JPH0954087A

JPH0954087A - ヘモグロビン▲Ａ１ｃ▼測定用乾式試験具

Info

Publication number: JPH0954087A
Application number: JP23751895A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Yamamoto; 博司山本; Masao Kono; 昌雄河野; Shigeru Doi; 茂土井
Original assignee: KDK Corp; Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-08-10
Filing date: 1995-08-10
Publication date: 1997-02-25

Abstract

(57)【要約】【構成】溶血剤と変性剤と微粒子とを塗布した溶血層
と、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が含まれる凝集層と、凝集微粒子
を捕捉する測定層が、支持体上に順に積層されており、
展開後の展開残液を吸収する吸収層が上記測定層の周辺
に配置されている、乾式試験具である。【発明の効果】本発明によれば、大型の分析装置を用い
ず、しかも溶血および／または変性処理操作といった前
処理を必要とせず、検体数の少ない中小病院や開業医、
または患者自身でも小型機器を用いて、簡単な操作でヘ
モグロビンＡとヘモグロビンＡ_１ｃとを同時に直接測定
できる。しかも、本発明の原理である免疫凝集反応は、
市販の着色ビーズを用いるので、色素等で抗体を標識す
る必要がない。目的物質を標識しないので、標識化によ
る抗体の変性の危険性もない。さらに、検体は展開液と
ともに上から下へ展開するために、液がむらなく均一に
展開される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビンＡ
（ＨｂＡと略する）とヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃ
と略する）を同時に測定することにより、ＨｂＡ量に対
するＨｂＡ_１ｃ量の比率を簡易測定するための乾式の試
験具に関する。

【０００２】

【従来の技術】血中のヘモグロビンに糖が結合したグリ
コヘモグロビンは、その濃度が過去１〜２ケ月間の平均
的な血中糖濃度を反映するために、糖尿病の診断あるい
は糖尿病の経過観察に適した指標として広く利用されて
いる。

【０００３】グリコヘモグロビンを測定する場合には、
全体のヘモグロビン量を対照とした際のグリコヘモグロ
ビン量の比率で示される。この場合、ヘモグロビンの種
類（ヘモグロビンＡ，Ｓ，ＣおよびＥ）のうち、ヘモグ
ロビンＡ（ＨｂＡ）中の特定のグリコヘモグロビンであ
る、ヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃ）の割合を指標と
して用いることが臨床的に一般化されており、ＨｂＡに
対するＨｂＡ_１ｃの比率で示すと、通常約４〜６％がそ
の目安とされている。

【０００４】ＨｂＡ_１ｃの測定法としては電気泳動法、
ボロン酸アフィニティクロマトグラフィー法、イオン交
換クロマトグラフィー法、イムノアッセイ法などが知ら
れているが、現在では所要時間や分離性などの点からイ
オン交換クロマトグラフィー法が主流となっている。し
かし、最近では特異性の高い抗体を用いたイムノアッセ
イ法でも測定されるようになって来ている。

【０００５】このイムノアッセイ法は、用いる抗体の特
異性が高いためイオン交換クロマトグラフィー法におい
て問題とされる不安定型グリコヘモグロビン、カルバミ
ル化ヘモグロビン、アセトアルデヒド化ヘモグロビンお
よびアセチル化ヘモグロビンなどの影響を受けず、迅速
かつ検体処理能力が高い長所がある。

【０００６】しかし、グリコヘモグロビンに対する特異
抗体はヘモグロビンと化学構造の相違する部位（つまり
糖が結合した部分）をエピトープとしており、さらにＨ
ｂＡ_１ｃの場合その部位は十分露出していないため、イ
ムノアッセイ法を行う際、多くの場合その部位を露出さ
せるための変性操作が必要である。

【０００７】イオン交換クロマトグラフィー法および従
来のイムノアッセイ法では、比較的大型の分析装置を必
要とし、大きな病院検査室または検査センターでのみ測
定が行なわれている。

【０００８】一方、イムノアッセイ法を応用したもの
で、血中のヘモグロビンＡ、Ｓ、ＣおよびＥの種類判定
を目視でできる使い捨てタイプの乾式検査具（Ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ３，６７〜７６，１９９４）も知られてい
る。この乾式検査具は患者自身で測定することが可能で
あるが、前処理として溶血操作を必要とし、ＨｂＡ_１ｃ
といったグリコヘモグロビンを測定するものではない。
前処理を患者自身が行う場合、操作の煩雑さの他に汚染
も問題である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ＨｂＡ_１ｃといったグ
リコヘモグロビンを測る事ができ、かつ検体を前処理す
ることなしに測定可能な乾式試験具が開発されればその
メリットは極めて大きい。そこで本発明は、大型の分析
装置を用いず、しかも溶血および／または変性処理操作
を必要とせず、検体数の少ない中小病院や開業医、また
は患者自身でも小型機器を用いて、簡単な操作でＨｂＡ
とＨｂＡ_１ｃとを同時に直接測定できる乾式試験具を提
供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的は、全体が液体
を移送しうる材質で形成されており、展開液を用いるこ
とで血中のＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの量を測定するた
めの乾式試験具であって、１個の支持体上に、以下のｉ
からｖの構成すなわちｉ）溶血剤と変性剤と微粒子とを塗布した溶血層ｉｉ）展開層ｉｉｉ）抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が含まれる凝集層ｉｖ）展開層ｖ）凝集微粒子を捕捉する測定層が順に積層されており、展開後の展開残液を吸収する吸
収層が上記測定層の周囲に配置されている、血中ＨｂＡ
_１ｃ測定用乾式試験具を用いて、血液検体を点着して展
開させた後光学的方法により測定してＨｂＡとＨｂＡ
_１ｃの量を同時に求め、それぞれの値からＨｂＡに対す
るＨｂＡ_１ｃの比率を算出することにより、達成でき
る。なお、このときに使用される血液検体としては、全
血は勿論のこと、分離された赤血球でも良い。

【００１１】免疫凝集反応は、市販の着色ビーズを用い
るので、色素等で抗体を標識する必要がない。目的物質
を標識しないので、標識化による抗体の変性の危険性も
ない。さらに、検体である全血は、展開液とともに上か
ら下へ展開するために液がむらなく均一に展開される。

【００１２】また、先の構造物の隣に、さらに以下のｖ
ｉからｖｉｉｉの構成すなわちｖｉ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉｉ）展開層ｖｉｉｉ）ＨｂＡを捕捉する測定層が順に積層された構造物を設置することにより、測定精
度を向上することができる。詳細は後述する。以下具体
的に述べる。

【００１３】

【発明の実施の形態】第１図は、支持体１の上に凝集微
粒子のみを捕捉しうる測定層２を設け、測定層２の上に
展開可能な材質からなる展開層３を設け、展開層３の上
に抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を塗布した凝集層４を設け、凝集層
４の上に展開可能な材質からなる展開層５を設け、展開
層５の上に溶血剤・微粒子および変性剤を塗布した溶血
層６を設け、測定層２の周囲に展開後の展開残液を吸収
する吸収層８を設け、これらを積層したものを、穴を有
するカバー７で覆った試験具の縦断面図である。これを
試験具Ａとする。この試験具の溶血層６に血液検体を点
着すると、溶血と変性が行なわれ、微粒子の表面へＨｂ
Ａ_１ｃを含むＨｂＡが吸着される。引き続き展開液を溶
血層６に加えると微粒子は凝集層４の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体
と免疫反応して凝集し、凝集した微粒子は測定層２に捕
捉され、凝集しなかった微粒子を含む展開残液は吸収層
８に吸収される。次いで、測定層２と吸収層８中のＨｂ
ＡとＨｂＡ_１ｃによる着色度と、測定層２に捕捉された
微粒子自身（ＨｂＡ_１ｃ量に相当）の着色度をそれぞれ
光学的方法により測定して、その結果からそれぞれＨｂ
ＡおよびＨｂＡ_１ｃの値を求め、ＨｂＡに対するＨｂＡ
_１ｃの比率を算出する。

【００１４】ここで、各構成要素の機能と材料を以下に
示す。基本的に、材料は公知のもので構わない。

【００１５】支持体は光透過性の物質が好ましく、本発
明では展開終了後の光学的測定を支持体下部から行うた
めに、測定層の下部は必ず光透過性でなくてはならな
い。また、支持体は一枚板である必要はなく、例えば支
持体全体が光非透過性であり、測定層下部に貫通孔を有
していてもよい。材質は、ある程度の強度を有するもの
で、例えばガラス，ポリスチレン，ポリエステル，ポリ
エチレンテレフタレート，酢酸セルロースなどが挙げら
れる。

【００１６】展開層をなす展開膜は、吸着反応や免疫凝
集反応を行わせるための場として、またその反応の速度
を調節するためにある。また、この展開層の一部へ溶血
剤等を塗布して溶血層を、抗体を塗布して凝集層を設け
る。材質としては、酢酸セルロース、ニトロセルロー
ス、セルロース、ガラスファイバーなどの、液体と微粒
子が通りやすい物質であることが必要である。

【００１７】溶血層に含まれる溶血剤としてはサポニン
が有力であるが、界面活性剤も使用できる。その界面活
性剤の種類としては、ポリソルベート、ポリエチレング
リコ−ル−ｐ−イソオクチルエーテルなどが挙げられ
る。その中でも溶血能の点から、トリトンＸ−１００が
市販品として特に望ましい。同時に溶血層に塗布される
変性剤は、ＨｂＡ_１ｃを変性させてＨｂＡとの化学構造
の相違する部位（つまり糖部分）を露出させ、抗ＨｂＡ
_１ｃ抗体が免疫的に認識し易くする役割を有する。種類
としては、チオシアン酸塩のような酸や、プロテアーゼ
のような加水分解酵素が好ましく、単に酸性にするのみ
でも良い。さらに、ヘモグロビンＡ_１ｃを捕捉するため
の構造物の溶血剤層には、抗原を吸着させるための微粒
子を含ませる。それは、免疫凝集反応で使用される市販
の着色ビーズ（ラテックス製）でよく、また、着色また
は無着色の金属コロイド（金、銀、銅）も使用できる。
ただし、これら微粒子の着色は、ヘモグロビンの色（赤
色）と光学的に区別して測定できるものでなければなら
ない。

【００１８】凝集層に含まれる抗ＨｂＡ_１ｃ抗体として
は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体がともに
使用できる。

【００１９】測定層は、凝集した微粒子を捕捉し得る孔
径を有する濾過剤である多孔性マトリックスが望まし
い。濾過剤の例は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ
スルオン、ポリプロピレン、ポリビニリデンジフロライ
ド、セルロース混合エステルなどが挙げられる。また、
この層に捕捉された微粒子の呈色を観察するために、そ
の呈色とは波長の異なる色をした膜が好ましい。好まし
くは白色である。捕捉の方法は、濾過剤を使用して濾過
することが望ましくて一般的であるが、抗体やイオン交
換樹脂を使用する方法もある。

【００２０】吸収剤の条件としては、展開残液を吸収す
るのに十分な細孔容積を有する多孔性マトリックスか、
十分な液吸収能を有する乾燥ゲルが挙げられる。例とし
ては、セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリル酸、
ポリビニールアルコールなどがある。

【００２１】展開に用いる展開液としては、通常のイム
ノアッセイ法に使用されるような、少量の蛋白質、塩、
界面活性剤を含む緩衝液が望ましく、一例としては、
０．１％ウシ血清アルブミンと、０．０１％トリトンＸ
−１００と、０．９％塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリ
ン酸緩衝液が挙げられる。

【００２２】溶血層と凝集層と測定層は、展開膜に各種
試薬を含浸・塗布または結合させることで作製するが、
手法としては当業者間で公知の方法で良く、施すべき物
質を１種以上の含浸溶液中へ溶かし込み、塗り付けるこ
とで含浸したり、インクジェットプリンターで噴霧した
り、化学的に結合する（「酵素免疫測定法」医学書院、
１９８７年）ことができる。いずれにしても、最終的に
は乾燥させる。

【００２３】支持体上へ各層を配置する方法としては、
円形に加工した各々の層の膜を重ね合わせ，カバーと支
持体とを物理的に（例えば接着剤で）固定する。もちろ
ん、円形である必要は特にない。その際のカバーの材質
の例は、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリスチレ
ン，メタクリル樹脂，ポリカーボネートなどが挙げられ
る。

【００２４】第２図は、支持体１１の上に、ＨｂＡ_１ｃ
を捕捉するための構造物と、その隣にＨｂＡを捕捉する
ための新しい構造物を有する試験具の断面図である。こ
の試験具を試験具Ｂとする。ＨｂＡ_１ｃを捕捉するため
の構造物は、図１の試験具Ａと同様である。ＨｂＡを捕
捉するための構造物は、支持体１１の上に抗ＨｂＡ抗体
またはイオン交換物質を固定化した測定層２２を有し、
その測定層の上に液を展開可能な材質からなる展開層２
３を有し、その展開層の上に溶血剤を塗布した溶血層２
６を有している。これらの構成要素は、検体と展開液を
供給するための穴を有するカバー２７で覆われており、
積層されると同時に支持体へ固定されている。測定層２
２の周囲には、展開残液を吸収させる吸収剤からなる吸
収層２８が設けてある。ＨｂＡ_１ｃを捕捉するための構
造物は、支持体１１の上に凝集微粒子のみを捕捉しうる
濾過剤でできた測定層１２を有し、その測定層１２の上
に液を展開可能な材質からなる展開層１３を有し、その
展開層１３の上に抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を塗布した凝集層１
４を有し、その凝集層１４の上に液を展開可能な材質か
らなる展開層１５を有し、その展開層１５上に溶血剤，
変性剤および微粒子を塗布した溶血層１６を有してい
る。これらの構成要素は、穴を有するカバー１７で覆わ
れており、積層されると同時に支持体へ固定されてい
る。測定層の周囲には、展開残液を吸収させる吸収剤か
らなる吸収層１８が設けてある。

【００２５】試験具Ｂの溶血層２６に血液検体を点着す
ると溶血され、次いで展開液を溶血層２６に加えると、
ＨｂＡは展開され測定層２２に固定化されている抗Ｈｂ
Ａ抗体またはイオン交換物質に捕捉される。その際の展
開残液は吸収層２８に吸収される。一方、溶血層１６に
血液検体を点着すると、検体は溶血および変性され、Ｈ
ｂＡ_１ｃを含むＨｂＡは微粒子に吸着する。引き続き展
開液を溶血層１６に加えると、ＨｂＡ_１ｃを含むＨｂＡ
と吸着したその微粒子は凝集層１４の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体
と反応して凝集する。凝集した微粒子は測定層１２に捕
捉され、凝集していない微粒子を含む展開残液は吸収層
１８に吸収される。次いで、測定層２２中のＨｂＡの着
色度と、測定層１２に捕捉された微粒子自身（ＨｂＡ
_１ｃ量に相当）の着色度とをそれぞれ光学的に測定し、
その結果からそれぞれＨｂＡおよびＨｂＡ_１ｃの値を求
めた後、ＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を算出する。

【００２６】試験具Ｂでは、ＨｂＡとＨｂＡ_１ｃを捕捉
する場所が異なり、それぞれを異なる手段で確実に捕捉
するために、試験具Ａと比較すると、測定精度が向上す
る。

【００２７】ＨｂＡ_１ｃを捕捉するための構造物中の溶
血層では、ＨｂＡ_１ｃを変性させてＨｂＡとの化学構造
の相違する部位（つまり糖部分）を露出させ、抗ＨｂＡ
_１ｃ抗体が免疫的に認識し易くする必要があるが、Ｈｂ
Ａを捕捉するための構造物中の溶血層では、ＨｂＡ_１ｃ
を含むＨｂＡ全体を捕捉するために、変性剤は特に必要
としない。また、凝集する微粒子もないので、測定層に
は抗ＨｂＡ抗体やイオン交換樹脂（イオン交換樹脂の例
としては、ジエチルアミノエチルセルロース，カルボキ
シメチルセルロース）などを固定化して含ませておけば
よい。抗ＨｂＡ抗体は、ＨｂＡとＨｂＡ_１ｃの両方を認
識し、種類としては、ポリクローナル抗体とモノクロー
ナル抗体がともに使用できる。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、大型の分析装置を用い
ず、しかも溶血および／または変性処理操作といった前
処理を必要とせず、検体数の少ない中小病院や開業医、
または患者自身でも小型機器を用いて、簡単な操作でＨ
ｂＡとＨｂＡ_１ｃとを同時に直接測定できる。しかも、
本発明の原理である免疫凝集反応は、市販の着色ビーズ
を用いるので、色素等で抗体を標識する必要がない。目
的物質を標識しないので、標識化による抗体の変性の危
険性もない。さらに、検体は展開液とともに上から下へ
展開するために、液がむらなく均一に展開される。

【００２９】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の試験具Ａの縦断面図である。

【図２】本発明の試験具Ｂの縦断面図である。

【符号の説明】

１，１１：支持体２，１２，２２：測定層３，５，１３，１５，２３：展開層４，１４，：凝集層６，１６，２６：溶血層７，１７，２７：カバー８，１８，２８：吸収層

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】展開液を用いることにより全血中のヘモグ
ロビンＡ（ＨｂＡと略する）量に対するヘモグロビンＡ
_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃと略する）量を測定するための乾式試
験具であって、１個の支持体上に、以下のｉからｖの構
成すなわちｉ）溶血剤と変性剤と微粒子とを塗布した溶血層ｉｉ）展開層ｉｉｉ）抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が含まれる凝集層ｉｖ）展開層ｖ）凝集微粒子を捕捉する測定層が順に積層されており、展開後の展開残液を吸収する吸
収層が上記測定層の周囲に配置されている、ＨｂＡ_１ｃ
測定用乾式試験具。
【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載の構造物の隣
に、さらに以下のｖｉからｖｉｉｉの構成すなわちｖｉ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉｉ）展開層ｖｉｉｉ）抗ＨｂＡ抗体かイオン交換樹脂が固定化され
ている測定層が順に積層された構造物が並列に設置してあり、展開後
の展開残液を吸収する吸収層が上記測定層の周囲に配置
されている、血中ＨｂＡ_１ｃ測定用乾式試験具
【請求項３】測定層での凝集微粒子の捕捉方法が、濾過
剤による濾過作用によるものである、特許請求の範囲第
１又は２項に記載の試験具。
【請求項４】微粒子が、ヘモグロビンの色と光学的に区
別して測定し得る色に着色されている、特許請求の範囲
第１から３項のいずれかに記載の試験具。
【請求項５】測定層における光学的測定のために、支持
体の全体又は一部分が光透過性であるか、又は測定層の
下部に穴を開けたものである、特許請求の範囲第１から
４項のいずれかに記載の試験具。