酵素標識体を使用することが望ましい。

【００５０】本発明の具体例な例としては、試料中のリ
ガンド、例えば抗原または抗体とアルカリホスファター
ゼを結合した該リガンドに特異的な親和性を有する物
質、例えば抗体または抗原を反応させ、反応生成物と未
反応生成物を分離した後、反応生成物に結合したアルカ
リホスファターゼ活性または未反応生成物のアルカリホ
スファターゼ活性を測定する。

【００５１】標識物質としてアリカリホスファターゼを
用いる免疫学的測定法は、抗体、抗原のいずれを測定す
る場合にも、競合法、もしくは非競合法のヘテロジニア
ス法に使用することができる。いずれの方法においても
一次抗体のみならず、二次抗体を用いる方法において
も、それらにアルカリホスファターゼを標識することが
できる。また二次抗体の代わりに、プロテインＡ、プロ
テインＧのようなＦｃレセプターにアルカリホスファタ
ーゼを標識して使用できる。

【００５２】また、本発明の方法の別な具体例として
は、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
有する物質を固相に結合しているリガンドの検出法があ
る。固相としては、従来既知のものを使用すればよく、
例えばポリスチレンビーズなどが挙げられる。

【００５３】また、他の具体的な例としては、アビジン
化合物またはビオチン化合物がリガンドに対して特異的
な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原に結合
し、アルカリホスファターゼがビオチン化合物またはア
ビジンに化合物結合して、リガンド、例えば抗原または
抗体とリガンドに対して特異的な親和性を有する物質、
例えば抗体または抗原との親和性反応と同時に、または
その後にアビジン化合物−ビオチン化合物結合反応を行
い、該反応により結合したアルカリホスファターゼ活性
または残存するアルカリホスファターゼ活性を測定する
試料中のリガンドの検出法がある。ここにアビジン化合
物とはビオチン化合物と強く結合する糖タンパク質であ
り、例えばアビジン、ストレプトアビジンなどが挙げら
れる。また、ビオチン化合物とはビタミンＢ複合体の１
つであり、例えばビオチンなどが挙げられる。

【００５４】アビジン化合物とビオチン化合物、就中ア
ビジンとビオチンの結合定数は、１０¹⁵Ｍ^-1レベルで非
常に高いこと、アビジン化合物、就中アビジンは４つの
ビオチン結合部位を持つこと、ビオチン化合物を導入す
ることは、例えば抗体などの活性の損失が少ないことに
よりアビジン化合物−ビオチン化合物系は大きなメリッ
トを有している。

【００５５】例えば固相サンドウイッチ免疫測定法にお
いて、固相に固定化した抗体と試料を反応させ、さらに
ビオチン化合物を結合した抗体と反応させた後、反応生
成物中のビオチン化合物または未反応生成物中のビオチ
ン化合物をアルカリホスファターゼで標識したアビジン
化合物により検出する。アビジンおよび類縁物質のスト
レプトアビジンは分子量５万程度のタンパク質であり、
これらはアルカリホスファターゼとグルタルアルデヒド
法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリジン−ジス
ルフィド法などを用いて結合することができる。

【００５６】一方、ビオチン化合物に代えてアビジン化
合物を結合する抗体を使用した場合、抗原抗体反応の
後、アビジン化合物とアルカリホスファターゼで標識し
たビオチン化合物により検出する。アルカリホスファタ
ーゼをビオチン化する試薬は市販されており、例えばビ
オチン−Ｎ−ハイドロキシ−コハク酸イミドエステル、
ビオチン−Ｎ−ハイドロキシ−スルホコハク酸イミドエ
ステル、ビオチノイル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ハ
イドロキシ−コハク酸イミドエステルなどを挙げること
ができる。

【００５７】本発明の試料中のリガンド検出試薬とは、
下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標
識されたリガンドに対する特異的結合物質または下記理
化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識され
たリガンドおよびアルカリホスファターゼ測定試薬を含
有する。アルカリホスファターゼ測定試薬としては、発
色基質、蛍光基質、発光基質などが例示される。

【００５８】発色基質としては、ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸、１−ナフトールフタレインモノリン酸（特公平５
−１３９５８号公報）、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルリン酸およびそれとニトロブルーテトラゾリ
ウムとの組み合わせなどが挙げられる。また、蛍光基質
としては、４−メチルウンベリフェリルリン酸、フェナ
レノン−６−リン酸とその類縁化合物、ベンズフェナレ
ン−６−リン酸とその類縁化合物（特開昭６２−１９０
１９１号公報）などが挙げられる。さらに、発光基質と
しては、ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤ等の１，２−ジオキセタン
化合物またはそれらの誘導体およびこれらの化合物とエ
ンハンサー、例えば界面活性剤、蛍光性物質またはタン
パク質などの混合物などが挙げられる。

【００５９】本発明のこれら基質の濃度は、０．０１〜
２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは〜５０ｍｍｏｌ／ｌで
ある。本発明の酵素反応は、通常、ｐＨ７〜１１で行う
が、至適ｐＨを考慮すると、ｐＨ８〜１１で酵素反応す
ることが望ましい。使用する緩衝液としては、トリス塩
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ジエタノールアミン塩酸緩衝
液、トリエタノールアミン塩酸緩衝液、重炭酸緩衝液、
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩酸緩衝液、バルビタール
緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ
−２−メチルプロパノール塩酸緩衝液、アミノアルコー
ル系緩衝液などを例示することができる。これらの緩衝
液の濃度は、５〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０
〜５０ｍｍｏｌ／ｌである。

【００６０】反応生成物に結合する酵素または未反応生
成物に結合する酵素の活性は、アルカリホスファターゼ
活性をレート法で測定することより実施できるが、上記
基質と酵素結合体を一定時間反応させ、反応停止後に該
生成物を検出することによっても行うことができる。停
止剤として使用できるものとしては、アルカリ溶液、酵
素阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、無機リン酸等が使
用できる。また反応停止後、強アルカリ条件にすること
により、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ジオキセタン化合
物等の基質では、感度を更に上げることができる（特開
平２−２７３１９９号公報）。

【００６１】本発明に使用する緩衝液中にはアルカリホ
スファターゼの不活性化を防ぐために金属塩を添加する
ことが望ましい。使用できる金属塩としてはマグネシウ
ム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、カルシウム塩
が挙げられるが、好ましくはマグネシウム塩とコバルト
塩である。好ましいマグネシウム塩の添加濃度は０．０
５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌであり、酢酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、硫
酸マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸マグネシウム
等のマグネシウム錯化合物を使用することができる。好
ましいコバルト塩の添加濃度は０．０２〜５ｍｍｏｌ／
ｌであり、酢酸コバルト、塩化コバルト、クエン酸コバ
ルト、硫酸コバルト、エチレンジアミン四酢酸コバルト
等のコバルト錯化合物を使用することができる。マグネ
シウム塩とコバルト塩を併用することが望ましいが必須
ではない。

【００６２】本発明の実施に有用な界面活性剤は、アル
カリホスファターゼ活性を大きく阻害しない任意のもの
を使用することができる。一般に有用な界面活性剤は非
イオン性界面活性剤であるが、両性界面活性剤およびイ
オン性界面活性剤も使用できる。また本発明には水と混
和しうる有機溶媒の併用も可能である。その例としてメ
タノール、エタノール、プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリ
ル、ヘキサメチレンホスホアミドなどである。

【００６３】さらに、本発明の試薬には酵素反応を円滑
に行わせるため、あるいはその構成成分の活性を維持す
るため、他の化合物を添加してもよい。このような化合
物として、例えば安定化剤、賦形剤が挙げられる。また
バックグラウンドや非特異反応の低減にアルカリホスフ
ァターゼの不活化型酵素を添加することは有効である。

【００６４】本発明は上記固相サンドウイッチ免疫測定
法のみならず、ホルモン−レセプター親和性を利用した
ホルモンやそのレセプターの測定、核酸−核酸親和性、
例えばＤＮＡ−ＤＮＡ反応またはＤＮＡ−ＲＮＡ反応な
どを利用した測定などにも用いることができる。

【００６５】本発明の具体的な核酸を検出する例として
は、捕捉オリゴヌクレオチドを固定した部材に核酸（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ）を含む試料を作用させ、次いでアル
カリホスファターゼを標識した検出オリゴヌクレオチド
を作用させて、捕捉オリゴヌクレオチドに結合した核酸
と標識した検出オリゴヌクレオチドとの核酸ハイブリダ
イゼーションを行い、未反応の検出オリゴヌクレオチド
を分離した後、核酸ハイブリダイゼーションされた結合
体のアルカリホスファターゼ活性を測定することによ
り、試料中の核酸を検出する方法がある。

【００６６】試料中の核酸としては、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａなど、１本鎖または２本鎖核酸が例示される。試料と
しては、血清、尿、リンパ液などの体液、各種組織など
の材料が例示される。

【００６７】本発明のアルカリホスファターゼとＤＮＡ
またはＲＮＡとの複合体の作製は、例えば M.Renz and
C.Kurz,Nucleic Acids Res.,12(8),3435(1984)に記載の
方法を用いることができる。例えば、アルカリフォスフ
ァターゼとポリエチレンイミンを架橋して、コンジュゲ
ートを作製した後、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレ
オチドをグルタルアルデヒドにより架橋させ、標識核酸
を得る。またオリゴヌクレオチドを合成する場合、その
５’末端や任意の鎖にスペーサーアームを介して、直
接、アミノ基やチオール基を導入する試薬が市販されて
おり、これらの試薬とアルカリホスファターゼをグルタ
ルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、コ
ハク酸イミドエステル法、ピリジン−ジスルフィド法を
により結合して、オリゴヌクレオチドにアルカリホスフ
ァターゼを導入することもできる。

【００６８】試料としてはＤＮＡが例示され、ＤＮＡを
鋳型として伸長反応を行う際、ビオチン化プライマーも
しくはビオチン化ターミネーター等を利用して、ビオチ
ンをＤＮＡ断片に取り込ませる。次に電気泳動により断
片を展開した後、アビジン化アルカリホスファターゼも
しくはアビジン、続いてビオチン化アルカリホスファタ
ーゼと反応させて、断片を検出する。

【００６９】更には、本発明は試料中の核酸を取り出し
て、核酸ハイブリダイゼーションを行う方法に代えて、
細胞中で核酸ハイブリダイゼーションを行う in situ
ハイブリダイゼーションにも使用可能である。

【００７０】本発明の他の具体例としては、標識とし
て、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼ
を使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法が
ある。配列決定にはジデオキシターミネーション法、マ
キサム−ギルバート法など公知の手法を選択することが
できる。例えば、ジデオキシターミネーション法を用い
る場合、以下の方法が例示される。まず配列を決定すべ
き核酸（一本鎖もしくはアルカリ変性した二本鎖）にビ
オチン化プライマーをハイブリダイズさせ、さらに１種
のジデオキシリボヌクレオチド（例えばｄｄＡＴＰ）を
４種のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）および
核酸合成酵素（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素、Ｔ７ポリメ
ラーゼ等）とともに加え、伸長反応と停止反応を同時に
行わせる。他の３種のジデオキシリボヌクレオチド（ｄ
ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ）についても同
様に反応をおこなわせ、得られる４種の反応液をそれぞ
れシークエンスゲル上の電気泳動に付した後、アビジン
化アルカリホスファターゼもしくはアビジン、続いてビ
オチン化アルカリホスファターゼを反応させ、発色基質
等を用いて種々の伸長断片を検出、各レーンを比較対照
することにより核酸配列を決定する。上記アルカリホス
ファターゼ標識核酸を用いる核酸配列決定用試薬として
は、該酵素を直接的または間接的に結合するＤＮＡまた
はＲＮＡとアルカリホスファターゼ測定試薬を包含す
る。

【００７１】

【発明の効果】本発明によって高純度であって、安定性
がよい新規なアルカリホスファターゼを得ることができ
る。また、本発明で特定されるアルカリホスファターゼ
を使用するバインディングアッセイ用試薬、それによる
試料中のリガンド検出法は、高感度であって、長期保存
性に優れる。しかも目的物質の検出にあたり、バックグ
ラウンドの少ない良好な結果を与えることができる。

【００７２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。実施例１ ３．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、０．１
％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００
２％リン酸一カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含む
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１
２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌とし
て、バチルス・バディウスＴＥ３５９２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５３２９）を一白金耳植菌し、３０℃で２０時間培
養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレ
ーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３０
０ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で２０時間培養し
た。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を
得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマ
トグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィ
ー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比
活性２，３００Ｕ／ｍｇにまで精製した。

【００７３】得られたアルカリホスファターゼは下記特
性を有していた。 １．下記の反応を触媒した。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸

【００７４】２．基質特異性

【表１】

【００７５】３．Ｋｍ値 ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は０．３４ｍＭで
あった。 ４．至適ｐＨ ０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に
示す通りであって、至適ｐＨは９〜１０であった。 ５．安定ｐＨ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ
３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１０）で２５℃、１６時間保存して、その残存活
性を測定した。その結果、図２に示す通りであって、安
定ｐＨはｐＨ６〜９であった。 ６．至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は６０℃以上であった。 ７．熱安定性 本発明の酵素を１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および０．１ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ₂ を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を
測定した。その結果は図４に示す通りであって、６０℃
まで安定であった。 ８．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺が必須
であった。 ９．分子量： １４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０．糖含量：糖は検出されなかった。

【００７６】実施例２ ３．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、０．１
％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００
２％リン酸一カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含む
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１
２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌とし
て、バチルス・バディウスＴＥ３５９３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５３３０）を一白金耳植菌し、３０℃で２０時間培
養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレ
ーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３０
０ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で２０時間培養し
た。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を
得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマ
トグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィ
ー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比
活性２，７９０Ｕ／ｍｇにまで精製した。

【００７７】得られたアルカリホスファターゼは下記特
性を有していた。 １．下記反応を触媒した。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸

【００７８】２．基質特異性

【表２】

【００７９】３．Ｋｍ値 ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は０．２６ｍＭで
あった。 ４．至適ｐＨ ０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図５に
示す通りであって、至適ｐＨは９〜１０であった。 ５．安定ｐＨ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ
３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１０）で２５℃、１６時間保存してその残存活性
を測定した。その結果は図６に示す通りであって、安定
ｐＨはｐＨ６〜９であった。 ６．至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図７に
示す通りであって、至適温度は６０℃以上であった。 ７．熱安定性 本発明の酵素を１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および０．１ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ₂ を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を
測定した。その結果は図８に示す通りであって、６０℃
まで安定であった。 ８．活性化および安定化剤 Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺が必須であった。 ９．分子量 １４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０．糖含量 糖は検出されなかった。

【００８０】実施例３ ３．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、０．１
％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００
２％リン酸一カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含む
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１
２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌とし
て、バチルス・バディウスＴＥ３５９７（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５１２０）を一白金耳植菌し、３０℃で２０時間培
養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレ
ーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３０
０ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で２０時間培養し
た。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を
得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマ
トグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィ
ー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比
活性２，３００Ｕ／ｍｇにまで精製した。

【００８１】得られたアルカリホスファターゼは下記特
性を有していた。 １．下記反応を触媒した。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸

【００８２】２．基質特異性

【表３】

【００８３】３．Ｋｍ値 ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は０．２８ｍＭで
あった。 ４．至適ｐＨ ０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図９に
示す通りであって、至適ｐＨは９．５〜１０であった。 ５．安定ｐＨ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ
３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１０）で２５℃、１６時間保存してその残存活性
を測定した。その結果は図１０に示す通りであって、安
定ｐＨはｐＨ６〜１１であった。 ６．至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図１１
に示す通りであって、至適温度は６０℃以上であった。 ７．熱安定性 本発明の酵素を１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および０．１ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ₂ を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を
測定した。その結果は図１２に示す通りであって、７０
℃まで安定であった。 ８．活性化および安定化剤 Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺が必須であった。 ９．分子量 １４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０．糖含量 糖は検出されなかった。

【００８４】比較例１ 本願発明の酵素と従来から公知であった酵素との性質を
下記表に対比する。

【００８５】

【表４】

【００８６】実施例４ （１）アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＣＲＰＩ
ｇＧの作製 実施例３のアルカリホスファターゼ５ｍｇを含む５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およ
び０．１ｍＭ ＣｏＣｌ₂ を含む）２．５ｍｌに２５％
グルタルアルデヒド溶液３５μｌを加え、２５℃で５０
分間インキュベートした。次に、２．５ｍｇのヤギ抗ヒ
トＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所製）を含
む０．５ｍｌ ５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を加
え、２５℃で更に７５分間インキュベートした。次に２
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．７を１５０μｌ添加
後、４℃で３０分間撹拌し、１５０ｍｇのＮａＢＨ₄ を
含む水溶液を１５０μｌ添加後、４℃で１５時間インキ
ュベートした。得られた混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ
２００（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグ
ラフィー（溶出液として０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ₂ 、０．１％ Ｎａ
Ｎ₃ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を
使用）で精製し、第一ピークを酵素標識抗体として取得
した。

【００８７】（２）ヒトＣＲＰの検量線 ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所
製）を被覆したポリスチレンビーズ１個にヒトＣＲＰ
０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０℃で１時
間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３回洗浄
後、アルカリホスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍｌに希
釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時間イン
キュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１ｍＭ
ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ を含む
１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加え、３
７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２ｍｌ
を加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を
測定し、検量線を作成した（図１３）。

【００８８】比較例２ 仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）５ｍ
ｇを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２．５
ｍｌに２５％グルタルアルデヒド溶液１５０μｌを加
え、実施例１と同様に操作を行い、酵素標識抗体を取得
した。上記酵素標識抗体を用い、実施例１と同様にヒト
ＣＲＰについての検量線を作製した（図１３）。特異発
色（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度
（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本
発明のアルカリホスファターゼ１２．５に対して、ＣＩ
ＡＰは５．１３であり、本発明のアルカリホスファター
ゼの方が非特異吸着が小さかった。

【００８９】実施例５ （１）アルカリホスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＣＲＰ
Ｆａｂ’の作製 ヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆ（ａｂ’）₂ （バインディング
サイト社）５ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
６．０ １ｍｌに０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミ
ン、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ６．０ １００ｍｌを加え、３７℃、９０分間イン
キュベートした。該混合液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、０．５ｍ
ｌに濃縮した。一方、実施例３のアルカリホスファター
ゼ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールアミン緩
衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ
ＣｏＣｌ₂ を含む）５００μｌに０．１ｍｇ Ｎ−サク
シニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレートを含むジメチルホルムアミ
ド１０μｌを加え、３０℃で３０分間インキュベートし
た。得られた液は１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ₂ を含む０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．０
で脱塩後、０．５ｍｌに濃縮した。調製したヒツジ抗ヒ
トＣＲＰ Ｆａｂ’にマレイミド化アルカリホスファタ
ーゼを加え、４℃、２０時間インキュベートした。次に
１０ｍＭ ２−メルカプトエチルアミン ５０μｌを加
え、２５℃で２０分間インキュベートした。得られた混
合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピー
クを酵素標識抗体として取得した。

【００９０】（２）ヒトＣＲＰの検量線 ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（株式会社日本バイオテス
ト研究所製）を被覆したポリスチレンビーズ１個に、ヒ
トＣＲＰ０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０
℃で１時間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３
回洗浄後、アルカリホスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍ
ｌに希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時
間インキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１
ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂
を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加
え、３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ
２ｍｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸
光度を測定し、検量線を作成した（図１４）。

【００９１】比較例３ ＣＩＡＰ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールア
ミン緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．１
ｍＭ ＺｎＣｌ₂ 、３Ｍ ＮａＣｌを含む）５００μｌ
について実施例５と同様の操作を行い、酵素標識抗体を
取得した。上記酵素標識抗体を用い、実施例４と同様に
してヒトＣＲＰについての検量線を作成した（図１
４）。特異発色（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブラ
ンクの吸光度（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／
Ｎ比）は、本発明のアルカリホスファターゼ５５．２に
対して、ＣＩＡＰは３４．８であり、本発明のアルカリ
ホスファターゼの方が非特異吸着が小さかった。

【００９２】実施例６ （１）ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼ
の作製 ストレプトアビジン４ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ７．５ ６００μｌに０．１ｍｇ Ｓ−アセチ
ルメルカプトスクシニックアンハイドライドを含むジメ
チルホルムアミド１０μｌを添加し、３０℃で３０分間
インキュベートした。次に０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．０ ２０μｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．０ １２０μｌ、１Ｍ塩酸ハイドロキシルアミン１
２０μｌを添加し、３０℃で５分間インキュベートし、
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、６００μ
ｌに濃縮した。実施例５で作製したマレイミド化アルカ
リホスファターゼ溶液１００μｌに作製したメルカプト
スクシニル化ストレプトアビジン１００μｌを加え、４
℃、２０時間インキュベート後、得られた混合物をＳｕ
ｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピークを酵素標
識ストレプトアビジンとした。

【００９３】比較例４ ＣＩＡＰについて実施例６と同様な方法で酵素標識スト
レプトアビジンを作製した。常法に従い、イモビロン
（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプラ
イし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、本
発明の酵素標識ストレプトアビジン及びＣＩＡＰ標識ス
トレプトアビジン０．３Ｕ／ｍｌと３０℃で１時間イン
キュベートした。次に発光基質ＰＰＤを含む１Ｍ ジエ
タノールアミン緩衝液，ｐＨ９．８（５ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに感光させて検出
した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡＰ標識体共に
０．５ｎｇのビオチニル化ストレプトアビジンを検出す
ることができた。次に本発明の酵素標識ストレプトアビ
ジンおよびＣＩＡＰ標識ストレプトアビジンを１ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．５で４０℃に７日間保存して、アルカリホスファタ
ーゼ活性を比較した。結果を図１５に示すが、本発明の
酵素標識ストレプトアビジンの方が安定であった（図１
５）。

【００９４】実施例７ （１）ビオチニル化アルカリホスファターゼの作製 本発明のアルカリホスファターゼ６ｍｇを含む３０ｍＭ
トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５（１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ２を含む）６００μｌ
に０．１２８ｍｇ Ｄ−ビオチニン−ε−アミノカプリ
ン酸−Ｎ−ハイドロキシスクシイミドエステルを含むジ
メチルホルムアミド２０μｌを加え、２５℃で３時間撹
拌した後、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、
０．１ｍＭ ＣｏＣｌ₂ 、０．１％ＮａＮ₃ を含む５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液に対して透析した。

【００９５】比較例５ ＣＩＡＰについて実施例７と同様の方法でビオチニル化
アルカリホスファタを作製した。常法に従い、イモビロ
ン（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプ
ライし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、
１μｇ／ｍｌの本発明のビオチニル化アルカリホスファ
ターゼ及びビオチニル化ＣＩＡＰ０．３Ｕ／ｍｌと３０
℃で１時間インキュベートした。次に発光基質ＰＰＤを
含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８（５
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに
感光させて検出した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡ
Ｐ標識体共に５０ｐｇのビオチニル化ストレプトアビジ
ンを検出することができた。次に本発明のビオチニル化
アルカリホスファターゼおよびビオチニル化ＣＩＡＰを
１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５中で熱アルカリフォスファターゼ活性の
熱安定性を比較した。結果を図１６に示すが、本発明の
ビオチニル化アルカリフォスファターゼの方が安定であ
った。

【００９６】実施例８ （１）アルカリホスファターゼ標識プローブ Ｕｎｉ−Ｌｉｎｋ^TMＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ（クロ
ーンテック社製）を５’端に組み込んだ下記配列のオリ
ゴヌクレオチドを通常の方法で合成し、精製した。５’
−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧ
ＣＧＴＡＡＴ−３’上記プローブ１０ｎｍｏｌｅを含む
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ １０μｌにジスクシミジルスベ
リン酸溶液（１０ｍｇ／ｍｌ−ＤＭＳＯ）５０μｌ加
え、攪拌後、２５℃１５分間反応させ、セファデックス
Ｇ−２５カラムでゲルろ過し、最初のオリゴヌクレオチ
ドを含むピークを分取した。該ピークを１００μｌに濃
縮し、本発明のアルカリフォスファターゼ１．５ｍｇを
含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ ４０μｌを加え、２５℃で
一晩反応した。該混合物に約５００μｌの１．０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．０を加えた後、ＭｏｎｏＱ（ファルマシア製）を用
いる高速液体クロマトグラフィー（溶出液Ａ：１．０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ を含む２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．０、溶出液Ｂ：１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．
０）で精製した。

【００９７】比較例６ ＣＩＡＰについて実施例５の方法で、ＣＩＡＰ標識プロ
ーブを作製した。本発明の酵素標識プローブおよびＣＩ
ＡＰ標識プローブを１ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳで
７０℃で２時間処理して、アルカリフォスファターゼ活
性を比較した。結果は図１７に示すように、本発明の酵
素標識プローブの方が安定であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルス・バディウスＴＥ３５９２が産生する
酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフであ
る。

【図２】バチルス・バディウスＴＥ３５９２が産生する
酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。

【図３】バチルス・バディウスＴＥ３５９２が産生する
酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフであ
る。

【図４】バチルス・バディウスＴＥ３５９２が産生する
酵素の熱安定性を示すクラフである。

【図５】バチルス・バディウスＴＥ３５９３が産生する
酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフであ
る。

【図６】バチルス・バディウスＴＥ３５９３が産生する
酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。

【図７】バチルス・バディウスＴＥ３５９３が産生する
酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフであ
る。

【図８】バチルス・バディウスＴＥ３５９３が産生する
酵素の熱安定性を示すクラフである。

【図９】バチルス・バディウスＴＥ３５９７が産生する
酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフであ
る。

【図１０】バチルス・バディウスＴＥ３５９７が産生す
る酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。

【図１１】バチルス・バディウスＴＥ３５９７が産生す
る酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフであ
る。

【図１２】バチルス・バディウスＴＥ３５９７が産生す
る酵素の熱安定性を示すグラフである。

【図１３】本発明の酵素標識およびＣＩＡＰ標識ヤギ抗
ヒトＣＲＰＩｇＧを用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を
示す。

【図１４】本発明の酵素標識およびＣＩＡ標識ヒツジ抗
ヒトＣＲＰＦａｂを用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を
示す。

【図１５】ストレプトアビジンによる本発明の酵素標識
体とＣＩＡＰ標識体の保存安定性の比較を示す。

【図１６】ビオチンによる本発明の酵素標識体とＣＩＡ
Ｐ標識体の熱安定性の比較を示す。

【図１７】本発明の酵素およびＣＩＡＰ標識プローブの
熱安定性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記理化学的性質を有するアルカリホス
   ファターゼ。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
   ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
   ０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
   過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
2. 【請求項２】 下記理化学的性質を有する請求項１記載
   のアルカリホスファターゼ。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
   ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ４．至適温度：６０℃以上 ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ７．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ８．糖鎖を有さない。 ９．Ｋｍ値：０．３４ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
   に対する） １０．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
   ろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １１．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メ
   チルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グ
   リセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、
   フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸
   に作用する。
3. 【請求項３】 下記理化学的性質を有する請求項１記載
   のアルカリホスファターゼ。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
   ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ４．至適温度：６０℃以上 ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ７．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ８．糖鎖を有さない。 ９．Ｋｍ値：０．２６ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
   に対する） １０．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
   ろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １１．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メ
   チルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グ
   リセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、
   フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸
   に作用する。
4. 【請求項４】 下記理化学的性質を有する請求項１記載
   のアルカリホスファターゼ。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
   ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：７０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ４．至適温度：６０℃以上 ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ６．至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０ ７．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ８．糖鎖を有さない。 ９．Ｋｍ値：０．２８ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
   に対する） １０．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
   ろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １１．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メ
   チルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グ
   リセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、
   フォスフォエタノールアミン、グルコース−１−リン
   酸、グルコース−６−リン酸に作用する
5. 【請求項５】 バチルス属に属し、下記理化学的性質を
   有するアルカリホスファターゼ生成能を有する菌株を培
   地にて培養し、培養物より該アルカリホスファターゼを
   採取することを特徴とするアルカリホスファターゼの製
   造法。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
   ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
   ０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
   過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
6. 【請求項６】 アルカリホスファターゼ生成能を有する
   菌株が、バチルス・バディウスＴＥ３５９２（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−５３２９）、ＴＥ３５９３（ＦＥＲＭＢＰ−５
   ３３０）またはＴＥ３５９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２
   ０）である請求項５記載のアルカリホスファターゼの製
   造法。
7. 【請求項７】 標識として、下記理化学的性質を有する
   アルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試
   料中のリガンドを検出する方法。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
   ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
   ０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
   過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
8. 【請求項８】 試料中のリガンドを検出する方法が、試
   料中のリガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有
   する物質との親和性反応を利用するものであり、該反応
   により結合した物質に結合するアルカリホスファターゼ
   活性を測定するか、あるいは結合しなかったアルカリホ
   スファターゼ活性を測定する方法である請求項７記載の
   試料中のリガンドの検出法。
9. 【請求項９】 リガンドとリガンドに対して特異的な親
   和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
   り、アルカリホスファターゼがリガンドに対して特異的
   な親和性を有する物質に直接的または間接的に結合する
   請求項７記載の試料中のリガンドの検出法。
10. 【請求項１０】 リガンドとリガンドに対して特異的な
    親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
    り、アルカリホスファターゼがリガンドに直接的または
    間接的に結合する請求項７記載の試料中のリガンドの検
    出法。
11. 【請求項１１】 アビジン化合物またはビオチン化合物
    が結合したリガンドに対して特異的な親和性を有する物
    質と、アルカリホスファターゼとビオチン化合物との結
    合とを、リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を
    有する物質との親和性反応と同時に、またはその後にア
    ビジン化合物−ビオチン化合物結合反応に付し、該反応
    により結合したアルカリホスファターゼ活性または残存
    するアルカリホスファターゼ活性を測定する請求項７記
    載の試料中のリガンドの検出法。
12. 【請求項１２】 リガンドが抗原、抗体、ホルモン、ホ
    ルモンレセプターまたは核酸である請求項７記載の試料
    中のリガンドの検出法。
13. 【請求項１３】 リガンドとリガンドに対して特異的な
    親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
    り、該親和性反応が抗原抗体反応である請求項７記載の
    試料中のリガンドの検出法。
14. 【請求項１４】 リガンドとリガンドに対して特異的な
    親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
    り、該親和性反応がホルモン−レセプター反応である請
    求項７記載の試料中のリガンドの検出法。
15. 【請求項１５】 リガンドとリガンドに対して特異的な
    親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
    り、該親和性反応が核酸ハイブリダイゼーション反応で
    ある請求項７記載の試料中のリガンドの検出法。
16. 【請求項１６】 リガンドとリガンドに対して特異的な
    親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
    り、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
    有する物質のいずれか一方が固相に結合している請求項
    ７記載の試料中のリガンドの検出法。
17. 【請求項１７】 （ｉ）下記理化学的性質を有するアル
    カリホスファターゼで標識されたリガンドに対する特異
    的結合物質または（ii）下記理化学的性質を有するアル
    カリホスファターゼで標識されたリガンドおよび (iii)
    アルカリホスファターゼ測定試薬を含有する生体試料中
    のリガンド検出試薬。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
    ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
    ０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
    過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
18. 【請求項１８】 （ｉ）アビジン化合物またはビオチン
    化合物を結合するリガンドに対して特異的な親和性を有
    する物質および（ii）ビオチン化合物またはアビジン化
    合物を結合する下記理化学的性質を有するアルカリホス
    ファターゼおよび(iii) アルカリホスファターゼを測定
    する物質を含有する生体試料中のリガンド検出試薬。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
    ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
    ０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
    過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
19. 【請求項１９】 アルカリホスファターゼ測定試薬が
    １，２−ジオキセタン化合物またはこの誘導体、フェナ
    レノン−６−リン酸、ベンズフェナレン−６−リン酸、
    ４−メチルウンベリフェリルリン酸、ｐ−ニトロフェニ
    ルリン酸、１−ナフトールフタレインリン酸、５−ブロ
    モ−４−クロロ−３−インドリルリン酸またはこれらの
    化合物の誘導体である請求項１７または１８記載の生体
    試料中のリガンド検出試薬。
20. 【請求項２０】 リガンドが抗原、抗体、ホルモン、ホ
    ルモンレセプターまたは核酸である請求項１７または１
    ８記載の試料中のリガンド検出試薬。
21. 【請求項２１】 リガンドまたはリガンドに対して特異
    的な親和性を有する物質とが親和性反応性であって、親
    和性反応が抗原抗体反応である請求項１７または１８記
    載の試料中のリガンド検出試薬。
22. 【請求項２２】 リガンドとリガンドに対して特異的な
    親和性を有する物質とが親和性反応性であって、親和性
    反応がホルモン−ホルモンレセプター反応である請求項
    １７または１８記載の試料中のリガンド検出試薬。
23. 【請求項２３】 リガンドとリガンドに対して特異的な
    親和性を有する物質とが親和性反応性であって、親和性
    反応が核酸ハイブリダイゼーション反応である請求項１
    ７または１８記載の試料中のリガンド検出試薬。
24. 【請求項２４】 リガンドまたはリガンドに対して特異
    的な親和性を有する物質のいずれか一方が固相に結合し
    ている請求項１７または１８記載の試料中のリガンド検
    出試薬。
25. 【請求項２５】 標識として、下記理化学的性質を有す
    るアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする
    試料中のリガンドを定量する方法。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
    ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
    ０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
    過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
26. 【請求項２６】 標識として、下記理化学的性質を有す
    るアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする
    試料中の核酸配列決定法。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ₂ Ｏ → アルコー
    ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ⁺⁺およびＣｏ⁺⁺ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で少なくとも３
    ０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
    過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）